JPH1180195A - 準安定結合の修飾速度を上昇させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質またはペプチド分子内の準安定ペ
プチドの結合の切断または形成の速度を上昇させる。 【解決手段】 速度を上昇させる抗体を引き出すための
抗原であって、準安定結合をもつハプテンを含む抗原に
より上記課題が達成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は概してペプチド結合
の切断または形成速度を上昇させる方法に関する。さら
に詳しくは、本発明はタンパク質またはペプチド分子内
の特異的準安定ペプチド結合の、そのような分子と速度
上昇抗体との接触による切断または形成の速度を上昇さ
せる方法に関する。いくつかの参考文献が本出願の括弧
内のアラビア数字で引用されている。これらの参考文献
の全ての引用は明細書の最後、請求の範囲のすぐ直前に
見られる。参考文献はより十分に、本発明自身のある局
面同様、本発明に関する技術の状況を記述している。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質中のあるペプチド配列は準安
定であることが知られている。これらの配列は“センシ
トープ”として引用されるが、脱アミド化、異性化、ラ
セミ化およびある場合にはペプチド結合の切断のような
自発的な化学反応が可能である。それ自体それらはその
ような感受性部位で起きる化学反応の速度上昇抗体の標
的部位である。ある合成ペプチド配列は特に自発的反応
が可能である(1) 。アスパラギン、アスパラギン酸、グ
ルタミン、グルタミン酸は感受性の配列と頻繁に会合す
るアミノ酸残基である、そしてこれらの特定の側鎖に隣
接するアミノ酸残基はペプチド内のこれらの部位の特定
の感受性を決定できることが提案されている(2) 。完全
なタンパク質のこれらの部位周辺の構造的性質はまた自
発的な化学的修飾に対するこれらの部位の安定性に影響
を及ぼすことができることも観察されている(3)。

【０００３】さらに具体的には、ジペプチド配列、ＡＳ
Ｎ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲＯ、ＡＳＰ
−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘま
たはＧＬＵ−Ｘを含むポリペプチドは、他のジペプチド
よりもさらに速い速度で加水分解をうけることが知られ
ている。この不安定性は、２個のアミノ酸の間のペプチ
ド結合に対する側鎖アミドまたは酸の分子内攻撃の結果
生じる環状構造の形成による。しかしこれらの準安定結
合は天然（変性していない）タンパク質中ではより安定
であることが報告されている(2) 。アシル転移反応(4)
、向シグマ性再編成(5) 、分子内環状化(6) 、および
ペプチド結合加水分解(7) を触媒する抗体が既に産出さ
れている。そのような抗体は特に基質が補助する触媒を
おこなう、即ち反応性求核原子を含む基質または形態変
化する分子内の触媒の反応を触媒するのに適しているこ
とが推測されている。

【０００４】ペプチドに対して生じた抗体は同一の配列
が完全なタンパク質中に存在しているとそこに結合する
ことができる。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のアミ
ノ酸１から１５を含むペプチドに対して生じた抗体は天
然の腫瘍壊死因子に結合し、そうすることにより細胞表
面受容体との相互作用を阻害することができる(8) 。同
様に、ＨＩＶのｇｐ１２０コートタンパク質のアミノ酸
を含むペプチドに対する抗体は完全なウイルスと交差反
応し、ウイルスとその細胞受容体、ＣＤ４との相互作用
を阻害する(9) 。別の例では、ニワトリ卵リゾチームの
アミノ酸６７から８３を含むペプチドに対する単クロー
ン抗体は完全タンパク質と交差反応することができ、エ
ピトープ内の配列が本質的に類似している他の鳥類のリ
ゾチームを認識することができた(10)。触媒抗体を調製
する方法が記述され、目的の抗原または基質への非触媒
および触媒抗体の結合方法が記述される一方、これまで
に自発的な加水分解を起こすことが知られているある準
安定ペプチド結合の切断または形成の速度を上昇させる
技術は与えられていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、タンパク質またはペプチド分子内の準安定ペプチド
結合の切断または形成の速度を上昇させる方法を提供す
ることである。さらに本発明の目的は、準安定ペプチド
結合を含むペプチドまたはタンパク質分子を発明にした
がった合理的な計画方法により調製された速度上昇抗体
に接触させることにより、準安定ペプチド結合、例えば
ＡＳＮ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲＯ、Ａ
ＳＰ−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−
Ｘ、ＧＬＵ−Ｘの切断または形成速度を上昇させる方法
を提供することである。本発明のもう一つのおよび関連
する目的は、タンパク質またはペプチド分子の特異的な
ペプチド結合の加水分解速度を、そのような分子とこれ
らの結合の天然の傾向を、ペプチド結合中のアスパラギ
ン酸またはグルタミン酸のアミドまたは酸の官能基また
はアスパラギンまたはグルタミン側鎖の分子内攻撃によ
る環状中間体構造を形成するように促進する速度上昇抗
体と接触させることにより、上昇させる方法を提供する
ことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】発明のこれらおよび他の
目的は速度を上昇させる抗体を引き出す抗原で達成さ
れ、前記抗原は準安定結合をもつハプテンを含む。本発
明の一つの態様は、準安定結合部位で目的の基質の反応
速度を上昇させることができる抗体を引き出す抗原であ
り、前記抗原は前記準安定結合部位またはその近傍で目
的の基質をまねるハプテンを含む。本発明のさらなる態
様は、目的の基質中の準安定結合の修飾速度を上昇させ
る抗体である。前記抗体は、修飾される特異的準安定結
合を選択すること；前記準安定結合部位またはその近傍
で前記基質をまねるハプテンを含む抗原を選択するこ
と；前記抗原に抗体産生能のある細胞をさらし、それに
より抗体産生細胞を産出すること；前記抗体産生細胞を
ミエローマ細胞と雑種形成させ、それによりそれぞれが
単クローン抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を
産出すること；および修飾される準安定結合部位または
その近傍でエピトープに結合する単クローン抗体を同定
し、前記準安定結合の修飾速度を上昇させるために、前
記複数の単クローン抗体をスクリーニングすることの各
段階を含む過程により調製される。

【０００７】本発明のさらなる態様は、目的のタンパク
質またはペプチド分子基質中で切断または形成される特
異的準安定結合を選択すること；前記準安定結合部位ま
たはその近傍で前記基質をまねるハプテンを含む抗原を
選択すること；抗体を産生できる細胞を前記抗原にさら
し、それにより抗体産生細胞を産出すること；前記抗体
産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それぞれが
単クローン抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を
産出すること；および前記準安定結合の修飾速度を上昇
させるように修飾された準安定結合部位またはその近傍
でエピトープに結合する単クローン抗体を同定するため
に複数の単クローン抗体をスクリーニングすることの各
段階からなる、目的の準安定結合の切断または形成速度
を上昇する抗体を調製する方法である。またさらに、本
発明の態様は、前記特異的準安定結合部位またはその近
傍でエピトープで前記基質に結合し、反応速度を上昇さ
せるために、前記抗体にとって十分な条件下で、前記基
質を抗体と接触させることを含む、目的のタンパク質ま
たはペプチド分子基質内の特異的準安定結合の修飾速度
を上昇させる方法である。

【０００８】さらにもう一つの本発明の態様は、前記特
異的準安定結合部位またはその近傍のエピトープで前記
基質に結合し、それにより前記反応速度を上昇させるた
めに前記抗体にとって十分な条件下で、前記基質を効果
的な量の抗体と接触させることを含む、目的のタンパク
質またはペプチド分子基質内の特異的準安定結合の修飾
速度を上昇させる方法である。前記抗体は、修飾される
特異的準安定結合を選択すること；前記準安定結合部位
またはその近傍で前記基質をまねるハプテンを含む抗原
を選択すること；抗体産生能のある細胞を前記抗原にさ
らし、それにより抗体産生細胞を産出すること；前記抗
体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それによ
りそれぞれが単クローン抗体を産生する複数のハイブリ
ドーマ細胞を産出すること；および修飾される準安定結
合部位またはその近傍でエピトープに結合する単クロー
ン抗体を同定するために前記複数の単クローン抗体をス
クリーニングすることという方法により生産される。本
発明、ならびに他の目的、その特性および利点は、以下
の詳細な説明からより明らかに、そして完全に理解され
るであろう。

【０００９】

【発明の実施の形態】ＸおよびＹがいずれかのアミノ酸
であるＡＳＮ−Ｘ、ＡＳＰ−Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−
Ｘ、ＬＹＳ−ＸおよびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからなるグループ
から準安定結合が選択される抗原を本発明は具体化して
いる。特に、本発明は前記準安定結合部位またはその近
傍でアミノ酸配列と免疫学的に交差反応するハプテンを
含む抗原を具体化している。さらに本発明は特に前記ハ
プテンが少なくとも２個のアミノ酸の配列からなる抗原
を具体化する。またさらに本発明は、特にＸおよびＹが
いずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、ＡＳＰ−Ｘ、Ｇ
ＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−Ｘ、ＬＹＳ−ＸおよびＨＩＳ−Ｙ−
Ｘからなるグループから前記準安定結合が選択され、前
記準安定結合の同一性が技術的に既知の条件下で目的の
基質を修飾し、そのような修飾で得られる産物を解析す
ることにより決定されるような前記抗原により引き出さ
れる抗体を具体化する。

【００１０】用語の定義 最も広義には、「抗原」という用語は抗体の形成を誘導
する分子として定義される。この中で用いられる「抗
原」という用語は本質的に免疫原性分子、発明にしたが
ったハプテンまたは適当な共役部分によりキャリアー分
子と連結した発明にしたがったハプテンを含む免疫原を
意味する。キャリアー分子は例えば、キーホールリンペ
ットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ニワ
トリ免疫グロブリン、オブアルブミン、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、Ｔ−ヘルパーペプチド等を含む。ここ
で用いられる「共役部分」は技術的によく知られた生物
工学的架橋剤（例えば、イリノイ州ロックフォードのピ
ース社から購入できる）を指し、例えばトラウト試薬、
ジサクシニルスベリン酸等を含む。

【００１１】「抗体」という用語は免疫グロブリン全体
および抗原結合部位を含むその断片を含む。「速度上昇
抗体」という用語は、準安定結合ペプチドを含むタンパ
ク質またはペプチド分子上のエピトープを認識、結合
し、それにより化学量論的に、または触媒的に（これら
の用語は以下で定義される）反応速度を上昇させる本発
明にかかる抗体を指す。「準安定ペプチド結合」という
用語は、形成または切断の自発的反応を起こす性質をも
つ全ての結合を含む。「自発的反応」という用語はペプ
チド結合で通常観察されるよりも速い速度で進むペプチ
ド配列内の特定の位置での反応を指す。特に、ＡＳＮ−
ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲＯ、ＡＳＰ−Ｇ
ＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘまたは
ＧＬＵ−Ｘは環状中間体の形成により仲介される自発的
なペプチド結合加水分解を起こすことが知られている。

【００１２】ここで用いられている「ジペプチド類似
体」という用語は、２個のアミノ酸の間の通常のアミド
結合（即ち、−ＣＯ−ＮＨ−）が上に定義した原子の配
列で置換されている構造を指す。付加的アミノ酸残基は
ポリペプチドを形成するためにジペプチド類似体の周辺
に取り込まれる。ジペプチド類似体周辺の部分は、天然
に生じるＣ＝Ｏ基がＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂ 、ＣＦ₂ 、ま
たはＣ＝Ｓで置換される、および／または天然に生じる
ＮＨ基がＯ、Ｓ、ＣＨ₂ 、ＣＦ₂ 、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓ
で置換されるような変化ができるペプチド結合を含む。
例えば、この部分はアミド結合のＣ＝ＯおよびＮＨ基が
置換されているレトロペプチドである。ここで用いられ
ている「ハプテン」という用語はエピトープとして作用
できる分子として定義される。ハプテンは目的の準安定
結合を含むペプチドまたはタンパク質の領域と同一であ
る、またはそれをまねる少なくとも２個のアミノ酸の配
列を含む。ハプテンはまた、前に定義されたジペプチド
類似体のような類似体を含む。

【００１３】ここで用いられる「天然に生じるアミノ
酸」という用語は、タンパク質に見いだされるあるいは
見いだされない２０個の必須α−アミノ酸および他のα
−アミノ酸を含む。これらのアミノ酸はアラニン、アル
ギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、
グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イ
ソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニル
アラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフ
ァン、チロシン、バリン、４−ヒドロキシプロリン、５
−ヒドロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリジン、３−メチ
ルヒスチジン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ホモシ
ステイン、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、カナ
バニン、ジエンコール酸およびβ−シアノアラニンを含
む。アミノ酸はアミノ基、カルボニル基、水素原子およ
び「側鎖」と記述される特徴的な基を結合する炭素原子
からなる。ここで用いられる「前記側鎖類似体」という
用語は、１またはそれ以上の部分の天然に生じる側鎖が
本質的に天然に生じる部分に相当する１またはそれ以上
の異なる部分により置換されている天然に生じるアミノ
酸の側鎖として定義される。ヒドロキシ基を含むそれら
の側鎖はグルコシル化、リン酸化、スルホニル化または
ヒドロキシ保護基による保護がなされる。側鎖のどのヒ
ドロキシ基も技術的によく知られた任意の数の適当なヒ
ドロキシ保護基により保護される。これらは例えば第３
級ブチルエーテル基を含む。

【００１４】「目的の部位またはその近傍での」抗体の
結合は目的の準安定結合への抗体の直接的な結合、目的
の準安定結合に近接するペプチド配列への結合、または
目的の準安定結合へ直接的な、および目的の準安定結合
の一方または両方にあるアミノ酸配列への結合を意味す
る。「触媒」抗体は、他の全ての条件（例えば、温度、
反応物／基質濃度等）が同一であるときに、化学反応速
度を変化させることができ、反応では消費されず、触媒
抗体１モルあたり多モルの反応物／基質を変換できる抗
体である。メカニズムの観点から、これは平衡位置をシ
フトすることなしに化学反応速度を変えることにより反
応物／基質に結合し、反応物／基質の産物への変換を加
速し、産物を放出する。前記の定義は理想的な触媒の特
性である。しかし実際には、最高の触媒でさえ反応系の
汚染により、または反応過程中の化学的あるいは物理的
破壊の結果として被毒化、または不活化する。技術的に
よく知られた理由により、触媒の真の操作は、反応系の
成分により、または反応環境条件により不明確にされ
る。抗体が反応完了後エピトープから離れる場合、準安
定ペプチド結合に作用する速度上昇抗体は触媒抗体とし
て記述される。「化学量論的」抗体は化学量論的に化学
反応速度を上昇させる抗体である、即ち、反応速度を上
昇させるが、触媒抗体とは異なり、反応の間に化学量論
的に消費される。反応完了後抗体がエピトープに結合し
たまま、または反応により変化し、そのためさらに反応
を促進することができない場合、準安定ペプチド結合に
作用する速度上昇抗体は化学量論的抗体として記述され
る。

【００１５】速度上昇抗体の標的としてのタンパク質ま
たはペプチド分子およびその準安定結合の同定 準安定結合は発明の方法にとって好ましい修飾部位であ
る。例えば、以下のアミノ酸の組み合わせ、ＡＳＮ−Ｇ
ＬＹ、ＡＳＮ−ＰＲＯ、ＡＳＰ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲ
Ｏ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘ、または
ＧＬＵ−Ｘを含む配列は変性タンパク質または小ペプチ
ド中では準安定で、自発的な加水分解をうけることが知
られている。天然のタンパク質に存在している場合、こ
れらの結合はより安定であるが、準安定結合部位または
そこに近接した部位でのエピトープへの抗体の結合は結
合を不安定化し、切断の速度上昇が得られる。目的のタ
ンパク質またはペプチド分子内の準安定結合の同一性と
位置は技術的に利用可能な各種の方法により知られ、ま
た確立されている(11,12) 。そのような情報は各種の形
態で、各種の水準の正確さで得られ、タンパク質または
ペプチド分子の３次元構造、そのコンピューターモデル
または予想構造、あるいは親水性プロフィールを含む。

【００１６】適当な準安定結合を同定する経験的方法
は、目的のタンパク質またはペプチド分子を修飾を起こ
させるのに十分な時間、技術的に認識できる修飾条件に
さらすことを含む。例えば、各種温度でのＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン四酢酸）中（14-16)での、各種温度同
様、ヒドロキシルアミン(17)または希釈酸(18,19) での
タンパク質のインキュベーションのような他の方法を用
いて自己溶解を誘導することを当業者は正しく認識する
であろう。その後、修飾された画分は同定され、修飾が
起きた準安定結合が同定される。発明の方法にしたがっ
て有利に修飾されたタンパク質またペプチド分子は免疫
グロブリン（加水分解）、腫瘍壊死因子（加水分解）お
よびヒト免疫不全ウイルス（加水分解）を含む。

【００１７】速度上昇抗体の調製 修飾された準安定結合が上述の方法により同定される
と、抗原が抗体を引き出す免疫学的方法に使用するため
に得られる、または合成される。抗原は望ましくは目的
の準安定結合または目的の準安定結合類似体を含む小ペ
プチドまたはその類似体である。その後抗原は、試験管
内、または生体内技術のいずれかを用いて目的の速度上
昇性をもつ抗体を引き出すために免疫原として使用され
る。

【００１８】広くは、その方法は抗体産生能をもつ細胞
を免疫原にさらし、それにより抗体産生細胞を産出する
こと；抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、
それによりそれぞれが単クローン抗体を産生する複数の
ハイブリドーマ細胞を産出すること；および目的の化学
反応を触媒する単クローン抗体を同定するために複数の
単クローン抗体をスクリーニングすることからなる。そ
のように同定された単クローン抗体は目的の化学反応を
触媒するのに十分な量を得るために、再び生体内または
試験管内の技術のいずれかにより複製される。本発明の
好ましい免疫原は、基質補助機構による触媒過程に関与
できる準安定結合またはアミノ酸側鎖をもつペプチドを
含む。これらにはＹおよびＸがいずれかのアミノ酸であ
るＡＳＮ−Ｘ；ＡＳＰ−Ｘ；ＧＬＮ−Ｘ；ＧＬＵ−Ｘ；
ＬＹＳ−Ｘ；およびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからなる配列が含ま
れる。発明のこれらの経験的加水分解断片解析技術によ
り見いだされた他の免疫原もまた使用される。触媒され
る特異的反応の反応経路に補足的なポケットを組み合わ
せた抗体をつくることにより分子内触媒反応をペプチド
またはタンパク質基質におこなわせるように誘導された
環状類似体を含む免疫原もまた使用される。

【００１９】目的の活性および特異性を用いた抗体の検
出はそれらが引き出された際のハイブリドーマのスクリ
ーニングにより達成される。例えば、スクリーニングは
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または分光光
度計による方法（ＥＬＩＳＡ）により達成される。単ク
ローン抗体は、ここで参考文献に取り入れられている、
１９８０年４月１日に発行された米国特許第４，１９
６，２６５号のＫｏｐｒｏｗｓｋｉ等により記載された
技術を改良した方法により、生体内で引き出される。そ
の過程の詳細は技術的に知られている。特異的抗原に関
する一連の単クローン抗体は適当な条件下で調製され
る。これにはまず適当な抗原でＢＡＬＢ／Ｃマウスを免
疫することが含まれる。抗原はペプチドまたは他のキャ
リアー分子に結合する本発明にかかるハプテンが含まれ
る。

【００２０】抗体産生リンパ細胞はその後免疫されたマ
ウスの脾臓から取り出され、ハイブリドーマ細胞をつく
るためにＳＰ２／０細胞のようなミエローマ細胞と雑種
形成される。これらのハイブリドーマ細胞はその後マイ
クロタイタープレートのウェルに植えられる。ハイブリ
ドーマ細胞により生産される一連の単クローン抗体は適
当な条件下で目的の反応を触媒する単クローン抗体を同
定するために、適当な条件下でスクリーニングされる。
代わりに、培地は免疫原に結合する抗体について試験さ
れ、これらの抗体を産生するハイブリドーマはその後組
織培養に広げられるか、または生体内で生育される。ス
クリーニングは、反応物の標準液をマイクロタイターウ
ェルから回収された培地のアリコットで処理し、通常の
機器法で目的産物の測定をおこなうことにより簡便に達
成される。この測定は例えば、分光光度計による方法ま
たは気体−液体または高速液体クロマトグラフィーによ
り簡単に行なわれる。目的産物または反応物の標準試料
と比較することにより、反応速度が定量される。このよ
うに、単クローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
含むウェルが同定される。選択されたハイブリドーマ細
胞はその後コロニーを得るために培養される。

【００２１】これらのコロニーはさらに試験管内または
生体内の系で広げられる。後者の場合、同系のＢＡＬＢ
／Ｃマウスのようなマウスが選択されたハイブリドーマ
細胞を腹腔内に接種され、通常は２から３週間以内に腫
瘍がつくられる。これらの腫瘍は、目的の単クローン抗
体を含む腹水の生産を伴う。単クローン抗体はその後限
外濾過、超遠心、透析および免疫アフィニティークロマ
トグラフィーのような通常の方法により腹水から単独に
回収される。発明の免疫原から引き出される抗体は、目
的の準安定結合の修飾を触媒するためだけにデザインさ
れているという意味で「部位特異的」である。同様に、
これらの抗体はその末端にある構造配位をもつ部分の末
端から結合を形成することを触媒するためだけにデザイ
ンされている。本発明にしたがい合理的にデザインされ
た免疫原は、2 またはそれ以上の切断産物を産出し、正
しい構造配位をもつそれらの切断産物が結び付けられる
結合の形成を触媒するために、タンパク質またはペプチ
ド分子の特異的部位で結合を切断することができる部位
特異的抗体を引き出すために用いられる。発明はさらに
以下の例に記述される。

【００２２】

【実施例】

例Ｉヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）糖タンパク質
１２０（ＧＰ １２０）を用いたタンパク質中の準安
定ペプチド結合を決定する方法 ＧＰ １２０は技術的によく知られた方法で均一に精製
される。精製されたＧＰ １２０は終濃度が１mg／mlに
なるように１０mM ＣａＣｌ₂ を含む５０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（pH９．０）に溶解され、その後５５℃で
４８時間熱処理される。反応液は断片化のパターンを決
定するためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）により解析される。ゲル
はタンパク質のバンドを目に見えるようにするためにク
ーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色される。
分子量標準との比較に基づいて、gp１２０バンドよりも
速く移動するバンドは準安定結合の切断を示す。熱自己
溶解により生産される個々の断片はＨＰＬＣにより均一
になるまで精製され、それらの同一性は酸加水分解後の
アミノ酸分析およびシークエンシングにより確定され
る。これら全てのデータとgp１２０の既知のアミノ酸配
列との比較により断片およびそれにより準安定切断部位
の明白な同定がなされる。この方法は容易に他のペプチ
ド、タンパク質、糖タンパク質、およびペプチドグリカ
ンに利用される。当業者は他の方法が各種の温度でのＥ
ＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（14-16)、各種温度
同様、ヒドロキシルアミン(17)または希釈酸(18,19) 中
でのタンパク質のインキュベーションのような自己溶解
を誘導するために用いられることを正しく認識できる。

【００２３】例II準安定ペプチド結合切断のための類似体の合成 発明のさらなる態様では、配位的に不自然なペプチド類
似体を含む免疫原により引き出される抗体は正常なペプ
チドの加水分解を促進する。そのような免疫原は例え
ば、ある環状または非環状のペプチド類似体から調製さ
れる。本発明のこの態様は、これらの準安定結合が他の
ペプチド結合よりもさらに速い速度でうける自発的反応
の中間体である環状構造類似体を利用する。これらの中
間体は、ＡＳＮ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−Ｐ
ＲＯ、ＡＳＰ−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸である
ＧＬＮ−Ｘ、またはＧＬＵ−Ｘのような２個のアミノ酸
の間の準安定結合上の側鎖アミドまたは酸の分子内攻撃
の結果得られる。類似体は自発的な加水分解の間に準安
定ペプチド配位の形態をまねる。免疫原として調製され
たそのような類似体により誘導される抗体は結合し、目
的の準安定ペプチド結合の配位に変化を誘導することに
より特定の準安定ペプチド結合の切断を促進する。図に
より、好ましいペプチドの合成は以下に記述される。

【００２４】A.環状ジフルオロケトンハプテンの合成 環状ジフルオロケトンハプテンは、準安定ペプチド結合
であるＡＳＮ−ＧＬＹおよびＡＳＰ−ＧＬＹが他のジペ
プチド結合よりもかなり速い速度でうける自発的切断を
仲介する化学構造の配位的類似体としてデザインされ
る。前記ハプテンを取り込む免疫原は、ＡＳＮ−ＧＬＹ
およびＡＳＰ−ＧＬＹ結合のみ、または完全な配列の部
分としての結合で切断を誘導できる抗体の形成を引き出
すようにデザインされる。これらの立体異性のペプチド
への取り込みは既知のペプチド合成により進む。これら
の図１〜３のハプテンはスキーム１にしたがって合成さ
れる：

【００２５】合成の方法論は本質的には出願番号ＰＣＴ
／ＵＳ ８９／０１９５１（１９８９年５月４日出願）
の例７に記述されている方法に、環状類似体をつくるべ
くさらに修飾を加えたものにしたがっている。化合物４
−フェニルベンゾイルクロリド〔１〕はアスパラギン酸
のモノメチルエステル〔２〕で濃縮され、４−フェニル
ベンゾイルで保護された類似体〔３〕が得られる。ラク
トンの環状化〔４〕は１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いたア
プロティックな条件下で達成される。不飽和ジフルオロ
ケト酸〔５〕の無水物を用いた濃縮（J. F. Normant et
al., Bull. Soc. Chim. Fi., （1974）2072(25b) ）は
ジペプチドシントン〔６〕を与える(25)。液体アンモニ
ア中でのトリメチルアルミニウムを用いた〔６〕の処理
は保護されたアスパラギンシントン〔７〕を与える。ア
ルデヒドへのオゾン分解および酸類似体

〔９〕へのジョ
ーンズ酸化は円滑に進む。ナトリウムアマルガムを用い
た４−フェニルベンゾイル基の脱保護化(24)は、リンカ
ー部分で誘導化されて必要なペプチド配列を与えるか
〔１１〕、または、当業者に知られている方法(26)によ
り必要なペプチド配列に取り込まれるようなＡＳＮ−Ｇ
ＬＹ環状ジフルオロケトンジペプチドシントンを提供す
る。保護されたジペプチドシントン〔６〕の炭酸カリウ
ムによる処理はアスパラギン酸−ＧＬＹシントン〔８〕
を与える。同様のオゾン分解の後にジョーンズ酸化を行
うことにより、当業者に知られている方法論(26)により
選択された配列に取り込まれるか、または直接的にキャ
リアータンパク質に付着するためのリンカー部分〔１
１〕(24)で誘導化されるＡＳＰ−ＧＬＹ環状ジフルオロ
ケトンジペプチドシントン〔１０〕を与える。

【００２６】B.ハプテンを含む環状リンの合成 （以下に示される）スキーム２によりつくられるハプテ
ンを含むリン、または前記ハプテンを取り込んだ免疫原
は、ＹがＧＬＹまたはＰＲＯであるＡＳＮ−ＹおよびＡ
ＳＰ−Ｙのみで、あるいは完全な配列の部分としてこれ
らで切断を誘導できる抗体を引き出すようにデザインさ
れる。立体異性を含むこれらのリンのペプチドへの取り
込みは既知のペプチド合成により進む。発明のこの態様
は、他のジペプチド結合よりもさらに速い速度で、Ｙが
ＧＬＹまたはＰＲＯである準安定ペプチド結合ＡＳＮ−
ＹおよびＡＳＰ−Ｙがうける自発的加水分解を仲介する
化学構造類似体を含むリンを利用する。説明として、ペ
プチド類似体を含む好ましいリンの合成は図４〜５のス
キーム２に記述される。ハプテンを含む環状リンの合成
方法は本質的に文献の方法論にしたがう；しかし、生産
される類似体は先例のない化合物である。環状リン立体
異性のペプチドへの取り込みは既知のペプチド合成によ
り進む。

【００２７】既知のスルホキシド(22)〔１４〕は、α−
アセトキシスルフィド〔１５〕を与えるために無水酢酸
存在下での加熱によるプメラー再配置に供される。温和
な塩基処理は、フェニルスルフィニル陰イオンの除去に
付随して選択的にアセトキシ基を切断してアルデヒドを
与える 〔１６〕；ジョーンズ酸化の後にジアゾメタンを用いて
エステル化をすれば、エステル〔１７〕が得られる。単
一のメトキシホスフィニル基の選択的モノ脱保護の後に
塩化チオニル処理を行うと、ジメチル銅リチウムを用い
た反応でホスホン酸塩を与える塩化ホスフィノイルを与
える〔１８〕。分子内クライゼン型環状化は〔１９〕を
得るためにメタノール中ナトリウムメトキシドにさらす
ことにより達成される。塩基加水分解の後に塩化チオニ
ル処理をすれば、目的のジペプチド類似体〔２１〕を得
るために適当に保護されたアミノ酸誘導体と共役する塩
化ホスホニル〔２０〕を与える。

【００２８】C.準安定結合切断のための非環状リントリ
ペプチド類似体 図６のスキーム３にしたがったハプテンを含む非環状リ
ン(23)は上記のＡおよびＢのハプテンよりも広い交差反
応性を提供する。本発明のこの態様は準安定ペプチド結
合、ＡＳＮ−ＰＲＯ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲ
Ｏ、ＡＳＰ−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧ
ＬＮ−ＸまたはＧＬＵ−Ｘが他のジペプチド結合よりも
さらに速い速度でうける自発的加水分解の中間体である
化学的構造の類似体を含む非環状リンを利用する。免疫
原として調製された類似体を含むそのようなリンにより
誘導される抗体は結合し、目的の準安定ペプチド結合の
配位に変化を誘導することにより、特定の準安定ペプチ
ド結合の加水分解を促進する。実例として、ペプチド類
似体を含む好ましいリンの合成がスキーム３に記述され
る。既知のβ−ラクタム誘導体〔２２〕（Ｒ＝Ｍｅ）は
文献(23)に記述されているものに類似の方法で〔２３〕
で与えられる保護アミノ酸誘導体と共役して〔２３〕を
与える。次に、β−ラクタム環のアルコール分解は保護
されたジペプチド誘導体〔２４〕を与える。リンエステ
ルの選択的切断はチオフェノレート陰イオン処理により
達成される。塩化チオニルでの反応に続いて適当に保護
されたアミノ酸との共役によって得られた酸の塩素化は
トリペプチド類似体〔２５〕を与える。

【００２９】例III免疫原ペプチドを用いたＨＩＶ gp １２０コートタンパ
ク質に対する触媒抗体の生体内での誘導 A.免疫原の調製 目的の準安定ペプチド結合が例Ｉに記述されたように選
択されると、速度上昇抗体を誘導するための最適なハプ
テンを決定することが必要である。最適な速度上昇抗体
は、目的の準安定結合部位またはその近傍に位置するエ
ピトープと免疫学的に交差反応するハプテンにより誘導
される。最大の速度上昇を与える抗体を誘導するハプテ
ンは経験的に決定されねばならない。目的の準安定ペプ
チド結合部位またはその近傍の異なる部位を認識する抗
体は、いずれが速度を上昇させ、それらのうちのいずれ
が最高に速度を上昇させるかを決定するためにスクリー
ニングされる。

【００３０】例Ｉに記述された方法により同定される準
安定ペプチド結合を含む、またはそこに隣接する一連の
オクタペプチド配列が合成される。配列はＨＩＶ gp １
２０に見いだされるアミノ酸配列に相同または同一であ
るか、あるいは例IIにしたがった、目的の準安定ペプチ
ド結合のジペプチドまたはトリペプチド類似体を含む。
そのような類似体は目的の準安定ペプチド結合をその部
位または、例Ｉの方法により同定され、７個のアミノ酸
までのいずれかの側に隣接した部位で定義する天然に生
じるアミノ酸を置換する。それゆえ、目的の準安定結合
または目的の準安定ペプチド結合の合成ペプチド類似体
を含む入れ子状のオクタペプチドが生成される。同一の
２個のアミノ酸の間に位置する準安定結合を含むが、そ
れぞれ異なるオクタペプチドのペプチドのＮ−末端から
異なる距離に生じるこの入れ子状のオクタペプチドが生
成される。それゆえ、一連のオクタペプチドは目的の準
安定ペプチド結合、または異なる位置に存在する類似体
として目に見えるようになる。この一連のオクタペプチ
ドにより誘導される相当の抗体は、天然の gp １２０タ
ンパク質中に存在する目的の準安定ペプチド結合から異
なる距離で結合する一団の抗体を表す。

【００３１】目的の準安定ペプチド結合（またはその類
似体）を含むハプテンの性質をより理解するために、例
としてのみ示される、標的タンパク質内に準安定結合を
含む次の１２個のアミノ酸配列：VDRASNPKASTRを考え
る。以下のオクタペプチドは免疫原として用いるために
構築される：

【化１】ＮＨ₂ −V D R A S N-X-P K- COOH ＮＨ₂ −D R A S N-X-P K A- COOH ＮＨ₂ −R A S N-X-P K A S- COOH ＮＨ₂ −A S N-X-P K A S T- COOH ＮＨ₂ −S N-X-P X A S T R- COOH ここでＮＸＰはジペプチド立体異性または天然に生じる
アミノ酸準安定ジペプチドである。それゆえ、天然のタ
ンパク質配列中の一連のエピトープで結合する相当の一
群の抗体を誘導するための一群のハプテンを調製できる
ことは高く評価されるべきである。この一群の抗体はそ
の後、いずれが好ましい速度上昇抗体であるかを決定す
るためにスクリーニングされる。それぞれのペプチドハ
プテンは架橋剤ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステルを用いて、末端のシステイ
ン残基を介してキーホールリンペットのヘモシアニン
（ＫＬＨ）と共役される。

【００３２】B.単クローン抗体の調製 ＢＡＬＢ／Ｃマウスが、完全フロイント補助剤で乳状化
されたＫＬＨ−ペプチド結合（免疫原）で免疫される。
血液試料はそれぞれのマウスから得られ、血清が遠心に
より分離され、４℃で保存される。このようにして得ら
れた血清は標準のＥＬＩＳＡ法により、元々のペプチド
免疫原に対する結合活性でスクリーニングされる。上述
のように免疫され、免疫原に対する反応性でアッセイさ
れた抗体産生マウスは犠牲にされ、その脾臓が取り出さ
れ、ハイブリドーマ細胞が融合のパートナーとしてＳＰ
２／０ミエローマ細胞を用いて調製される。

【００３３】C.触媒単クローン抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞のスクリーニング プラスチック製マイクロタイタープレート（Falcon 39
15 Probind, Becton Dickinson Labware CAS, USA ）の
ウェルはＴｒｉｓ−ＨＣｌ（０．１ Ｍ，pH９．６）緩
衝液に溶解した５μｇ／mlペプチド５０μＬでコートさ
れる。プレートは最初に３０分間３７℃で、さらに室温
で一晩インキュベートされる。ツイーン（Tween ）を含
むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Tween ０．１％pH
７．４）で３回洗浄後、連続的希釈をしたＰＢＳ−ＢＳ
Ａ １％ pH７．４に溶解した単クローン抗体５０μｌ
がペプチドをコートした二重のウェルに添加され、３７
℃で２時間インキュベートされる。プレートは再びＰＢ
Ａ−Tween ０．１％で３回洗浄され、ウェルはその後
１：５００に希釈されたアルカリホスファターゼ標識ヤ
ギ抗マウスＩｇＧ（Sigma, MO, USA）で処理される。イ
ンキュベーションは３７℃で１時間行われる。

【００３４】ＰＢＳ−Tween ０．１％での十分な洗浄
後、１mMのＭｇＣｌ₂ およびＺｎＣｌ ₂ を含む０．１Ｍ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（pH１０．４）に溶解された
アルカリホスファターゼ基質（シグマ１０４−１０５の
２錠／１０ml）１５０μＬとインキュベートされる。酵
素反応は３７℃で２４時間続けられ、５０μＬのＮａ₂
ＣＯ₃ （１．５Ｍ）の添加により止められる。４０５nm
での吸収がタイターテックマルチスキャンＥＬＩＳＡリ
ーダー（FlowLaboratories ）で読まれる。力価発現は
（１：１００希釈の保存された正常マウス血清を含む）
負の対照の３倍の大きさの吸収を与える最大希釈による
光学密度の上昇により決定される。このスクリーニング
アッセイで正の反応を与えるハイブリドーマは次の研究
のために選択される。ＩｇＧはベイカーボンドＡＢｘ
ＨＰＬＣカラムを用いたＨＰＬＣにより腹水から精製さ
れる。

【００３５】D.ＨＩＶ gp １２０コートタンパク質に特
異的な触媒抗体によるペプチド切断の触媒 準安定結合（２．７μＭ）を含む、またはそこに隣接す
るオクタペプチド基質（２．７μＭ）は上に概略を示し
た方法により生産された触媒抗体とインキュベートさ
れ、反応は混合液の逆相ＨＰＬＣ分析によりモニターさ
れる。反応は触媒抗体による高ｋ_cat のための最適pHを
決定するために各種のpHで行われる。３Ｈ無水酢酸（４
−１０Ｃｉ／mmol；アマーシャム）を用いた遊離のオク
タペプチドまたは上述のリンカー−ペプチド共役体のア
セチル化により調製されたトリチウム標識オクタペプチ
ド基質を用いて反応が行われる。ＨＰＬＣがその後トリ
チウム標識切断産物の生産を追跡するために用いられ
る。オクタペプチド基質の切断に最高のｋ_cat 値を示す
抗体はウイルス複製の阻害能を試験される。

【００３６】ウイルス複製アッセイは、培養が２００μ
Ｌを含むマイクロチューブウェルに広げられることを除
いて、文献(20)に記述された方法に本質的にしたがって
行われる。それぞれ２５μＬの段階濃度の精製単クロー
ン抗体は２５μＬの５０ＴＣＩＤ⁵⁰ ＨＴＬＶ ＩＩＩ
Ｂと共に５％ＣＯ₂ 中で、３７℃で１時間予めインキュ
ベートされる。プレインキュベーションに続き、Ｈ９細
胞（加熱処理により不活化した２０％ＦＣＳを添加した
１５０μＬＲＰＭ１−０４０中に１×１０⁵ 細胞）がウ
ェルに添加され、最終的に抗体濃度は０．１μｇ／mlか
ら１０μｇ／mlの範囲となる。マイクロタイタープレー
トは５％ＣＯ₂ 中で３７℃１４日間インキュベートされ
る。細胞は３、７、１０日に新鮮な培地と無細胞上清１
００μＬを交換することにより培養され、この間は抗体
の添加は行われない。無細胞上清（１００μＬ）はＲＩ
Ａ（ＤｕＰｏｎｔ，ＮＥＫ−０４０）によりｐ２４抗原
が分析される。ｐ２４の量は感染の程度およびウイルス
の複製に関連するので、対照の抗体で処理されたウイル
スと比較しｐ２４が顕著な減少を示した触媒抗体処理を
行ったウェルは触媒抗体による gp １２０の切断による
阻害を示す。

【００３７】Ｃ８１６６融合アッセイは文献(21)に記述
される。単クローン抗体は２時間アッセイで試験され
る。慢性的にＨＴＬＶ−ＩＩＩＢを感染されたＨ９細胞
（１×１０⁴ ）は９６穴プレートで、１５０μＬ培地中
各種濃度の抗体と予めインキュベートされる。全てのア
ッセイは３連で行われる。５％ＣＯ₂ 中３７℃１時間の
インキュベーション後、３×１０⁴ Ｃ８１６６細胞（Ｈ
ＴＬＶ−Ｉで形質転換した臍帯リンパ細胞）５０μｌが
ウェルに添加される。最終的なウェル中の抗体濃度は３
１μｇ／mlおよび５μｇ／mlである。２５μｇ／mlのＯ
ＣＴ４Ａ（OrthoDiagnostics ）を用いたプレインキュ
ベーションが対照として用いられる。５％ＣＯ₂ 中、３
７℃、２時間プレートをインキュベートした後、多核体
（リンパ細胞の直径の３倍以上に細胞質が膨らんでい
る）がカウントされる。計測中の偏りを防ぐために、試
料はコードされる。

【００３８】それぞれの単クローン抗体の抗ウイルス活
性はＨＩＶ−Ｉ複製および細胞融合アッセイで試験され
る。結果は単クローン抗体によるウイルス感染の投与量
依存性の阻害を示す。準安定結合を含むペプチドによる
免疫により引き出された触媒単クローン抗体は、リンパ
細胞のＣＤ４受容体への結合に含まれるウイルスコート
タンパク質の重要な領域の破壊を引き起こすことによ
り、ＨＩＶウイルスによる感染を阻害できる。触媒単ク
ローン抗体は、タンパク分解酵素の作用に類似の様式で
選択された配列のペプチド結合を切断する。オクタペプ
チドまたは gp １２０の抗体触媒加水分解の機構は金属
イオンを含んでいてもいなくてもよいが、いずれの場合
も、抗体の活性部位に求核体を含むか、抗体結合部位に
より活性化された水の求核的付加のいずれかを含む。

【００３９】例IVヒトＩｇＥを切断しアレルギー反応を阻害する単クロー
ン抗体の生産、スクリーニングおよび単離の方法論 背景 アレルギー反応開始におけるＩｇＥの役割は６０年以上
多くの研究の主題であった。これらの研究はアレルギー
反応の経路について詳細な理解を導き出してきた。アレ
ルギー反応開始の第一の事象はアレルゲン（抗原）のＩ
ｇＥへの結合である。これによりＩｇＥの幹細胞および
好塩基球細胞の表面への架橋ができ、ＩｇＥは標的細胞
上に存在するＦｃ受容体へＦｃ領域を介して結合する。
この架橋の結果、身体の他の組織への効果を介してアレ
ルギー反応の心身に有害な効果を最終的には導き出すヒ
スタミン、ＳＲＳ−Ａおよびたの血管に作用するアミン
の放出が誘発される。ＩｇＥ分子は機能的にはその結合
活性により定義される２つの部分に分けられる。このこ
とは、分子が２断片を生成するパパインタンパク分解に
供せられたときに示される。このタンパク分解の結果、
アレルギー反応を導き出す能力に関して、ＩｇＥは不活
性化される。事実、Ｆｃ受容体のＦｃ断片への阻害を介
した阻害剤となる。

【００４０】抗アレルギー単クローン抗体を産生するた
めに、特異的にＩｇＥを切断し、他の心身に有害な効果
なしにこれを不活性化することができる触媒抗体が調製
される。これを達成するため、単クローン抗体は目的の
配列内に含まれる環状ジペプチド類似体

【化２】 を用いて引き出される。そのように引き出された触媒単
クローン抗体は以下に示される位置で天然のＩｇＥペプ
チド配列を切断する：

【００４１】

【化３】

【００４２】この配列はＩｇＥのＣＨ₂ およびＣＨ₃ ド
メインの間に存在し、この切断によりＩｇＥ分子の活性
が破壊され、アレルギー反応の生成を阻害する。この領
域に対する触媒抗体をつくるため、（Ｘ）が上に示され
た環状ジペプチド類似体を表すペプチドハプテンＡＤＳ
（Ｘ）ＲＧＶが標準の固相または液相法により合成され
る。完成したペプチドは十分に保護がはずされ、固相合
成が用いられた場合、トリフルオロ酢酸を用いて、固体
支持体から切断される。ペプチドのＮ末端アミノ基はマ
ウスを免疫するためのキャリアータンパク質に付着され
る。

【００４３】A.免疫原の調製 1.ペプチド合成 ペプチドハプテンはポリアミド- キーセルグール複合樹
脂を用いた固相法により合成される。側鎖の保護基は以
下のものである：Ｏ−tert−ブチル（チロシン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン）；Ｎ−
４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホ
ニル（アルギニン）。Ｎ−官能基の一時的な保護は、ピ
ペリジン／ＤＭＦ：２０／８０を用いて１０分で除去さ
れるフルオレニルメトキシカルボニルによる。共役反応
はＦＭＯＣ−アミノ酸無水物を用いて行われる。保護さ
れたペプチジル樹脂は、トリフルオロ酢酸／チオアニソ
ール／ｍ−クレゾール／チオフェノール／エタンジチオ
ール溶液：９０／２／２／２／４を用いて３時間処理す
ることにより完全に保護が除かれる。濾過後、濾液は真
空下で少量まで濃縮される。エーテルがペプチドを沈澱
させるために添加される。エーテル上清は除去され、ペ
プチドの沈澱はエーテルで２回洗浄され、ペプチドハプ
テン

【化４】Ala-Asp-Ser(X)-Arg-Gly-Val が得られる。ここで括弧で囲まれた部分は以下に示され
る環状ジペプチド類似体である。Ｘの合成は本質的に例
IIに記述された方法にしたがっている。

【００４４】2.ハプテンのキャリアー分子への結合 上記のようなペプチドハプテンはグルタールアルデヒド
を用いて、キーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）に結合される。共役の効率は、反応液へ添加された
¹²⁵Ｉで標識したペプチドの微量の結合を評価したとこ
ろによれば、５０から８０％である。触媒抗体の免疫お
よびスクリーニングは本質的に上述のように行われる。

【００４５】C.ヒトＩｇＥのＣＨ₂ −ＣＨ₃ インタード
メイン領域に特異的な触媒抗体によるペプチド切断の触
媒 ペプチド基質ＡＤＳＮＰＲＧＶ（２．７μＭ）は上に略
述した方法により生産した触媒抗体とインキュベートさ
れ、反応は混合物の逆相ＨＰＬＣ分析によりモニターさ
れる。ペプチド基質に対して触媒ペプチダーゼ活性を示
す抗体はＩｇＥ切断能のために処理される。ＩｇＥ不活性化アッセイ 精製されたＩｇＥ抗ＮＰが１μｇのＩｇＥに１μｇの触
媒抗体を用いて、精製された触媒抗体による消化に供さ
れる。インキュベーションはＰＢＳ（pH＆．５）中で各
種の期間（時間から日）３７℃で行われる。この反応の
非特異性をコントロールするために、非触媒単クローン
抗体が並行反応に含まれる。切断を評価するために、好
塩基球の結合の消失を調べる。上記の消化のＩｇＥ抗Ｎ
Ｐの試料（１から５ ng ）が、２００μｌのＲＰＭＩ１
６４０、１０％仔牛胎児血清および１０mM ＥＤＴＡ中
で１５分間、３７℃である範囲の好塩基球細胞（６×１
０⁵ ・１０⁷ 細胞／ml）とインキュベートされる。これ
らの細胞はその後同一緩衝液で３回洗浄され、³⁵Ｓ−Ｂ
ＳＡ−ＮＩＰ（０．１μCi) 添加後さらに３７℃で１５
分間インキュベートされる。細胞は洗浄され、放射活性
が計測される。ＩｇＥ対照インキュベーションと比較し
た、細胞への³⁵Ｓ結合の減少または消失はＩｇＥの切断
が起きていることを示す。

【００４６】例Ｖ腫瘍壊死因子を標的とした抗体酵素プロテアーゼの生産 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は活性化マクロファージにより
分泌されるサイトカインである。ＴＮＦはエンドトキシ
ンにより誘導されるショック、前脂肪細胞におけるリポ
タンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性の抑制、滑液細胞に
よるコラゲナーゼ活性およびプロスタグランジンＥ２生
産の促進、インターロイキン１生産の促進およびヌード
マウスにおけるカヘキシーの誘導を含む各種の生物学的
効果を媒介することが示されている。ＴＮＦ特異的細胞
表面受容体はいくつかの型の細胞に存在する。これらの
受容体へのＴＮＦの結合はＴＮＦの生物学的効果の誘導
に必要であることが信じられている。ｈＴＮＦのアミノ
酸１から１５に対する抗体が細胞表面受容体への結合を
阻害することが示されている（Socher et al., Proc.Na
tl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 8829-8833 ）。ｈＴＮ
ＦのＮ末端の８つのアミノ酸は受容体認識には必要ない
こともまた知られている。それ故、受容体結合の重要な
領域は９から１５の残基を含むかもしれない。以下の式
はＴＮＦのＮ末端の２５アミノ酸、重要な残基９から１
５（*)および準安定部位ＮＰ、即ちＡｓｎ−Ｐｒｏを示
している。

【化５】 ジペプチド立体異性を含むペプチド類似体の合成は前述
の例IVに本質的にしたがって行われる。準安定ジペプチ
ド立体異性の合成は本質的には例IIの記述にしたがって
いる。免疫原の調製、免疫および触媒抗体のスクリーニ
ングは、バイオアッセイがＴＮＦ抗体酵素のタンパク分
解および不活性化を決定するのに使用されたことを除い
て、本質的に上述したように行われている。

【００４７】腫瘍壊死因子細胞溶解アッセイ ハツカネズミＬ−９２９線維芽細胞（３０，０００／ウ
ェル）が、１μｇ／mlのアクチノマイシンＤ存在下で９
６穴組織培養プレートで培養される。触媒抗体による処
理の前後にＴＮＦの連続的希釈がウェルに加えられ、１
８時間インキュベートされる。培地はその後除去され、
細胞は０．５％クリスタルバイオレットの２５％メタノ
ール溶液で染色される。５４０nmでの吸収が Biotek EL
ISA マイクロプレートリーダーで測定される。培地のみ
の細胞は０％の溶解であることが考えられ、３Ｍグアニ
ジン−塩酸で処理した細胞は完全に溶解すると考えられ
る。ＴＮＦ１単位は５０％の細胞溶解を起こすのに必要
な量として定義される。

【００４８】参考文献 1. T. Geiger and S. Clarke, j. Biol. Chem.,198
7, 262(2), 785-794. 2. S. Clarke, Int. J. Pept. Prptein Res.,1987,
30, 808-821. 3. A. A. Kossiakoff, Science, 1988, 240, 191-19
3. 4. A. Tramantano et al, Science, 1986,234,1566,
R. Sugasawara, M. Powell,el al. J. Am. Chem.Soc.,
1987, 109, 2174. 5. D. Y. Jackson et al, J. Am. Chem. Soc.,1988,
110 4841; D. Hilvert et al, P.N.A.S. USA, 1988, 8
5, 4953. 6. A. D. Napper, S. J. Benkovic, et al,Science,
1987, 237, 1041. 7. B. L. Iverson and R. A. Lerner, Science, 198
9, 234, 1184-1187. 8. Socher, et al. P.N.A.S. USA, 1987, 84,8829-8
833. 9. Laskey, et al, Cell, 1987, 50, 975-985. 10. M. J. Darsley and A. R. Rees, EMBO J．，198
5, 4, 383-392.１１． Ｒ．Ｃ．Ｒ．Ｃ． Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓｏｎ ＆ Ｓ． Ｃｌａｒｅｋ， J. Biol.
Chem．， 1989, 264. 12. R. Lura and V. Schirch, Biochemistry, 1989,
27, 7671-77. 13. Laemmli, E. K. Nature 1970, 227,630-635. 14. R.J.T. Corbett and R. S. Roche. Int. J.Rept.
Prot. Rel., 1986, 20, 549-559. 15. A. Fontana, Biophysical Chem．， 1988,29,181
-193. 16. A. Fontana, et al. Biochemistry., 1986,25, 1
847-1851. 17. J. K. Blodgett, et al., J. Am. Chem.Soc., 19
85, 107, 4305-4313. 18. C. van der Auwera and M.T.O. Anteuvius,Int.
J. Rept. Prot. Res.,1988, 31, 186-191. 19. ibid. Int. J. Rept. Prot. Res., 1988, 31, 39
1-310. 20. D. Ho. J. Virol., 61, 2024(1987). 21. B. D. Walker et al., P.N.A.S. USA, 84,8120. 22. Y. Vo. Quanq, J. Med. Chem 29, 579-587(198
6).２３． Ｍ． Ｍ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．， JCS Chem. Comm p730 (1980). 24. R. N. Scribner, Tetrahedron Letters (1976) 3
853-3856. 25. M. Kolb and B. Neises, Tetrahedron Letters
27, 4437-4440(1986). 25b. J. F. Normant et al., Bull. Soc. Chim.Fr, (1
974)2072. 26. M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesi
s, Pub. Springer Verlag, Berlin 1984).

【図面の簡単な説明】

【図１】ハプテンの合成スキーム１。

【図２】合成スキーム１（図１）の続き。

【図３】合成スキーム１（図２）の続き。

【図４】ペプチド類似体を含むリン化合物の合成スキー
ム２。

【図５】合成スキーム２（図４）の続き。

【図６】ペプチド類似体を含むリン化合物の合成スキー
ム３。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リーズ，アンソニー，アール. アメリカ合衆国20814 メリーランド州ベ セスダ，1305エヌ，プックス ヒル ロー ド 5225 (72)発明者 ブース，ポール，エム. アメリカ合衆国20874 メリーランド州ジ ャーマンタウン，アイランド ビュー サ ークル 12116 (72)発明者 ホング，ウォンピョ アメリカ合衆国01002 メリーランド州ポ トマック，キャンドルライト レーン 10921 (72)発明者 ティットマス，リチャード アメリカ合衆国20851 メリーランド州ロ ックビル，クルックストン レーン 12905 (72)発明者 マッセィ，リチャード アメリカ合衆国20852 メリーランド州ロ ックビル，ブレリアン コート ５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 速度上昇抗体を引き出すための抗原であ
   って、前記抗原は準安定結合をもつハプテンを含む抗
   原。