JPH1180200A - 無菌動物を用いたモノクローナル抗体及びその利用 - Google Patents
無菌動物を用いたモノクローナル抗体及びその利用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 フィブリン特異的モノクローナル抗体の提
供。 【解決手段】 (a) フィブリノーゲン、(b) プラスミン
誘導フィブリノーゲン分解産物、および(c) プラスミン
誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、ハイブリド
ーマ ATCC HB 9739 により生産されたフィブリン特異的
モノクローナル抗体。
供。 【解決手段】 (a) フィブリノーゲン、(b) プラスミン
誘導フィブリノーゲン分解産物、および(c) プラスミン
誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、ハイブリド
ーマ ATCC HB 9739 により生産されたフィブリン特異的
モノクローナル抗体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原を抗体と接触
させることからなる該抗原の存在を判定するためのイム
ノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動
物から得られたポリクローナル抗体をインビボおよびイ
ンビトロで臨床的診断および治療に利用するための方法
を提供するものである。また本発明はフィブリン特異的
モノクローナル抗体をも提供する。
させることからなる該抗原の存在を判定するためのイム
ノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動
物から得られたポリクローナル抗体をインビボおよびイ
ンビトロで臨床的診断および治療に利用するための方法
を提供するものである。また本発明はフィブリン特異的
モノクローナル抗体をも提供する。
【０００２】
【従来の技術】Kohlerと Milstein が、初めて成功裡に
モノクローナル抗体産生性ハイブリドーマを生成させる
技法を考案したと一般に考えられている (G. Kohler お
よび C. Milstein, 1975, Nature 256, 495-497; 1976,
Eur. J.Immunol. 6, 511-519)。抗体生成細胞 (脾臓Ｂ
リンパ球) をミエローマ細胞 (骨髄原発性腫瘍の悪性細
胞) と融合させることによって、単一の融合細胞ハイブ
リッド (ハイブリドーマまたはクローンと称される) か
ら生じたハイブリッド細胞系を作成した。このハイブリ
ドーマはリンパ球とミエローマ細胞系の両方の特定の性
質を受け継いでいた。ハイブリドーマはリンパ球と同様
に免疫グロブリンの一タイプを分泌し、さらにミエロー
マ細胞と同様に無限に細胞分裂を起こす能力を有してい
た。これら二つの特徴を合わせ持つことは従来の抗血清
をしのぐ明かな利点を提供した。
モノクローナル抗体産生性ハイブリドーマを生成させる
技法を考案したと一般に考えられている (G. Kohler お
よび C. Milstein, 1975, Nature 256, 495-497; 1976,
Eur. J.Immunol. 6, 511-519)。抗体生成細胞 (脾臓Ｂ
リンパ球) をミエローマ細胞 (骨髄原発性腫瘍の悪性細
胞) と融合させることによって、単一の融合細胞ハイブ
リッド (ハイブリドーマまたはクローンと称される) か
ら生じたハイブリッド細胞系を作成した。このハイブリ
ドーマはリンパ球とミエローマ細胞系の両方の特定の性
質を受け継いでいた。ハイブリドーマはリンパ球と同様
に免疫グロブリンの一タイプを分泌し、さらにミエロー
マ細胞と同様に無限に細胞分裂を起こす能力を有してい
た。これら二つの特徴を合わせ持つことは従来の抗血清
をしのぐ明かな利点を提供した。
【０００３】ワクチン接種した動物から得られる抗血清
は、決して同一に再生産することのできないポリクロー
ナル抗体の変動性混合物である。モノクローナル抗体
は、単一タイプの高度に特異的な免疫グロブリンであ
る。ハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンの
単一タイプは、多数の抗原決定基を有する複合分子であ
る抗原上の一つのそして唯一の抗原決定基、すなわちエ
ピトープに特異的である。たとえば、抗原がタンパク質
である場合、抗原決定基はタンパク質分子全体の内にあ
る多くのペプチド配列 (一般に６−７アミノ酸の長さで
ある；M. Z. Atassi, 1980, Molec. Cell.Biochem. 32,
21-43) のうちの一つであろう。したがって、単一の抗
原に対して生じた複数のモノクローナル抗体は、その抗
体を生じさせた決定基に応じて相互に異なる可能性があ
る。しかし、任意の所定のハイブリドーマについては、
それが生産するすべての抗体が同一である。さらに、ハ
イブリドーマ細胞系はインビトロまたはインビボで容易
に増殖し、極めて高濃度のモノクローナル抗体を生成す
る。
は、決して同一に再生産することのできないポリクロー
ナル抗体の変動性混合物である。モノクローナル抗体
は、単一タイプの高度に特異的な免疫グロブリンであ
る。ハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンの
単一タイプは、多数の抗原決定基を有する複合分子であ
る抗原上の一つのそして唯一の抗原決定基、すなわちエ
ピトープに特異的である。たとえば、抗原がタンパク質
である場合、抗原決定基はタンパク質分子全体の内にあ
る多くのペプチド配列 (一般に６−７アミノ酸の長さで
ある；M. Z. Atassi, 1980, Molec. Cell.Biochem. 32,
21-43) のうちの一つであろう。したがって、単一の抗
原に対して生じた複数のモノクローナル抗体は、その抗
体を生じさせた決定基に応じて相互に異なる可能性があ
る。しかし、任意の所定のハイブリドーマについては、
それが生産するすべての抗体が同一である。さらに、ハ
イブリドーマ細胞系はインビトロまたはインビボで容易
に増殖し、極めて高濃度のモノクローナル抗体を生成す
る。
【０００４】モノクローナル抗体をプローブとして使用
してその抗原を検出することができる。したがってモノ
クローナル抗体は、インビトロ診断例えばラジオイムノ
アッセイおよびエンザイムリンクトイムノアッセイ(ELI
SA)、およびインビボ診断例えば放射性標識モノクロー
ナル抗体を用いるインビボ像形成に利用されている。ま
た、モノクローナル抗体をかかる抗体の抗原へ向けての
ドラッグデリバリーのための輸送担体として利用するこ
ともできる。
してその抗原を検出することができる。したがってモノ
クローナル抗体は、インビトロ診断例えばラジオイムノ
アッセイおよびエンザイムリンクトイムノアッセイ(ELI
SA)、およびインビボ診断例えば放射性標識モノクロー
ナル抗体を用いるインビボ像形成に利用されている。ま
た、モノクローナル抗体をかかる抗体の抗原へ向けての
ドラッグデリバリーのための輸送担体として利用するこ
ともできる。
【０００５】しかしながら、モノクローナル抗体をかか
る目的に利用できる前提として、必須なことはそのモノ
クローナル抗体が、関心の対象となる抗原、すなわち標
的抗原と結合する能力を有することである。この方法
は、作成されたハイブリドーマをスクリーニングして、
もしあるとすればどのハイブリドーマが標的抗原と結合
できるモノクローナル抗体を生産するかを決定すること
によって実施される。このスクリーニング方法は非常に
冗長であると考えられ、標的抗原に結合しうる抗体を生
産するハイブリドーマが同定されるまでに、夥しい数
の、例えば、おそらく数千個のモノクローナル抗体をス
クリーニングしなければならないかもしれない。従っ
て、ハイブリドーマが標的抗原に対する抗体を生産する
可能性を高めるモノクローナル抗体の製造方法が必要と
されている。
る目的に利用できる前提として、必須なことはそのモノ
クローナル抗体が、関心の対象となる抗原、すなわち標
的抗原と結合する能力を有することである。この方法
は、作成されたハイブリドーマをスクリーニングして、
もしあるとすればどのハイブリドーマが標的抗原と結合
できるモノクローナル抗体を生産するかを決定すること
によって実施される。このスクリーニング方法は非常に
冗長であると考えられ、標的抗原に結合しうる抗体を生
産するハイブリドーマが同定されるまでに、夥しい数
の、例えば、おそらく数千個のモノクローナル抗体をス
クリーニングしなければならないかもしれない。従っ
て、ハイブリドーマが標的抗原に対する抗体を生産する
可能性を高めるモノクローナル抗体の製造方法が必要と
されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗原を抗体
と接触させることからなる該抗原の存在を判定するため
のイムノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した
無菌動物から得られたポリクローナル抗体をインビボお
よびインビトロで臨床的診断および治療に利用するため
の方法を提供することを目的とする。また本発明は、フ
ィブリン特異的モノクローナル抗体をも提供することを
目的とする。
と接触させることからなる該抗原の存在を判定するため
のイムノアッセイ、モノクローナル抗体および免疫した
無菌動物から得られたポリクローナル抗体をインビボお
よびインビトロで臨床的診断および治療に利用するため
の方法を提供することを目的とする。また本発明は、フ
ィブリン特異的モノクローナル抗体をも提供することを
目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下を含んで
なるイムノアッセイを提供する：抗原を抗体と接触させ
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイにおいて、改良点が該抗体として無抗原動物由来
の抗体を用いることからなるイムノアッセイ。 本発明
は無菌動物由来のモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を利用する方法をも提供するものである。本発
明はまた、フィブリン特異的モノクローナル抗体および
かかるモノクローナル抗体の利用方法をも提供する。以
下、本発明を詳細に説明する。
なるイムノアッセイを提供する：抗原を抗体と接触させ
ることからなる該抗原の存在を判定するためのイムノア
ッセイにおいて、改良点が該抗体として無抗原動物由来
の抗体を用いることからなるイムノアッセイ。 本発明
は無菌動物由来のモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を利用する方法をも提供するものである。本発
明はまた、フィブリン特異的モノクローナル抗体および
かかるモノクローナル抗体の利用方法をも提供する。以
下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
Ｉ． 抗原を抗体と接触させることからなる該抗原の存
在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点が
該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることからな
るイムノアッセイ：無菌動物由来のモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を利用する方法 （１）無菌動物 本発明は、モノクローナル抗体生産のための無菌動物の
使用に関する。無菌動物は19世紀後期に最初に開発さ
れ、それ以来広範に利用されてきている。
在を判定するためのイムノアッセイにおいて、改良点が
該抗体として無抗原動物由来の抗体を用いることからな
るイムノアッセイ：無菌動物由来のモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体を利用する方法 （１）無菌動物 本発明は、モノクローナル抗体生産のための無菌動物の
使用に関する。無菌動物は19世紀後期に最初に開発さ
れ、それ以来広範に利用されてきている。
【０００９】無菌動物は、細菌、ウイルス、真菌、原生
動物、および他の非病原性または寄生性形態物を包含す
るあらゆる論証可能な生命の関連形を含有しないノトバ
イオートである。ノトバイオートは無菌的帝王切開また
は卵の無菌孵化により得られた動物または系統であり、
アイソレーター条件下で無菌技法により飼育され連続的
に維持される。このような動物に於いては、関連するあ
らゆる動物相および植物相の組成は、もし存在するとし
ても、一般に認められている現行の方法論によって完全
に限定されている。 (以下の点を銘記すべきである。す
なわち、すべてのマウスは潜伏性白血病誘発ウイルスを
担持しており、従ってこのような白血病誘発ウイルスに
ついて以外は無菌的であるマウスは本発明の目的に関し
て無菌的であると見なされるべきである。） 無菌系の核心は、欲せざる微生物の侵入に対する障壁を
用意することである。動物を囲うプラスチック、金属、
ゴムおよびガラスの物理的障壁に加えて、無菌系は空気
の濾過、食物及び水の滅菌、手袋による操作といった操
作上の障壁を必要とし、このような障壁が障壁系の不可
欠の部分をなす。また、アイソレーターへの物資の搬入
は無菌条件下で行うべきである。
動物、および他の非病原性または寄生性形態物を包含す
るあらゆる論証可能な生命の関連形を含有しないノトバ
イオートである。ノトバイオートは無菌的帝王切開また
は卵の無菌孵化により得られた動物または系統であり、
アイソレーター条件下で無菌技法により飼育され連続的
に維持される。このような動物に於いては、関連するあ
らゆる動物相および植物相の組成は、もし存在するとし
ても、一般に認められている現行の方法論によって完全
に限定されている。 (以下の点を銘記すべきである。す
なわち、すべてのマウスは潜伏性白血病誘発ウイルスを
担持しており、従ってこのような白血病誘発ウイルスに
ついて以外は無菌的であるマウスは本発明の目的に関し
て無菌的であると見なされるべきである。） 無菌系の核心は、欲せざる微生物の侵入に対する障壁を
用意することである。動物を囲うプラスチック、金属、
ゴムおよびガラスの物理的障壁に加えて、無菌系は空気
の濾過、食物及び水の滅菌、手袋による操作といった操
作上の障壁を必要とし、このような障壁が障壁系の不可
欠の部分をなす。また、アイソレーターへの物資の搬入
は無菌条件下で行うべきである。
【００１０】あらゆる無菌動物が本発明に利用できると
考えられる。最も一般的な無菌動物はマウス、ブタ、ラ
ット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、霊長類、お
よび家禽であり、マウス、特にBalb/cマウスが好まし
い。 （２）無菌動物の生産、ケアおよび維持 無菌動物の生産、ケアおよび維持に関しては夥しい刊行
物がある。例えば、Wostmann, B. S. 編、Gnoto-biote
s: Standards and Guidelines for the Breeding,Care
and Management of Laboratory Animals. National Res
earch Council,National Academy of Sciences, Was
hington, D. C. 1970; Coates, M. E.ら、The Germfree
Animal in Research, Academic Press, London, 1968;
および Pleasants, J. R., Gnotobio-tics, in Handboo
k of laboratory Animal Science, 第１巻, Melby, E.
C.ほか編、CRC Press, Boca Raton,Fla., 117, (1974)
、以上の刊行物は参照としてここにとり込まれる。
考えられる。最も一般的な無菌動物はマウス、ブタ、ラ
ット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、霊長類、お
よび家禽であり、マウス、特にBalb/cマウスが好まし
い。 （２）無菌動物の生産、ケアおよび維持 無菌動物の生産、ケアおよび維持に関しては夥しい刊行
物がある。例えば、Wostmann, B. S. 編、Gnoto-biote
s: Standards and Guidelines for the Breeding,Care
and Management of Laboratory Animals. National Res
earch Council,National Academy of Sciences, Was
hington, D. C. 1970; Coates, M. E.ら、The Germfree
Animal in Research, Academic Press, London, 1968;
および Pleasants, J. R., Gnotobio-tics, in Handboo
k of laboratory Animal Science, 第１巻, Melby, E.
C.ほか編、CRC Press, Boca Raton,Fla., 117, (1974)
、以上の刊行物は参照としてここにとり込まれる。
【００１１】以下は、Wostmann, B.S.編、Gnotobiotes:
Standardsand Guidelines for theBreeding, Care and
Mana- gement of Laboratory Animals, National Rese
arch Council, National Academy of Sciences, Washin
gton,D. C. の無菌ラットおよびマウスの生産、ケアお
よび維持を記述する論文の要約である。かかる生産、ケ
アおよび維持は他の動物についても同様である点に留意
すべきである。 室内環境 施設、設備、および管理方法は、最大の環境制御と最適
の快適さおよび福利を動物に供与するよう設計され、運
営されるべきである。ケージ、給餌器および給水器は、
動物に最大の快適さを供与し、食物及び水が容易に摂取
できるようにし、そして清掃および滅菌が実行可能で効
率的であるように設計および組み立てられるべきであ
る。
Standardsand Guidelines for theBreeding, Care and
Mana- gement of Laboratory Animals, National Rese
arch Council, National Academy of Sciences, Washin
gton,D. C. の無菌ラットおよびマウスの生産、ケアお
よび維持を記述する論文の要約である。かかる生産、ケ
アおよび維持は他の動物についても同様である点に留意
すべきである。 室内環境 施設、設備、および管理方法は、最大の環境制御と最適
の快適さおよび福利を動物に供与するよう設計され、運
営されるべきである。ケージ、給餌器および給水器は、
動物に最大の快適さを供与し、食物及び水が容易に摂取
できるようにし、そして清掃および滅菌が実行可能で効
率的であるように設計および組み立てられるべきであ
る。
【００１２】大規模な無菌作業のための望ましいフロア
プランは以下からなるべきである： １. アイソレーターを組み立てそして滅菌するための作
業領域、２. 動物の入っているアイソレーターを維持す
る領域、および３. ノトバイオートの環境を日常的に監
視するための実験室領域。事務室および飼料調製領域を
フロアプランに組み込んでもよい。
プランは以下からなるべきである： １. アイソレーターを組み立てそして滅菌するための作
業領域、２. 動物の入っているアイソレーターを維持す
る領域、および３. ノトバイオートの環境を日常的に監
視するための実験室領域。事務室および飼料調製領域を
フロアプランに組み込んでもよい。
【００１３】ノトバイオートのアイソレーターを維持す
るための室内環境は従来の実験用齧歯類の収容に関して
確立された基準に合致しなければならない。その構造は
昆虫を通さず、壁および床は防水性であるべきである。
光線は年間を通じて同一の明暗周期で一定不変であるべ
きである。換気装置は、化学的な滅菌により生じたあら
ゆる煙霧を速やかに除去しなければならず、気候条件は
以下に詳述するように制御されるべきである。
るための室内環境は従来の実験用齧歯類の収容に関して
確立された基準に合致しなければならない。その構造は
昆虫を通さず、壁および床は防水性であるべきである。
光線は年間を通じて同一の明暗周期で一定不変であるべ
きである。換気装置は、化学的な滅菌により生じたあら
ゆる煙霧を速やかに除去しなければならず、気候条件は
以下に詳述するように制御されるべきである。
【００１４】温度。アイソレーターの温度を22℃から26
℃の間 (72から78°Ｆの間) に保つために、一般に認め
られている動物の室温、21−27℃ (70−80°Ｆ) を下方
調整する必要があろう。 湿度。相対湿度 (RH) は、ヒトが快適なレベルである40
−60パーセントに保つべきである。しかしながら、アイ
ソレーターの換気に室内空気を使用する場合には、40−
50パーセントのRHが推奨される。
℃の間 (72から78°Ｆの間) に保つために、一般に認め
られている動物の室温、21−27℃ (70−80°Ｆ) を下方
調整する必要があろう。 湿度。相対湿度 (RH) は、ヒトが快適なレベルである40
−60パーセントに保つべきである。しかしながら、アイ
ソレーターの換気に室内空気を使用する場合には、40−
50パーセントのRHが推奨される。
【００１５】換気。室内の空気交換は化学滅菌の間に生
じたあらゆる煙霧を速やかに除去するのに十分でなけれ
ばならない。１時間当り10から15回の空気交換が推奨さ
れる。危険なレベルの化学性煙霧に曝される職員を防護
するために、新鮮空気換気装置のあるヘッドマスクが利
用可能であるべきである。 無菌設備 (Sacquiet, E. 1968, Equipment design and
management: Generaltechnique of maintaining germ-f
ree animals, p.1-22 In M. E. Coates編、the germfre
e animal in research. Academic Press.London: Trexl
er, P.C. 1968, Equipment design and management: Tr
ansport of germ-free animals and current developme
nts in equipment design, p.23-35 In M. E. Coates
編、The germfree animal in research. Academic Pres
s, London 参照) 環境中の微生物を完全に排除するには絶対的な障壁が必
要である。アイソレーター操作の成功は、常にそのよう
な障壁を維持することにかかっている。金属とプラスチ
ックの二種類の一般的な種類のアイソレーターがある。
金属性ユニットのなかには、20psi (1,406g/cm2) の内
部蒸気圧に耐えられるように建造されているものもあ
る。(Reyniers, J. A. 1959, Design and operation of
apparatusfor rearing germ-free animals. An. N. Y.
Acad. Sci. 78: 47; Miyakawa, M.1959. The Miyakawa
remote-control gremfree rearing unit. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 78: 37参照)。また、最初の滅菌のために、
大きなオートクレーブ内に設置されているものもある(G
ustafsson, B.E. 1959. Lightweight stainless steel
systems for rearing germ-free animals. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 78: 17参照) 。
じたあらゆる煙霧を速やかに除去するのに十分でなけれ
ばならない。１時間当り10から15回の空気交換が推奨さ
れる。危険なレベルの化学性煙霧に曝される職員を防護
するために、新鮮空気換気装置のあるヘッドマスクが利
用可能であるべきである。 無菌設備 (Sacquiet, E. 1968, Equipment design and
management: Generaltechnique of maintaining germ-f
ree animals, p.1-22 In M. E. Coates編、the germfre
e animal in research. Academic Press.London: Trexl
er, P.C. 1968, Equipment design and management: Tr
ansport of germ-free animals and current developme
nts in equipment design, p.23-35 In M. E. Coates
編、The germfree animal in research. Academic Pres
s, London 参照) 環境中の微生物を完全に排除するには絶対的な障壁が必
要である。アイソレーター操作の成功は、常にそのよう
な障壁を維持することにかかっている。金属とプラスチ
ックの二種類の一般的な種類のアイソレーターがある。
金属性ユニットのなかには、20psi (1,406g/cm2) の内
部蒸気圧に耐えられるように建造されているものもあ
る。(Reyniers, J. A. 1959, Design and operation of
apparatusfor rearing germ-free animals. An. N. Y.
Acad. Sci. 78: 47; Miyakawa, M.1959. The Miyakawa
remote-control gremfree rearing unit. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 78: 37参照)。また、最初の滅菌のために、
大きなオートクレーブ内に設置されているものもある(G
ustafsson, B.E. 1959. Lightweight stainless steel
systems for rearing germ-free animals. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 78: 17参照) 。
【００１６】現在最も広く用いられているユニットはフ
レキシブルフィルムアイソレーターである (Trexler,
P. C.および L.I. Reynolds. 1957. Flexible film app
aratus for the rearing and use of germfree animal
s. Appl.Microbiol. 5: 406 参照) 。このアイソレータ
ーは、通常、伸縮自由の積層のビニルからなり、化学的
に滅菌されなけらばならず、容易に特定の要求に適応で
きる。別の種類はナイロンの大きなチューブからできて
いて、それぞれの末端が縛られており、オートクレーブ
内で滅菌できる。(Lev, M. 1962. An autoclavableplas
tic unit for rearing animals under germfree condit
ions. J. Appl. Bacteriol. 25: 30参照)。プレキシガ
ラスアイソレーターおよび使い捨てフレキシブルフィル
ムユニットも開発されている。これらの多くは十分軽い
のでラック上に２, ３個積み重ねることができ、フロア
スペースを節約する特徴がある。
レキシブルフィルムアイソレーターである (Trexler,
P. C.および L.I. Reynolds. 1957. Flexible film app
aratus for the rearing and use of germfree animal
s. Appl.Microbiol. 5: 406 参照) 。このアイソレータ
ーは、通常、伸縮自由の積層のビニルからなり、化学的
に滅菌されなけらばならず、容易に特定の要求に適応で
きる。別の種類はナイロンの大きなチューブからできて
いて、それぞれの末端が縛られており、オートクレーブ
内で滅菌できる。(Lev, M. 1962. An autoclavableplas
tic unit for rearing animals under germfree condit
ions. J. Appl. Bacteriol. 25: 30参照)。プレキシガ
ラスアイソレーターおよび使い捨てフレキシブルフィル
ムユニットも開発されている。これらの多くは十分軽い
のでラック上に２, ３個積み重ねることができ、フロア
スペースを節約する特徴がある。
【００１７】熱に弱いアイソレーターでは、一般に食物
および供給物を滅菌するための特別なシリンダーが用い
られる。このシリンダーは高圧オートクレーブ内で容易
に脱気できるよう、大きな濾過部分を有するよう設計さ
れるべきである(Trexler, P.C. 1963. An isolator sys
tem for control of contamination. Lab. Anim. Care.
13: 572 参照) 。あるいはまた、減圧によらずに脱気し
そして滅菌中に高圧化するために、シリンダーに大気中
に開口したドレインチューブを設けることもできる。
(Jaworski, N. E. およびC. E. Miller. 1963. Refinem
ent of the cylinder technique for supplyinggermfre
e isolators. Lab. Anim. Care. 13: 591参照)。
および供給物を滅菌するための特別なシリンダーが用い
られる。このシリンダーは高圧オートクレーブ内で容易
に脱気できるよう、大きな濾過部分を有するよう設計さ
れるべきである(Trexler, P.C. 1963. An isolator sys
tem for control of contamination. Lab. Anim. Care.
13: 572 参照) 。あるいはまた、減圧によらずに脱気し
そして滅菌中に高圧化するために、シリンダーに大気中
に開口したドレインチューブを設けることもできる。
(Jaworski, N. E. およびC. E. Miller. 1963. Refinem
ent of the cylinder technique for supplyinggermfre
e isolators. Lab. Anim. Care. 13: 591参照)。
【００１８】滅 菌 アイソレーター内で使用する設備、食物、下敷、水およ
び空気はすべて完全に無菌でなければならない。用いら
れる方法および条件は個々のアイテムの特性によって決
定される。加圧蒸気は最も良く知られた滅菌法である。
この方法は熱に安定な多孔質アイテムに特に適する。微
生物が潜んでいると考えられ得るあらゆる部分を蒸気に
直接接触させなければならない。蒸気に曝す時間は用い
られる温度に関係する。一度に滅菌する量のうちで最も
到達しにくい部分 (パッケージの中心部分) を121℃(25
0°Ｆ) で最低15分間蒸気に曝すことが推奨される。無
菌性を確保するために注意深く検査した後、より高い温
度およびより短い暴露時間を用いてもよい。標準的なパ
ッケージサイズおよび飼料、下敷、その他の材料の詰め
込み密度は、蒸気の浸透時間が一定で予測可能であるこ
とを保証するためには非常に重要である。
び空気はすべて完全に無菌でなければならない。用いら
れる方法および条件は個々のアイテムの特性によって決
定される。加圧蒸気は最も良く知られた滅菌法である。
この方法は熱に安定な多孔質アイテムに特に適する。微
生物が潜んでいると考えられ得るあらゆる部分を蒸気に
直接接触させなければならない。蒸気に曝す時間は用い
られる温度に関係する。一度に滅菌する量のうちで最も
到達しにくい部分 (パッケージの中心部分) を121℃(25
0°Ｆ) で最低15分間蒸気に曝すことが推奨される。無
菌性を確保するために注意深く検査した後、より高い温
度およびより短い暴露時間を用いてもよい。標準的なパ
ッケージサイズおよび飼料、下敷、その他の材料の詰め
込み密度は、蒸気の浸透時間が一定で予測可能であるこ
とを保証するためには非常に重要である。
【００１９】乾熱はアイソレーター用の空気供給の滅菌
に用いられている (Miyakawa, M. 1959. The Miyakawa
remote-control germfree rearing unit. Ann. N. Y. A
cad.Sci. 78: 37; Gustafsson, B. E. 1959. Lightweig
ht stainless steel systemsfor rearing germ-free an
imals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 78: 17参照)。過酢酸
(CH3 COOOH) は、熱に弱く、非多孔質の、特にフレキ
シブルフィルムユニットに広く用いられる。この酸は湿
潤剤 (界面活性剤) を用いて２％溶液として使用される
(Trexler, P. C.およびL. I. Reynolds. 1957. Flexib
le filmapparatus for the rearing and use of germfr
ee animals. Appl. Microbiol.5: 406参照) 。特別な状
況に対しては他の化学物質例えば、次亜塩素酸塩、ヨー
ドフォア、または第四級アンモニウム化学物を、子宮摘
出術により得られた新生仔を入れる液体トラップに用い
ることができ、またはHgCl2 を孵化前に卵を滅菌状態に
するために用いることができる。
に用いられている (Miyakawa, M. 1959. The Miyakawa
remote-control germfree rearing unit. Ann. N. Y. A
cad.Sci. 78: 37; Gustafsson, B. E. 1959. Lightweig
ht stainless steel systemsfor rearing germ-free an
imals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 78: 17参照)。過酢酸
(CH3 COOOH) は、熱に弱く、非多孔質の、特にフレキ
シブルフィルムユニットに広く用いられる。この酸は湿
潤剤 (界面活性剤) を用いて２％溶液として使用される
(Trexler, P. C.およびL. I. Reynolds. 1957. Flexib
le filmapparatus for the rearing and use of germfr
ee animals. Appl. Microbiol.5: 406参照) 。特別な状
況に対しては他の化学物質例えば、次亜塩素酸塩、ヨー
ドフォア、または第四級アンモニウム化学物を、子宮摘
出術により得られた新生仔を入れる液体トラップに用い
ることができ、またはHgCl2 を孵化前に卵を滅菌状態に
するために用いることができる。
【００２０】湿らすことのできない、熱に弱いアイテム
を滅菌するためには、エチレンオキシド(ETO) を用いる
ことができる。滅菌時間は温度、湿度、圧力、および E
TO濃度によって決まる。 ETOは下敷および飼料成分と化
学的に反応して有毒なまたは望ましくない化合物を生成
する可能性がある。 ETOは引火性で、中毒の危険がある
ため、滅菌に日常的に ETOを使用することは20パーセン
ト以下の ETOしか含有しない市販のガス混合物に制限す
べきである。
を滅菌するためには、エチレンオキシド(ETO) を用いる
ことができる。滅菌時間は温度、湿度、圧力、および E
TO濃度によって決まる。 ETOは下敷および飼料成分と化
学的に反応して有毒なまたは望ましくない化合物を生成
する可能性がある。 ETOは引火性で、中毒の危険がある
ため、滅菌に日常的に ETOを使用することは20パーセン
ト以下の ETOしか含有しない市販のガス混合物に制限す
べきである。
【００２１】空気供給物の滅菌にはファイバーガラスフ
ィルターが通常用いられる。このフィルターは完璧な濾
過装置として機能しなければならない。メンブランが直
径0.22マイクロメーター以上の粒子を排除するフィルタ
ーのように完璧なフィルターであるならば、熱に曝すこ
とを避けるために、液体のメンブラン濾過を用いること
ができる。
ィルターが通常用いられる。このフィルターは完璧な濾
過装置として機能しなければならない。メンブランが直
径0.22マイクロメーター以上の粒子を排除するフィルタ
ーのように完璧なフィルターであるならば、熱に曝すこ
とを避けるために、液体のメンブラン濾過を用いること
ができる。
【００２２】飼料または他の特別なアイテムの滅菌には
ガンマ線または電子ビーム源による照射を用いることが
できる。用いる線量は２５−６×106 ラドまでである。 内部環境 温度。内部のアイソレーター温度は室内環境の関数であ
り、22から26℃ (72から78°Ｆ) の間に維持すべきであ
る。
ガンマ線または電子ビーム源による照射を用いることが
できる。用いる線量は２５−６×106 ラドまでである。 内部環境 温度。内部のアイソレーター温度は室内環境の関数であ
り、22から26℃ (72から78°Ｆ) の間に維持すべきであ
る。
【００２３】湿度。アイソレーターは過剰な負荷、不適
切な換気、あるいはその両方の場合に、水分の凝縮を受
け易い。アイソレーターに入る空気は相対湿度50パーセ
ント以下そして好ましくは40パーセント以上であるべき
である。 空気供給。アイソレーターは時間当り12から20回の換気
を行い、３−５インチ(８−13cm) 水柱の正圧でなけれ
ばならない。空気は中央の給源から、あるいはそれぞれ
のユニット用の個々のブロワーから供給できる。中央換
気システムとしてはタービン型エアコンプレッサーが推
奨されるが、これはオイルピストン型ではオイルを空気
供給管路中に噴霧する傾向があるためである。
切な換気、あるいはその両方の場合に、水分の凝縮を受
け易い。アイソレーターに入る空気は相対湿度50パーセ
ント以下そして好ましくは40パーセント以上であるべき
である。 空気供給。アイソレーターは時間当り12から20回の換気
を行い、３−５インチ(８−13cm) 水柱の正圧でなけれ
ばならない。空気は中央の給源から、あるいはそれぞれ
のユニット用の個々のブロワーから供給できる。中央換
気システムとしてはタービン型エアコンプレッサーが推
奨されるが、これはオイルピストン型ではオイルを空気
供給管路中に噴霧する傾向があるためである。
【００２４】空気拡散アイソレーター (Trexler, P. C.
1968,Equipment design and management: Transport o
f germ-free animals and current developments in eq
uipment design, p.23-35, In M. E. Coates編The germ
free animal in research, Academic Press,London)
は、停電の場合にも換気中断には陥りにくい。しかしな
がら、この種類は時間当りの換気回数が比較的少ないと
いう欠点があり、万一障壁内に小さな破損部分ができた
場合に汚染を防ぐのに役立つ保護のための正圧に欠け
る。
1968,Equipment design and management: Transport o
f germ-free animals and current developments in eq
uipment design, p.23-35, In M. E. Coates編The germ
free animal in research, Academic Press,London)
は、停電の場合にも換気中断には陥りにくい。しかしな
がら、この種類は時間当りの換気回数が比較的少ないと
いう欠点があり、万一障壁内に小さな破損部分ができた
場合に汚染を防ぐのに役立つ保護のための正圧に欠け
る。
【００２５】緊急時安全装置。停電や機械的な故障が生
じたときにアイソレーター内の空気圧を維持するための
適切な設備が空気供給の遮断から２, ３分以内に供給さ
れなければならない。非固定フィルムアイソレーターの
崩壊は、結局動物の窒息に帰着するが、より緊急の危険
は動物がフィルムや手袋に到達しこれを損なう恐れがあ
ることである。ゴムストッパーを用いて空気の導管を塞
ぐことによってこれを一時的に防ぐことができる。個々
のアイソレーターの空気供給の作動に必要なのは、唯
一、緊急時の電力供給である。中央換気システムは、非
常用空気供給のために、第二のタービンコンプレッサー
を有すべきである。
じたときにアイソレーター内の空気圧を維持するための
適切な設備が空気供給の遮断から２, ３分以内に供給さ
れなければならない。非固定フィルムアイソレーターの
崩壊は、結局動物の窒息に帰着するが、より緊急の危険
は動物がフィルムや手袋に到達しこれを損なう恐れがあ
ることである。ゴムストッパーを用いて空気の導管を塞
ぐことによってこれを一時的に防ぐことができる。個々
のアイソレーターの空気供給の作動に必要なのは、唯
一、緊急時の電力供給である。中央換気システムは、非
常用空気供給のために、第二のタービンコンプレッサー
を有すべきである。
【００２６】温度および圧力の測定記録を取ることが推
奨される。電力不足や機械的な故障が生じた場合にライ
ン圧力の低下によって作動するオーディオビジュアル警
報システムを中央換気システムに組み込むべきである。
同様の警報システムが空気供給の温度の望ましからざる
変動を知らせるべきである。個々のアイソレーターの換
気システムについては、室内環境について継続的に記録
して監視することが推奨される。 ケージングおよび内部備品 備品。アイソレーター用の基本的な備品リストには、し
っかりした蓋のついたケージ、水容器および給餌器、ゴ
ム手袋のための布製保護手袋、エキストラドアガスケッ
トまたはキャップをしめるリング、先端にゴムのついた
長いピンセット、止血鉗子、はさみ、タオル、ガーゼス
ポンジ、道具類を入れるための２クオート缶、蓋付き４
クオート食餌缶、スプーン、培養試験管、紙袋、および
汚れた下敷用の耐水バッグが包含される。
奨される。電力不足や機械的な故障が生じた場合にライ
ン圧力の低下によって作動するオーディオビジュアル警
報システムを中央換気システムに組み込むべきである。
同様の警報システムが空気供給の温度の望ましからざる
変動を知らせるべきである。個々のアイソレーターの換
気システムについては、室内環境について継続的に記録
して監視することが推奨される。 ケージングおよび内部備品 備品。アイソレーター用の基本的な備品リストには、し
っかりした蓋のついたケージ、水容器および給餌器、ゴ
ム手袋のための布製保護手袋、エキストラドアガスケッ
トまたはキャップをしめるリング、先端にゴムのついた
長いピンセット、止血鉗子、はさみ、タオル、ガーゼス
ポンジ、道具類を入れるための２クオート缶、蓋付き４
クオート食餌缶、スプーン、培養試験管、紙袋、および
汚れた下敷用の耐水バッグが包含される。
【００２７】ケージは、滑らかな耐腐食性の材質で作る
べきである。ケージは液体を通さず、滅菌が容易でなけ
ればならない。許容できると考えられる材質にはプラス
チック、ステンレス鋼、およびガラスが包含される。亜
鉛メッキは徐々に腐食し、微量金属の混入が実験結果に
影響を与える可能性があるため望ましくない。ケージの
大きさは通常、入口部分の大きさで制限される。雌マウ
スおよび仔のための最低の面積は、50平方インチ (970c
m2) である。多くの状況では、動物当りもっと広いスペ
ースが必要であろう。
べきである。ケージは液体を通さず、滅菌が容易でなけ
ればならない。許容できると考えられる材質にはプラス
チック、ステンレス鋼、およびガラスが包含される。亜
鉛メッキは徐々に腐食し、微量金属の混入が実験結果に
影響を与える可能性があるため望ましくない。ケージの
大きさは通常、入口部分の大きさで制限される。雌マウ
スおよび仔のための最低の面積は、50平方インチ (970c
m2) である。多くの状況では、動物当りもっと広いスペ
ースが必要であろう。
【００２８】第１表は重量分類によるマウスおよびラッ
トの一匹当りの推奨される床面積を示す。 第１表 ケージに収容されたマウスおよびラット について推奨される動物当りの床面積 区分 体 重 動物当りの ケージ当りの 番号 (g) 面積in.2(cm2) 最大個体数 マウス 1 10まで 6 ( 40) 40 2 10─15 8 ( 50) 30 3 15─25 12 ( 75) 20 4 over 25 15 ( 95) 16ラット 1 50まで 15 ( 95) 50 2 50− 100 17 (110) 50 3 100− 150 19 (125) 40 4 150− 200 23 (150) 40 5 200− 300 29 (185) 30 6 over 300 40 (260) 25 その他の注意点 バリアーシステムの完全性を確保するために、微少な漏
れに関するフレオンテストが勧められる。
トの一匹当りの推奨される床面積を示す。 第１表 ケージに収容されたマウスおよびラット について推奨される動物当りの床面積 区分 体 重 動物当りの ケージ当りの 番号 (g) 面積in.2(cm2) 最大個体数 マウス 1 10まで 6 ( 40) 40 2 10─15 8 ( 50) 30 3 15─25 12 ( 75) 20 4 over 25 15 ( 95) 16ラット 1 50まで 15 ( 95) 50 2 50− 100 17 (110) 50 3 100− 150 19 (125) 40 4 150− 200 23 (150) 40 5 200− 300 29 (185) 30 6 over 300 40 (260) 25 その他の注意点 バリアーシステムの完全性を確保するために、微少な漏
れに関するフレオンテストが勧められる。
【００２９】各ユニットを組み立てて滅菌したときか
ら、そのユニットに関するすべての操作の時間を追った
記録を継続するために、各ユニットはそれ自身の運転記
録に備えるべきである。かかる記録はアイソレーター番
号で区別される金属の病院−チャートホルダーに保管す
ると便利である。この記録は例えば手袋の交換といった
日常的な保守に関する記録も含むべきである。飼育記録
も同じチャートホルダーに保管することができる。
ら、そのユニットに関するすべての操作の時間を追った
記録を継続するために、各ユニットはそれ自身の運転記
録に備えるべきである。かかる記録はアイソレーター番
号で区別される金属の病院−チャートホルダーに保管す
ると便利である。この記録は例えば手袋の交換といった
日常的な保守に関する記録も含むべきである。飼育記録
も同じチャートホルダーに保管することができる。
【００３０】アイソレーター内部で使用できるスペース
が限られているため、飼料および下敷用に、そして無菌
通路でつながっているアイソレーター間の動物の移動の
ために、紙製で折りたたみ式のコンテナーが望ましい。
静電スパークが生じた場合は爆発するかもしれないので
アイソレーター内ではエーテルを使用すべきでない。揮
発性で不燃性の麻酔剤としてフルオタン (ブロモクロロ
トリフルオロエタン) が推奨される。 飼料、下敷および水 一般的な注意点 商品として製造された飼料に関する完全な配合が、防腐
剤、抗酸化剤、および他の添加物を含めたすべての成分
およびその濃度を列挙して提供されるべきである。製造
日が明示されるべきである。製造者は飼料が以下の通り
であることを保証すべきである： １. 天然に存在するホルモン活性が正常な許容限度内で
ある。
が限られているため、飼料および下敷用に、そして無菌
通路でつながっているアイソレーター間の動物の移動の
ために、紙製で折りたたみ式のコンテナーが望ましい。
静電スパークが生じた場合は爆発するかもしれないので
アイソレーター内ではエーテルを使用すべきでない。揮
発性で不燃性の麻酔剤としてフルオタン (ブロモクロロ
トリフルオロエタン) が推奨される。 飼料、下敷および水 一般的な注意点 商品として製造された飼料に関する完全な配合が、防腐
剤、抗酸化剤、および他の添加物を含めたすべての成分
およびその濃度を列挙して提供されるべきである。製造
日が明示されるべきである。製造者は飼料が以下の通り
であることを保証すべきである： １. 天然に存在するホルモン活性が正常な許容限度内で
ある。
【００３１】２. 薬物、ホルモン、抗生物質、または異
常な生理的状況をつくり出す可能性があるかあるいは研
究操作を妨げる可能性のある他のあらゆる物質を含有す
る添加物を含まない。 ３. 統計学的に選択されたサンプルに基づいてサルモネ
ラ菌を含まない。 ４. 齧歯類および害獣の汚染がない。
常な生理的状況をつくり出す可能性があるかあるいは研
究操作を妨げる可能性のある他のあらゆる物質を含有す
る添加物を含まない。 ３. 統計学的に選択されたサンプルに基づいてサルモネ
ラ菌を含まない。 ４. 齧歯類および害獣の汚染がない。
【００３２】５. 病原体を含む可能性のある脂肪融出し
ていない肉片や魚肉をまったく含まない。 飼料の栄養強化 無菌動物の飼料は加熱滅菌によるビタミンの損失 (特にビタミンＢ群の一部とビタミンＡおよびＤ) およ
びタンパク質の栄養価の低下 (利用可能なリジン、メチ
オニン、アルギニン、およびトリプトファンの減少) を
補うために、正常な要求量以上にある種の栄養分を含有
しなければならない。また、無菌動物飼料は、 通常の
動物では胃腸管内での微生物合成によって利用可能であ
る要求栄養素も提供しなければならない (Reddy, B.
S., B. S. Wostmann, および J. R.Pleasants. 1968 Nu
tritionally adequate diets for germ-free animals,
p.87-111, M. E. Coates編、The germ-free animal in
research. Academic Press, London参照) 。かかる飼
料の例が L-485であり、これは大規模に検査され (Xell
ogg, T. F.および B. S.Wostmann. 1969, Rat and mous
e stock diet L-485. Lab. Anim. Care.参照) 、商業的
に生産できる安価な飼料である (第２表参照) 。タンパ
ク質の質の低下を補うための手段として、全タンパク質
含量を増加させるよりむしろ特定のアミノ酸を補うこと
を考慮すべきである。飼料の全タンパク質含量を増加さ
せると水の消費および排泄が増加し、湿った状況を引き
起こし、それによって一定の大きさのアイソレーター内
に収容できる動物数が制限される。 第２表 ラットおよびマウス用飼料L-485の比較 成 分 kg当りの量 飼 料 黄トウモロコシ粉（トウモロコシ） 590 g 大豆油かす (粗タンパク質50％) 300 アルファルファ粉末 (脱水；17％タンパク質) 35 コーン油 (１回精製) 30 NaCl 10 CaHPO4 2H2O 10 CaCO3 5 リジン (飼料等級) 5 メチオニン (飼料等級) 5 B. H. T.（ブチル化ヒドロキシトルエン） 0.125 微量ミネラル混合物 0.25 ビタミン混合物 Ａ 26,000 IU Ｄ3 1,000 IU Ｅ (ａトコフェロール アセテート） 225 mg Ｋ3 （メナジオン） 90 リボフラビン 30 パントテン酸 285 ナイアシン 65 塩化コリン 2,000 Ｂ12 (マンニトール中 0.1％粉末） 2 チアミン HCl 65 ピリドキシン HCl 20 葉 酸 10 パラアミノ安息香酸 50 微量ミネラル混合物 (市販) MN 酸化第一マンガンとして 65 mg Fe 炭酸第一鉄として 20 Cu 銅酸化物類として 2 Zn 酸化亜鉛として 15 Ｉ ヨウ素酸カルシウムとして 1.5 Co 炭酸コバルトとして 0.6 蒸気滅菌 (Reddy, B. S., B. S. Wostmann,および J.
R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets fo
r germ-free animals, p.87-111 In M. E. Coates[編].
the germ-free animal in research. Academic Press,
London 参照) 実際の方法は利用できる設備によって異なる。三つの要
因が一般に重要である： １. 可能な限りいつでも最低20センチHgの滅菌前減圧を
行うことによって、外気に開口したクレーブまたはシリ
ンダー内の飼料の蒸気浸透が容易になる。用いるシリン
ダーが外気に開口されていない場合には28インチHgまた
はそれ以上の減圧が望ましい。
ていない肉片や魚肉をまったく含まない。 飼料の栄養強化 無菌動物の飼料は加熱滅菌によるビタミンの損失 (特にビタミンＢ群の一部とビタミンＡおよびＤ) およ
びタンパク質の栄養価の低下 (利用可能なリジン、メチ
オニン、アルギニン、およびトリプトファンの減少) を
補うために、正常な要求量以上にある種の栄養分を含有
しなければならない。また、無菌動物飼料は、 通常の
動物では胃腸管内での微生物合成によって利用可能であ
る要求栄養素も提供しなければならない (Reddy, B.
S., B. S. Wostmann, および J. R.Pleasants. 1968 Nu
tritionally adequate diets for germ-free animals,
p.87-111, M. E. Coates編、The germ-free animal in
research. Academic Press, London参照) 。かかる飼
料の例が L-485であり、これは大規模に検査され (Xell
ogg, T. F.および B. S.Wostmann. 1969, Rat and mous
e stock diet L-485. Lab. Anim. Care.参照) 、商業的
に生産できる安価な飼料である (第２表参照) 。タンパ
ク質の質の低下を補うための手段として、全タンパク質
含量を増加させるよりむしろ特定のアミノ酸を補うこと
を考慮すべきである。飼料の全タンパク質含量を増加さ
せると水の消費および排泄が増加し、湿った状況を引き
起こし、それによって一定の大きさのアイソレーター内
に収容できる動物数が制限される。 第２表 ラットおよびマウス用飼料L-485の比較 成 分 kg当りの量 飼 料 黄トウモロコシ粉（トウモロコシ） 590 g 大豆油かす (粗タンパク質50％) 300 アルファルファ粉末 (脱水；17％タンパク質) 35 コーン油 (１回精製) 30 NaCl 10 CaHPO4 2H2O 10 CaCO3 5 リジン (飼料等級) 5 メチオニン (飼料等級) 5 B. H. T.（ブチル化ヒドロキシトルエン） 0.125 微量ミネラル混合物 0.25 ビタミン混合物 Ａ 26,000 IU Ｄ3 1,000 IU Ｅ (ａトコフェロール アセテート） 225 mg Ｋ3 （メナジオン） 90 リボフラビン 30 パントテン酸 285 ナイアシン 65 塩化コリン 2,000 Ｂ12 (マンニトール中 0.1％粉末） 2 チアミン HCl 65 ピリドキシン HCl 20 葉 酸 10 パラアミノ安息香酸 50 微量ミネラル混合物 (市販) MN 酸化第一マンガンとして 65 mg Fe 炭酸第一鉄として 20 Cu 銅酸化物類として 2 Zn 酸化亜鉛として 15 Ｉ ヨウ素酸カルシウムとして 1.5 Co 炭酸コバルトとして 0.6 蒸気滅菌 (Reddy, B. S., B. S. Wostmann,および J.
R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets fo
r germ-free animals, p.87-111 In M. E. Coates[編].
the germ-free animal in research. Academic Press,
London 参照) 実際の方法は利用できる設備によって異なる。三つの要
因が一般に重要である： １. 可能な限りいつでも最低20センチHgの滅菌前減圧を
行うことによって、外気に開口したクレーブまたはシリ
ンダー内の飼料の蒸気浸透が容易になる。用いるシリン
ダーが外気に開口されていない場合には28インチHgまた
はそれ以上の減圧が望ましい。
【００３３】２. 完全な無菌度を保証する最短の滅菌フ
ェーズを使用する。設備および技術に応じて安全のため
の余裕を加える。飼料の中心部で測定した温度が最低 1
21℃(250°Ｆ) に達しなければならない。その温度での
実際の滅菌フェーズは最低15分持続しなければならな
い。もっと高い滅菌温度では、滅菌時間は相対的に短く
なる。
ェーズを使用する。設備および技術に応じて安全のため
の余裕を加える。飼料の中心部で測定した温度が最低 1
21℃(250°Ｆ) に達しなければならない。その温度での
実際の滅菌フェーズは最低15分持続しなければならな
い。もっと高い滅菌温度では、滅菌時間は相対的に短く
なる。
【００３４】３. 滅菌後の減圧は飼料温度の低下を速め
るであろう。これは、栄養素の不必要な熱破壊を防ぐで
あろう。しかしながら、装置の設計および性能は、この
操作段階を行う間の漏れを防ぐのに適していなければな
らない。飼料の蒸気滅菌に於いては、目標は不完全な滅
菌、および過度に長く加熱することによる不必要な栄養
の損失の双方を避けることである。ある程度の栄養素の
損失は避けられないが、以下をたくみに操作することに
よってかなり満足できる結果を得ることができる： ａ 温度、時間、滅菌前および滅菌後減圧、およびペレ
ットの大きさのような技術的手順。
るであろう。これは、栄養素の不必要な熱破壊を防ぐで
あろう。しかしながら、装置の設計および性能は、この
操作段階を行う間の漏れを防ぐのに適していなければな
らない。飼料の蒸気滅菌に於いては、目標は不完全な滅
菌、および過度に長く加熱することによる不必要な栄養
の損失の双方を避けることである。ある程度の栄養素の
損失は避けられないが、以下をたくみに操作することに
よってかなり満足できる結果を得ることができる： ａ 温度、時間、滅菌前および滅菌後減圧、およびペレ
ットの大きさのような技術的手順。
【００３５】ｂ 飼料中の水分含量。水分含量が増加す
ると滅菌後のビタミンＢの回収が改善される (Zimmerma
n, D. R.,および B.S. Wostmann. 1963. Vitamin stabi
lityin diets sterilized for germfree animals. J. N
utr.79: 318)。固形飼料については、25％までの水分含
量、あるいは飼料の貯蔵品質と両立すると判明する限り
高い水分含量が望ましい。飼料の水分含量を変化させた
後は、その飼料が滅菌温度に到達する速度をあらためて
検査すべきである。 照射滅菌 (Reddy, B. S., B. S. Wostmann および J.
R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets fo
r germ-free animals, p.87-111 M. E. Coates編、The
germ-free animal in research. Academic Press, Lon
don; Ley, F. J., J. Bleby, M. E. Coates, およびJ.
S. Paterson. 1969 Sterilization of labo-ratory ani
mal diets using gamma radiation. Lab. Anim. 3: 221
参照) 技法および線量は照射の設備および種類によって異な
る。一般に、照射滅菌は結果的に栄養素の破壊がより少
ないと考えられるが、現時点では飼料は蒸気で滅菌する
のが望ましい。無菌度に関する検査。
ると滅菌後のビタミンＢの回収が改善される (Zimmerma
n, D. R.,および B.S. Wostmann. 1963. Vitamin stabi
lityin diets sterilized for germfree animals. J. N
utr.79: 318)。固形飼料については、25％までの水分含
量、あるいは飼料の貯蔵品質と両立すると判明する限り
高い水分含量が望ましい。飼料の水分含量を変化させた
後は、その飼料が滅菌温度に到達する速度をあらためて
検査すべきである。 照射滅菌 (Reddy, B. S., B. S. Wostmann および J.
R. Pleasants. 1968 Nutritionally adequate diets fo
r germ-free animals, p.87-111 M. E. Coates編、The
germ-free animal in research. Academic Press, Lon
don; Ley, F. J., J. Bleby, M. E. Coates, およびJ.
S. Paterson. 1969 Sterilization of labo-ratory ani
mal diets using gamma radiation. Lab. Anim. 3: 221
参照) 技法および線量は照射の設備および種類によって異な
る。一般に、照射滅菌は結果的に栄養素の破壊がより少
ないと考えられるが、現時点では飼料は蒸気で滅菌する
のが望ましい。無菌度に関する検査。
【００３６】任意の特定の滅菌方法で達成された無菌度
を監視するためには、バチルス・ステアロサーモフィル
ス菌(Bacillus stearothermophilus) 胞子片の使用が推
奨される。この胞子片を飼料の中心部に埋め込む必要が
ある。また、アイソレーターおよびその中の動物も定期
的に微生物学的に監視すべきである。かかる監視は、ア
イソレーターのバリアーの破れに起因するかあるいはア
イソレーターまたはその内容物の不適切な滅菌に起因す
る、偶発的な汚染を検出するのに必要である。これは、
Wostmann, B.S.編、Gnotobiotes: Standards and Guid
elines for theBreeding, Care and Mana- gement of L
aboratory Animals, National Research Council, Nati
onal Academy of Sciences, Washington,D. C., 1970,
pp.28-39 の記載にしたがって行うことができる。 滅菌中の栄養価損失の測定 重要な栄養素の損失に関する有用な検査法としては、飼
料添加チアミンの回収の指標として酸で抽出可能なチア
ミンの定量が勧められる (Wostmann, B.S.およびP. L.
Knight. 1960. The effect of methyl alcohol on the
conversion ofthiamine to thiochrome. Experientia 1
6: 500 参照) 。25％以下の回収率は、飼料の全体的な
栄養の質がかなり害われていることを示す。適当な設備
および注意によって、50％またはそれ以上の回収率を達
成しなければならない。 固形飼料の貯蔵 無菌実験は一般にコストが高いため、栄養価の有意に低
下した飼料を決して使用しないよう特別の注意を払うべ
きである。ａ滅菌していない飼料は常に冷蔵で保存し、
決して一ヶ月より長くならないこと、およびｂ滅菌済み
飼料のアイソレーター内部での貯蔵期間は一週間または
それ以下とし、決して10日を越えてはならないこと、が
望ましい。 下 敷 下敷は最低週に一回交換すべきである。下敷の材質は滅
菌が容易で、動物によって容易には食べられないことが
望ましい。滅菌操作の結果として有毒化合物を生じては
ならない。ほこりの立たないストローブマツの破片 (の
こぎりくず) およびかんなくずが望ましい。シナノキお
よびポプラのかんなくず、またはつぶしたトウモロコシ
の穂軸は許容できる。珪藻土製品、スギ、樹脂を含む木
材、および堅木は望ましくない。酸化エチレン滅菌は、
有害な化合物が形成される可能性についての疑問が解明
されるまでは用いられるべきでない。 水 飲料水は滅菌されなければならない。角型パック容器、
メイソンジャー、またはユニットに接続したタンク内で
オートクレーブすることができる。各容器の内部に小量
の空気スペースを残す必要がある。 ノトバイオートの帝王切開出産の原理 あらゆる帝王切開の成功の鍵は、一部は妊娠を満期まで
進行させることである。このことは妊娠期間の短い動物
に特に当てはまり、このような動物では胎仔は分娩前の
最後の24時間にその体重の20％を獲得することができ
る。時宣的な交配はほどほどに成功するが、比較的大き
な仔を産む動物 (ラットおよびマウス) では、手術を行
う前に、雌が最初の仔を分娩するのを待つことが有用で
あろう。モルモットでは、最も満足できる方法は、恥骨
の広がりを測定することによって手術する雌を選択する
ことである (Philips, B. P., P.A. Wolfe, および H.
A. Gordon. 1959. Studies on rearing the guinea pig
germfree. Ann. N. Y. Acad.Sci. 78: 183参照)。
を監視するためには、バチルス・ステアロサーモフィル
ス菌(Bacillus stearothermophilus) 胞子片の使用が推
奨される。この胞子片を飼料の中心部に埋め込む必要が
ある。また、アイソレーターおよびその中の動物も定期
的に微生物学的に監視すべきである。かかる監視は、ア
イソレーターのバリアーの破れに起因するかあるいはア
イソレーターまたはその内容物の不適切な滅菌に起因す
る、偶発的な汚染を検出するのに必要である。これは、
Wostmann, B.S.編、Gnotobiotes: Standards and Guid
elines for theBreeding, Care and Mana- gement of L
aboratory Animals, National Research Council, Nati
onal Academy of Sciences, Washington,D. C., 1970,
pp.28-39 の記載にしたがって行うことができる。 滅菌中の栄養価損失の測定 重要な栄養素の損失に関する有用な検査法としては、飼
料添加チアミンの回収の指標として酸で抽出可能なチア
ミンの定量が勧められる (Wostmann, B.S.およびP. L.
Knight. 1960. The effect of methyl alcohol on the
conversion ofthiamine to thiochrome. Experientia 1
6: 500 参照) 。25％以下の回収率は、飼料の全体的な
栄養の質がかなり害われていることを示す。適当な設備
および注意によって、50％またはそれ以上の回収率を達
成しなければならない。 固形飼料の貯蔵 無菌実験は一般にコストが高いため、栄養価の有意に低
下した飼料を決して使用しないよう特別の注意を払うべ
きである。ａ滅菌していない飼料は常に冷蔵で保存し、
決して一ヶ月より長くならないこと、およびｂ滅菌済み
飼料のアイソレーター内部での貯蔵期間は一週間または
それ以下とし、決して10日を越えてはならないこと、が
望ましい。 下 敷 下敷は最低週に一回交換すべきである。下敷の材質は滅
菌が容易で、動物によって容易には食べられないことが
望ましい。滅菌操作の結果として有毒化合物を生じては
ならない。ほこりの立たないストローブマツの破片 (の
こぎりくず) およびかんなくずが望ましい。シナノキお
よびポプラのかんなくず、またはつぶしたトウモロコシ
の穂軸は許容できる。珪藻土製品、スギ、樹脂を含む木
材、および堅木は望ましくない。酸化エチレン滅菌は、
有害な化合物が形成される可能性についての疑問が解明
されるまでは用いられるべきでない。 水 飲料水は滅菌されなければならない。角型パック容器、
メイソンジャー、またはユニットに接続したタンク内で
オートクレーブすることができる。各容器の内部に小量
の空気スペースを残す必要がある。 ノトバイオートの帝王切開出産の原理 あらゆる帝王切開の成功の鍵は、一部は妊娠を満期まで
進行させることである。このことは妊娠期間の短い動物
に特に当てはまり、このような動物では胎仔は分娩前の
最後の24時間にその体重の20％を獲得することができ
る。時宣的な交配はほどほどに成功するが、比較的大き
な仔を産む動物 (ラットおよびマウス) では、手術を行
う前に、雌が最初の仔を分娩するのを待つことが有用で
あろう。モルモットでは、最も満足できる方法は、恥骨
の広がりを測定することによって手術する雌を選択する
ことである (Philips, B. P., P.A. Wolfe, および H.
A. Gordon. 1959. Studies on rearing the guinea pig
germfree. Ann. N. Y. Acad.Sci. 78: 183参照)。
【００３７】帝王切開で引き出された仔が最初の呼吸を
する前に、仔は無菌的な環境中に生み出されなくてはな
らない。仔は、母体から直接、子宮切開によって切開し
た無菌バリアーである膜を通って無菌のアイソレーター
の中へ、または子宮摘出によって殺菌トラップを通って
無菌のアイソレーターの中へ、取り出される。帝王切開
手術前の雌の通常の手術準備には腹部の毛の除去および
手術部位の清拭および消毒が包含される。腹部正中線局
所麻酔または全身麻酔も危険なレベルの胎児機能低下や
胎児死亡を招くことなく用いることができるが、ラット
およびマウスでは頸椎の脱臼によって麻酔を行うのが望
ましい。モルモットでは、手術は一般に予め鎮静後に局
所麻酔のもとで行われる。
する前に、仔は無菌的な環境中に生み出されなくてはな
らない。仔は、母体から直接、子宮切開によって切開し
た無菌バリアーである膜を通って無菌のアイソレーター
の中へ、または子宮摘出によって殺菌トラップを通って
無菌のアイソレーターの中へ、取り出される。帝王切開
手術前の雌の通常の手術準備には腹部の毛の除去および
手術部位の清拭および消毒が包含される。腹部正中線局
所麻酔または全身麻酔も危険なレベルの胎児機能低下や
胎児死亡を招くことなく用いることができるが、ラット
およびマウスでは頸椎の脱臼によって麻酔を行うのが望
ましい。モルモットでは、手術は一般に予め鎮静後に局
所麻酔のもとで行われる。
【００３８】子宮切開によってバリアー膜を通って仔を
出産するためには特別のアイソレーター設備が必要であ
る。レニアーズ ステンレス製外科用ユニット (Reynie
rs,J. A. 1965. Germfree life methodology (gnotobio
-tics) and experimental nutrition. p.458-466, Pro
c.3rd Internat. Congr. Biochem., Bruxelles参照)に
は、ユニットの上下のコンパートメントを分ける組み込
み型の水平金属仕切りがある。この仕切りには上部コン
パートメントの完全な形を維持するためにマイラープラ
スチックフィルムでおおわれた円形の入口がある。手術
の準備をした雌を下部コンパートメントに置き、腹部を
マイラーに押しつける。すべての手術道具は上部コンパ
ートメントにあり、この無菌領域で手術を行う。電気メ
スまたは小刀を用いて、プラスチックおよび皮膚を通し
て切開を行う。それ自身により滅菌する電気メスの刃が
皮膚切開には好ましい。皮膚およびマイラーの端を一緒
にしっかりととめ、反転させる。皮膚の切断端を覆うた
めに腹部に滅菌した掛け布を掛けそして腹腔を開く前に
あらわになった筋膜に暖かい消毒液 (ベンザルコニウム
クロライド 1：1,000)をかける。腸を切らぬよう細心の
注意を払うべきである。一対の鉗子または止血鉗子を腹
膜壁と内臓の間に挿入することが有用であろう。次に、
子宮を開き仔を取り出す。胎膜を除去し、臍帯を縛って
切断する。仔をそっと乾かし、呼吸を刺激するためにマ
ッサージする。その後仔は飼育ユニットに移され、養い
親の世話を受け、または手で給餌される。別のマイラー
シートを手術用開口部上にしっかりととめ、以上の手順
を５、６匹ほどの雌について、汚染の重大を危険もなく
繰り返すことができる。また、手術用ユニットとしてプ
ラスチックアイソレーターまたはグローブバッグを用い
て、帝王切開出産を行うこともできる。アイソレーター
の床の外側表面を予め滅菌し、動物の腹部と接触させ、
このようにして上記のマイラーシートと同じ目的を果た
す。手術後、プラスチックバリアーのスリットは滅菌テ
ープで閉じることができ、そして別の妊娠している雌に
ついて、手術手順を繰り返すことができる。
出産するためには特別のアイソレーター設備が必要であ
る。レニアーズ ステンレス製外科用ユニット (Reynie
rs,J. A. 1965. Germfree life methodology (gnotobio
-tics) and experimental nutrition. p.458-466, Pro
c.3rd Internat. Congr. Biochem., Bruxelles参照)に
は、ユニットの上下のコンパートメントを分ける組み込
み型の水平金属仕切りがある。この仕切りには上部コン
パートメントの完全な形を維持するためにマイラープラ
スチックフィルムでおおわれた円形の入口がある。手術
の準備をした雌を下部コンパートメントに置き、腹部を
マイラーに押しつける。すべての手術道具は上部コンパ
ートメントにあり、この無菌領域で手術を行う。電気メ
スまたは小刀を用いて、プラスチックおよび皮膚を通し
て切開を行う。それ自身により滅菌する電気メスの刃が
皮膚切開には好ましい。皮膚およびマイラーの端を一緒
にしっかりととめ、反転させる。皮膚の切断端を覆うた
めに腹部に滅菌した掛け布を掛けそして腹腔を開く前に
あらわになった筋膜に暖かい消毒液 (ベンザルコニウム
クロライド 1：1,000)をかける。腸を切らぬよう細心の
注意を払うべきである。一対の鉗子または止血鉗子を腹
膜壁と内臓の間に挿入することが有用であろう。次に、
子宮を開き仔を取り出す。胎膜を除去し、臍帯を縛って
切断する。仔をそっと乾かし、呼吸を刺激するためにマ
ッサージする。その後仔は飼育ユニットに移され、養い
親の世話を受け、または手で給餌される。別のマイラー
シートを手術用開口部上にしっかりととめ、以上の手順
を５、６匹ほどの雌について、汚染の重大を危険もなく
繰り返すことができる。また、手術用ユニットとしてプ
ラスチックアイソレーターまたはグローブバッグを用い
て、帝王切開出産を行うこともできる。アイソレーター
の床の外側表面を予め滅菌し、動物の腹部と接触させ、
このようにして上記のマイラーシートと同じ目的を果た
す。手術後、プラスチックバリアーのスリットは滅菌テ
ープで閉じることができ、そして別の妊娠している雌に
ついて、手術手順を繰り返すことができる。
【００３９】プラスチックアイソレーターを用いる場合
には子宮切開による仔の出産がより一般的である (Fost
er, H.1959. A. procedure for obtaining nucleus sto
ck for a pathogen-free animal colony. Lab. Anim.Ca
re 9: 135 参照) 。子宮を無菌的に露出させ、子宮頸の
すぐ前方で縛る。切り取った子宮を液体の殺菌トラップ
を通して無菌ユニット内に移す。一たんアイソレーター
内に入ると、羊水を吸い込むのを防ぐためにできる限り
速やかに仔を取り出す。臍帯を縛り切断する前に通常仔
を拭い、よく呼吸させる。次に仔を養い親に与えまたは
ヒトが飼育する。
には子宮切開による仔の出産がより一般的である (Fost
er, H.1959. A. procedure for obtaining nucleus sto
ck for a pathogen-free animal colony. Lab. Anim.Ca
re 9: 135 参照) 。子宮を無菌的に露出させ、子宮頸の
すぐ前方で縛る。切り取った子宮を液体の殺菌トラップ
を通して無菌ユニット内に移す。一たんアイソレーター
内に入ると、羊水を吸い込むのを防ぐためにできる限り
速やかに仔を取り出す。臍帯を縛り切断する前に通常仔
を拭い、よく呼吸させる。次に仔を養い親に与えまたは
ヒトが飼育する。
【００４０】マウス、ラットおよびブタでは子宮切開が
用いられ成功する。しかしながら、モルモットでは、も
し母親の血液供給遮断とアイソレーター内での出産の間
に２分も経過すると高度の胎児死亡が起こるため、子宮
切開が好ましい。 ノトバイオート集団の繁殖システム 近交系 従来の繁殖集団で用いられた通常の兄弟姉妹間交配系
を、ノトバイオート集団でも用いることができる。 非近交系 まったくランダムな繁殖には、兄弟姉妹の交配および従
兄弟のある程度の交配が包含される。非近親勾配繁殖集
団では通常かかる交配を避けるが、結果として得られる
交配システムは、可能な限り最大限までは近親交配の割
合を低下させるものではない。近親交配が最低であるよ
うな任意のシステムを利用できる(Falconer, D.C. 196
7. Genetic aspects of breeding methods. p.72-96 In
The UFAQhandbook on the care and management of la
boratory animals, 第３版、E.および S Livingstone,
LTd., London; National Research Council, Institute
for Laboratory Animal Resources. 1969. A guide to
genetic standards for laboratory animals. Nationa
l Academy of Sciences, Washington, D. C.参照)。
用いられ成功する。しかしながら、モルモットでは、も
し母親の血液供給遮断とアイソレーター内での出産の間
に２分も経過すると高度の胎児死亡が起こるため、子宮
切開が好ましい。 ノトバイオート集団の繁殖システム 近交系 従来の繁殖集団で用いられた通常の兄弟姉妹間交配系
を、ノトバイオート集団でも用いることができる。 非近交系 まったくランダムな繁殖には、兄弟姉妹の交配および従
兄弟のある程度の交配が包含される。非近親勾配繁殖集
団では通常かかる交配を避けるが、結果として得られる
交配システムは、可能な限り最大限までは近親交配の割
合を低下させるものではない。近親交配が最低であるよ
うな任意のシステムを利用できる(Falconer, D.C. 196
7. Genetic aspects of breeding methods. p.72-96 In
The UFAQhandbook on the care and management of la
boratory animals, 第３版、E.および S Livingstone,
LTd., London; National Research Council, Institute
for Laboratory Animal Resources. 1969. A guide to
genetic standards for laboratory animals. Nationa
l Academy of Sciences, Washington, D. C.参照)。
【００４１】比較可能な従来型集団およびノトバイオー
ト集団。もし比較目的で従来型集団とノトバイオート集
団の両方を維持することが望ましい場合は、従来型集団
の有効な繁殖集団からノトバイオート集団へ帝王切開で
生まれた仔を導くことによって、これらの２集団は同様
の遺伝的素質を維持することができる。これが、非ノト
バイオートラットおよびマウスの生産に最も重点を置く
生産者の選択方法であると思われるが、微生物学的な監
視を簡易化する微生物学的系統の確立を妨げる短所を有
する。理想的にはこれは、特定の交配からの仔を従来型
集団の繁殖系統として用い、そしてこれら各々の交配か
らの次の仔をノトバイオート集団の繁殖系統として用い
ることによって達成される。もし２、３世代毎にこの方
法にしたがうならば、両方の集団の遺伝的素質は非常に
類似するはずである (もちろん同じ交配システムをそれ
ぞれの集団に用いる場合)。
ト集団。もし比較目的で従来型集団とノトバイオート集
団の両方を維持することが望ましい場合は、従来型集団
の有効な繁殖集団からノトバイオート集団へ帝王切開で
生まれた仔を導くことによって、これらの２集団は同様
の遺伝的素質を維持することができる。これが、非ノト
バイオートラットおよびマウスの生産に最も重点を置く
生産者の選択方法であると思われるが、微生物学的な監
視を簡易化する微生物学的系統の確立を妨げる短所を有
する。理想的にはこれは、特定の交配からの仔を従来型
集団の繁殖系統として用い、そしてこれら各々の交配か
らの次の仔をノトバイオート集団の繁殖系統として用い
ることによって達成される。もし２、３世代毎にこの方
法にしたがうならば、両方の集団の遺伝的素質は非常に
類似するはずである (もちろん同じ交配システムをそれ
ぞれの集団に用いる場合)。
【００４２】あるいはまた、ノトバイオート集団の有効
繁殖集団から得られた仔を、従来型集団の確立または補
充に用いることもできる。同じ方法にしたがうならば、
遺伝的な結果は同一となるであろう。 記録管理 (Wolff, G. L. 1967. Practical matingsyst
ems and record-keeping in a breeding colony. p.97
-113 In the UFAW handbook on the care andmanagemen
t of laboratory animals, 第３版、E.および S. Livin
gstone, Ltd.,London 参照) 。
繁殖集団から得られた仔を、従来型集団の確立または補
充に用いることもできる。同じ方法にしたがうならば、
遺伝的な結果は同一となるであろう。 記録管理 (Wolff, G. L. 1967. Practical matingsyst
ems and record-keeping in a breeding colony. p.97
-113 In the UFAW handbook on the care andmanagemen
t of laboratory animals, 第３版、E.および S. Livin
gstone, Ltd.,London 参照) 。
【００４３】動物およびアイソレーターの保守に関する
適正な記録を保管すべきである。動物の記録は、手術の
有効性および動物の生物学的な行動を判定するべきであ
る。アイソレーターの記録は、時間を追ってアイソレー
ターに関する出来事を記録し続けるべきであり、汚染が
生じた場合バリアーのひび割れ箇所を突き止めるのに役
立つ。 （３）無抗原動物 本発明の好ましい実施態様に於ては、化学的に定義され
た (CD) 低分子量で水溶性の限外濾過された飼料で無菌
動物を飼育することが好ましい。かかる飼料によって、
動物による栄養素および抗原の摂取の完全な制御が可能
になると考えられる。一般に、このような飼料はアミノ
酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルのような化
学的に定義できる成分のみで構成されている。本発明の
目的のためには化学的に定義された飼料はアミノ酸、単
糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルを含んでなり、そ
して約10,000ダルトン以上の分子量を有する他の成分は
含まない。したがって、CD飼料の全成分は低分子量であ
り、動物体内で自然に循環する栄養素であって、それゆ
えかかる成分は免疫応答を刺激しないと考えられる。最
近の文献はCD飼料で飼育された無菌動物を「無抗原動
物」と呼ぶ。
適正な記録を保管すべきである。動物の記録は、手術の
有効性および動物の生物学的な行動を判定するべきであ
る。アイソレーターの記録は、時間を追ってアイソレー
ターに関する出来事を記録し続けるべきであり、汚染が
生じた場合バリアーのひび割れ箇所を突き止めるのに役
立つ。 （３）無抗原動物 本発明の好ましい実施態様に於ては、化学的に定義され
た (CD) 低分子量で水溶性の限外濾過された飼料で無菌
動物を飼育することが好ましい。かかる飼料によって、
動物による栄養素および抗原の摂取の完全な制御が可能
になると考えられる。一般に、このような飼料はアミノ
酸、単糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルのような化
学的に定義できる成分のみで構成されている。本発明の
目的のためには化学的に定義された飼料はアミノ酸、単
糖類、脂質、ビタミンおよびミネラルを含んでなり、そ
して約10,000ダルトン以上の分子量を有する他の成分は
含まない。したがって、CD飼料の全成分は低分子量であ
り、動物体内で自然に循環する栄養素であって、それゆ
えかかる成分は免疫応答を刺激しないと考えられる。最
近の文献はCD飼料で飼育された無菌動物を「無抗原動
物」と呼ぶ。
【００４４】また、濾紙の下敷を用いるのが好ましい。
そうしないと無菌動物が下敷を食べて免疫応答を引き起
こす可能性がある。濾紙の下敷を食べても免疫応答は生
じないと考えられる。特定の種のための特別なCD飼料
は、かかる種について知られている栄養要求を満たすよ
うな割合および量の成分を用いる。無菌マウス用の好ま
しいCD飼料の組成および調製は以下の通りである： 化学的に限定された餌料L489E14Se の組成および調製 成 分 量 (グラム／成分100g) 192mlのMilli-Q水に70℃で以下のものを加える： ロイシン 1.9 フェニルアラニン 0.74 イソロイシン 1.08 メチオニン 1.06 トリプトファン 0.37 バリン 1.23 アスパラギン 0.91 アルギニン HCl 0.81 トレオニン 0.74 リジン HCl 1.77 ヒスチジン HCl 0.74 溶液を45℃に冷やして以下のものを加える： グリシン 0.59 プロリン 1.48 セリン 1.33 アラニン 0.59 グルタミン酸ナトリウム 3.40 L-チロシンエチルエステル HCl 0.62 グルコン酸第一鉄 0.05 塩 類 35D1 0.105 亜セレン酸ナトリウム2 0.074 溶液を５℃に冷やして以下のものを加える： グリセロリン酸カルシウム 5.22 グリセロリン酸マグネシウム 1.43 塩化カルシウム 2H2O 0.185 塩化ナトリウム−ヨウ化カリウム(KI)混合物 0.086 (680mg KI含有) 0.086 ビタミンＢ混合物 lllE53 0.09 ビタミンＢ124 1.20 mg 塩化コリン 0.31 酢酸カリウム 1.85 108mlのMilli-Q水に70℃で無水 D-デキストロースを加えた。 71.28 溶液を５℃に冷却し、両者を合一して限外濾過した。
そうしないと無菌動物が下敷を食べて免疫応答を引き起
こす可能性がある。濾紙の下敷を食べても免疫応答は生
じないと考えられる。特定の種のための特別なCD飼料
は、かかる種について知られている栄養要求を満たすよ
うな割合および量の成分を用いる。無菌マウス用の好ま
しいCD飼料の組成および調製は以下の通りである： 化学的に限定された餌料L489E14Se の組成および調製 成 分 量 (グラム／成分100g) 192mlのMilli-Q水に70℃で以下のものを加える： ロイシン 1.9 フェニルアラニン 0.74 イソロイシン 1.08 メチオニン 1.06 トリプトファン 0.37 バリン 1.23 アスパラギン 0.91 アルギニン HCl 0.81 トレオニン 0.74 リジン HCl 1.77 ヒスチジン HCl 0.74 溶液を45℃に冷やして以下のものを加える： グリシン 0.59 プロリン 1.48 セリン 1.33 アラニン 0.59 グルタミン酸ナトリウム 3.40 L-チロシンエチルエステル HCl 0.62 グルコン酸第一鉄 0.05 塩 類 35D1 0.105 亜セレン酸ナトリウム2 0.074 溶液を５℃に冷やして以下のものを加える： グリセロリン酸カルシウム 5.22 グリセロリン酸マグネシウム 1.43 塩化カルシウム 2H2O 0.185 塩化ナトリウム−ヨウ化カリウム(KI)混合物 0.086 (680mg KI含有) 0.086 ビタミンＢ混合物 lllE53 0.09 ビタミンＢ124 1.20 mg 塩化コリン 0.31 酢酸カリウム 1.85 108mlのMilli-Q水に70℃で無水 D-デキストロースを加えた。 71.28 溶液を５℃に冷却し、両者を合一して限外濾過した。
【００４５】1 塩類35D の混合物の組成は第３表に示
す。 2 塩類35D 中のセレン酸ナトリウムに加え添加され
た。 3 第４表記載のビタミンＢ混合物lllE5の組成。 4 ビタミンＢ混合物lllE5 のビタミンＢ12に加え添加
された (以下の実施例参照)。 かかる組成物をマウスまたはラットに自由に食べさせ
る。 液体添加物 LADEK 69E6の組成 成 分 成体１日当りの用量中の量* (0.385ml) 精製大豆トリグリセリド1 0.33g パルミチン酸レチニル 6.45mg(11.7 I.U.) コレカルシフェロール 0.0288mg(1.15 I.U.) ２−アンボ−アルファトコフェロール 3.3mg ２−アンボ−アルファトコフェロールアセテート 6.6mg フィロキノン 72mg * 授乳期マウスは通常の成体量の２倍与えられる。 1 成分は：12％パルミテート 1.5％ステアレート 24％オレエート 55％リノレエート ８％リノレネート CD餌料の詳細な説明については Pleasants, J. R. ら、
J. Nutr., 116, 1949-1964 (1986), Pleasants, J.ら、
Germfree Research: Microflora Control andIts Appli
cation to the Biomedical Sciences, B.S.Wostmann, E
d., p.87, Liss, New York (1985); Wost- mann, B.S.
ら、 J. Nutr., 112, 552 (1982); およびPleasants,
J. R.ら、J. Nutr. 100, 498 (1970)を参照されたい。
これら開示は参照としてここにとり込まれる。 （４）モノクローナル抗体の生産 次に、無菌動物をモノクローナル抗体の生産に利用す
る。無菌系を利用して、無菌状態でない動物が生産でき
るあらゆる抗原に対するモノクローナル抗体を生産でき
る。抗原の例示リストは米国特許第３,935,074号に明ら
かである。しかしながら、無菌動物は抗原に対して非常
に増強された免疫応答を示すと考えられる。したがっ
て、抗原の特異的なエピトープに結合しうる抗体を生産
するＢ−リンパ球を突き止める確率を高めることができ
る。これが本発明の主要な利点である。さらに、無菌系
は、多数のエピトープを有する抗原に対して高度に特異
的な抗体を生産するのに特に有用であると考えられる。
す。 2 塩類35D 中のセレン酸ナトリウムに加え添加され
た。 3 第４表記載のビタミンＢ混合物lllE5の組成。 4 ビタミンＢ混合物lllE5 のビタミンＢ12に加え添加
された (以下の実施例参照)。 かかる組成物をマウスまたはラットに自由に食べさせ
る。 液体添加物 LADEK 69E6の組成 成 分 成体１日当りの用量中の量* (0.385ml) 精製大豆トリグリセリド1 0.33g パルミチン酸レチニル 6.45mg(11.7 I.U.) コレカルシフェロール 0.0288mg(1.15 I.U.) ２−アンボ−アルファトコフェロール 3.3mg ２−アンボ−アルファトコフェロールアセテート 6.6mg フィロキノン 72mg * 授乳期マウスは通常の成体量の２倍与えられる。 1 成分は：12％パルミテート 1.5％ステアレート 24％オレエート 55％リノレエート ８％リノレネート CD餌料の詳細な説明については Pleasants, J. R. ら、
J. Nutr., 116, 1949-1964 (1986), Pleasants, J.ら、
Germfree Research: Microflora Control andIts Appli
cation to the Biomedical Sciences, B.S.Wostmann, E
d., p.87, Liss, New York (1985); Wost- mann, B.S.
ら、 J. Nutr., 112, 552 (1982); およびPleasants,
J. R.ら、J. Nutr. 100, 498 (1970)を参照されたい。
これら開示は参照としてここにとり込まれる。 （４）モノクローナル抗体の生産 次に、無菌動物をモノクローナル抗体の生産に利用す
る。無菌系を利用して、無菌状態でない動物が生産でき
るあらゆる抗原に対するモノクローナル抗体を生産でき
る。抗原の例示リストは米国特許第３,935,074号に明ら
かである。しかしながら、無菌動物は抗原に対して非常
に増強された免疫応答を示すと考えられる。したがっ
て、抗原の特異的なエピトープに結合しうる抗体を生産
するＢ−リンパ球を突き止める確率を高めることができ
る。これが本発明の主要な利点である。さらに、無菌系
は、多数のエピトープを有する抗原に対して高度に特異
的な抗体を生産するのに特に有用であると考えられる。
【００４６】無菌動物は標準技法によって免疫すること
ができる。しかしながら、無菌動物を各免疫処理の間に
最低３週間おいて最低３回免疫処理し、そのあと融合前
追加免疫することが好ましい。免疫処置のこのような増
加は、通常の２回免疫後に好ましい IgG分泌性Ｂリンパ
球ではなく、なお主として IgM分泌性Ｂリンパ球の存在
が観察されているため、必要であると考えられる。 （５）体細胞 抗体生産能のある無菌動物の体細胞、とりわけＢリンパ
球はＢ細胞ミエローマ系との融合に適する。分裂期の形
質芽球抗体産生細胞が優先的に融合する。体細胞は感作
無菌動物のリンパ節、脾臓および末梢血液から得ること
ができ、そしてリンパ系細胞の選択は、相当程度まで、
特定の融合システムでの経験的な有用性に依存する。し
かしながら、脾臓由来の体細胞が一般に望ましい。ひと
たび感作または高度免疫されると、無菌動物は抗体産生
リンパ球源として使用できる。マウスリンパ球は、高い
割合で以下に記載のマウスミエローマ系との安定な融合
を生ずる。しかしながら、他の無菌動物由来の抗体産生
細胞の使用も可能である。特定の無菌動物の選択は、抗
原の選択によって決まる。これは、その無菌動物が用意
するいくつかのＢリンパ球の中に、かかる抗原に対する
抗体を生産できるＢリンパ球のあることが必須であるた
めである。 （６）不死化細胞 特定の目的に適したミエローマ細胞系が、ハイブリドー
マ産生性融合法で用いるためにリンパ球腫瘍から開発さ
れている(G. Kohlerおよび C. Milstein, 1976, Eur.
J. Immunol. 6: 511-519; M. Schulmanら、1978, Natur
e 276: 269-270)。この細胞系は少なくとも三つの理由
から開発された。第一の理由は融合したミエローマ細胞
の選択を容易にするためである。通常、ハイブリドーマ
の成長を支持する特定の選択培地で成長できなくするよ
うな酵素欠乏を有するミエローマを用いることによっ
て、これを達成することができる。第二の理由は、リン
パ球腫瘍細胞の、それ自身の抗体を生産する固有能力か
ら生ずる。モノクローナル技術を使用する目的は、所望
の単一の特異抗体 (これはハイブリドーマの体細胞成分
によって遺伝的に指示される) を生産する不死の融合ハ
イブリッド細胞系を得ることである。ハイブリドーマに
よる腫瘍細胞抗体の生産を排除するために、免疫グロブ
リンの軽鎖または重鎖を生産できないミエローマ細胞系
または抗体分泌機構の欠失した同細胞系が用いられる。
この細胞系を選択した第三の理由はその融合への適性お
よび効率である。
ができる。しかしながら、無菌動物を各免疫処理の間に
最低３週間おいて最低３回免疫処理し、そのあと融合前
追加免疫することが好ましい。免疫処置のこのような増
加は、通常の２回免疫後に好ましい IgG分泌性Ｂリンパ
球ではなく、なお主として IgM分泌性Ｂリンパ球の存在
が観察されているため、必要であると考えられる。 （５）体細胞 抗体生産能のある無菌動物の体細胞、とりわけＢリンパ
球はＢ細胞ミエローマ系との融合に適する。分裂期の形
質芽球抗体産生細胞が優先的に融合する。体細胞は感作
無菌動物のリンパ節、脾臓および末梢血液から得ること
ができ、そしてリンパ系細胞の選択は、相当程度まで、
特定の融合システムでの経験的な有用性に依存する。し
かしながら、脾臓由来の体細胞が一般に望ましい。ひと
たび感作または高度免疫されると、無菌動物は抗体産生
リンパ球源として使用できる。マウスリンパ球は、高い
割合で以下に記載のマウスミエローマ系との安定な融合
を生ずる。しかしながら、他の無菌動物由来の抗体産生
細胞の使用も可能である。特定の無菌動物の選択は、抗
原の選択によって決まる。これは、その無菌動物が用意
するいくつかのＢリンパ球の中に、かかる抗原に対する
抗体を生産できるＢリンパ球のあることが必須であるた
めである。 （６）不死化細胞 特定の目的に適したミエローマ細胞系が、ハイブリドー
マ産生性融合法で用いるためにリンパ球腫瘍から開発さ
れている(G. Kohlerおよび C. Milstein, 1976, Eur.
J. Immunol. 6: 511-519; M. Schulmanら、1978, Natur
e 276: 269-270)。この細胞系は少なくとも三つの理由
から開発された。第一の理由は融合したミエローマ細胞
の選択を容易にするためである。通常、ハイブリドーマ
の成長を支持する特定の選択培地で成長できなくするよ
うな酵素欠乏を有するミエローマを用いることによっ
て、これを達成することができる。第二の理由は、リン
パ球腫瘍細胞の、それ自身の抗体を生産する固有能力か
ら生ずる。モノクローナル技術を使用する目的は、所望
の単一の特異抗体 (これはハイブリドーマの体細胞成分
によって遺伝的に指示される) を生産する不死の融合ハ
イブリッド細胞系を得ることである。ハイブリドーマに
よる腫瘍細胞抗体の生産を排除するために、免疫グロブ
リンの軽鎖または重鎖を生産できないミエローマ細胞系
または抗体分泌機構の欠失した同細胞系が用いられる。
この細胞系を選択した第三の理由はその融合への適性お
よび効率である。
【００４７】融合細胞ハイブリッドの生産にいくつかの
ミエローマ細胞系が使用でき、これにはマウス由来の N
S-1, X63-Ag8, NIS-Ag4/1, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag8.
653,Sp2/O-Agf14, FO, および S194/5XXO.Bu.1., およ
びラット由来の210-.RCY3.Agl.2.3 が包含される。(G.
J.Hammerling, U. Hammerling および J. F. Kearnly,
編、1981, Monoclonal antibodies and hybridomas In
J.L. Turk,編、Research Monographs in Immunology,Vo
l.３, Elsevier/North Holland Biomedical Press,New
York) （７）融 合 抗体産生性脾臓またはリンパ節細胞と不死化細胞とのハ
イブリッドを生成させる方法は一般に細胞膜の融合を促
進する作用剤 (類)(化学物質、ウイルスまたは電気) の
存在下において約20：1 〜約 1：1 まで変動しうる割合
で体細胞と不死化細胞とを混合することから成る。同種
の動物が融合操作に用いられる体細胞および不死化細胞
の供給源として役立てられるのがしばしば好ましい。融
合法は Kohler および Milstein (1975, Nature 256: 4
95-497; 1976, Eur. J. Immunol.6: 511-519), Gefter
ら、(1977, Somatic Cell Genet.3: 231-236) および K
ozbor ら、1983, Immunology Today, 4, 72 に記載され
ている。これらの研究者により使用された融合促進剤は
それぞれセンダイウイルスおよびポリエチレングリコー
ル (PEG)であった。
ミエローマ細胞系が使用でき、これにはマウス由来の N
S-1, X63-Ag8, NIS-Ag4/1, MPC11-45.6TG1.7, X63-Ag8.
653,Sp2/O-Agf14, FO, および S194/5XXO.Bu.1., およ
びラット由来の210-.RCY3.Agl.2.3 が包含される。(G.
J.Hammerling, U. Hammerling および J. F. Kearnly,
編、1981, Monoclonal antibodies and hybridomas In
J.L. Turk,編、Research Monographs in Immunology,Vo
l.３, Elsevier/North Holland Biomedical Press,New
York) （７）融 合 抗体産生性脾臓またはリンパ節細胞と不死化細胞とのハ
イブリッドを生成させる方法は一般に細胞膜の融合を促
進する作用剤 (類)(化学物質、ウイルスまたは電気) の
存在下において約20：1 〜約 1：1 まで変動しうる割合
で体細胞と不死化細胞とを混合することから成る。同種
の動物が融合操作に用いられる体細胞および不死化細胞
の供給源として役立てられるのがしばしば好ましい。融
合法は Kohler および Milstein (1975, Nature 256: 4
95-497; 1976, Eur. J. Immunol.6: 511-519), Gefter
ら、(1977, Somatic Cell Genet.3: 231-236) および K
ozbor ら、1983, Immunology Today, 4, 72 に記載され
ている。これらの研究者により使用された融合促進剤は
それぞれセンダイウイルスおよびポリエチレングリコー
ル (PEG)であった。
【００４８】また最近開発された EBV形質転換法も利用
できる(Coleら、1985, MonoclonalAntibodiesおよびCan
cerTherapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)。 （８）クローンの単離および抗体検出 融合方法は通常約１×10-6 −１×10-8の非常に低い頻
度でしか生存能力あるハイブリッドを生成しない。生存
しうるハイブリッドを得られる頻度が低いので、残った
未融合細胞、特に未融合ミエローマ細胞から融合細胞ハ
イブリッドを選択する手段を有することが必須要件であ
る。生成した他の融合細胞ハイブリッドの中から所望の
抗体産生ハイブリドーマを検出する方法もまた必要であ
る。
できる(Coleら、1985, MonoclonalAntibodiesおよびCan
cerTherapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)。 （８）クローンの単離および抗体検出 融合方法は通常約１×10-6 −１×10-8の非常に低い頻
度でしか生存能力あるハイブリッドを生成しない。生存
しうるハイブリッドを得られる頻度が低いので、残った
未融合細胞、特に未融合ミエローマ細胞から融合細胞ハ
イブリッドを選択する手段を有することが必須要件であ
る。生成した他の融合細胞ハイブリッドの中から所望の
抗体産生ハイブリドーマを検出する方法もまた必要であ
る。
【００４９】一般に、融合細胞は選択培地、例えばヒポ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する
HAT培地中で培養する。 HAT培地はハイブリッド細胞の
増殖を可能にしそして通常無限に分裂を続ける未融合ミ
エローマ細胞の増殖を阻止する。アミノプテリンはテト
ラヒドロ葉酸の産生を阻害することにより新たなプリン
およびピリミジン合成を阻止する。チミジン添加はピリ
ミジン合成の遮断を迂回し、一方ヒポキサンチンが培地
に包含されているので阻害された細胞はヌクレオチドサ
ルベージ経路を用いてプリンを合成できる。使用された
ミエローマ細胞はヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ (HPRT) を欠く変異種でありしたがってサ
ルベージ経路を利用できない。生存ハイブリッドにおい
ては、Ｂリンパ球がこの酵素生産遺伝情報を供給する。
Ｂリンパ球自体は、培養では限定された寿命しか有しな
いので (約２週間) 、 HAT培地中で増殖できる唯一の細
胞がミエローマおよび脾臓細胞から形成されたハイブリ
ッドである。
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する
HAT培地中で培養する。 HAT培地はハイブリッド細胞の
増殖を可能にしそして通常無限に分裂を続ける未融合ミ
エローマ細胞の増殖を阻止する。アミノプテリンはテト
ラヒドロ葉酸の産生を阻害することにより新たなプリン
およびピリミジン合成を阻止する。チミジン添加はピリ
ミジン合成の遮断を迂回し、一方ヒポキサンチンが培地
に包含されているので阻害された細胞はヌクレオチドサ
ルベージ経路を用いてプリンを合成できる。使用された
ミエローマ細胞はヒポキサンチンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ (HPRT) を欠く変異種でありしたがってサ
ルベージ経路を利用できない。生存ハイブリッドにおい
ては、Ｂリンパ球がこの酵素生産遺伝情報を供給する。
Ｂリンパ球自体は、培養では限定された寿命しか有しな
いので (約２週間) 、 HAT培地中で増殖できる唯一の細
胞がミエローマおよび脾臓細胞から形成されたハイブリ
ッドである。
【００５０】ハイブリッドにより分泌された抗体のスク
リーニングを促進し、そして個々のハイブリッドが他の
ものより増殖するのをふせぐために、融合したミエロー
マおよびＢリンパ球の混合物を HAT培地で希釈しそして
マイクロタイタープレートの多重ウェルで培養した。２
−３週間して、ハイブリッドクローンが顕微鏡で見える
ようになったところでハイブリッドクローンを含有する
個々のウェルの上清液を特異的抗体産生に関してアッセ
イする。
リーニングを促進し、そして個々のハイブリッドが他の
ものより増殖するのをふせぐために、融合したミエロー
マおよびＢリンパ球の混合物を HAT培地で希釈しそして
マイクロタイタープレートの多重ウェルで培養した。２
−３週間して、ハイブリッドクローンが顕微鏡で見える
ようになったところでハイブリッドクローンを含有する
個々のウェルの上清液を特異的抗体産生に関してアッセ
イする。
【００５１】アッセイは感度が良く、簡単で迅速でなけ
ればならない。アッセイ法にはラジオイノムアッセイ、
酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイおよびプラーク
アッセイが包含される。 （９）細胞増殖および抗体産生 ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々
の抗体産生細胞系にクローン化されると、各細胞系は２
つの標準法のうちいずれかで増殖できる。ハイブリドー
マの試料を最初の融合に体細胞およびミエローマ細胞を
提供するのに用いられた種類の組織適合性動物に注射で
きる。注射された動物は融合細胞ハイブリッドにより産
生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生
ずる。血清または腹水液のような動物の体液を採り、高
濃度のモノクローナル抗体を得る。別の方法としては、
個々の細胞系を実験室培養器でインビトロ増殖させるこ
とができる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度
に含有する培養培地をデカンテーション、濾過または遠
心により収集できる。 （10）モノクローナル抗体の使用 本発明の方法により作られたモノクローナル抗体はモノ
クローナル抗体を使用する既知または将来開発されるべ
き任意の方法で使用できる。
ればならない。アッセイ法にはラジオイノムアッセイ、
酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイおよびプラーク
アッセイが包含される。 （９）細胞増殖および抗体産生 ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々
の抗体産生細胞系にクローン化されると、各細胞系は２
つの標準法のうちいずれかで増殖できる。ハイブリドー
マの試料を最初の融合に体細胞およびミエローマ細胞を
提供するのに用いられた種類の組織適合性動物に注射で
きる。注射された動物は融合細胞ハイブリッドにより産
生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生
ずる。血清または腹水液のような動物の体液を採り、高
濃度のモノクローナル抗体を得る。別の方法としては、
個々の細胞系を実験室培養器でインビトロ増殖させるこ
とができる。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度
に含有する培養培地をデカンテーション、濾過または遠
心により収集できる。 （10）モノクローナル抗体の使用 本発明の方法により作られたモノクローナル抗体はモノ
クローナル抗体を使用する既知または将来開発されるべ
き任意の方法で使用できる。
【００５２】モノクローナル抗体の主要な用途は抗原−
抗体相互作用の測定であるイムノアッセイである。かか
るアッセイは一般に不均質または均質である。均質イム
ノアッセイにおいては、免疫的反応は特異的抗体、標識
した被分析物、および関心のある試料を通常必要とす
る。標識から生ずるシグナルは抗体を標識被分析物に結
合させると直接または間接に改変される。免疫反応およ
びその程度の検出のいずれも均質溶液中で行なわれる。
使用できる免疫化学的標識にはフリーラジカル、蛍光染
色、酵素、バクテリオファージ、補酵素その他が包含さ
れる。均質イムノアッセイの主な利点は、特異的抗体が
標識被分析物から分離される必要がないことである。
抗体相互作用の測定であるイムノアッセイである。かか
るアッセイは一般に不均質または均質である。均質イム
ノアッセイにおいては、免疫的反応は特異的抗体、標識
した被分析物、および関心のある試料を通常必要とす
る。標識から生ずるシグナルは抗体を標識被分析物に結
合させると直接または間接に改変される。免疫反応およ
びその程度の検出のいずれも均質溶液中で行なわれる。
使用できる免疫化学的標識にはフリーラジカル、蛍光染
色、酵素、バクテリオファージ、補酵素その他が包含さ
れる。均質イムノアッセイの主な利点は、特異的抗体が
標識被分析物から分離される必要がないことである。
【００５３】不均質イムノアッセイにおいては、試薬は
通常検査試料、特異的抗体、および検出できるシグナル
を生成させる手段である。検査試料は一般にプレートま
たはスライドのような支持体上に載せ、そして液相中の
抗体と接触させる。続いて支持体を液相から分離しそし
て支持相かまたは液相をかかるシグナルを生成する手段
を使用して、検出できるシグナルについて検査する。シ
グナルは検査試料中の被分析物の存在に関連している。
検出できるシグナルを生成させる手段には放射性標識、
蛍光物質、酵素その他の使用が包含される。不均質イム
ノアッセイの例をあげればラジオイノムアッセイ、免疫
蛍光法、エンザイムリンクトイムノアッセイ等である。
通常検査試料、特異的抗体、および検出できるシグナル
を生成させる手段である。検査試料は一般にプレートま
たはスライドのような支持体上に載せ、そして液相中の
抗体と接触させる。続いて支持体を液相から分離しそし
て支持相かまたは液相をかかるシグナルを生成する手段
を使用して、検出できるシグナルについて検査する。シ
グナルは検査試料中の被分析物の存在に関連している。
検出できるシグナルを生成させる手段には放射性標識、
蛍光物質、酵素その他の使用が包含される。不均質イム
ノアッセイの例をあげればラジオイノムアッセイ、免疫
蛍光法、エンザイムリンクトイムノアッセイ等である。
【００５４】上記のイムノアッセイ法のさらに詳しい考
案については Edward T. Maggio, CRC Prsee, Inc., Bo
ca Raton, Fla., 1980による“エンザイムイムノアッセ
イ"を参照。また、例えば、全てを網羅しているのでは
ないが、米国特許第3,690,834; 3,791,932; 3,817,837;
３,850,578; ３,853,987; ３,867,517; 3,901,654;3,93
5,074; 3,984,533; 3,996,345;および 4,098,876号を参
照。
案については Edward T. Maggio, CRC Prsee, Inc., Bo
ca Raton, Fla., 1980による“エンザイムイムノアッセ
イ"を参照。また、例えば、全てを網羅しているのでは
ないが、米国特許第3,690,834; 3,791,932; 3,817,837;
３,850,578; ３,853,987; ３,867,517; 3,901,654;3,93
5,074; 3,984,533; 3,996,345;および 4,098,876号を参
照。
【００５５】モノクローナル抗体のもうひとつの主要な
用途はインビボ像形成および治療剤である。モノクロー
ナル抗体を放射性化合物、例えば放射性ヨウ素で標識
し、患者に静脈投与できる。抗体は磁気プローブでも標
識できる。続いて NMRを使用して抗原を正確に探し当て
ることができる。抗体が抗原のところに局在化した後、
抗原を放射トモグラフィーおよび放射性核走査法により
検出でき、それにより抗原の位置を正確に探り当てるこ
とができる。
用途はインビボ像形成および治療剤である。モノクロー
ナル抗体を放射性化合物、例えば放射性ヨウ素で標識
し、患者に静脈投与できる。抗体は磁気プローブでも標
識できる。続いて NMRを使用して抗原を正確に探し当て
ることができる。抗体が抗原のところに局在化した後、
抗原を放射トモグラフィーおよび放射性核走査法により
検出でき、それにより抗原の位置を正確に探り当てるこ
とができる。
【００５６】説明すると、精製されたモノクローナル抗
体をヒトアルブミンを含有するかまたは含有しない適切
な担体、例えば食塩水中に適切な用量で懸濁し、そして
静脈投与例えばMillerら、Hybridomas in Cancer Diagn
osisand Therapy (1982)(ここに参照としてとり込まれ
る) に記載されているように数時間にわたって継続的に
静脈注入することにより投与する。
体をヒトアルブミンを含有するかまたは含有しない適切
な担体、例えば食塩水中に適切な用量で懸濁し、そして
静脈投与例えばMillerら、Hybridomas in Cancer Diagn
osisand Therapy (1982)(ここに参照としてとり込まれ
る) に記載されているように数時間にわたって継続的に
静脈注入することにより投与する。
【００５７】本発明のモノクローナル抗体は治療上使用
できる。適切な生物学的性質を有する抗体は治療剤とし
てすぐに役に立つ。あるいはまた、抗体を毒素と結合さ
せて免疫毒素を形成させるかまたは放射性物質または薬
物に結合させて放射性薬剤または薬剤を形成させる。抗
体の免疫毒素および放射性薬剤を生成させる方法はよく
知られている (例えば Cancer Treatment Reports (198
4) 68: 317-328参照)。
できる。適切な生物学的性質を有する抗体は治療剤とし
てすぐに役に立つ。あるいはまた、抗体を毒素と結合さ
せて免疫毒素を形成させるかまたは放射性物質または薬
物に結合させて放射性薬剤または薬剤を形成させる。抗
体の免疫毒素および放射性薬剤を生成させる方法はよく
知られている (例えば Cancer Treatment Reports (198
4) 68: 317-328参照)。
【００５８】無菌動物由来のポリクローナル抗体はまた
イムノアッセイにも使用できそして従来の動物由来のポ
リクローナル抗体と比べた場合、改善された結果を提供
すると考えられる。無菌動物由来のポリクローナル抗体
は前記した無菌動物、前記免疫処理法を用い、続いて従
来法、例えば動物から血清を分離することにより動物か
らポリクローナル抗体を分離することにより作製ができ
る。 II. フィブリン特異性モノクローナル抗体 （１）背 景 止血メカニズムは破損した血管の損傷治癒に係わる複雑
な生理学的応答メカニズムである。止血は損傷した血
管、血小板および凝血系の共同作業的相互作用により達
成される。凝血系の役割は損傷した血管の内皮下の構造
物上に組み立てられている血小板プラグを安定化しつな
ぎとめるための大量のフィブリン網を提供することであ
る。循環フィブリノーゲンからの不溶性フィブリンマト
リックスの形成は必要とされる部位でのトロンビンの爆
発的生産で最高潮に達する複雑な連続反応の結果であ
る。凝血はプロ酵素 (凝塊因子) が連続的に活性化され
て活性酵素となるまでの連鎖的酵素反応を伴う増幅過程
である。血栓形成に係わるフィブリン重合過程を制御す
る多数の生理学的メカニズムが存在する。これらにはト
ロンビンインヒビターアンチトロンビンIII (AT III)、
プロテインＣ、プロスタサイクリンおよび繊維素溶解系
の種々の成分例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー (t-PA) およびその即効インヒビターが包含される。
イムノアッセイにも使用できそして従来の動物由来のポ
リクローナル抗体と比べた場合、改善された結果を提供
すると考えられる。無菌動物由来のポリクローナル抗体
は前記した無菌動物、前記免疫処理法を用い、続いて従
来法、例えば動物から血清を分離することにより動物か
らポリクローナル抗体を分離することにより作製ができ
る。 II. フィブリン特異性モノクローナル抗体 （１）背 景 止血メカニズムは破損した血管の損傷治癒に係わる複雑
な生理学的応答メカニズムである。止血は損傷した血
管、血小板および凝血系の共同作業的相互作用により達
成される。凝血系の役割は損傷した血管の内皮下の構造
物上に組み立てられている血小板プラグを安定化しつな
ぎとめるための大量のフィブリン網を提供することであ
る。循環フィブリノーゲンからの不溶性フィブリンマト
リックスの形成は必要とされる部位でのトロンビンの爆
発的生産で最高潮に達する複雑な連続反応の結果であ
る。凝血はプロ酵素 (凝塊因子) が連続的に活性化され
て活性酵素となるまでの連鎖的酵素反応を伴う増幅過程
である。血栓形成に係わるフィブリン重合過程を制御す
る多数の生理学的メカニズムが存在する。これらにはト
ロンビンインヒビターアンチトロンビンIII (AT III)、
プロテインＣ、プロスタサイクリンおよび繊維素溶解系
の種々の成分例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー (t-PA) およびその即効インヒビターが包含される。
【００５９】Astrup 1956 Astrup, T., Blood 11, 781-
806 (1956)により提案された止血仮説は、フィブリン形
成 (凝血) とフィブリン溶解 (繊維素溶解) との間にあ
る平衡が存在すると述べている。正常または健康な状態
においてはこれらの機能は等しく均衡している。しかし
ながら、止血過程がそこなわれると、凝血および繊維素
溶解がそれぞれ血栓症および出血として病的に発現され
る。病的血栓症または血栓性疾患の臨床的徴候は極度に
多様であり、そして播種性血管内凝血 (DIC)、深部静脈
血栓症 (DVT)、動脈および静脈血栓症が包含される。他
の血管疾患の血栓塞栓症および血栓性合併症 (例えばア
テローム性動脈硬化症) は主要 動脈の閉塞を生じて臓
器虚血および、脳血管の発作 (卒中) 、心筋梗塞、その
他のような付随する生命をおびやかす状態につながりう
る。
806 (1956)により提案された止血仮説は、フィブリン形
成 (凝血) とフィブリン溶解 (繊維素溶解) との間にあ
る平衡が存在すると述べている。正常または健康な状態
においてはこれらの機能は等しく均衡している。しかし
ながら、止血過程がそこなわれると、凝血および繊維素
溶解がそれぞれ血栓症および出血として病的に発現され
る。病的血栓症または血栓性疾患の臨床的徴候は極度に
多様であり、そして播種性血管内凝血 (DIC)、深部静脈
血栓症 (DVT)、動脈および静脈血栓症が包含される。他
の血管疾患の血栓塞栓症および血栓性合併症 (例えばア
テローム性動脈硬化症) は主要 動脈の閉塞を生じて臓
器虚血および、脳血管の発作 (卒中) 、心筋梗塞、その
他のような付随する生命をおびやかす状態につながりう
る。
【００６０】繊維素溶解過程はプラスミノーゲンアクチ
ベーターとして知られる作用剤の作用により不活性酵素
前駆体プラスミノーゲンをタンパク分解酵素プラスミン
に変換することを必要とする。生理学的繊維素溶解の分
子メカニズムは完全には理解されていないが、フィブリ
ン形成の間にプラスミノーゲンがフィブリンに結合しそ
こでそれがプラスミノーゲンアクチベーター例えばt-PA
により活性化されうることが知られている。この様式で
プラスミン生成が血栓内で進行する。血栓内ではプラス
ミン生成はプラスミンの主要な生理学的インヒビター、
α2 −抗プラスミンによる不活性化から保護されてい
る。
ベーターとして知られる作用剤の作用により不活性酵素
前駆体プラスミノーゲンをタンパク分解酵素プラスミン
に変換することを必要とする。生理学的繊維素溶解の分
子メカニズムは完全には理解されていないが、フィブリ
ン形成の間にプラスミノーゲンがフィブリンに結合しそ
こでそれがプラスミノーゲンアクチベーター例えばt-PA
により活性化されうることが知られている。この様式で
プラスミン生成が血栓内で進行する。血栓内ではプラス
ミン生成はプラスミンの主要な生理学的インヒビター、
α2 −抗プラスミンによる不活性化から保護されてい
る。
【００６１】プラスミンにさらされると、フィブリノー
ゲンおよびフィブリンは分解されてそれらの分解産物を
生ずる。フィブリノーゲンはフラグメントＸおよびＹ
に、そしてプラスミンにさらにさらされると、フラグメ
ントＤおよびＥに分解される。フィブリンは非架橋フィ
ブリンからフラグメントＸ, Ｙ, ＤおよびＥに、そして
架橋フィブリンから架橋Ｄ−ダイマー、Ｄ−Ｄ／Ｅ複合
体、Ｙ−ダイマー、Ｙ−Ｄ−ダイマーおよびＸオリゴマ
ーに分解される。
ゲンおよびフィブリンは分解されてそれらの分解産物を
生ずる。フィブリノーゲンはフラグメントＸおよびＹ
に、そしてプラスミンにさらにさらされると、フラグメ
ントＤおよびＥに分解される。フィブリンは非架橋フィ
ブリンからフラグメントＸ, Ｙ, ＤおよびＥに、そして
架橋フィブリンから架橋Ｄ−ダイマー、Ｄ−Ｄ／Ｅ複合
体、Ｙ−ダイマー、Ｙ−Ｄ−ダイマーおよびＸオリゴマ
ーに分解される。
【００６２】血栓性障害のマーカーに関するアッセイは
ラジオイムノアッセイおよびラテックス凝集型のアッセ
イの両アッセイにおいてポリクローナル抗体を使用して
つい最近まで行なわれている。これらのアッセイはGaffn
ey (Gaffney, P.J., Ann. N.Y. Acad. Sci., 408, 407-
423 (1983)により、全然信頼できないものであることが
示されている。モノクローナル抗体を用いるより特異的
でかつ感度のよいイムノアッセイ(例えばELISA)が臨床
実験室において日常行なわれるようになってきている。
これら診断アッセイにおける限定的要因は使用される特
定のモノクローナル抗体の特異性およびアフィニティで
ある。損なわれた止血の任意のありうるインジケーター
に対する高度に特異的な抗体の生成は、インジケーター
のレベルの低さおよび血漿中ではるかに高いレベルで通
常存在するその前駆体と特定のマーカーとの抗原関連性
の両方により阻止される。実施例は、酵素およびそのイ
ンヒビターとの間の複合体例えばトロンビン−アンチト
ロンビンIII 、プラスミン−α2 -抗プラスミン、t-PA-
PAI-1の形成である。かかる複合体形成により生成され
る新しい抗原部位の数は極度に少なく、免疫学的プロー
ブ (例えばモノクローナル抗体) の生産を困難にしてい
る。
ラジオイムノアッセイおよびラテックス凝集型のアッセ
イの両アッセイにおいてポリクローナル抗体を使用して
つい最近まで行なわれている。これらのアッセイはGaffn
ey (Gaffney, P.J., Ann. N.Y. Acad. Sci., 408, 407-
423 (1983)により、全然信頼できないものであることが
示されている。モノクローナル抗体を用いるより特異的
でかつ感度のよいイムノアッセイ(例えばELISA)が臨床
実験室において日常行なわれるようになってきている。
これら診断アッセイにおける限定的要因は使用される特
定のモノクローナル抗体の特異性およびアフィニティで
ある。損なわれた止血の任意のありうるインジケーター
に対する高度に特異的な抗体の生成は、インジケーター
のレベルの低さおよび血漿中ではるかに高いレベルで通
常存在するその前駆体と特定のマーカーとの抗原関連性
の両方により阻止される。実施例は、酵素およびそのイ
ンヒビターとの間の複合体例えばトロンビン−アンチト
ロンビンIII 、プラスミン−α2 -抗プラスミン、t-PA-
PAI-1の形成である。かかる複合体形成により生成され
る新しい抗原部位の数は極度に少なく、免疫学的プロー
ブ (例えばモノクローナル抗体) の生産を困難にしてい
る。
【００６３】同様に、フィブリンに対するモノクローナ
ル抗体を得ることに関連する主要な問題はフィブリンと
その生理学的前駆体フィブリノーゲンとの間の構造的お
よびコンホーメーション的相似性である。フィブリノー
ゲンがフィブリンに変換される場合の共有構造の保存は
98％以上と推定されており (Plow, E. F., et al.,Se
min. Thromb. Haemostas, 8, 36 (1982)したがってフィ
ブリン分子のエピトープの少ない割合だけが事実新生抗
原 (そしてフィブリンに特有) である。フィブリン抗体
を得るために採用されている多くの方法は可溶性フィブ
リンフラグメントおよび、フィブリン上の露出した新生
抗原部位に似せた合成ペプチドを用いて動物を免疫する
ことに集中している。Hui, K. Y., ら、Science 22, 11
29-32 (1983), Scheefers-Borchel, V.,ら、 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 82, 7091-95(1985), Elms, M. J.,
ら、 Thromb. Haemostas, 50, 591-94 (1983, および K
urdryk, B.ら、Mol. Immul., 21,89-94 (1984)を参照。
しかしながらかかる抗体の結合部位はフィブリン分解過
程中にも保存されておりしたがってかかる抗体もフィブ
リン分解産物に結合することができると考えられてい
る。
ル抗体を得ることに関連する主要な問題はフィブリンと
その生理学的前駆体フィブリノーゲンとの間の構造的お
よびコンホーメーション的相似性である。フィブリノー
ゲンがフィブリンに変換される場合の共有構造の保存は
98％以上と推定されており (Plow, E. F., et al.,Se
min. Thromb. Haemostas, 8, 36 (1982)したがってフィ
ブリン分子のエピトープの少ない割合だけが事実新生抗
原 (そしてフィブリンに特有) である。フィブリン抗体
を得るために採用されている多くの方法は可溶性フィブ
リンフラグメントおよび、フィブリン上の露出した新生
抗原部位に似せた合成ペプチドを用いて動物を免疫する
ことに集中している。Hui, K. Y., ら、Science 22, 11
29-32 (1983), Scheefers-Borchel, V.,ら、 Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 82, 7091-95(1985), Elms, M. J.,
ら、 Thromb. Haemostas, 50, 591-94 (1983, および K
urdryk, B.ら、Mol. Immul., 21,89-94 (1984)を参照。
しかしながらかかる抗体の結合部位はフィブリン分解過
程中にも保存されておりしたがってかかる抗体もフィブ
リン分解産物に結合することができると考えられてい
る。
【００６４】本発明はフィブリン特異的モノクローナル
抗体を産生するのに全く異なる方法を取ることを可能に
しそして無抗原 (AF) 動物の増強された免疫学的感受性
と結合した無傷のフィブリン抗原を利用するものであ
る。本発明の目的のためには、フィブリン特異的モノク
ローナル抗体はフィブリノーゲン、フィブリノーゲン分
解産物またはフィブリン分解産物でなくフィブリンに結
合する。 （２）材料および方法 動 物 無菌 BALB/cAnNマウスはthe University of Wisco-nsin
で維持された無菌 (GF) 群体より得た。この動物をGF条
件下で我々の研究所に輸送した。無抗原 (AF)群体を天
然成分食餌 L-485(Pleasants, J. P.,ら、J.Nutr. 116,
1949-1964 (1986) 参照) を与えた妊娠中のGFマウスを
AFアイソレイターに移すことから始めた。AFアイソレイ
ターでは直ちにマウスを化学的に限定された (CD) AF食
餌に変えた。天然成分 (NI) 食餌に決して直接接触して
いないそれらの子供を母乳から離乳させてCD飼料にしそ
して第一AF世代と称した。このAFマウスを、雌が妊娠し
ているとわかるまで組にしてつがわせた。次に雄を取り
出し雌がそれからは日常の脂質補充物を確実に全部受取
れるようにした。子供は24日令で離乳させた。
抗体を産生するのに全く異なる方法を取ることを可能に
しそして無抗原 (AF) 動物の増強された免疫学的感受性
と結合した無傷のフィブリン抗原を利用するものであ
る。本発明の目的のためには、フィブリン特異的モノク
ローナル抗体はフィブリノーゲン、フィブリノーゲン分
解産物またはフィブリン分解産物でなくフィブリンに結
合する。 （２）材料および方法 動 物 無菌 BALB/cAnNマウスはthe University of Wisco-nsin
で維持された無菌 (GF) 群体より得た。この動物をGF条
件下で我々の研究所に輸送した。無抗原 (AF)群体を天
然成分食餌 L-485(Pleasants, J. P.,ら、J.Nutr. 116,
1949-1964 (1986) 参照) を与えた妊娠中のGFマウスを
AFアイソレイターに移すことから始めた。AFアイソレイ
ターでは直ちにマウスを化学的に限定された (CD) AF食
餌に変えた。天然成分 (NI) 食餌に決して直接接触して
いないそれらの子供を母乳から離乳させてCD飼料にしそ
して第一AF世代と称した。このAFマウスを、雌が妊娠し
ているとわかるまで組にしてつがわせた。次に雄を取り
出し雌がそれからは日常の脂質補充物を確実に全部受取
れるようにした。子供は24日令で離乳させた。
【００６５】 飼育舎 ＡＦ育生種を標準ポリカーボネートマウスケージ28×1
7.8×12.7cmの半分に対して飼った。底を切り取り網目
のステンレス鋼の偽底に取り替えた。ステンレス鋼板の
縦方向の仕切りをプラスチックケージの端にボルトで止
め、ケージをこえて充分上に突き出てステンレス鋼製網
のふたを所定の場所に保持できるようにした。通常ケー
ジの内部に収まるこのへこんだふたを逆にして偽底上に
十分な高さの空間を提供できるようにした。適切な大き
さのステンレス鋼製輪を60ml餌料用ビンを保持するため
にふたの上に溶接した。４個のステンレス鋼製カップを
偽底および上部との中間で、縦方向仕切りの両側末端に
溶接した (ケージの写真はPleasants, J. R., The germ
free system for aging and immunity In: CRC Handboo
k of Immunology in Aging, (Kay, M.M. B.S. Makinoda
n, T.,編), pp.257-297, CRC Press, Boca Raton, Fl.
(1981)に示されている。餌料用ビンは茶色のガラスであ
った。餌料および水用のビンの両方はその中心にドリル
であけた穴を有するプラスチックのふたを有した。ビン
を満たし、その輪に倒置した。脂質補充物をステンレス
鋼製カップに毎日測り入れた。プラスチック皿を各ケー
ジの下に置き排泄物を受けるようにした。
7.8×12.7cmの半分に対して飼った。底を切り取り網目
のステンレス鋼の偽底に取り替えた。ステンレス鋼板の
縦方向の仕切りをプラスチックケージの端にボルトで止
め、ケージをこえて充分上に突き出てステンレス鋼製網
のふたを所定の場所に保持できるようにした。通常ケー
ジの内部に収まるこのへこんだふたを逆にして偽底上に
十分な高さの空間を提供できるようにした。適切な大き
さのステンレス鋼製輪を60ml餌料用ビンを保持するため
にふたの上に溶接した。４個のステンレス鋼製カップを
偽底および上部との中間で、縦方向仕切りの両側末端に
溶接した (ケージの写真はPleasants, J. R., The germ
free system for aging and immunity In: CRC Handboo
k of Immunology in Aging, (Kay, M.M. B.S. Makinoda
n, T.,編), pp.257-297, CRC Press, Boca Raton, Fl.
(1981)に示されている。餌料用ビンは茶色のガラスであ
った。餌料および水用のビンの両方はその中心にドリル
であけた穴を有するプラスチックのふたを有した。ビン
を満たし、その輪に倒置した。脂質補充物をステンレス
鋼製カップに毎日測り入れた。プラスチック皿を各ケー
ジの下に置き排泄物を受けるようにした。
【００６６】下敷きとしておよび摂収しうる繊維として
の両方の役をする濾紙はクリッピング (Sargent Welch)
として購入した Whatman ashless filter paper No.41
である。下敷きにはその紙を細片に切断した。切断して
いない正方形の紙をアイソレーターの内部の清掃に使用
した。紙と 121℃で25分間オートクレーブするかまたは
プラスチックバッグ中で照射 (4.5Mrad)した。全てのマ
ウスはケージの片端をおおうのに充分な紙を与えられ
た。それがぬれたり、黄色になるかまたは汚れた場合は
取り替えた。
の両方の役をする濾紙はクリッピング (Sargent Welch)
として購入した Whatman ashless filter paper No.41
である。下敷きにはその紙を細片に切断した。切断して
いない正方形の紙をアイソレーターの内部の清掃に使用
した。紙と 121℃で25分間オートクレーブするかまたは
プラスチックバッグ中で照射 (4.5Mrad)した。全てのマ
ウスはケージの片端をおおうのに充分な紙を与えられ
た。それがぬれたり、黄色になるかまたは汚れた場合は
取り替えた。
【００６７】ゲージは標準ノトバイオート法 (Wostman
n, B. S.,編、Gnotobiotes Standards and Guide Lines
for the Breeding, Care and Management of Laborato
ry Animals, National Research Council, National Ac
ademy of Sciences, Washington, D. C.)を用いTrexler
型 (Trexler, P. C., Lab. Anim. Care, 13,572-581(1
963)) の1.37×0.６×0.6 Ｍのフレキシブルアイソレー
ター内に維持した。アイソレーターは12時間明暗の時間
割で21℃で室内に維持した2.５cm直径の7.55cm長さのタ
イゴン (Tygon)チューブをアイソレーターの頂部にはめ
こみそして上部および下部両方でビニール栓で閉じた。
これは飼料、水および油の滅菌濾過の入口を提供する。
n, B. S.,編、Gnotobiotes Standards and Guide Lines
for the Breeding, Care and Management of Laborato
ry Animals, National Research Council, National Ac
ademy of Sciences, Washington, D. C.)を用いTrexler
型 (Trexler, P. C., Lab. Anim. Care, 13,572-581(1
963)) の1.37×0.６×0.6 Ｍのフレキシブルアイソレー
ター内に維持した。アイソレーターは12時間明暗の時間
割で21℃で室内に維持した2.５cm直径の7.55cm長さのタ
イゴン (Tygon)チューブをアイソレーターの頂部にはめ
こみそして上部および下部両方でビニール栓で閉じた。
これは飼料、水および油の滅菌濾過の入口を提供する。
【００６８】 餌 料 第１表は餌料組成物および限外濾過 Milli-Q水(Millipo
re, MA) 中に成分を溶解させる順序を示す。アミノ酸お
よびデキストロースは Sigma組織培養等級であった。ビ
タミン類も Hoffman-La Roche, Inc. (Nutley, NJ)の善
意により供給された純パルミチン酸レチニルを除いては
Sigma からのものであった。他の試薬はFisher 保証ま
たは同等品であった。完全に水溶性の食餌を直径150mm
の３枚のPm10膜 (Amicon) を使用し Amicon Diaflo TC3
限界濾過器で冷時濾過した。
re, MA) 中に成分を溶解させる順序を示す。アミノ酸お
よびデキストロースは Sigma組織培養等級であった。ビ
タミン類も Hoffman-La Roche, Inc. (Nutley, NJ)の善
意により供給された純パルミチン酸レチニルを除いては
Sigma からのものであった。他の試薬はFisher 保証ま
たは同等品であった。完全に水溶性の食餌を直径150mm
の３枚のPm10膜 (Amicon) を使用し Amicon Diaflo TC3
限界濾過器で冷時濾過した。
【００６９】限外濾過膜は分子量カットオフ10,000ダル
トンを有した。組立てられた限外濾過装置を使用に先立
ち0.15％次亜塩素酸ナトリウム溶液を通過させることに
より滅菌にし、続いて充分に洗浄した。限外濾過餌料は
必要時まで無菌貯蔵器中４℃で保存した。餌料はNo６ネ
オプレン栓に挿入された配送用チューブを有するオート
クレーブずみ加圧フィルターホルダー中の0.２μm ナイ
ロン (MSI)を使用してAFアイソレーターに導入した。こ
の目的には、アイソレーターの上部にさしこまれたタイ
ゴンチューブから上部のビニール栓を取りはずし、チュ
ーブの内部を0.１％アルキル−アリールスルホネートを
含有する２％過酢酸の滅菌溶液でスプレーした。フィル
ターホルダー栓を上部栓の場所に挿入した。20分後、下
部の栓を取りはずし (アイソレーターの内部) そして餌
料または水を20psi の窒素下でアイソレーターに濾過し
て入れた。
トンを有した。組立てられた限外濾過装置を使用に先立
ち0.15％次亜塩素酸ナトリウム溶液を通過させることに
より滅菌にし、続いて充分に洗浄した。限外濾過餌料は
必要時まで無菌貯蔵器中４℃で保存した。餌料はNo６ネ
オプレン栓に挿入された配送用チューブを有するオート
クレーブずみ加圧フィルターホルダー中の0.２μm ナイ
ロン (MSI)を使用してAFアイソレーターに導入した。こ
の目的には、アイソレーターの上部にさしこまれたタイ
ゴンチューブから上部のビニール栓を取りはずし、チュ
ーブの内部を0.１％アルキル−アリールスルホネートを
含有する２％過酢酸の滅菌溶液でスプレーした。フィル
ターホルダー栓を上部栓の場所に挿入した。20分後、下
部の栓を取りはずし (アイソレーターの内部) そして餌
料または水を20psi の窒素下でアイソレーターに濾過し
て入れた。
【００７０】脂質補充物の組成を第２表に示す。大豆の
トリグリセリドはパルミテートからリノレネートまでの
エステルを生成する温度範囲で真空蒸留したそれらのメ
チルエステルからつくられた調製物であった。これらの
エステルを続いてグリセリンとエステル交換して混合ト
リグリセリドを形成させた。(Nu-Chek Prep, Elysian,
MN) 。この混合物をアイソレーターに濾過して入れる
(その時には混合物は50℃に加温) に先立ちこのトリグ
リセリド混合物に脂溶性ビタミンを加えそして餌料の水
溶性部分について用いたと同じ方法によりアイソレータ
ー中に濾過して入れた。
トリグリセリドはパルミテートからリノレネートまでの
エステルを生成する温度範囲で真空蒸留したそれらのメ
チルエステルからつくられた調製物であった。これらの
エステルを続いてグリセリンとエステル交換して混合ト
リグリセリドを形成させた。(Nu-Chek Prep, Elysian,
MN) 。この混合物をアイソレーターに濾過して入れる
(その時には混合物は50℃に加温) に先立ちこのトリグ
リセリド混合物に脂溶性ビタミンを加えそして餌料の水
溶性部分について用いたと同じ方法によりアイソレータ
ー中に濾過して入れた。
【００７１】脂質の摂取料は 0.375ml／日と測定され
た。脂質補充物を増大させることにより、新生マウスの
死亡率が著しく減少した。平均の仔寸法も従来通り飼育
した動物のそれまで増加した。授乳中の雌は正常量の２
倍の脂質補充物を与えられた。 第１表 化学的に限定された餌料L489ElSeの組成および調製 成 分 量 (グラム／成分100g) 70℃のMilli-Q水192mlに下記のものを添加した： ロイシン 1.9 フェニルアラニン 0.74 イソロイシン 1.08 メチオニン 1.06 トリプトファン 0.37 バリン 1.23 アスパラギン 0.91 アルギニン HCl 0.81 トレオニン 0.74 リジン HCl 1.77 ヒスチジン HCl 0.74 溶液を45℃に冷やし、下記のものを添加した： グリシン 0.59 プロリン 1.48 セリン 1.33 アラニン 0.59 グルタミン酸ナトリウム 3.40 L-チロシンエチルエステル HCl 0.62 グルコン酸第一鉄 0.05 塩 3５Ｄ1 0.105 セレン酸ナトリウム2 0.074 溶液を５℃に冷やし、下記のものを添加した： グリセロリン酸カルシウム 5.22 グリセロリン酸マグネシウム 1.43 塩化カルシウム 2H2O 0.185 塩化ナトリウム−ヨウ化カリウム(KI)混合物 0.086 (680mg KI含有) ビタミンＢ混合物 lllE53 0.09 ビタミンＢ124 1.20 mg 塩化コリン 0.31 酢酸カリウム 1.85 70℃のMilli-Q水108mlに70℃で無水D-デキストロースを
添加した。溶液を５℃に冷やし両者を混合して限外濾過
した。
た。脂質補充物を増大させることにより、新生マウスの
死亡率が著しく減少した。平均の仔寸法も従来通り飼育
した動物のそれまで増加した。授乳中の雌は正常量の２
倍の脂質補充物を与えられた。 第１表 化学的に限定された餌料L489ElSeの組成および調製 成 分 量 (グラム／成分100g) 70℃のMilli-Q水192mlに下記のものを添加した： ロイシン 1.9 フェニルアラニン 0.74 イソロイシン 1.08 メチオニン 1.06 トリプトファン 0.37 バリン 1.23 アスパラギン 0.91 アルギニン HCl 0.81 トレオニン 0.74 リジン HCl 1.77 ヒスチジン HCl 0.74 溶液を45℃に冷やし、下記のものを添加した： グリシン 0.59 プロリン 1.48 セリン 1.33 アラニン 0.59 グルタミン酸ナトリウム 3.40 L-チロシンエチルエステル HCl 0.62 グルコン酸第一鉄 0.05 塩 3５Ｄ1 0.105 セレン酸ナトリウム2 0.074 溶液を５℃に冷やし、下記のものを添加した： グリセロリン酸カルシウム 5.22 グリセロリン酸マグネシウム 1.43 塩化カルシウム 2H2O 0.185 塩化ナトリウム−ヨウ化カリウム(KI)混合物 0.086 (680mg KI含有) ビタミンＢ混合物 lllE53 0.09 ビタミンＢ124 1.20 mg 塩化コリン 0.31 酢酸カリウム 1.85 70℃のMilli-Q水108mlに70℃で無水D-デキストロースを
添加した。溶液を５℃に冷やし両者を混合して限外濾過
した。
【００７２】1 塩35D 混合物の組成は第３表に示す。 2 塩35D 中の亜セレン酸ナトリウムに加え添加。 3 ビタミンＢ混合物lllE5の組成 (第４表参照) 4 ビタミンＢ混合物lllE5 中のビタミンＢ-12 に加え
添加。 第２表 脂質補充物 LADEK 69E6の組成 成 分 １日量当りの量* (0.375ml) 精製大豆トリグリセリド1 0.33g パルミチン酸レチニル 6.45mg(11.7 I.U.) コレカルシフェロール .0288mg(1.15 I.U.) ２アンボ−α−トコフェロール 3.3mg ２アンボ−α−トコフェロールアセテート 6.6mg フィロキノン 72mg * 授乳中のマウスには標準成体マウス量の２倍を与えた。 1 成分は：12％パルミテート 1.5％ステアレート 24％オレエート 55％リノレエート ８％リノレネート 第３表 35D塩混合物の組成 塩 量 (餌料300ml当り)(mg) Mn（アセテート)24H2O 55.4 ZuSO4 H2O 40.6 Cu（アセテート)2 H2O 3.7 Cr（アセテート)3 H2O 2.5 NaF 2.1 SnSO4 2H2O 0.37 (NH4)6 Mo7 O24 4H2O 0.37 NiCl2 3H2O 0.37 Co（アセテート)2 4H2O 0.11 Na3 VO4 0.22 Na2 SeO3 0.096 第４表 ビタミンＢ混合物の111E5の組成 成 分 量 (mg/300ml餌料) チアミン HCl 1.23 ピリドキシン HCl 1.54 ビオチン 0.25 葉 酸 0.37 ビタミンＢ12 0.37 リボフラビン 1.85 ナイアシンアミド 9.2 i-イノシトール 61.9 パントテン酸カルシウム 12.3 水はMilli-Q 限外濾過等級であり、餌料と同じ方法でア
イソレーターに濾過して入れた。
添加。 第２表 脂質補充物 LADEK 69E6の組成 成 分 １日量当りの量* (0.375ml) 精製大豆トリグリセリド1 0.33g パルミチン酸レチニル 6.45mg(11.7 I.U.) コレカルシフェロール .0288mg(1.15 I.U.) ２アンボ−α−トコフェロール 3.3mg ２アンボ−α−トコフェロールアセテート 6.6mg フィロキノン 72mg * 授乳中のマウスには標準成体マウス量の２倍を与えた。 1 成分は：12％パルミテート 1.5％ステアレート 24％オレエート 55％リノレエート ８％リノレネート 第３表 35D塩混合物の組成 塩 量 (餌料300ml当り)(mg) Mn（アセテート)24H2O 55.4 ZuSO4 H2O 40.6 Cu（アセテート)2 H2O 3.7 Cr（アセテート)3 H2O 2.5 NaF 2.1 SnSO4 2H2O 0.37 (NH4)6 Mo7 O24 4H2O 0.37 NiCl2 3H2O 0.37 Co（アセテート)2 4H2O 0.11 Na3 VO4 0.22 Na2 SeO3 0.096 第４表 ビタミンＢ混合物の111E5の組成 成 分 量 (mg/300ml餌料) チアミン HCl 1.23 ピリドキシン HCl 1.54 ビオチン 0.25 葉 酸 0.37 ビタミンＢ12 0.37 リボフラビン 1.85 ナイアシンアミド 9.2 i-イノシトール 61.9 パントテン酸カルシウム 12.3 水はMilli-Q 限外濾過等級であり、餌料と同じ方法でア
イソレーターに濾過して入れた。
【００７３】 微生物学的監視 無抗原系を微生物汚染について Wostmann, B.S. 編(197
0) Gnotobiotics Standards and guidelines for the b
reeding care and management of laboratoryanimals,
National Research Council, National Academy of Sci
ences, Washington, D. C. に記載されたガイドライン
に従い検査した。要約すると、アイソレーター内部から
の餌料および水で湿ったスワブを用いて、マウスからお
よび各ゲージの下の蓄積した排泄物から新しく排泄物の
塗抹標本を得た。また塗抹標本はアイソレーターの壁、
特に入口周辺からも採取した。常に二通り塗抹標本を取
った。そのひとセットを、グラム染色を用いて細菌およ
び真菌について直接顕微鏡検査により検査した。スワブ
の第２組は微生物の検出に用いた。培養物が陰性である
と見られるまで三週間経過させた。
0) Gnotobiotics Standards and guidelines for the b
reeding care and management of laboratoryanimals,
National Research Council, National Academy of Sci
ences, Washington, D. C. に記載されたガイドライン
に従い検査した。要約すると、アイソレーター内部から
の餌料および水で湿ったスワブを用いて、マウスからお
よび各ゲージの下の蓄積した排泄物から新しく排泄物の
塗抹標本を得た。また塗抹標本はアイソレーターの壁、
特に入口周辺からも採取した。常に二通り塗抹標本を取
った。そのひとセットを、グラム染色を用いて細菌およ
び真菌について直接顕微鏡検査により検査した。スワブ
の第２組は微生物の検出に用いた。培養物が陰性である
と見られるまで三週間経過させた。
【００７４】微生物学的検査は約２週間ごとにまたはア
イソレーターに新しい加入がなされた２−３日後に行っ
た。 （３）無抗原マウスを用いるモノクローナル抗体の生産 前記無抗原マウスをモノクローナル抗体生産におけるリ
ンパ球ドナーとして用いた。全抗原の溶液は層流フード
中で無菌条件下に調製した。
イソレーターに新しい加入がなされた２−３日後に行っ
た。 （３）無抗原マウスを用いるモノクローナル抗体の生産 前記無抗原マウスをモノクローナル抗体生産におけるリ
ンパ球ドナーとして用いた。全抗原の溶液は層流フード
中で無菌条件下に調製した。
【００７５】下記プロトコールをAFマウスの免疫化に採
用した。抗原 (25−50μg)を無菌食塩水 (100μｌ) に
溶解させ、そして同量のフロインド完全アジュバント
(FCA)で乳化した。インターフェロン (1000単位) を乳
濁液調製に先立ち抗原の溶液に添加した。無菌注射器お
よび針を全ての免疫処置に使用した。注射器を入口を通
してAFアイソレーターに搬入し、そこで過酢酸 (２％)
の溶液でスプレーすることにより滅菌した。ブースター
注射は同量の抗原を用い、 FCAをフロインド不完全アジ
ュバントで置き換えて行った。全部で３回のブースター
免疫を各３週間間隔で行った。最後のブースター (アジ
ュバントなし) は融合の４−７日前に行った。全ての免
疫処置は腹腔内に行った。マウスを融合の当日にアイソ
レーターから取り出しそしてCO2 窒息によりすぐに殺し
た。脾臓を取り出して脾細胞を標準ハイブリドーマ法を
用いてマウスミエローマ細胞 (NS１) と融合させた。 （４）フィブリン特異的モノクローナル抗体生産のため
の無抗原動物系の使用 無抗原系を用いてフィブリン特異的モノクローナル抗体
を生成させた。抗体は特異性が高く、そしてフィブリノ
ーゲン、フィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分
解産物を認識しない。ハイブリドーマ細胞系はヒトフィ
ブリンで免疫化した無抗原 BALB/c マウスの脾細胞およ
びNS１ミエローマ細胞の融合により生成させた。
用した。抗原 (25−50μg)を無菌食塩水 (100μｌ) に
溶解させ、そして同量のフロインド完全アジュバント
(FCA)で乳化した。インターフェロン (1000単位) を乳
濁液調製に先立ち抗原の溶液に添加した。無菌注射器お
よび針を全ての免疫処置に使用した。注射器を入口を通
してAFアイソレーターに搬入し、そこで過酢酸 (２％)
の溶液でスプレーすることにより滅菌した。ブースター
注射は同量の抗原を用い、 FCAをフロインド不完全アジ
ュバントで置き換えて行った。全部で３回のブースター
免疫を各３週間間隔で行った。最後のブースター (アジ
ュバントなし) は融合の４−７日前に行った。全ての免
疫処置は腹腔内に行った。マウスを融合の当日にアイソ
レーターから取り出しそしてCO2 窒息によりすぐに殺し
た。脾臓を取り出して脾細胞を標準ハイブリドーマ法を
用いてマウスミエローマ細胞 (NS１) と融合させた。 （４）フィブリン特異的モノクローナル抗体生産のため
の無抗原動物系の使用 無抗原系を用いてフィブリン特異的モノクローナル抗体
を生成させた。抗体は特異性が高く、そしてフィブリノ
ーゲン、フィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分
解産物を認識しない。ハイブリドーマ細胞系はヒトフィ
ブリンで免疫化した無抗原 BALB/c マウスの脾細胞およ
びNS１ミエローマ細胞の融合により生成させた。
【００７６】 免疫処置日程 ８週令の３匹の雌の無抗原マウスをヒトフィブリン調製
物33μg で免疫処置した。この調製物は、下記のように
調製されたフィブリンのフリーズフラクチャー試料であ
った：ヒトフィブリノーゲンをトロンビンおよび第XIII
a 因子によりフィブリンに変換した。次にフィブリン凝
塊を液体窒素中で凍結させそして機械的破壊により非常
に微細な粉末となした。フリーズフラクチャーしたフィ
ブリンの分散液を食塩水中に生成させて最終濃度１mg／
mlを有する架橋フィブリンXL-Fn の透明溶液を得た。こ
のフィブリン抗原の33μｌを動物の免疫化に使用した。
抗原溶液の量を無菌食塩水で１00μｌに調整し、次に前
項記載のようにして FCAで乳化した。２回のブースター
免疫処置をフロインド不完全アジュバント中の同レベル
の抗原を用い、３週間間隔で投与した。最後のブースタ
ーは融合４日前に行った。同レベルの抗原を用いそして
アジュバントを食塩水で置き換えた。
物33μg で免疫処置した。この調製物は、下記のように
調製されたフィブリンのフリーズフラクチャー試料であ
った：ヒトフィブリノーゲンをトロンビンおよび第XIII
a 因子によりフィブリンに変換した。次にフィブリン凝
塊を液体窒素中で凍結させそして機械的破壊により非常
に微細な粉末となした。フリーズフラクチャーしたフィ
ブリンの分散液を食塩水中に生成させて最終濃度１mg／
mlを有する架橋フィブリンXL-Fn の透明溶液を得た。こ
のフィブリン抗原の33μｌを動物の免疫化に使用した。
抗原溶液の量を無菌食塩水で１00μｌに調整し、次に前
項記載のようにして FCAで乳化した。２回のブースター
免疫処置をフロインド不完全アジュバント中の同レベル
の抗原を用い、３週間間隔で投与した。最後のブースタ
ーは融合４日前に行った。同レベルの抗原を用いそして
アジュバントを食塩水で置き換えた。
【００７７】 抗体の検出および測定 モノクローナル抗体の定性的および定量的測定はエンザ
イムリンクトイムノソルベントアッセイ (ELISA)を用い
て行った。 ELISAは96ウェル PVCプレート(Costar)上に
固定化したヒトフィブリンを用いて実施した。フィブリ
ン被覆したアッセイプレートはフィブリノーゲン溶液
(Kabi、等級Ｌ)(50μg ／mlボレート／食塩緩衝液) の
１00μｌを４℃にて一夜インキュベートすることにより
調製した。未結合フィブリノーゲンは0.05％ツィーン80
を含有するPBS (PBS−ツィーン) で洗浄することにより
除去した。各プラスチックウェル上に被覆したフィブリ
ノーゲンを２mM CaCl2を含有するトロンビン溶液 (10NI
H 単位／ml) 100 μｌと37℃で１時間インキュベートす
ることによりフィブリンに変換した。抗体の標準検量曲
線はSDS-PAGEによれば均質である抗体調製物を用いて作
成した。
イムリンクトイムノソルベントアッセイ (ELISA)を用い
て行った。 ELISAは96ウェル PVCプレート(Costar)上に
固定化したヒトフィブリンを用いて実施した。フィブリ
ン被覆したアッセイプレートはフィブリノーゲン溶液
(Kabi、等級Ｌ)(50μg ／mlボレート／食塩緩衝液) の
１00μｌを４℃にて一夜インキュベートすることにより
調製した。未結合フィブリノーゲンは0.05％ツィーン80
を含有するPBS (PBS−ツィーン) で洗浄することにより
除去した。各プラスチックウェル上に被覆したフィブリ
ノーゲンを２mM CaCl2を含有するトロンビン溶液 (10NI
H 単位／ml) 100 μｌと37℃で１時間インキュベートす
ることによりフィブリンに変換した。抗体の標準検量曲
線はSDS-PAGEによれば均質である抗体調製物を用いて作
成した。
【００７８】非特異的結合を阻止するために、フィブリ
ンを被覆したプレートをPBS pH7.４中の BSAの１％溶液
とインキュベートした。次に抗体含有溶液 (100 μｌ)
を添加し、37℃で90分間インキュベートした。手順の各
工程後、ウェルを PBS−ツィーンで充分に洗浄した。結
合された抗体は１％ BSAを含有する PBS、pH8.０、中で
希釈したアルカリホスファターゼ (Sigma)接合ウサギ抗
−マウス抗体の1000倍希釈物を添加することにより検出
した。
ンを被覆したプレートをPBS pH7.４中の BSAの１％溶液
とインキュベートした。次に抗体含有溶液 (100 μｌ)
を添加し、37℃で90分間インキュベートした。手順の各
工程後、ウェルを PBS−ツィーンで充分に洗浄した。結
合された抗体は１％ BSAを含有する PBS、pH8.０、中で
希釈したアルカリホスファターゼ (Sigma)接合ウサギ抗
−マウス抗体の1000倍希釈物を添加することにより検出
した。
【００７９】 ハイブリドーマの産生−融合 マウスを CO2窒息により殺しそして直ちに脾臓摘出を行
った。免疫化マウスの脾臓細胞を融合剤ポリエチレング
リコール4000(3,000−3,700)を用いて融合した。細胞を
Ｔフラスコ中の HAT選択培地で１週間インキュベートし
た。この期間の後、細胞を５個の96ウェルプレートに塗
布すると、そのうち93ウェルが増殖を示した。これらの
うち、19ウェルはフィブリン抗原に関して陽性であっ
た。これらのクローンのうちのひとつF492D8 (後にMH１
と改称) は、フィブリン抗原は認識するがフィブリノー
ゲンと交差反応しない抗体を産生した。この特別のクロ
ーン、MH１を限界希釈法で３回再クローンし、第三のク
ローニング期は１ウェル１細胞で行った。細胞系が、い
ったん安定化されると、無血清培地に移した。この細胞
系は約7.５mg／ｌレベルで抗体を産生する。
った。免疫化マウスの脾臓細胞を融合剤ポリエチレング
リコール4000(3,000−3,700)を用いて融合した。細胞を
Ｔフラスコ中の HAT選択培地で１週間インキュベートし
た。この期間の後、細胞を５個の96ウェルプレートに塗
布すると、そのうち93ウェルが増殖を示した。これらの
うち、19ウェルはフィブリン抗原に関して陽性であっ
た。これらのクローンのうちのひとつF492D8 (後にMH１
と改称) は、フィブリン抗原は認識するがフィブリノー
ゲンと交差反応しない抗体を産生した。この特別のクロ
ーン、MH１を限界希釈法で３回再クローンし、第三のク
ローニング期は１ウェル１細胞で行った。細胞系が、い
ったん安定化されると、無血清培地に移した。この細胞
系は約7.５mg／ｌレベルで抗体を産生する。
【００８０】 モノクローナル抗体の精製 精製に先立ち (４ｌバッチの) 組織培養上清を遠心して
細胞屑を除去し、そして0.８μM ナイロン膜で濾過して
すべての残留微粒子物質を除去した。ハイブリドーマ上
清は分子量カットオフ30,000を有するYM型の膜 (Amico
n) を用いてらせん巻き限外濾過装置を使用して４℃に
て５00ml量まで濃縮した。20mM 2 (N-モルホリン) エタ
ンスルホン酸 (MES)、pH６ (緩衝液Ａ) への緩衝液交換
は製造業者の説明書に従いダイアフィルトレーション
(diafiltration)により達成した。最終容量１00mlとな
るまでさらに濃縮した後、抗体溶液をさらに精製する前
に 0.451ミクロンナイロン膜で濾過した。濃縮した抗体
溶液を7.75mm×10cm ABxカラム(J. T. Baker, Phillips
burg, NJ) を用いる Waters HPLCクロマトグラフィーで
の液体クロマトグラフィーにより精製した。カラムを緩
衝液Ａで平衡化し、試料(100ml) を1.０ml／分の流速で
注いだ。緩衝液Ａで充分に洗浄した後、抗体を緩衝液Ａ
から１00％緩衝液Ｂ (１M 酢酸ナトリウム pH 7)のグラ
ジィエントを用いてカラムから１ml／分で溶出させた。
フラクション（２ml) を収集し、MAb (ELISAにより測
定) を含有するものをプールしてリン酸緩衝食塩水 (PB
S)(20mM リン酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH
７.4) で透析し、１mg／ml以上の濃度で−20℃にて保存
した。ABx カラムは１00％緩衝液Ｂで５分間洗浄し続い
て15カラム量の緩衝液Ａで再度平衡化することにより再
生した。 （５）フィブリン特異性の測定 フィブリン特異性の最初の測定はハイブリドーマ上清を
フィブリンおよびフィブリノーゲン被覆マイクロタイタ
ープレートで別々にスクリーニングすることにより行っ
た。フィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生する
細胞系のみが受容された。
細胞屑を除去し、そして0.８μM ナイロン膜で濾過して
すべての残留微粒子物質を除去した。ハイブリドーマ上
清は分子量カットオフ30,000を有するYM型の膜 (Amico
n) を用いてらせん巻き限外濾過装置を使用して４℃に
て５00ml量まで濃縮した。20mM 2 (N-モルホリン) エタ
ンスルホン酸 (MES)、pH６ (緩衝液Ａ) への緩衝液交換
は製造業者の説明書に従いダイアフィルトレーション
(diafiltration)により達成した。最終容量１00mlとな
るまでさらに濃縮した後、抗体溶液をさらに精製する前
に 0.451ミクロンナイロン膜で濾過した。濃縮した抗体
溶液を7.75mm×10cm ABxカラム(J. T. Baker, Phillips
burg, NJ) を用いる Waters HPLCクロマトグラフィーで
の液体クロマトグラフィーにより精製した。カラムを緩
衝液Ａで平衡化し、試料(100ml) を1.０ml／分の流速で
注いだ。緩衝液Ａで充分に洗浄した後、抗体を緩衝液Ａ
から１00％緩衝液Ｂ (１M 酢酸ナトリウム pH 7)のグラ
ジィエントを用いてカラムから１ml／分で溶出させた。
フラクション（２ml) を収集し、MAb (ELISAにより測
定) を含有するものをプールしてリン酸緩衝食塩水 (PB
S)(20mM リン酸ナトリウム、150mM 塩化ナトリウム、pH
７.4) で透析し、１mg／ml以上の濃度で−20℃にて保存
した。ABx カラムは１00％緩衝液Ｂで５分間洗浄し続い
て15カラム量の緩衝液Ａで再度平衡化することにより再
生した。 （５）フィブリン特異性の測定 フィブリン特異性の最初の測定はハイブリドーマ上清を
フィブリンおよびフィブリノーゲン被覆マイクロタイタ
ープレートで別々にスクリーニングすることにより行っ
た。フィブリノーゲンと交差反応しない抗体を産生する
細胞系のみが受容された。
【００８１】フィブリン特異性のそれ以上の確認は溶液
中のフィブリノーゲンとの競合アッセイを用いて測定さ
れ、それによりこの抗体が溶液中のフィブリノーゲンを
認識しないことが確認された。抗体のフィブリン特異性
を確認するのに用いられる競合アッセイは前記ELISAア
ッセイで記載されるようにして行われ、抗体を溶液中の
フィブリノーゲンとプレインキュベーションした。要約
すると、ハイブリドーマ上清を、抗体のフィブリノーゲ
ンへの非特異的結合を阻止するためにBSA(10mg／ml) を
含有する生理学的濃度のフィブリノーゲン溶液 (４mg／
ml) と37℃で30分間インキュベートした。次にフィブリ
ノーゲン／抗体溶液を、フィブリンを被覆したマイクロ
タイタープレートのウェルに移した。GlyProArgPro(GPR
P)を、フィブリンウェル中に残留するトロンビンによる
フィブリノーゲンのありうる重合防止するためにフィブ
リノーゲンインヒビターに添加した。次にアッセイを固
定化抗原に結合された抗体に関する慣用のELISA アッセ
イと同様にして実施した。MH１抗体のフィブリン特異性
を検査する全ての実験において、第２の抗体45Ｊを対照
として用いた。45Ｊはフィブリンおよびフィブリノーゲ
ンと交差反応する。
中のフィブリノーゲンとの競合アッセイを用いて測定さ
れ、それによりこの抗体が溶液中のフィブリノーゲンを
認識しないことが確認された。抗体のフィブリン特異性
を確認するのに用いられる競合アッセイは前記ELISAア
ッセイで記載されるようにして行われ、抗体を溶液中の
フィブリノーゲンとプレインキュベーションした。要約
すると、ハイブリドーマ上清を、抗体のフィブリノーゲ
ンへの非特異的結合を阻止するためにBSA(10mg／ml) を
含有する生理学的濃度のフィブリノーゲン溶液 (４mg／
ml) と37℃で30分間インキュベートした。次にフィブリ
ノーゲン／抗体溶液を、フィブリンを被覆したマイクロ
タイタープレートのウェルに移した。GlyProArgPro(GPR
P)を、フィブリンウェル中に残留するトロンビンによる
フィブリノーゲンのありうる重合防止するためにフィブ
リノーゲンインヒビターに添加した。次にアッセイを固
定化抗原に結合された抗体に関する慣用のELISA アッセ
イと同様にして実施した。MH１抗体のフィブリン特異性
を検査する全ての実験において、第２の抗体45Ｊを対照
として用いた。45Ｊはフィブリンおよびフィブリノーゲ
ンと交差反応する。
【００８２】 フィブリノーゲンとの交差反応の測定 ｉ）固定化されたフィブリンおよびフィブリノーゲン 細胞系MH１は、フィブリンが PVCマイクロタイターアッ
セイプレートの表面に固定化された場合、それと交差反
応するマウスモノクローナル抗体を産生する (第５表)
。同じアッセイにおいて、この抗体はプレートに固定
化されたフィブリノーゲンを認識しない。第５表のデー
タが示すように、フィブリノーゲンがいったんトロンビ
ンによりフィブリンに変換されると免疫反応は劇的に増
大し、このことはフィブリン分子上の新しいエピトープ
の露出または形成を明らかに示している。しかしながら
対照抗体である45Ｊはフィブリノーゲンがフィブリンに
変換された場合に保存されているエピトープを明らかに
認識する。
セイプレートの表面に固定化された場合、それと交差反
応するマウスモノクローナル抗体を産生する (第５表)
。同じアッセイにおいて、この抗体はプレートに固定
化されたフィブリノーゲンを認識しない。第５表のデー
タが示すように、フィブリノーゲンがいったんトロンビ
ンによりフィブリンに変換されると免疫反応は劇的に増
大し、このことはフィブリン分子上の新しいエピトープ
の露出または形成を明らかに示している。しかしながら
対照抗体である45Ｊはフィブリノーゲンがフィブリンに
変換された場合に保存されているエピトープを明らかに
認識する。
【００８３】ii) フィブリンおよびフィブリノーゲンと
の競合アッセイ 抗体、MH１抗体のフィブリン特異性は、ハイブリドーマ
上清をフィブリン被覆ウェル上でのELISA に先立ちフィ
ブリノーゲン溶液 (最終濃度４mg／ml) とプレインキュ
ベートする競合アッセイでさらに示された。かかる高レ
ベルのフィブリノーゲンをこの競合アッセイに用いたの
で (抗体濃度の×500)、 BSA (最終濃度10mg／ml) を混
合物に添加した。フィブリン被覆ウェル上の残留トロン
ビンによるフィブリン重合を阻止するためにペプチドGP
RPを添加した。このアッセイの結果は、MH１抗体が溶液
中のフィブリノーゲンを認識しないことを示している
(第６図)。
の競合アッセイ 抗体、MH１抗体のフィブリン特異性は、ハイブリドーマ
上清をフィブリン被覆ウェル上でのELISA に先立ちフィ
ブリノーゲン溶液 (最終濃度４mg／ml) とプレインキュ
ベートする競合アッセイでさらに示された。かかる高レ
ベルのフィブリノーゲンをこの競合アッセイに用いたの
で (抗体濃度の×500)、 BSA (最終濃度10mg／ml) を混
合物に添加した。フィブリン被覆ウェル上の残留トロン
ビンによるフィブリン重合を阻止するためにペプチドGP
RPを添加した。このアッセイの結果は、MH１抗体が溶液
中のフィブリノーゲンを認識しないことを示している
(第６図)。
【００８４】フィブリン400ng がマイクロタイターアッ
セイプレートの各ウェルに結合すると仮定すると、この
特別の競合アッセイに使用されたフィブリノーゲンレベ
ルは結合フィブリン抗原よりも 1,000倍過剰である。さ
らに、これは組織上清中の抗体レベルの４00倍過剰であ
る。 第５表 フィブリノーゲンおよびフィブリン抗原 とのMH１抗体の交差反応性 MAb Ａ405nM ／30分 フィブリン フィブリノーゲン MH１ .90 0.25 45Ｊ 1.65 1.50 第６表 フィブリノーゲンの存在下におけるMH１抗体 とフィブリンとの交差反応性 MAb Ａ405nM ／30分 ＋フィブリノーゲン −フィブリノーゲン MH１ 1.24 1.27 45Ｊ 0.438 1.74 フィブリン (ブィブリノーゲン) 分解産物との交差
反応性の測定 フィブリノーゲン分解産物 (FDP)はフィブリノーゲンを
プラスミンと37℃で10分〜３時間インキュベートするこ
とにより調製した。所望の時間にトラシロール(Trasylo
l)(100カリクレインインヒビター単位／ml) および20mM
イプシロンアミノカプロン酸 (EACA) の添加によりフィ
ブリノーゲン分解を停止させた。
セイプレートの各ウェルに結合すると仮定すると、この
特別の競合アッセイに使用されたフィブリノーゲンレベ
ルは結合フィブリン抗原よりも 1,000倍過剰である。さ
らに、これは組織上清中の抗体レベルの４00倍過剰であ
る。 第５表 フィブリノーゲンおよびフィブリン抗原 とのMH１抗体の交差反応性 MAb Ａ405nM ／30分 フィブリン フィブリノーゲン MH１ .90 0.25 45Ｊ 1.65 1.50 第６表 フィブリノーゲンの存在下におけるMH１抗体 とフィブリンとの交差反応性 MAb Ａ405nM ／30分 ＋フィブリノーゲン −フィブリノーゲン MH１ 1.24 1.27 45Ｊ 0.438 1.74 フィブリン (ブィブリノーゲン) 分解産物との交差
反応性の測定 フィブリノーゲン分解産物 (FDP)はフィブリノーゲンを
プラスミンと37℃で10分〜３時間インキュベートするこ
とにより調製した。所望の時間にトラシロール(Trasylo
l)(100カリクレインインヒビター単位／ml) および20mM
イプシロンアミノカプロン酸 (EACA) の添加によりフィ
ブリノーゲン分解を停止させた。
【００８５】架橋フィブリン分解産物 (XLFDP)は、10mM
CaCl2、プラスミノーゲン (0.25mg／ml) およびウロキ
ナーゼ (50IU／ml) を含有するトリス緩衝食塩水 (TBS,
pH７４、50mMトリスHCl、150mM NaCl) 中のフィブリノ
ーゲン溶液 (５mg／ml) にトロンビン (４NIH 単位／m
l) を添加することにより調製した。この混合物を37℃
でインキュベートしそしてプラスミン消化を前記FDP で
記載したようにして種々の時間間隔で終了させた。
CaCl2、プラスミノーゲン (0.25mg／ml) およびウロキ
ナーゼ (50IU／ml) を含有するトリス緩衝食塩水 (TBS,
pH７４、50mMトリスHCl、150mM NaCl) 中のフィブリノ
ーゲン溶液 (５mg／ml) にトロンビン (４NIH 単位／m
l) を添加することにより調製した。この混合物を37℃
でインキュベートしそしてプラスミン消化を前記FDP で
記載したようにして種々の時間間隔で終了させた。
【００８６】抗体とフィブリン分解産物およびフィブリ
ノーゲン分解産物との交差反応性を測定するためには、
適当な分解産物をマイクロタイタープレートに被覆しそ
して常法によりELISA を行った。第７表の結果が示すよ
うに、MH１抗体はプラスミンにより生成されたフィブリ
ノーゲン分解産物のいずれとも交差反応しない。第８表
が示すとおり、この抗体はXL−フィブリン分解産物と反
応しない。また、抗体をウェスタンブロッティング分析
により交差反応性について検査した場合にもこの観察が
なされた。
ノーゲン分解産物との交差反応性を測定するためには、
適当な分解産物をマイクロタイタープレートに被覆しそ
して常法によりELISA を行った。第７表の結果が示すよ
うに、MH１抗体はプラスミンにより生成されたフィブリ
ノーゲン分解産物のいずれとも交差反応しない。第８表
が示すとおり、この抗体はXL−フィブリン分解産物と反
応しない。また、抗体をウェスタンブロッティング分析
により交差反応性について検査した場合にもこの観察が
なされた。
【００８７】抗体は、前駆体分子フィブリノーゲンの表
面上に存在しないか露出されていない無傷のフィブリン
分子のエピトープを認識するという結論が導き出されう
る。このエピトープは第８表のデータが示唆するとお
り、架橋フィブリンのプラスミン消化により明らかに破
壊される。従って、MH１抗体は以下のように定義されう
るフィブリン特異的モノクローナル抗体である。
面上に存在しないか露出されていない無傷のフィブリン
分子のエピトープを認識するという結論が導き出されう
る。このエピトープは第８表のデータが示唆するとお
り、架橋フィブリンのプラスミン消化により明らかに破
壊される。従って、MH１抗体は以下のように定義されう
るフィブリン特異的モノクローナル抗体である。
【００８８】すなわち本発明の目的にとって、フィブリ
ン特異的モノクローナル抗体は次のようなモノクローナ
ル抗体である： １. 前記した、フィブリンおよびフィブリノーゲンとの
交差反応性を測定するための競合アッセイにおいて、こ
のモノクローナル抗体はフィブリノーゲンがフィブリン
と比較して1000倍過剰量で用いられた場合にフィブリノ
ーゲンと約75％以下、そして好ましくは約10％以下の交
差反応性しか有しない、 ２. 前記した、架橋フィブリンおよびフィブリン分解産
物との交差反応性を測定するためのアッセイにおいて、
このモノクローナル抗体と、プラスミンで約３時間消化
したフィブリンとの反応性はモノクローナル抗体とフィ
ブリンとのゼロ時間における反応性の約50％以下、そし
て好ましくは約40％以下である、および ３. 前記した、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲ
ン分解産物との交差反応性を測定するためのアッセイに
おいて、このモノクローナル抗体と、プラスミンで約４
時間消化したフィブリノーゲンとの反応性はゼロ時間で
のこのモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとの反応
性より決して大きくない。
ン特異的モノクローナル抗体は次のようなモノクローナ
ル抗体である： １. 前記した、フィブリンおよびフィブリノーゲンとの
交差反応性を測定するための競合アッセイにおいて、こ
のモノクローナル抗体はフィブリノーゲンがフィブリン
と比較して1000倍過剰量で用いられた場合にフィブリノ
ーゲンと約75％以下、そして好ましくは約10％以下の交
差反応性しか有しない、 ２. 前記した、架橋フィブリンおよびフィブリン分解産
物との交差反応性を測定するためのアッセイにおいて、
このモノクローナル抗体と、プラスミンで約３時間消化
したフィブリンとの反応性はモノクローナル抗体とフィ
ブリンとのゼロ時間における反応性の約50％以下、そし
て好ましくは約40％以下である、および ３. 前記した、フィブリノーゲンおよびフィブリノーゲ
ン分解産物との交差反応性を測定するためのアッセイに
おいて、このモノクローナル抗体と、プラスミンで約４
時間消化したフィブリノーゲンとの反応性はゼロ時間で
のこのモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとの反応
性より決して大きくない。
【００８９】MH１抗体は、そのフィブリンに対するアフ
ィニティを測定することによりさらに特性決定されてい
る。アフィニティは125I 標識MH１抗体を用いスカッチ
ャード分析 (Frankel ら、Molecular Immunology, 16,
101-106 (1979)) により測定した。解離定数 KD につい
て得られた値は6.７×10-10M であった。かかるアフィ
ニティはフィブリンに対するt-PAのアフィニティのそれ
の約5,000倍である。
ィニティを測定することによりさらに特性決定されてい
る。アフィニティは125I 標識MH１抗体を用いスカッチ
ャード分析 (Frankel ら、Molecular Immunology, 16,
101-106 (1979)) により測定した。解離定数 KD につい
て得られた値は6.７×10-10M であった。かかるアフィ
ニティはフィブリンに対するt-PAのアフィニティのそれ
の約5,000倍である。
【００９０】MH１抗体がフィブリノーゲンのＡα、Ｂβ
またはガンマ鎖と交差反応しないこともウェスタンブロ
ッティング分析により測定されている。また、MH１抗体
がフィブリノーゲンのトロンビン処理ＡαまたはＢβ鎖
と交差反応しないことも同じ分析法により測定されてい
る。 (フィブリノーゲンのトロンビン処理は、Ａα鎖お
よびＢβ鎖からそれぞれフィブリノペプチドＡおよびフ
ィブリノペプチドＢの放出を生じ、それゆえフィブリン
のα鎖およびβ鎖が形成される。) 第７表 フィブリノーゲン分解産物とのMH１抗体の交差反応性 プラスミン消化時間 Ａ (分) 405nm／30分 MH１ 45Ｊ 0 0.15 1.037 10 0.10 nm 20 0.11 1.02 40 0.11 0.410 60 0.10 0.330 240 0.09 0.300 第８表 フィブリン分解産物とのMH１抗体の交差反応性 プラスミン消化時間 Ａ (時間) 405nm／30分 MH１ 45Ｊ 0 0.890 1.40 3 0.354 1.0 5 0.310 0.77 加えて、第７表の結果が示すとおり、対照抗体45Ｊ抗体
はフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲン分
解産物とは交差反応しない。従って、かかるモノクロー
ナル抗体はフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体
であって本発明のもう一つの観点を表わすものである。
フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は、インビ
トロで血漿フィブリノーゲンレベルを測定するのに利用
できる任意のイムノアッセイに使用できる。45Ｊ抗体
は、45ＪエピトープがフィブリノーゲンのＡα鎖のアミ
ノ酸およそ206からおよそ424までの領域にあり、そして
およそ207からおよそ231までの領域にある可能性が最も
高いことが測定されているという点でさらに特性決定さ
れている。本発明の目的にとって、フィブリノーゲン特
異的モノクローナル抗体は前記したように、フィブリノ
ーゲンおよびフィブリノーゲン分解産物との交差反応性
を測定するアッセイにおいて、プラスミンで約40分間消
化したフィブリノーゲンとそのモノクローナル抗体との
反応性がモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとのゼ
ロ時間での反応性の約50％以下である抗体である。
またはガンマ鎖と交差反応しないこともウェスタンブロ
ッティング分析により測定されている。また、MH１抗体
がフィブリノーゲンのトロンビン処理ＡαまたはＢβ鎖
と交差反応しないことも同じ分析法により測定されてい
る。 (フィブリノーゲンのトロンビン処理は、Ａα鎖お
よびＢβ鎖からそれぞれフィブリノペプチドＡおよびフ
ィブリノペプチドＢの放出を生じ、それゆえフィブリン
のα鎖およびβ鎖が形成される。) 第７表 フィブリノーゲン分解産物とのMH１抗体の交差反応性 プラスミン消化時間 Ａ (分) 405nm／30分 MH１ 45Ｊ 0 0.15 1.037 10 0.10 nm 20 0.11 1.02 40 0.11 0.410 60 0.10 0.330 240 0.09 0.300 第８表 フィブリン分解産物とのMH１抗体の交差反応性 プラスミン消化時間 Ａ (時間) 405nm／30分 MH１ 45Ｊ 0 0.890 1.40 3 0.354 1.0 5 0.310 0.77 加えて、第７表の結果が示すとおり、対照抗体45Ｊ抗体
はフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲン分
解産物とは交差反応しない。従って、かかるモノクロー
ナル抗体はフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体
であって本発明のもう一つの観点を表わすものである。
フィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体は、インビ
トロで血漿フィブリノーゲンレベルを測定するのに利用
できる任意のイムノアッセイに使用できる。45Ｊ抗体
は、45ＪエピトープがフィブリノーゲンのＡα鎖のアミ
ノ酸およそ206からおよそ424までの領域にあり、そして
およそ207からおよそ231までの領域にある可能性が最も
高いことが測定されているという点でさらに特性決定さ
れている。本発明の目的にとって、フィブリノーゲン特
異的モノクローナル抗体は前記したように、フィブリノ
ーゲンおよびフィブリノーゲン分解産物との交差反応性
を測定するアッセイにおいて、プラスミンで約40分間消
化したフィブリノーゲンとそのモノクローナル抗体との
反応性がモノクローナル抗体とフィブリノーゲンとのゼ
ロ時間での反応性の約50％以下である抗体である。
【００９１】45Ｊハイブリドーマはフィブリンで免疫し
た慣用のBalb/cマウスを用いる常法により作られた。し
かしながら、フィブリノーゲンも抗原として利用でき
る。 非架橋フィブリンおよび非架橋フィブリン凝血塊と
の交差反応性の測定抗体MH１は架橋フィブリン (XLFn)
とのみならず非架橋フィブリン (NONXLFn)とも交差反応
することがELISA により示されている。ELISA は以下の
ようにして行われた。 １. 96ウェルマイクロタイターアッセイプレートを100
μｌのフィブリノーゲン溶液 (ボレート(pH8.5) 食塩水
緩衝液中50μg/ml) で４℃で一夜被覆した。 ２. 架橋フィブリンは、２mM CaCl2および10mMシステイ
ンを含有するトリス緩衝食塩水(TBS、pH7.４、50mMトリ
スHCl、150mM NaCl) 中のトロンビン溶液 (10NIH単位／
ml) と37℃で１時間インキュベーションすることにより
フィブリノーゲン被覆ウェル中で形成された。 ３. 非架橋フィブリンはEDTAを最終濃度0.0125M まで含
有するりん酸塩緩衝液 (pH6.１) 中のトロンビン溶液
(10NIH 単位／ml) と37℃で１時間インキュベーション
することにより、フィブリノーゲン被覆ウェル中で形成
された。 ４. 結合された抗体は抗マウスアルカリホスファターゼ
接合体とインキュベーションすることにより測定した。
結合された接合体はアルカリホスファターゼ基質を添加
することにより測定しそして生ずる比色反応を自動式プ
レート読みとり器中405nMで監視し た。
た慣用のBalb/cマウスを用いる常法により作られた。し
かしながら、フィブリノーゲンも抗原として利用でき
る。 非架橋フィブリンおよび非架橋フィブリン凝血塊と
の交差反応性の測定抗体MH１は架橋フィブリン (XLFn)
とのみならず非架橋フィブリン (NONXLFn)とも交差反応
することがELISA により示されている。ELISA は以下の
ようにして行われた。 １. 96ウェルマイクロタイターアッセイプレートを100
μｌのフィブリノーゲン溶液 (ボレート(pH8.5) 食塩水
緩衝液中50μg/ml) で４℃で一夜被覆した。 ２. 架橋フィブリンは、２mM CaCl2および10mMシステイ
ンを含有するトリス緩衝食塩水(TBS、pH7.４、50mMトリ
スHCl、150mM NaCl) 中のトロンビン溶液 (10NIH単位／
ml) と37℃で１時間インキュベーションすることにより
フィブリノーゲン被覆ウェル中で形成された。 ３. 非架橋フィブリンはEDTAを最終濃度0.0125M まで含
有するりん酸塩緩衝液 (pH6.１) 中のトロンビン溶液
(10NIH 単位／ml) と37℃で１時間インキュベーション
することにより、フィブリノーゲン被覆ウェル中で形成
された。 ４. 結合された抗体は抗マウスアルカリホスファターゼ
接合体とインキュベーションすることにより測定した。
結合された接合体はアルカリホスファターゼ基質を添加
することにより測定しそして生ずる比色反応を自動式プ
レート読みとり器中405nMで監視し た。
【００９２】アッセイの結果を第９表に示し、そして架
橋フィブリンとの抗体の交差反応性はそれと非架橋フィ
ブリンとのそれより大きいと結論できる。最も簡単な説
明は架橋重合体状構造中に存在する共有架橋が抗体が認
識するコンホーメーションを固定または凍結させる役目
をするということである。非架橋種ではコンホーメーシ
ョンは形成されはするが重合体の共有結合によって安定
化されていない。
橋フィブリンとの抗体の交差反応性はそれと非架橋フィ
ブリンとのそれより大きいと結論できる。最も簡単な説
明は架橋重合体状構造中に存在する共有架橋が抗体が認
識するコンホーメーションを固定または凍結させる役目
をするということである。非架橋種ではコンホーメーシ
ョンは形成されはするが重合体の共有結合によって安定
化されていない。
【００９３】この抗体がインビトロで形成された架橋お
よび非架橋凝血塊の両方と交差反応することも示されて
いる。架橋フィブリンは、フィブリノーゲン溶液(CaCl2
(２mM) およびシステイン (10mM) を含有するトリス (5
0mM、pH７４) 食塩水中) をトロンビン (10NIH 単位／m
l) と37℃で３時間インキュベートすることにより調製
した。非架橋フィブリンは、EDTAを最終濃度0.0125Ｍま
で含有するりん酸塩緩衝液 (pH6.１) 中のフィブリノー
ゲン溶液 (３mg／ml) をトロンビン溶液 (10NIH 単位／
ml) と37℃で３時間インキュベートすることにより形成
された。凝血塊の形成後、これらを洗浄しそして125I
−標識MH１を含有する１％ BSA溶液 400μｌと37℃でイ
ンキュベートした。種々の時点で少量の溶液をとり出し
そして抗体とり込みの量をガンマカウンター中で血漿を
計測することにより測定した。第10表は非架橋および架
橋凝血塊の両方による抗体のとり込みを示す。 第９表 架橋および非架橋フィブリン とのMH１抗体の交差反応性 抗体濃度 架橋フィブリン 非架橋フィブリン (ng./ml.) (405ナノメーターでの吸収) 100.000 0.764 0.409 50.000 0.460 0.319 25.000 0.305 0.154 12.500 0.174 0.074 6.250 0.069 0.000 第 10 表 架橋および非架橋フィブリン凝血塊 とのMH１抗体の交差反応性 フィブリン凝血塊 ８時間後の標識抗体のとり込み％ 架 橋 79％ 非架橋 76％ （６）ハイブリドーマの寄託 MH１および45Ｊは1988年６月９日にアメリカン タイプ
カルチャーコレクション(ATCC)に寄託されておりそして
それぞれ受託番号HB 9739およびHB 9740を与えられた。
ATCCは12301 Parklawn Drive, Rockville,MD. 20852に
ある。MH１抗体はカッパ軽鎖を有するIg1 抗体でありそ
してMH１抗体はヒトフィブリンのみならずウサギフィブ
リンとも交差反応することが観察されている。
よび非架橋凝血塊の両方と交差反応することも示されて
いる。架橋フィブリンは、フィブリノーゲン溶液(CaCl2
(２mM) およびシステイン (10mM) を含有するトリス (5
0mM、pH７４) 食塩水中) をトロンビン (10NIH 単位／m
l) と37℃で３時間インキュベートすることにより調製
した。非架橋フィブリンは、EDTAを最終濃度0.0125Ｍま
で含有するりん酸塩緩衝液 (pH6.１) 中のフィブリノー
ゲン溶液 (３mg／ml) をトロンビン溶液 (10NIH 単位／
ml) と37℃で３時間インキュベートすることにより形成
された。凝血塊の形成後、これらを洗浄しそして125I
−標識MH１を含有する１％ BSA溶液 400μｌと37℃でイ
ンキュベートした。種々の時点で少量の溶液をとり出し
そして抗体とり込みの量をガンマカウンター中で血漿を
計測することにより測定した。第10表は非架橋および架
橋凝血塊の両方による抗体のとり込みを示す。 第９表 架橋および非架橋フィブリン とのMH１抗体の交差反応性 抗体濃度 架橋フィブリン 非架橋フィブリン (ng./ml.) (405ナノメーターでの吸収) 100.000 0.764 0.409 50.000 0.460 0.319 25.000 0.305 0.154 12.500 0.174 0.074 6.250 0.069 0.000 第 10 表 架橋および非架橋フィブリン凝血塊 とのMH１抗体の交差反応性 フィブリン凝血塊 ８時間後の標識抗体のとり込み％ 架 橋 79％ 非架橋 76％ （６）ハイブリドーマの寄託 MH１および45Ｊは1988年６月９日にアメリカン タイプ
カルチャーコレクション(ATCC)に寄託されておりそして
それぞれ受託番号HB 9739およびHB 9740を与えられた。
ATCCは12301 Parklawn Drive, Rockville,MD. 20852に
ある。MH１抗体はカッパ軽鎖を有するIg1 抗体でありそ
してMH１抗体はヒトフィブリンのみならずウサギフィブ
リンとも交差反応することが観察されている。
【００９４】本発明は寄託されたハイブリドーマにその
範囲が限定れることを意図するものではなく、これらは
ここに定義されるようにフィブリン特異的モノクローナ
ル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗
体を生成したハイブリドーマの単一の説明例であること
が意図される。機能的に同等なすべての細胞系が本発明
の範囲内にある。“機能的に同等" なる用語は、MH１抗
体が結合するフィブリンのエピトープへの結合または45
Ｊ抗体が結合するフィブリノーゲンのエピトープへの結
合においてそれぞれMH１抗体または45Ｊ抗体とその抗体
が競合しうることを意味する。さらに、かかる用語には
ここに記載されるように、MH１抗体が結合しそして45Ｊ
抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合
するフィブリン特異的モノクローナル抗体およびフィブ
リノーゲン特異的モノクローナル抗体がそれぞれ包含さ
れる。 （７）フィブリン特異的モノクローナル抗体のインビボ
診断用途および治療用途 凝血塊／血管病所在確認 本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体はインビ
ボでフィブリン凝血塊またはフィブリン集塊を標的ねら
いしうる。それゆえこれらはヒトのありうる組織または
血管損傷の局在判定および血管疾患の監視に用いること
ができる。フィブリン特異的モノクローナル抗体は、か
かるモノクローナル抗体がフィブリノーゲン、フィブリ
ン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物に結合せ
ず、それによりバックグラウンドを低下させ、このこと
によりフィブリン凝血塊またはフィブリンの集塊物をよ
り正確に所在確認できるので、この用途に特に好まし
い。
範囲が限定れることを意図するものではなく、これらは
ここに定義されるようにフィブリン特異的モノクローナ
ル抗体およびフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗
体を生成したハイブリドーマの単一の説明例であること
が意図される。機能的に同等なすべての細胞系が本発明
の範囲内にある。“機能的に同等" なる用語は、MH１抗
体が結合するフィブリンのエピトープへの結合または45
Ｊ抗体が結合するフィブリノーゲンのエピトープへの結
合においてそれぞれMH１抗体または45Ｊ抗体とその抗体
が競合しうることを意味する。さらに、かかる用語には
ここに記載されるように、MH１抗体が結合しそして45Ｊ
抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合
するフィブリン特異的モノクローナル抗体およびフィブ
リノーゲン特異的モノクローナル抗体がそれぞれ包含さ
れる。 （７）フィブリン特異的モノクローナル抗体のインビボ
診断用途および治療用途 凝血塊／血管病所在確認 本発明のフィブリン特異的モノクローナル抗体はインビ
ボでフィブリン凝血塊またはフィブリン集塊を標的ねら
いしうる。それゆえこれらはヒトのありうる組織または
血管損傷の局在判定および血管疾患の監視に用いること
ができる。フィブリン特異的モノクローナル抗体は、か
かるモノクローナル抗体がフィブリノーゲン、フィブリ
ン分解産物およびフィブリノーゲン分解産物に結合せ
ず、それによりバックグラウンドを低下させ、このこと
によりフィブリン凝血塊またはフィブリンの集塊物をよ
り正確に所在確認できるので、この用途に特に好まし
い。
【００９５】この応用にとっては、精製モノクローナル
抗体の使用が好ましい。精製はHPLC法でなされるのが好
ましい。ヒトへの投与用のモノクローナル抗体の精製は
また硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム沈澱に続く
食塩水での透析および濾過滅菌によっても達成できる。
あるいはまた、イムノアフィニティクロマトグラフィー
法をモノクローナル抗体の精製に用いることもできる。
抗体の使用が好ましい。精製はHPLC法でなされるのが好
ましい。ヒトへの投与用のモノクローナル抗体の精製は
また硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム沈澱に続く
食塩水での透析および濾過滅菌によっても達成できる。
あるいはまた、イムノアフィニティクロマトグラフィー
法をモノクローナル抗体の精製に用いることもできる。
【００９６】精製モノクローナル抗体は放射性化合物例
えば、 123I 、 125I 、 131 I、 99mTc、 111 In
で標識しそして患者に静脈投与することができる。抗体
は磁気プローブで標識することもできる。次に凝血塊の
位置を正確に指摘するのにNMR を利用できる。凝血塊ま
たはフィブリン集塊物での抗体の局在確認後、それらを
放射形トモグラフィー法および放射性核走査法により検
出し、それにより例えば血栓またはフィブリンによりカ
プセル化された腫瘍の位置を正確に指摘できる。
えば、 123I 、 125I 、 131 I、 99mTc、 111 In
で標識しそして患者に静脈投与することができる。抗体
は磁気プローブで標識することもできる。次に凝血塊の
位置を正確に指摘するのにNMR を利用できる。凝血塊ま
たはフィブリン集塊物での抗体の局在確認後、それらを
放射形トモグラフィー法および放射性核走査法により検
出し、それにより例えば血栓またはフィブリンによりカ
プセル化された腫瘍の位置を正確に指摘できる。
【００９７】例示するには、精製モノクローナル抗体を
適当な担体例えばヒトアルブミンを含有または含有しな
い食塩水中に適当な用量で懸濁させ、そして患者に投与
する。このモノクローナル抗体は好ましくは静脈投与、
例えば数時間にわたり連続して静脈注入することにより
投与される。 血管疾患のモノクローナル抗体接合体を用いる治療 本発明のモノクローナル抗体は広範囲の薬剤例えば細胞
毒剤および血栓溶解剤例えばt-PA、ウロキナーゼ、スト
レプトキナーゼ、およびフィブリンを溶解させうる他の
プロテアーゼと一緒に使用できる。かかる使用は特に好
ましい、何故なら本発明のフィブリン特異的モノクロー
ナル抗体は、かかる試薬のどれもフィブリノーゲン、フ
ィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分解産物への
結合によって失われないであろうからかかる試薬の非常
に効率的な使用ができようからである。この点に関する
種々の概説はBaleら、1980, CancerResearch, 40: 2965-
297; Ghose および Blair, 1978, J.Natl. Cancer Ins
t., 61(3): 657-676; Gregoriadis,1977, Nature, 265:
407-411; Gregoriadis, 1980,Pharmac. Ther., 10:103
-108; および Trouet ら、1980, Recent Results Canc
er Res., 75: 229-235 を参照されたい。
適当な担体例えばヒトアルブミンを含有または含有しな
い食塩水中に適当な用量で懸濁させ、そして患者に投与
する。このモノクローナル抗体は好ましくは静脈投与、
例えば数時間にわたり連続して静脈注入することにより
投与される。 血管疾患のモノクローナル抗体接合体を用いる治療 本発明のモノクローナル抗体は広範囲の薬剤例えば細胞
毒剤および血栓溶解剤例えばt-PA、ウロキナーゼ、スト
レプトキナーゼ、およびフィブリンを溶解させうる他の
プロテアーゼと一緒に使用できる。かかる使用は特に好
ましい、何故なら本発明のフィブリン特異的モノクロー
ナル抗体は、かかる試薬のどれもフィブリノーゲン、フ
ィブリン分解産物またはフィブリノーゲン分解産物への
結合によって失われないであろうからかかる試薬の非常
に効率的な使用ができようからである。この点に関する
種々の概説はBaleら、1980, CancerResearch, 40: 2965-
297; Ghose および Blair, 1978, J.Natl. Cancer Ins
t., 61(3): 657-676; Gregoriadis,1977, Nature, 265:
407-411; Gregoriadis, 1980,Pharmac. Ther., 10:103
-108; および Trouet ら、1980, Recent Results Canc
er Res., 75: 229-235 を参照されたい。
【００９８】これら薬剤をモノクローナル抗体分子に結
合させるのに用いられる方法は非共有または共有結合を
包含しうる。非共有結合は抗体複合体が標的部位に到達
する以前に破壊される可能性がより高そうなので、共有
結合が好ましい。例えば、カルボジイミド結合は薬剤の
カルボキシ基と抗体分子のアミノ基との間で形成されう
る。ジアルデヒドまたはイミドエステルのような二官能
剤を薬物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合させる
のに使用できる。シッフ塩基反応は薬物を抗体分子に結
合させるのに使用できる。この方法はグリコールまたは
ヒドロキシ基を含有する薬物または細胞毒剤の過ヨウ素
酸塩酸化、従ってアルデヒドの形成を包含し、次にこれ
が抗体分子と反応する。結合は抗体分子のアミノ基との
シッフ塩基形成を介して起る。さらに、反応性スルフヒ
ドリル基を有する薬物も抗体分子に結合されている。 微生物 アメリカンタイプカルチャーコレクション 12301 Parklawn Drive Rockville MD 20852 USA 1988年６月９日寄託、受託番号 HB 9740
合させるのに用いられる方法は非共有または共有結合を
包含しうる。非共有結合は抗体複合体が標的部位に到達
する以前に破壊される可能性がより高そうなので、共有
結合が好ましい。例えば、カルボジイミド結合は薬剤の
カルボキシ基と抗体分子のアミノ基との間で形成されう
る。ジアルデヒドまたはイミドエステルのような二官能
剤を薬物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合させる
のに使用できる。シッフ塩基反応は薬物を抗体分子に結
合させるのに使用できる。この方法はグリコールまたは
ヒドロキシ基を含有する薬物または細胞毒剤の過ヨウ素
酸塩酸化、従ってアルデヒドの形成を包含し、次にこれ
が抗体分子と反応する。結合は抗体分子のアミノ基との
シッフ塩基形成を介して起る。さらに、反応性スルフヒ
ドリル基を有する薬物も抗体分子に結合されている。 微生物 アメリカンタイプカルチャーコレクション 12301 Parklawn Drive Rockville MD 20852 USA 1988年６月９日寄託、受託番号 HB 9740
【００９９】
【発明の効果】本発明により、抗原を抗体と接触させる
ことからなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッ
セイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から
得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビト
ロで臨床的診断および治療に利用するための方法が提供
される。また本発明により、フィブリン特異的モノクロ
ーナル抗体をも提供される。
ことからなる該抗原の存在を判定するためのイムノアッ
セイ、モノクローナル抗体および免疫した無菌動物から
得られたポリクローナル抗体をインビボおよびインビト
ロで臨床的診断および治療に利用するための方法が提供
される。また本発明により、フィブリン特異的モノクロ
ーナル抗体をも提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/465 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 プロプリス，ヴィクトリア，エー アメリカ合衆国，インディアナ州 46615, サウスベンド，ジェファーソン スクウ ェア 3317 (72)発明者 プリーザンツ，ジュリアン，アール. アメリカ合衆国，インディアナ州 46530, グレンジャー，ガムウッド ロード 52631
Claims (15)
- 【請求項１】 (a) フィブリノーゲン、(b) プラスミン
誘導フィブリノーゲン分解産物、および(c) プラスミン
誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、ハイブリド
ーマ ATCC HB 9739 により生産されたフィブリン特異的
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 像形成剤または治療剤に結合された、請
求項１のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 (a) フィブリノーゲン、(b) プラスミン
誘導フィブリノーゲン分解産物、および(c) プラスミン
誘導フィブリン分解産物と交差反応しない、フィブリン
特異的モノクローナル抗体を産生する連続細胞系列ハイ
ブリドーマ ATCC HB 9739。 - 【請求項４】 ハイブリドーマ ATCC HB 9739 により産
生されたMH-1抗体のMH-1標的抗原への免疫特異的結合を
競合的に阻害し、かつ (a) フィブリノーゲン、 (b) プラスミン誘導フィブリノーゲン分解産物、 および (c) プラスミン誘導フィブリン分解産物、 と交差反応しない、モノクローナル抗体。 - 【請求項５】 像形成剤または治療剤に結合された、請
求項４のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 有効量のモノクローナル抗体を診断学的
に許容しうる担体と共に含有して成るインビボでフィブ
リン凝血塊またはフィブリンの凝集を局在判定するため
の診断用組成物であって、該モノクローナル抗体が請求
項１または４のフィブリン特異的モノクローナル抗体で
ある組成物。 - 【請求項７】 有効量のモノクローナル抗体と血栓溶解
剤を製剤学的に許容しうる担体と共に含有して成る血栓
を治療するための医薬組成物であって、該モノクローナ
ル抗体が請求項１または４のフィブリン特異的モノクロ
ーナル抗体である組成物。 - 【請求項８】 有効量のモノクローナル抗体と細胞毒剤
を製剤学的に許容しうる担体と共に含有して成るフィブ
リンカプセル化腫瘍を治療するための医薬組成物であっ
て、該モノクローナル抗体が請求項１または４のフィブ
リン特異的モノクローナル抗体である組成物。 - 【請求項９】 血漿フィブリンをモノクローナル抗体と
接触させることから成るインビトロで血漿フィブリンレ
ベルを測定するためのイムノアッセイにおいて、改良点
が該モノクローナル抗体として請求項１または４のフィ
ブリン特異的モノクローナル抗体を用いることから成る
方法。 - 【請求項１０】 請求項１または４のフィブリン特異的
モノクローナル抗体を含むキット。 - 【請求項１１】 (a) フィブリノーゲンの単離した Aα
鎖に結合し、(b) トロンビンによるフィブリノーゲンの
フィブリンへの変換時間を延長せず、(c) フィブリンに
結合し、そして(d) プラスミン誘導フィブリノーゲン分
解産物と交差反応しない、ハイブリドーマ ATCC HB 974
0 により産生されたフィブリノーゲン特異的モノクロー
ナル抗体。 - 【請求項１２】 (a) フィブリノーゲンの単離した Aα
鎖に結合し、(b) トロンビンによるフィブリノーゲンの
フィブリンへの変換時間を延長せず、(c) フィブリンに
結合し、そして(d) プラスミン誘導フィブリノーゲン分
解産物と交差反応しない、フィブリノーゲン特異的モノ
クローナル抗体を産生する連続細胞系列ハイブリドーマ
ATCC HB 9740。 - 【請求項１３】 ハイブリドーマ ATCC HB 9740 により
産生された45J 抗体の45J 標的抗原への免疫特異的結合
を競合的に阻害し、かつ(a) フィブリノーゲンの単離し
た Aα鎖に結合し、(b) トロンビンによるフィブリノー
ゲンのフィブリンへの変換時間を延長せず、(c) フィブ
リンに結合し、そして(d) プラスミン誘導フィブリノー
ゲン分解産物と交差反応しない、ことを特徴とするモノ
クローナル抗体。 - 【請求項１４】 血漿フィブリノーゲンをモノクローナ
ル抗体と接触させることから成るインビトロで血漿フィ
ブリノーゲンレベルを測定するためのイムノアッセイに
おいて、改良点が該モノクローナル抗体として請求項11
または13のフィブリノーゲン特異的モノクローナル抗体
を用いることから成る方法。 - 【請求項１５】 請求項11または13のモノクローナル抗
体を含むキット。
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|---|---|---|---|
| US20625988A | 1988-06-13 | 1988-06-13 | |
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|---|---|---|---|
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| US5792742A (en) * | 1991-06-14 | 1998-08-11 | New York University | Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin |
| DE4134833A1 (de) * | 1991-09-25 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fibrin |
| US5789183A (en) * | 1992-08-14 | 1998-08-04 | University Of Arkansas | Serological detection and identification of rice blast |
| US5443827A (en) * | 1993-05-03 | 1995-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fibrin-targeted inhibitors of thrombin |
| US5670329A (en) * | 1993-05-28 | 1997-09-23 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method and analytical system for performing fibrinogen assays accurately, rapidly and simply using a rotating magnetic field |
| US5487892A (en) * | 1994-02-24 | 1996-01-30 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Method for treating thrombotic disease using a fibrin specific monoclonal antibody |
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