JPS62502964A

JPS62502964A - 細胞表面抗原に対する抗体を有する活性化血小板の検出

Info

Publication number: JPS62502964A
Application number: JP61501984A
Authority: JP
Inventors: ジンズバーグ　マーク　エイチ; プロー　エドワード　エフ
Original assignee: スクリツプス　クリニツク　アンド　リサ−チ　フアウンデ−シヨン
Priority date: 1985-04-04
Filing date: 1986-03-25
Publication date: 1987-11-26
Anticipated expiration: 2013-05-18
Also published as: EP0216864A1; DK173787B1; JP2752614B2; NO864872L; ES553738A0; NO170128C; EP0216864A4; CA1264029A; DE3685390D1; EP0216864B1; DK581386D0; US4820505A; ES8801439A1; NO864872D0; ATE76301T1; DK581386A; WO1986005693A1; NO170128B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞表面抗原に対する抗体を有する活性化血小板の検出技術分野本発明は、刺激状態にある活性化血小板の細胞膜上の特異的哺乳動物細胞膜性抗体（ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｃｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）に結合するが、刺激状態にない休止血小板には実質的に結合しない座位特異性像形成診断薬、該診断薬の調製方法および刺激状態にある血小板を検出し、標識し、かつ局在化（ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ）する診断系の利用に関するものである。

より詳しくは、本発明は特異的細胞表面表現細胞内血液タンパク成分に結合したモノクローナル受容体及びポリクロナール受容体に関するものである。

背景哺乳動物の血液には、血小板として知られる小さな細胞が含まれている。ヒトの血小板は約２〜４μｍの直径を有する核のない循環性の粒子である。自由浮遊細胞として血管内を自由に循環する血小板は「休止」血小板として知られている。

完全な休止血小板は通常は非付着性であり、完全な内皮と、または他の血液細胞と制限された相互作用しか示さない。しかしながら、これらの血小板は、止血の過程において、即ち血栓の形成の際に自由浮遊細胞から、「活性化血小板」として知られる、完全な血小板の付着性凝集塊に急速に転化される。

血管壁が打撲によりまたは血管の事故の結果損傷をうけた際には、止血応答が迅速に誘起されて、過度の血液損失を防ぐ。

この応答は、より高等な器官において進化してきたものであるので、血小板の関連作用および凝固系による止血部位の効果的な閉塞並びに局在化を誘起する。これとは対照的に慢性的疾患例えばアテローム性動脈硬化症により損傷した血管中では、活性化血小板はお互いに、また血管壁に付着し、血栓閉塞症を引き起こす。このような現象は心臓発作および静脈塞栓症を伴なう発作において起こる。血小板は損傷サイトに輸送され、そこで凝集して止血プラグを形成する。この時フィブリノーゲンは血餅の形成を助ける。

初期止血および血栓症における血小板の関与は、表面接触相互作用により開始され、前記血小板細胞の付着特性に依存している。３つの一般的現象が１つの付着現象を構成している。すなわち（１）内皮下層マトリックスのような基質への前記血小板の付着；（２）前記基質との付加的な接触サイトを形成する前記血小板の拡散；（３）凝集物を形成する付加的な血小板の漸増である。

血小板凝集は、アデノシン−５−ジホスフェート（ＡＤＰ＞、ＡＤＰ／フィブリノーゲン、エピネフリン、トロンビン、セロトニン、コラーゲン及びある種のアラキドン酸代謝基質に上記細胞をＨすることにより刺激されうる。

それゆえに、休止ヒト血小板の付着特性の表現は付着応答を調節する適当な刺激によって開始される。この刺激は、血小板を非付着性「休止」状態から血管に対するおよびお互いに対する前記血小板の付着性を裏付ける付着性「活性化」状態に転化し、血栓を形成する。かくして、これら細胞の付着特性の変化は、宿主防御機構および血栓塞栓症疾患の発病学においてきわめて重大な役割を演じている。

「刺激状態にない血小板」および「休止血小板」という用語は、本発明では前述のような生理的刺激に曝されず、それゆえ「非付着性」または「完全な」状態にあるような正常な自由浮遊血小板を示すために互換的に使用される。逆に「刺激状態にある血小板」および「活性化血小板」という用語は本発明においては、前述のような生理的刺激に曝され、それゆえに「付着性」状態にある血小板を示すため互換的に使用されている。

止血および血栓症の際、休止血小板は、凝集および分泌中に形態学的には形を変え、生化学的には細胞表面膜組成を変えることが知られている。前記血小板は円板形から長い仮定を有する球形に変形して近接血小板と共に凝集する。前記活性化血小板は、周囲環境に顆粒分を分泌し、血漿凝集を促進させ、発達したフィブリン繊維と結合し、凝血退縮を促進させる。

ｌ・ロンビンによる休止血小板の刺激に伴なう血小板表面膜変化に関する研究は、主な血小板表面膜変化は分泌後におこるが、可逆的な凝集後にはおこ、らないことを示した。

ジョージ（Ｇｅｏｒｇｅ）等のジャーナル　オブ　クリニカル　インベ休止ヒト血小板へのトロンビンの作用に関するもう一つの研究は、フィブリノーゲンでない、新しい細胞膜性タンパクの存在に関するものである。バエンジゲル（Ｂａｅｎｚ　ｉｇｅｒ）　等のプロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミーオブ・サイ２４０　（１９７１）参照。これも本発明の参考文献とする。この新しい膜タンパクは今まで［トロンポスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓ−ｐｏｎｄｉｎ）　Ｊとして認識されてきたが、時には「トロンビン感受性タンパク」または「糖タンパクＧ」としても知られている。

トロンポスボンジンは主な細胞下血液タンパク成分であると考えられる、約７× ７０ナノメーター（ｎｍ）のｍＭｂ状巨大分子である〔ローラー（Ｌａｗｙｅｒ）等、ジャ！ナル・オブ・ザ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２３　、８６０９（１９７８））。ローラー等は、また、トロンポスポンジンはその各々が同一であってもよいし、そうでなくても良いような、約１４２．０００〜約１９０．０００ダルトンの３つのジスルフィド結合された釦を含んでいることを報告した。トロンポスポンジンは、重量％比で約４：３：１．５の中和糖、アミノ糖およびシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）と共に約４重量％の炭水化物を含み、ヘクスロン酸は含まない。あの血漿タンパクの欠乏患者に関する研究から、血小板の付着性は、前述の刺激要求以外にも選択された「付着性タンパク」によって媒介されまたは調節されると考えられている。

付着性タンパクは、活性化血小板の細胞外部表面に表現される補助因子タンパクである。これらのタンパクは通常は休止血小板の細胞外部表面に全く存在しないか、ゎずがな量でのみ存在するかである。かくして、細胞膜性付着性タンパクは、初期は細胞内成分として、ある場合には細胞外成分として表現されると考えられる。

活性化血小板の細胞外部表面上で識別された付着性タンパクは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォノ・ウィレブランド（Ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　）因子（第８因子として公知）オヨびトロンポスポンジンを含む。これらの４つのタンパクは次のような共通の特徴を有する。すなわち、これらは（１）通常は休止血小板の細胞外部表面には存在しない；（２）刺激状態にない、完全な血小板とはほとんど相互作用をおこさない；（３）血小板刺激に伴って前記細胞表面で表現される；（４）全般的な構造上の類似性を有する；ということである。血小板細胞膜外部表面におけるこれら４つの付着性タンパクの表現に対して提起された機構は、ギンズバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　）とプロー（Ｐｌｏｗ）によるジャーナル・オブ・スープラモレキュラー・ストラフチャー・アンド・セルラー・バイオケミストリー（Ｊ、ＳｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃ：ｌ＋ｅｍ、）土７．９１（１９８１）において議論されている。

これらのタンパクの間での一次配列の類似性は十分に知られていないが、前記４つのタンパクの選ばれた構造上の特徴は同一ではない。上記の４つの付着性タンパクはすべて、マルチマー状態において内部的に対称な元素を有するグリコジル化巨大分子である。特に、フィブリノーゲンは約３４０．０００ダルトンの分子量を有し、約４８．０００．５６．０００および６５．０００ダルトンの分子量を有する複数のサブユニットから成る二量体構造を有している。フィブロネクチンは約４５０．０００ダルトンの分子量を有し、初めは、それぞれ約２２０，０００　、および２３０．０００ダルトンの分子量を有する二つの非常に類似しているが同一でないジスルフィド結合されたサブユニットの二量体として循環している。フィブロネクチンのより高重合度のマルチマー形成は血漿中で生ずることが知られ、前記マトリックス中において支配的である。

トロンポスポンジンは、約１４２．０００〜１９０．０００ダルトンの分子量を有する非常に類似した大きさの三つのジスルフィド結合されたサブユニットを有する分子量約４５０．０００ダルトンのトライマーとして存在する。フォノ　ウィレブランド因子は、マルチマー化して約１．０００．０００〜２０．０００．０００ダルトンの分子量を与える、２２０．０００クルトンのサブユニットから構成される。

血漿および細胞外マトリックスは上記４種の付着性タンパクの初期外因性タンパク源を構成すると考えられる。トロンポスポンジンは例外として、血漿は他の３種の付着性タンパクの主な潜在的な源である。サグリオ（Ｓａｇｌｉｏ）等は、トロンポスポンジンは血漿中において２０〜１３０　（ｎｇ／ｍｆ）の濃度のフィブロネクチンまたはフィブリノーゲンより３〜５桁程少ない量で存在することを報告した〔ブラッド（［１ｆｏｏｄ）、　５９　、１６２　。

（１９８２））。

トロンビンに曝されると、血小板は、環境に内容物を放出するようなある亜膜性の細胞質貯ｉ顆粒（α顆粒）を可動化することが知られている。血小板貯蔵顆粒は休止血小板の細胞表面には通常存在せず、細胞表面に結合した、トロンビンにより刺激された「活性化」血小板の膜タンパクとして存在する多くのタンパクを含む。更に前記付着性タンパク、特にトロンポスポンジンは初期は前記血小板の α顆粒内の内在性プール中に存在すると考えられている。

前記血小板細胞表面上の付着性タンパクの表現は、α顆粒成分の分泌および放出を誘発する血小板刺激に依存している。この放出により、前記付着性タンパクは前記細胞外環境に解放され、前記細胞表面上に出現する。加えて、付着性タンパクは通常は、休止血小板表面とわずかにしか結合していないため、外因性タンパク源からの付着性タンパクの細胞表面表現機構が開始され、これは血小板刺激に依存すると考えられている。

血小板の活性化および局在化は血管損傷の基本的現象であるので、活性化血小板と休止血小板との差異の検出および識別可能な方法および試薬が必要となる。損傷した血管壁と選択的に反応しうる活性化血小板を検出する能力により、特に犠牲者が外部的には明らかな損傷を有しないような外傷の場合、柔かい組織の損傷位置を見出し得る。

現在、循環する活性化血小板の検定は公知の血小板凝集化検査を使用してインビトロに行なわれ、この方法は未知の抗体含有試料の適当な希釈液を抗原担持細胞と共に培養し、抗体濃度（力価）を得られた凝集応答と既知の力価を有する標準抗体含有試料につき得られた応答とを比較して決定するものである。

しかしながら、この検査はしばしば煩しく、がっ信頼性に乏しいものである。

血小板をインビボで像形成するため現在行なわれている１つの方法としては、” Ｉｎを標識した血小板を使用した、時間のがかる不便な方法があげられる。この方法は患者から血小板を単離し、インビトロで放射性ヌクレオチドで血小板を標識し、次いで放射性標識した前記血小板を再び患者に注入する工程を含む。”Ｉｎで標識した前記血小板はバックグラウンド信号の干渉を減少させるため十分な時間経過させた後にのみ像形成されつる。

かくして、特異的細胞膜性付着性タンパクに選択的に結合し、像形成することのできる座位特異的像形成診断薬は、刺激状態にある活性化血小板のサイトを迅速に指示するという好ましい臨床上の有用性を有し、かつこのような血小板と休止血小板とを識別するために有用であり得る。

より詳しくは（これが刺激された活性化状態にある血小板の細胞表面抗原として表現される際に）特異的血小板タンパク成分に結合する抗体または抗体断片を含む座位特異的像形成診断薬は、現在インビトロにかつインビボで利用できる診断法の技術的な複雑さ、不便さおよび時間浪費の点の多くを回避できる。

ニューウエンハイス（Ｎ　ｉｅｕｗｅｎｈｕ　ｉｓ）等は休止血小板と交差反応しない、トロンビン活性化血小板に対するモノクロナール抗ス）のミエローマセルラインと融合することによりハイブリドーマとされた、トロンビン活性化ヒト血小板で免疫されたマウスから採取した牌細胞を使用して、該モノクロナール抗体を活性化血小板に対して調製した。抗血小板抗体が生産され、あるハイブリドーマはトロンビン活性化血小板またはＡＤＰ活性化血小板上の未知の抗原に結合した抗体を生成した。しかしながら、前記抗体はＡＤＰ、エピネフリン、コラーゲン、トロンビンまたは抗性物質、レストセチンにより刺激された血小板の凝集に関する研究においては、機能的特性を有していなかった。

前記抗体が結合している前記抗原は、α顆粒と異なる血小板顆粒の特定のサブクラスに位置することが知られていた。

スー・リン（１ｌｓｕ−Ｌｉｎ　）等はまた、公知の標準的方法を用いてマウスのハイブリドーマから調製されたトロンビン活性化血小板〔ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　＞、６２　（補追１）（１９８３）ｌ）に対して特異的なモノクロナール抗体の生産に関し報告した。

ウェスターン（Ｗｅａｔｅｒｎ）法による分離においては前記抗体の特異性は糖タンパクｎｂと糖タンパクｌ１ｌａの間を移動する識別されない単一のタンパク成分に対して存在した。該識別されないタンパクは可溶性活性化血小板から、または休止血小板から誘導され、かつ約９８．０００〜１２０．０００ダルトンの見掛分子量を有していた。

マツクエバー（ＭｃｌＥｖｅｒ）等は血小板脱糖タンパクＩＩａに対するモノクロナール抗体が活性化血小板にのみ結合していることを報告した〔ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、　６２　（補遺、１）、（１９８３）］。

前記ハイブリドーマは特異的にトロンビン活性化血小板に結合するが、末梢血液単核細胞には結合しないトロンビン活Ｐ１：化ヒト血小板に対し免疫されたマウスの牌臓細胞から生産された。

前記抗体の特異性は、約１３８．０００　（非還元性）ダルトンおよび１．４８．０００　（還元性）ダルトンの見掛分子量を有し、かつ廂小板活性化後その立体配座を変える血漿膜分子であると考えられる糖タンパクＩｌａに対して、または、放出反応の間に血漿膜と融合する顆粒膜成分に対して一定の判定規準に適合したタンパクに対して存在した。しかしながら、該タンパクの機能は知られていない。

かくして、血液タンパク成分に対して前もって標識した抗体が必要となり、特に、前記血液成分を検出し、局在化する手段として、前記サイトを像形成することにより、表現された細胞表面抗原のような前記血液成分を指示することのできる細胞下のα顆粒中に位置する抗体が必要となる。座位特異的指示診断薬は、血小板血栓の存在を走査する際の迅速な臨床的評価手段を与える。

特に心臓発作および発作患者において血栓の存在を識別し、かつ局在化するだめの、また急性心筋梗塞症を罹う患者に、その場で血栓溶解療法を適用するだめの非侵入性迅速臨床法が特に必要である。

また、損傷の後に、損傷をうけた血管壁の位置をインビボで検出する、すなわち危険な状態にある患者の潜在的冠状動脈疾患のスクリーニングを行なう必要もある。

発明の要約本発明は、哺乳動物の座位特異的像形成診断薬、その調製方法および適用に関するものであり、かつ該診断薬を使用する診断系に関するものである。前記診断薬は、血小板細胞膜性抗原に対し、動物宿主内に生成される受容体を含む。

前記受容体は、通常血液細胞膜性でない特異的細胞内または細胞外血液タンパク成分に対して動物宿主中に生成したモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体またはこれらの混合物を含む。前記タンパク成分は、血小板が刺激された「活性化」状態にある時前記血小板の細胞外部表面に存在し、かつ前述のような刺戯状態にない正常な、すなわち「休止」した完全状態にある血小板の細胞外部表面には実質的に存在しない細胞膜性抗原である。

種々の文字通りの形で、「抗原」という用語は本発明においては免疫原性である物質を含むとして使用されてきた。しかしながら、ごく最近の使用によれば、抗原は全抗体のような受容体が結合する物質として、かつ免疫原は抗体の生産をインビボで誘起させる物質として、それぞれ定義づけられている。抗体は外来物質の存在に応答して宿主動物であるマウス系により生産され、また免疫グロブリン（１ｇ）としても知られているタンパクである。抗体の特異性は免疫原に支配され、この免疫原に対して該抗体が生成される。本発明において使用されるように、「抗原」という用語は特異的細胞内または細胞膜（血液タンパク成分を含み、該タンパク成分は抗体並びに該抗体が結合する前記タンパクを生成するため使用され、かつ「受容体」という用語は該成分に対して宿主動物中に生成される抗体を含む。

受容体自体の特質によれば該受容体は細胞外部表面に接近しやすいものでなければならない。「細胞外部表面」という用語は亜膜性細胞質表面に対抗するものとして外部細ｎ包表面について使用されるものである。

抗原の細胞内成分は、前記細胞下皿小板顆粒、特に前記α顆粒に存在し、事実上血漿中に存在しないタンパクを含んでいる。

細胞外血液タンパク成分は正常な血漿中に存在するタンパクを含む。

本発明において抗原として有用なタンパクは、通常は、刺激状態にない休止血小板の細胞外部表面膜には存在しないか、またはごくわずかな量でのみ存在する。

前記タンパクは前述のような活性化され、かつ刺激された血小板の細胞外部表面における血小板細胞膜性抗原として表現されたものとして知られている。

本発明の試薬において抗原として使用する好ましいタンパクは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンウィレブランド因子およびトロンポスポンジンから成る多くの血液タンパク成分群を含む。特に好ましい糖タンパクは、シアロ糖タンパク、より好ましくは、トロンポスボンジンであａ０本発明の１つの局面は次の工程を含む座位特異的像形成診断剤の形成に関するものである。すなわち、動物宿主を、ヒト血小板細胞膜性抗原により、該抗原に対し抗体産生を誘起するに十分な量で免疫する工程、ただし該抗体は前記抗原に対する受容体である；前記免疫された宿主を前記抗原に対する抗体を形成するに十分な時間維持する工程と；前記免疫された宿主から抗体含有抗血清を取り出し、収集する工程と；このようにして生成された受容体を実質的に純粋な形態で回収する工程と；前記回収された受容体を指示手段と混合する工程とを含む。

本発明の特定の局面は、細胞膜性抗原として表現される際に、糖タンパク、特にトロンポスポンジンのようなシアロ糖タンパクを識別する座位特異的像形成診断薬に関するものである。史に詳しくは、抗トロンポスボンジン試薬（以下抗Ｔ　Ｓ　Ｐ　（！：　呼〕）は、刺激状態にある活性化血小板の細胞外部表面上で細胞膜性抗原として表現されるトロンポスポンジンに結合し、がっ、このように表現されていないか、または刺激状態にない休止血小板の細胞外部表面上に結合しているトロンポスポンジンに実質的に結合していない抗−ＴＳＰに関する。

本発明の別の局面は、座位特異的試薬に使用されるモノクローナル受容体を形成する方法に関するものである。該方法は下記工程を含む。すなわち：（ａ）　ヒト以外の動物宿主に、ヒト血小板細胞膜性抗原を、該抗原に対して抗体の生産を誘起するに十分な量で投与する工程、但し前記抗体は前記抗原の受容体である；（ｂ）前記免疫された宿主を前記抗原に対して抗体を形成するに十分な時間維持する工程；（Ｃ）前記免疫された宿主がら取り出された抗血清から抗体産生細胞を回収する工程；（ｄ＞好ましくは前記宿主断片から、前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合することによりハイブリドーマを形成する工程；（ｅ）適当な培地で、このように融合した前記ハイブリドーマを培養する工程；（ｒ）血小板が刺激された状態にある場合、該血小板の細胞膜性抗原に結合するモノクローナル受容体を生産する能力に対して前記ハイブリドーマを検定しかつ選択する工程、ここで前記血小板が刺激状態にない場合には前記受容体は実質的に前記血小板に結合しない；および（の　前記ハイブリドーマの生産物として実質的に純粋な形で前記モノクローナル受容体を集める工程である。

ば１〜２週間の後、かつ工程（ｂ）の前に前記宿主に、抗体産生を増大するため同じ抗原の二度目の注入を行なう工程を含む。

上記受容体を形成する方法は、前記ハイブリドーマをインビΣ兄で適当な培地中で培養し、周知の方法によって該ハイブリドーマ上澄から前記抗体を回収することを含む。これは細胞培養系として知られている。上記方法は、変法として、動物宿主に前記ハイブリドーマを注入し、前記宿主の腹水液から前記抗体を回収することを含む。これは完全動物系として知られている。このような完全動物系は、細胞培養系より多くの単位容積光たりの抗体を生産する傾向にあるが、完全動物系は大量の抗体が必要な場合に使用することは困難である。

本発明は任意の上記方法により生成されるモノクローナル受容体およびポリクローナル受容体を含んでいる。本発明の更なる局面において、上記モノクローナル受容体の調製方法は、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８６８０または８６８１を適当な培地中で培養し、前記ハイブリドーマの上澄から前記受容体を回収することを含む。

本発明は更にキットなどの哺乳動物診断系を含み、該キットは少なくとも一つのパッケージを含み、該パッケージは活性成分として本発明の受容体を含み、該受容体は指示手段と組合わせて、血液試料に導入した場合に、該受容体の生成を誘起した抗原に選択的に結合し、かつ結合サイトを指示することができる。更に詳しくは、前記受容体はある指示手段で標識され、特異的血液タンパク成分が刺激状態にある活性化血小板の細胞外部表面上で細胞膜性抗原きして表現される際、該成分に結合し、それ程刺激状態にないかまたは休止状態にある血小板から活性化血小板を検出しかつ識別する。

本発明の座位特異的像形成診断薬の使用は、通常は前記休止血小板の細胞外部表面に存在せず、かつ血液試料をインビトロで検定する際には活性化血小板の細胞外部表面に抗原として細胞膜に結合している細胞膜性血液タンパク成分の検出および局在化を含んでいる。

て表現される血小板のα顆粒成分の検出に関るものである。更に詳しくは、生理学的に許容できる指示手段を用いて標識したモノクローナル受容体またはポリクローナル受容体は、損傷を受けた血管壁に露出した活性化血小板の位置を選択的に局在化するだめの非侵入性臨床的インビボ法を提供する。

本発明の座位特異的像形成診断薬の１つの利点は、血小板血栓は心臓発作、卒中、静脈性血栓症、肺動脈塞栓症の患者におこる血栓塞栓症を診断するため迅速に走査され、短時間のその場の血栓融解法に対しこのような血栓の位置を識別し局在化せしめるということである。

本発明の別の利点は、トロンポスポンジンが潜在的冠状動脈疾患の重症患者における血管損傷の結果として、内皮マトリックス中に露出したような損傷血管壁を走査し、゛像形成するため、前記診断薬が使用されうろことである。

更に本発明の別の利点は、循環活性化血小板が、経口避妊剤のような前血栓症薬剤を経口させた患者の血液試料中でインビΣユで検出されつるということである。

本発明の利点は、本発明が従来公知の血小板凝集比検査より速く、より信頼性をもって活性化血小板を検出するということである。

更なる利点は、本発明の試薬、特に抗−ＴＳＰまたはその結合体は組織プラスミノーゲンアクチベーター、天然クロット溶解剤などの血栓融解剤のその場での治療比を改善する目的でクロットを局在化するため使用されうるということである。

本発明の別の利点または利益は、下記本発明の説明および請求の範囲から当業者にとって明白となろう。

発明の詳細な説明本発明は刺激状態の、および非刺激状態の血小板を検出し、区別する方法を意図している。本発明は、休止血小板が作用物質により刺激され、活性化血小板上の細胞外部表面抗原として表現される際、前記休止血小板のα顆粒から放出される血液タンパク成分に対するモノクローナル受容体またはポリクロナール受容体の形成および使用に関するものである。前記受容体はその上に前記細胞膜性抗原を有する活性化血小板に結合し、前述のように正常な休止血小板と交差反応しない。

本発明は更に、上記のような受容体および前記細胞表面表現抗原の位置を識別するための指示標識手段を含む、哺乳動物の座位特異的像形成診断薬を意図している。α顆粒の特異的血液タンパク成分は本発明を説明するだめのマーカーおよびターゲット抗体として使用されるが、本発明をこのように限定することを意図しない。

トロンポスポンジンは、次章で議論するように、前記ターゲット抗原として使用する」二で特に好ましい血液タンパク成分である。トロンポスポンジンは休止血小板の細胞外部表面に極めて少量で存在するが、活性化血小板の細胞外部表面には検出可能な量で表現される。トロンポスポンジンは、血小板の内在性細胞内の α顆粒プール内に存在する。逆に、約０．１％の循環トロンポスボンジンは血漿中で自由な状態にある。

モノクローナル受容体およびポリクローナル受容体は本明細書に記載されるようにトロンポスポンジンに対し特異的であり、かつ他の血漿タンパクと交差反応しないものとして述べてきた。

更に本明細書において述べたように、標識した受容体はトロンビン刺激性血小板に結合し、実質的に刺激状態にない血小板とは結合しない。かくして、本発明の受容体は、座位特異的な方法で休止血小板から活性化血小板を検出し、区別する像形成剤を提供しうる。

■、序論付着性タンパクとして活性化血小板の細胞外部表面に表現される血液タンパク成分は、前記内在性細胞内α顆粒プールから、または、血漿か内皮下マｌ−ＩＪソックスような外因性源から誘導されつる。これらの潜在的な源に存在する前記付着性タンパクの近似量の比較を第１表に示す。

第１表付着性タンパク　血小板含量　血漿含量（μｇ／１０’血小板）　（μｇ／ｍ１．）フィブリノーゲン　５０　３，０００フイブロネクチン　３３００７オンウイレブランド因子２２０トロンポスポンジン　２０　０．０２かくして、血漿：よＩ・ロンポスポンジンのそれ程重要な源ではなくフィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびフォンウィレブランド因子の実質的な源である。無限のアフィニティーを仮定スると、トロンポスポンジンの血小板への完全な結合により、■細胞あたり約５０〜３００分子の血液タンパク成分が配置されるにすぎない。

他方、トロンポスポンジンは下記の前記細胞のトロンビン刺激を表現した細胞表面であることが知られているα顆粒プールの主な血小板成分である。トロンポスポンジン表面表現は、カルシウムやマグネシウムのような二価金属イオンの存在下でおこるが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって減小する。トロンポスポンジンの血清中濃度は約１０．０００〜３０．０００ナノグラム／ミリリツトル（ｎｇ／ｍｆりであり、これは、約２０．０００ｎｇ／１０９細胞の血小板含量を示している。

前記内皮マトリックス細胞はフィブロネクチン、フォンウィレブランド因子およびトロンポスポンジンの外因性源となる。

トロンポスポンジンは内皮細胞、平滑筋細胞、単核細胞および線維芽細胞によって合成され、かつ細胞下マ）　ＩＪソックスとり込まれる。ラウギ（Ｒａｕｇｉ　）等による「トロンポスポンジン：培養中の細胞による合成および検出」、ジャーナル・オブ・ザ・セ）Ｌｔ−バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、　９５　、３５１　（１９８２）に報告されているように、内在性標識化に関する研究においては、トロンポスポンジンは１８時間にわたり、約１０〜７１ｎｇ／１０４細胞の速さで合成されることが示されている。他の研究としては、モッシャー（Ｍｏ５ｈｅｒ　）等による「培地された内皮細胞によるトロンポスポンジンの合成および分泌」、ジャーｆ　）’ｖ　・オブーセ）Ｉ、−バイオロジー（Ｊ　、　Ｃｅ１１．　［１ｉｏ１．）、９３　。

３４３（１９８２）、（以下モッシャー等と呼ぶ）、およびジャフエ（Ｊａｆｆｅ）等による「トロンポスポンジンを合成かつ分泌し、かつこれを内皮マトリックスに取り込む培養ヒト線維芽細胞」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミーオブサイエンス（米国）　［Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　：（ＵＳＡ））、８０，９９８　（１９８３）、Ｃ以下ジャフェ等（１９８３）と呼ぶ〕が知られている。

血小板凝集におけるトロンポスポンジンの役割は、十分理解されていないが、凝集活性に対して応答可能な刺激状態にある血小板表面上の分子であることが知られている。この知見は、ジャフェ（Ｊａｆｆｅ）等による［ヒト血小板の外因性レクチンであるトロンポスポンジン」ネーチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９５　、２４６（１９８２）Ｃ以下ジャフェ等（１９８２）という〕に報告された。

トロンポスポンジンはフィブリノーゲンとの相互作用を介して血小板凝集に１つの役割を演じていると考えられている。なぜならば、フィブリノーゲンは血小板分泌がなくても血小板凝集を維持できる。ここにおいて、トロンポスポンジンは前記血小板（例えばグレー（Ｇｒａｙ）血小板）において存在しないか、またはほんのわずかに存在する。しかしながら、逆に、ヌーデン（Ｎｕｒｄｅｎ）等は「血栓症と止血、５０．（抄録）４０１（１９８３）における、「ヒト血小板トロンポスボンジンに対するウサギ抗体の、トロンビン誘起血小板凝集の抑制」を報告した。

線維芽細胞により合成されたトロンポスポンジンの機能も明らかでない。マウスのモノクローナル抗トロンポスボンジンおよびウサギポリクローナル抗トロンポスポンジンを使用して、ジャフエ等（１９８３）は螢光抗体法により、培養したヒト線維芽細胞の原線維の細胞外マトリックスにトロンポスポンジンを局在化した。ヒト包皮および胎児肺線維芽細胞はそれぞれ、酵素結合イムノソルベント検定法（以下ＥＬＩ　ＳＡと呼ぶ）により決定されるように、約１５．７および５．８μｇ／１０’細胞７２４時間の速さで時間に依存して、培養培地にトロンポスポンジンを分泌した。

■概論本明細書において使用される「受容体」という用語は、抗原に結合する生物学的に活性な分子を意味している。本発明の受容体分子は完全抗体であり、実質的に完全な抗体すなわち、免疫された動物の腹水液または血清のような実質的に純粋な形の抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド部分である。

受容体分子の生物学的活性は、少なくとも生理学的ｐＨ値かつイオン強度にある水性媒Ｆ中のこれらの混合物上での前記受容体のその抗原性リガンドへの結合により立証される。好ましくは、前記受容体は、また約５〜約９のｐＨ値範囲内でまた、例えば蒸留水のイオン強度から約ＩＭＮａＣ６のイオン強度までの範囲で前記抗原性リガンドに結合している。

抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド部分く抗体結合サイト）は前記イディオタイプを含み、前記リガンドに結合し、かつ前記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２部分を含む抗体分子のポリペプチド部分である。抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は周知のものであり、公知の方法により実質的に完全な抗体と、それぞれパパインおよびペプシンとの反応により調製される。例えば、チオフィロポラス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ　）とディクソン（Ｄｉｘｏｎ　）　による米国特許第４．３４２．５６６号参照。Ｆａｌｉ’抗体部分も公知のものであり、メルカプトエタノールのようなもので２つの大きな鎖状部を架橋するジスルフィド結合を還元し、次いで得られたタンパクメルカプタンをヨードアセタミドのような試薬でアルキル化することによりＦ（ａｂ’）部分から調製される。完全抗体が好ましく、これは本発明の受容体分子の例証として使用される。

本発明に有用な受容体はモノクローナル受容体またはポリクローナル受容体である。［モノクローナル受容体Ｊ（Ｍａｂ）はただ１種の受容体分子を分泌するハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンによって生産された受容体である。

「ポリクローナル」受容体（Ｐａｂ）は、免疫原性分子の複数のエピトープに結合する、種々の抗体を分泌する種々の細胞から誘導されるクローンにより生産される受容体である。ポリクローナル受容体の調製はＭａｂ、の生産の１部として本発明では議論されている。

前記ハイブリドーマ細胞は抗体産生細胞およびミニロー−ｒまたは他の自己永続性セルラインがら融合される。このような受容体は最初にコーラ−（Ｋｏｈ　１ｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）ｌ：より、ネーチ’ｒ　（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６　、４９５　（１，９７５）に記載された。この文献を本発明の参考文献とする。モノクローナル受容体は、本発明のモノクローナル受容体を得る好ましい方法である。ハイブリドーマ組織培養から、または、別に、前記ハイブリドーマ組織が導入される非ヒト温血宿主動物から得られる複水体液から代表的に得られる。

抗体はＢ細胞（骨髄誘導リンパ細胞）とよばれる分化細胞によって分泌される。

各々のＢ細胞は単一の特異性を有する１種の抗体を分泌し、この結果種々の特異性を有する種々の抗体が各々神々のＢ細胞によって分泌される。前記Ｂ細胞をクローニングして、前記諸抗体の起源とする。しがしながら、Ｂ細胞は、培地中では数日で死亡するため、比較的「不死性」のものとして、所定の抗体の供給源が得られるようにしなければならない。

これは、動物、代表的には肺臓からＢ細胞を取り出し、該Ｂ細胞を癌細胞またはミエローマ細胞と融合して、細胞ハイブリッド（「ハイブリドーマ」と呼ぶ）を形成し、次いで該ハイブリドーマを培養することにより達成できる。２つの方法を以下にモノクローナル受容体を生産するハイブリドーマを形成するために、ミエローマセルライン免疫原としてのトロンポスボンジンで免疫された哺乳動物からの牌細胞のような血液タンパク成分と反応する抗体を生産する抗体産生細胞と融合される。

使用される前記抗体産生細胞は霊長動物、ヒト、ゲラ歯動物（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ウシ、イヌ、羊等のような任意の哺乳動物から誘導されつる。適当な非ヒト宿主動物が免疫原、この場合はトロンポスポンジン、の注入によす免疫され、次いで前記宿主が抗体を生産するための十分な時間の経過後に、追加抗原注入、および前記肺臓の単離を行うがこれは代表的に最初の免疫の約１〜３ケ月後である。

宿主として本発明に使用できる非ヒト定温動物は、家禽（例えばニワ）　ＩＪ、ハト）、平胸類鳥群（例えば、エミュー、ダチョウ、ヒクイドリまたはモア）または哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスターまたはマウス）を含んでいる。好ましくは、前記宿主動物としては、マウス、ウサギまたはエミューがあげられる。

ミエローマセルラインは抗体産生細胞と同じ種からのものが好ましい。それゆえに、マウス−マウスハイブリッド〔シュルマン（Ｓｈｕｌｍａｎ）等、、ネーチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ　＞、　２７６　。

２６９　（１９７８）または、ラット−ラットハイブリッド（ガルフ７　（Ｇａｌｆｒｅ）等、ネーチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）、２７７゜１３１　（１９７９））が、代表的に使用される。しかしながら、数種のラット−マウスハイブリッドはハイブリドーマの形成においてよく使用されてきた。〔ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ　）　＋「細胞融合によるモノクローナル抗体の生成」、アンチボディー・アズ・ア・トウール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ　）、マーチャロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏ口ｉｓ）笠編、ジョン・ウィリー　アンド　サンズ・リミテッド（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、）、　２７３−２８９（１９８２）に掲載されている；以下マーチャロニス等という〕。

本発明に使用される適当なミエローマセルラインとしては、ＭＰＣ−１１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６７）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＲＬ、１５８０）、Ｓｐ２／。−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｖ、１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）、Ｙ３−Ａｇ１．２．３〔フランス国、パリのコレクション・ナショナール・ド・タルチュール・ド・ミクロオルガニズム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｃ　ｄｒ＋Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託Ｎｕ　Ｉ　−０７８として寄託」およびＰ３Ｘ６３部ｇ８　（ＡＴＣＣＴ　ＨＢ９）が挙げられる。ミエローマラインＸ　６３．６５７が本発明において好ましい。

モノクローナル抗トロンポスボンジン（抗−ＴＳＰ）受容体は、本明細書に記載されるようにネズミ（マウス）ミエローマラインから形成され、かつポリクローナル抗トロンポスポンジン受容体はウサギミエローマラインおよびエミューミエローマラインから形成された。前記モノクローナル抗−ＴＳＰ試薬は、以下に示すようなＡＴＣＣ承認番号の下でアメリカンタイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ−ｉｏｎ）　（八ＴＣＣ）、メリーランド州、ロックビルに１９８４年１２月１２日付で寄託された。

モノクローナル　ＡＴＣＣ承認番号ＴＳＰ　ｌ−１（１４Ｅ７）　ＨＢ　８６８０ＴＳＰ　ｌ−２（９Ｄ７）　ＨＢ　８６８°１受容体は指示標識手段すなわち「指示原子団」または「標識」と共に使用される。指示原子団または標識は特異的細胞表面に表現された抗原の位置を決定し、かつある場合には前記受容体と前記抗原間の反応程度を決定するための手段として前記受容体と共に使用される。

「指示標識手段」、「指示原子団」または「標識」なる用語は、本発明では、前記受容体に結合されるがまたは別々に使用される単一原子および分子を含むものとして使用され、これら原子または分子は単独でまたは追加試薬と共に使用される。このような指示原子団または標識はそれ自身免疫学においてよく知られており、これらが新規受容体、方法および／または系′と共に使用される限りにおいては、本発明の１部を構成する。

前記指示標識手段は、変性を伴なわずに化学的に抗体または抗原に結合し、有用な免疫螢光トレーサーである螢光色素（色素）を形成する、螢光標識剤でありうる。適当な螢光標識剤としては、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジメチルアミノ−ナフタレン− ８−スルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リザミン、ローダミンＢ２００スルホニル　クロライド（ＲＢ２００ＳＣ）等がある。免疫螢光分析法の記載はマーチャロニス等の「免疫螢光分析Ｊ　１８９−２３１に見られる。この文献も本発明の参考文献とする。

前記指示原子団はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰ）またはグルコースオキシダーゼ等のような酵素であっても良い。

ここで主な指示原子団はＩ−Ｉ　ＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素であるが、受容体−リガント錯体が形成した事実を可視化するため補助試薬が必要とされる。ＨＲＰに対するこのような補助試薬としては過酸化水素およびジアミノベンジジンのような酸化色素プレカーサーが挙げられる。グルコースオキシダーゼに有用な補助試薬としては２，２′−アジノージ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）が挙げられる。

特に好ましい、螢光性標識剤はフルオレセインイソチオシアネートである。細胞に結合した螢光色素はオルソダイアグノスティックス・オブ・ウェストウッド（０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆＷｅｓｔｗｏｏｄ　）、マサチューセッツ州、によって販売されているような活性化細胞選別剤（ＦＡＣ８）を使用して、螢光顕微鏡によって測定される。活性化血小板の細胞外部表面における血液タンパク抗原の表現は、下記のように、本発明の標識された受容体の結合によりフルオレセイン螢光強度を増大させる。

代表的な放射性標識剤はガンマ線放射を生ずる放射性元素である。それ自身がガンマ線を放射する、例えば＋２４１．１２５１゜１２８１、１３１１．　１３２１．およびＳ　Ｉ　Ｃｒのような元素は１組のガンマ線放射生成放射性元素指示原子団を表わす１２５１は特に好ましい。

別の組の有用な指示原子団は、それ自身がポジトロンを放射するｌＩＣ１１６Ｆ ’ＳＩｓ○および１３Ｎのような元素である。このようにして放射されたポジトロンは、前記動物の身体に存在する電子と出会うとガンマ線を発生ずる。’１ｌｌｎのようなベータ線放射物質も有用である。

好ましい放射性標識モノクローナル受容体は、よく知られているように、放射性アミノ酸を含む培地においてハイブリドーマ細胞を培養するこきにより、並びに、ビーバー（Ｂｉｅｂｅｒ）とハワード（ｌｌｏｗａｒｄ）による米国特許第４．３８１．２９２号に記載されているように前記モノクローナル受容体を単離し、次いで、上記放射性元素の１種で上記モノクローナル受容体を標識することにより調製されうる。

抗−ＴＳＰまたはそのイディオタイプ含有ポリペプチド部分のような放射性標識は、次いで血管疾患、特に動脈血栓症または血管壁損傷を有する哺乳動物の血流中に注入することにより導入される。前記標識受容体はトロンビンで刺激した活性化血小板の細胞外部表面上で前記トロンポスポンジンと錯体を形成し、その位置は身体からの非結合標識受容体のクリアランスを可能とする適当な設定時間（約１８〜約２４時間）後に決定されつる。

前記哺乳動物は、ゼネラルエレクトリック（ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ　）社（ライスコンシン州、ミルウォーキー）からＣＴ（８０−８０ＯＣＴ／Ｔ）の名称で販売されている軸性断層撮影スキャナーのようなガンマ線放射検出器で、またはプルツクバーベン・ナショナル・ラボラトリ−（口ｒｏｏｋｈａｖｅｎ　ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）にあるペット（Ｐｅｔｔ）　ＶＴと呼ばれる装置などのポジトロン放射トランスアキシャル（ｔｒａｎｓａｘｉａｌ）断層撮影スキャナーで走査されるこのような走査は使用される放射性標識受容体の特異性の故に活性化血小板の像、並びに血餅または損傷を受けた柔らかい組織の位置や大きさに関する情報を提供する。

別の態様においては、受容体は該磁気共鳴（ＮＭＲ）分析に活性な元素、すなわちＮＭＲ活性元素を含む指示原子団でａ識されうる。多くのこのような元素がより一般的に使用される＋　３　（、Ｉ　Ｓ　Ｎ、１３Ｆ等以外にも市販されている。

前記ＮＭＲ活性＋ｓＦ原子を含む指示原子団、または複数のこのような原子を次のような条件下で、使用することが特に好ましい。すなわち（ｉ）実質的にすべての天然に豊富なフッ素原子は１９Ｆ’同位体であり、かくして実質的にすべてのフッ素含有化合物はＮＭＲ−活性である；（ｉｉ））’Ｊフロロ無水酢酸のような多くの化学的に活性なポリフッ素化化合物は比較的低価格で市販品として入手できる：また（　ｉｉｉ　）多くのフッ素化化合物はヘモグロビン置換時に酸素を運ぶために使用されるポリフッ素化ポリエーテルのように、ヒトへの使用に対して医学的に許容できることが知られてきた。

フッ素含有ＮＭＲ活性指示原子団を使用するもう一つの特定の利点は哺乳動物の身体は正常の状態ではほとんどフッ素を含まないということである。従って実質的に哺乳動物には存在しないＮＭＲ活性元素を使用することにより、身体のフッ素原子によるバックグラウンド信号は実質的に存在しないこときなる。

かくして、観測される主な信号は、標識受容体−血液タンパク成分錯体によるものとなる。

１つの態様においては、抗−ＴＳＰのような受容体が好ましくは、トリフロロ無水酢酸またはへキサフロロエタノールのようなフッ素含有物質で標識され、それぞれ、フッ素化アミドまたはフッ素化エステル誘導体を形成する。次いで前記フッ素化受容体は血管損傷をうけた哺乳動物の血流中への注入によって導入される。前記活性化血小板表面の表現されたトロンポスボンジンと錯体を形成する標識受容体に対し、かつ前記身体から除去されるべき任意の非錯体受容体に対し、予め設定した培養時間の後、いわゆる［全体ｊ　ＮＭＲ測定がビケッ）　（Ｐｙｋｅｔｔ）のサイエンティフィックアメリカン（５ｉｅｎｔｉｒｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　）。

して行なわれ、位置を決定し、活性化血小板の像を形成する。

前８２ガンマ線、ベータ線およびポジトロン　エミッターのようなそれ自身が放射性である指示手段または標識および前記Ｎ〜Ｉ　Ｒ活性元素は、好ましくは検定されるべき哺乳動物の体内で使用され、それ故にインビボ標識または指示手段といえるかもしれない。「指示手段」、「指示原子団」および「標識」という、より一般的な用語が本発明では使用されており、ここではインビボ標識または螢光色素または酵素のように検定する動物の体内では、それ程有用でない標識が意図されている。

前記指示手段は、前記受容体と結合するが、ここでは抗体が１２５１で標識されている。該手段は、またすべての指示物質または１部の別々の分子または原子を構成し、該分子または原子はＨＲＰの結合したウザギ抗マウス抗体のような受容体分子と反応し、該抗体受容体はマウス内に生成され、または１２５１のような放射性元素がスタフィロコッカス　アウレウス指示標識剤は好ましくは前記受容体と共に供給され、−緒にパッケージされるか、または別々にパッケージするこ七ができる。過酸化水素およびジアミノベンジジンのような袖ＩＩＪ＋剤が、ｔｌ　ＲＰのような指示原子団を使用する際、系に含まれ得る。このような物質は多くの指示原子団と同様に市販品として容易に入手でき、診断系と共に供給する必要はない。加えて、過酸化水素のような、いくつかの試薬は時間と共に分解し、またいくつかの放射性元素などは短命である。これらは好ましくは最終利用者自身により調達される。

かくして、哺乳動物においてインビボで活性化血小板のサイ１−を検出する上記方法は、次の工程を含んでいる。すなわち、（ａ）　本発明の受容体を有効量で含む組成物を調製する。ここで抗−ＴＳＰのような受容体は、インビボ指示原子団に結合している。代表的組成物としては、水単独、水性生理塩水、リン酸緩衝生理塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）または他の水性緩衝液によって与えられるような水性の、生理学的に許容できる媒体中に、約１〜約１００ｍｇの前記標識受容体を含むものが挙げられる使用される受容体の量は、とりわけ、完全抗体が使用される哺乳動物、血管刺激性現象および受容体のクラスに依存している。有用な指示原子団としては、前述のようにガンマ線放射元素、ＮＭＲ活性元素等が含まれる。

（１））このようにして与えられた組成物は、血栓症血管刺戯現象によって生成されるような活性化血小板の存在に対し検定されるべき哺乳動物の血流中に注入することにより導入される。

（（″、）このようにして注入された哺乳動物は、前記指示原子団の結合した（標識された）受容体が活性化血小板表面で錯体を形成し、かつ任意の錯体形成しない受容体を身体から除去するに十分な、前もって設定した時間維持される。

（ｄ）　前記哺乳動物は、次いで前記錯体形成した、標識受容体の位置検出手段で走査される。代表的検出手段としては、通常使用されるガンマ線検出器、ポジトロン放射断層撮影に使用される装置および実際に任意の時に身体の１部のみを走査するいわゆる「全体Ｊ　ＮＭＲ分光器が含まれる。

本発明は、更に、本発明の受容体を調製する方法、このような受容体を使用した検定方法およびパッケージ形態で本発明の受容体を含む診断系を意図している。

下記の議論においては、より一般的発明の代表として、特に好ましい受容体、これらの調製および利用に重点をおいて本発明のいくつかの特定かつ例示的な具体例を述べる。

ローラー（Ｌａｗｌｅｒ　）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）　２３　、８６０９　（１９７８）に記載されているように、血小板をトロンビンで活性化し、トロンポスポンジンを単離し、これを精製することにより、血小板濃縮物より得られ、１〜３日経過した血小板濃縮物からヒト血小板トロンポスボンジンを解放した。簡単にいえば、安定な可溶性のトロンポスボンジンを生理塩水中で排除、クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーの組合せにより単離した。前記トロンポスポンジン（ＴＳＰ）生成物の純度は、等電点電気泳動およびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析法により決定した場合、９５％より大きな値であった。

モノクローナル　抗−’ｒ　ｓ　ｐはコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ　）等、ネーチ− ？−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５　（１９７５）における標牟ハイブリドーマ技術を使用して形成した。部側に言えばＢΔＬＢ／Ｃマウスを完全フロインドアジュバント中に乳化されたマウスあたり約２５μｇのトロンポスボンジン試料の腹腔内注入によって免疫した。前記マウスを同じ容積の不完全フロイドアジュバント中の２５μ乙の前記トロンポスボンジン試料で、１４．２６．３６．および４７日１に再び免疫した。

次いで、各々のマウスを後方眼窩叢から出血させた。得られた血清を、抗体識別剤としてのＩ　１２５−山羊一抗−マウス免疫グロブリン〔シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　（”ｈｅｍ、）社、ミズーリー州・セントルイス〕と、固相抗原としての各々のウェル」二に塗布した２、５μｇ／ｍβのトロンポスポンジンとを用いた同相放射線免疫検定を使用して、抗トロンポスポンジン抗体に対しスクリーニングした。

最も高い力価の抗−ＴＳＰ抗体を有する二匹のマウスを更に免疫するため選択し、最初の免疫から９０日経過後に静脈内に２０μｇの前期ＴＰＳ試料を投与し、腹腔内に２０μｇの前期ＴＳＰ資料を投与することにより再び免疫する。前期マウスを９３日経過後４０μｇのトロンポスボンジン試料で再び免疫し、最も高い力価の抗−ＴＳＰ抗体を有するマウスを細胞融合のため選択した。

前期マウスは最後の免疫後３日経過後に殺した。前記マウスの肺臓を取出し、肺細胞を単離し、適当な媒質中に懸濁させた。この実験方法は周知の技術である。

適当な媒質としてはＩ−Ｉ　Ａ　Ｔ　（ヒポキザンチン、アミノプテリンおよびチミジン）があり、肺臓当たり約１　ｍＡの媒質で十分である。別の適当な媒質としては、１０％の仔牛脂児血清（ＦＣ３）を含むダルベツコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ　）がある。

前記肺細胞を、全体で］、、５Ｘ１０’個の細胞を生成するためプールした。前記細胞を、次いで、適当な細胞融合促進剤の存在下で未融合ネズミ（マウス）ミエローマセルライン×６３、６５７と融合させ、未融合牌細胞、未融合ミエローマ細胞および融合ハイブリドーマ細胞を含む組成物を得た。適当な融合促進剤としては、約１０００〜約４０００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）［シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ　）社、ミズーリー州、セントルイスより市販されているＰ　Ｅ　Ｇ　１０００、Ｐ　Ｅ　Ｇ　４０００］がある。

全容積的０．５〜１．０ｍｌの融合培地は、代表的には約３×１０７個のミエローマ細胞と融合した１０！１個の牌細胞に苅し適切である。カーティス（Ｃｕｒｔｉｓｓ　）等のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　。

２５７　、１５２１３　（１９８２）に記載されているように、好ましい比率は１０個の牌細胞あたり約１個のミエローマ細胞である。

多くのマウスミエローマセルラインが知られ、例えば、サルク・インスティデュート・セル・ディストリビューションセンター［（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　）カリフォルニア州、う・ジヨウ］のような種々の寄託機関より入手できる。容認しつる実施によれば、前期マウスミエローマセルラインは好ましくは「薬物抵抗」型であるべきである。この結果、未融合ミエローマ細胞は選択培地中では生存せず、一方ハイブリッドは生存する。最も一般のクラスは８−アザグアニン抵抗セルラインであり、これは、酵素ヒポキサンチン　グアニン　ホスホリボシル　トランスフェラーゼに乏しく、従ってＨＡＴ培地で生育しない。

未融合肺臓細胞、未融合ミエローマ細胞および融合細胞の混合物を未融合細胞を殺すに十分な時間（約１０〜１４日）で選択ＨＡ　Ｔ培地において、別々のコンテナで稀釈し、培養した。「コンテナ」という用語は、本発明では、特に微量滴定プレートまたは組織培養プレートのウェルを言うが、他の適当なコンテナも使用しつる。

特に、融合３日経過後、生育可能な細胞がＨＡＴ培地中で１ウエルあたり２Ｘ１０’生育可能細胞（全体で約３．５００ウエル）で９６ウエルの組織培養プレートを覆った。前記プレートを覆った細胞に融合後７日経過後にＨＡ　Ｔ培地を供給しかつその後約４〜５日間隔で必要に応じて更に供給した。微細な成長がおこり、抗体を含む培養上澄を融合１４日経過後に、固相放射線免疫検定（ＲＩＡ）による抗原特異的抗体産生の検定のため集めた。１４日経過後に、３．５００ウエルのうぢ７００ウエルが生育可能な細胞のコロニーを含んでいた。

ヤギ抗マウス免疫グロブリンを使用した固相免疫検定によって測定されるように、２５個のウェル、すなわち１％未満の培養上澄がヒトトロンポスポンジン（抗 −ＴＳＰを含ム）と反応した。これら２５ウエル中６ウエル（９Ｄ３．１１Ｆ３．１４Ｆ７．９Ｄ７．１１Ｄ７および１３Ｆ５と名づける）を融合２２日経過後に確認スクリーニング、すなわち、正常なヒト体止血小板とは反応がなく、ヒト活性化血小板と良好に反応がおこるようにスクリーニングを行なうため選択した。

更に限界稀釈法によって再びクローニングした。ここで稀釈液の容積は統計的に計算し、各々、別々のコンテナ（例えば、微量滴定プレートの各々のウェル）において一定数の細胞（例えば１−４）が分離されるようにした。

ハイブリドーマ成長および抗体分泌に適した時間（１４〜２８日）の経過後、得られた各コンテナ中の上澄液を、ＩＪ　ｌ−ン　バイオネティックス　キット［Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ　Ｋｉｔ（メリーランド州（ＭＤ）、ケンシングトン（Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ　）のリトンバイオネティックス（Ｌｉｔｔｏｎ　［１ｉｏｎｅｔｉｃｓ）　）を用いて、該キットの仕様に記載のように、分泌された抗−ＴＳＰのイソタイプにつき評価した。所定のハイブリドーマを選択し、培養上澄液から抗−ＴＳＰを回収した。

クローン化ハイブリドーマを１０％の牛胎児血清（Ｆｅ２）を含む培地内で培養し、ケネディ−（Ｋｅｎｎｅｄｙ　）等のダイアビーテス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　）、１９８２．３１　（サブルメント３）。

５２に記載のように液体窒素中で凍結保存した。

一旦所定のハイブリドーマを選択し、かつクローニングずれば、得られる抗体は２つの方法の一つにより生産できる。

より純粋なモノクローナル抗体が、適当な培地中で適当な長さの時間、所定のハイブリドーマをインビトロで培養し、次いで上澄液から所定の抗体を回収することにより生成される。

適当な培地並びに培養時間の長さは公知であり、また容易に決定される。インビトロ技術は、ヒト由来の抗原と免疫反応する他の特異的免疫グロブリン（抗ヒト免疫グロブリン）を木質的に含まない受容体を生成する。少量の他の免疫グロブリンが存在する場合があるが、これは培地が外因性血清（例えば、牛胎児血清）を含むためである。しかしながら、このインビトロ法は、いくつかの目的にとって十分な量のあるいは濃度の抗体を生成し得ない。

わずかに純度の劣るモノクローナル抗体をより高濃度で生産するためには、所定のハイブリドーマを、ブリスタン〔アルドリッチ　ケミカル　カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ。

Ｃｏ、）、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ　）、ウィスコンシン州（ＷＩ））感作マウス、好ましくは牌細胞を得たマウスに対して同系のもしくは準−同系のマウスに注入することができる。このハイブリドーマは適当なインキュベーション時間後に、抗体産生腫瘍を形成する。これは宿主マウスの血流中および腹膜滲出液（腹水）中に所定の抗体を比較的高濃度で与える。これらの宿主マウスはまた、その血液および腹水中に通常の抗体類を有しているが、これら通常の諸抗体の濃度はモノクローナル抗体濃度のわずか約５％にすぎない。その上、これらの通常の抗体はその特異性において支配的に抗−ヒト性ではないので、回収した腹水または血清から得られるモノクローナル抗体は、任意の痕跡の抗−ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない。

クローン化ハイブリドーマにより分泌された抗体の免疫グロブリンの１４鎖およびＬ鎖は、モノ（Ｍｏｎｏ）　Ａ　Ｂ　−Ｉ　ＤＥＩＡキット（Ｋｉｔ）　Ａ　（ロットＮａ　２０９２０．カリフォルニア州（ＣＡ）、サンフランシス：］　（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　）のジムドラブズ　インコーホレーテッド（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｓ　Ｉｎｃ、）を用いて決定された。この検定は該キットの製造業者により記載されたように、ハイブリドーマ培養上澄について実施した。

腹水を、上記６種のセルライン（９Ｄ３．１１Ｆ３．１４Ｅ７．９Ｄ７および１１Ｄ７）の５種から調製した。

９Ｄ３から得たもの以外のすべての抗体の場合において、酢酸セルロース電気泳動で単一のバンドが観察された。このことは更にモノクローナル性を証拠づけている。

９Ｄ３の場合においては、３つのバンドがみられた。このため、このセルラインはサブクローン化され、腹水を元のクローン２種およびサブクローン２種から集めた。各場合において、上記３つのバンドパターンを観測したところ、このセルラインもモノクローナルであることを示唆した。これら３つのバンドは恐らく抗体の１１釦およびＬ釦と親ミエローマラインにより生成されたミエローマタンパクとの再結合によるものであろう。

セルライア１４Ｅ７（ＡＴＣＣＨ８８６８０）は、オフテルロニー免疫拡散法によりＫ　Ｌ鎮を有するＩｇｃ２．抗体（ＭａｂＴＳＰ　ｌ−１）を産生ずるものと決定された。ＭａｂＴＳＰＩ−１は１０８のヒトトロンポスポンジンに対する固相放射線免疫検定（本明細書の第■ＩＣ章に記載したように）においである力価を有し、かつヒトフィブリノーゲンまたはフィブロネクチンとは反応しない。

加えて、ＭａｂＴＳＰＩ−１は酢酸セルロース電気泳動においてＴ移動度の単一の主バンドを示す。精製トロンポスポンジンまたはヒト血小板のウェスタン法において、この抗体は見掛は上のザブユニット分子量１８０．０００ダルトンの単一のポリペプチドと反応する。上記分子量は公知のトロンポスポンジンのサブユニット分子量と一致する。免疫螢光染色（本明細書の第１１［Ｄ　（１）章参照）法において、抗体は血小板α−粒子を染色する。これはトロンポスボンジンの貯蔵サイトであることが知られている。

セルライ：／９Ｄ７　（ＡＴＣＣＨ８８６８］）は”　ＭａｂＴＳＰ　Ｉ−２” と命名されたモノクローナル抗体を産生し、該抗体はＭａｂＴＳＰＩ−１と類似の諸特性を示ずが明白なエピトープを認識する。

Ｂ、ポリクローナル　抗−ＴＳＰの形成モノクローナル抗−ＴＳＰの形成に関連して前に記載したように、ポリクローナル抗−ＴＳＰは、ローラー（Ｌａｗｌｅｒ）等〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、１９７８，２３，８６０９］に従って精製されたトロンポスポンジン調製物を用いて生成された。

兎を、１　ｍｇのトロンポスボンジンの完全７０インドアジユバント溶液で２ケ月に１回の割合で皮下投与することで免疫した。

次いで、各兎を放血し、■１２５−山羊−抗マウス免疫グロブリン〔シグマケミカルコーポレーション（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　）、セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　）、ミズリー州（ＭＯ））を用いた固相放射線免疫検定法で、血清を抗−トロンポスポンジン抗体につきスクリーニングし、２．５ｍｇ／ｍＡのトロンポスボンジンを前記のごとく各ウェルに塗布した。

Ｃ０固相放射線免疫検定法（ＲＩΔ）可撓性丸底ポリビニルクロリド製微量滴定プレート〔ファルコン、マイクロテストｍ　（Ｆａｌｃｏｎ、　Ｍｉｃｒｏ　Ｔｅ５ｔｌｌＩ　）　。

バクトン　ディッキンソン＆コーポレーション（ＢｅｃｋｏｎＤｉｃｋｉロｓｏロａ口ｄＣｏ、）、　オクスナード、カリフォルニア（０ｘｎａｒｄ　、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　］中で検定を行った。これらウェルを、０．０５＋＋＋４２のトロンポスボンジンのＰＢＳ溶液を加え、プレートを３時間室温でインキュベートして一定の最終固相−結合抗原濃度を与えるように、トロンポスポンジン抗原で被覆した。すべての抗原を１μｇ／ｉｆｆで被覆した。これらウェルを３０分間、０．２５ｍ１２の３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および３％の正常山羊血清を含むＰＢＳで“後−被覆”して残留する活性サイトを隠蔽した。

検定のため、０．０５ｍＮのマウス血清およびハイブリドーマ培養上澄を含有する水性培地を、３％のＢＳＡを含む溶液で０．２５ｍ１．に希釈し、３％の山羊血清および０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイーン−２０）を各ウェルに添加して、固相−結合抗原を接触させ、かつ固／液相混合物を形成した。この固／液相混合物は、血清または上澄中に存在する抗−ＴＳＰ抗体が該抗原と免疫反応するのに十分な時間（４℃で］８時間）維持した。この固相および液相を分離して、固相を洗浄した。

洗浄後、免疫反応したマウス抗体即ち固相抗原に結合した抗体を、ウェル当りＬｏｎｇの免疫化学的に精製、放射性ヨウ素化した山羊抗−ネズミ免疫グロブリン（３〜４μＣｉ／μｇ）を含む組成の混合物によって検知して、第２の固／液相混合物を形成した。この第２の固／液相混合物を、該山羊抗〜ネズミ抗体が存在する任意の固相−結合抗体と免疫反応しかつこれに結合するのに十分な時間、例えば４時間、４℃にてカーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）等の上記文献に記載のように保持した。

この第２の固／液相混合物は分離され、分離された固相は典型的には洗浄して、あらゆる付着物、非特異的に結合した放射性ヨウ素化された山羊抗、ネズミ抗体を除去した。

次に、固相に結合した、山羊結合抗−ネズミ抗体の量を測定し、力価を標準的な周知の技術に従って得た。

コンペティティブアッセイは同様な方法で行い、３％の牛血Ｆｔアルブミン、３％の山羊血清および０．０５％のツイーン＝２０を含むＰＢＳで希釈した０、０２５ｍｊ２の競合体および限界量のモノクローナル抗体を含有する培養上澄０．０２５ｒｄを含んでいた。非特異的結合は特異的ハイブリドーマ培養上澄を、同じ！−１鎮型の免疫グロブリンを産生ずる非関連ハイブリドーマの培養上澄の同様な希釈物で置換することにより決定した。

特異的抗体（Ｂ、）の接合した１２５Ｉ−第２抗体の最大量は競合体の不存在下で測定した。データはＢ／Ｂ０として計算した。ここでＢはコンペティターの所定の濃度の下で結合した抗体１分当たりの平均カウント数を表わす。対照モノクローナル抗体は抗−アポリボタンバクＢであった。

Ｄ、像形成試薬の調製１）螢光法免疫螢光染色法は、ポリリジン−被覆円形ガラスカバースリップ上で２％のホルムアルデヒドを固定した血小板につき行った。これら細胞は０．１％トライトンＸ−１００で約３分間処理して、抗体に対して透過性とし、かつ約２０分間抗− ＴＳＰ抗体と共にインキュベートした。これら細胞をＰ’ＢＳですすぎ、２０分間、ローダミン標識兎Ｆ（ａｂ　’　）、抗−山羊免疫グロブリン〔カッペルラボラトリーズ（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒ〜ａｔｏｒｉｅｓ　）　、　）　ツクランビル、ペンシルバニア（Ｃｏｃｈｒａｎｖ　１−１１ｅ　、　ＰＡ））で染色した。この血小板はＨＢ　Ｏ５０Ｗ水銀ランプおよびＩＶＦＩｒ−ビ螢光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）　：Ｉ７テ゛ンサを備えたツγイス（Ｚｅｉｓｓ　）ユニバーサル顕微鏡〔カールツアイス（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）インコーポレーション、ニューヨーク〕により可視化された。

２）放射線標工な法抗−ＴＳＰ抗体は約０．５μＣｉ／μｇの特異的活性まで１２５１で放射線標識された。また２抗体放射線免疫検定法を実質的にブロー（Ｐｌｏｗ　）等のジャーナル　オブ　イムノロジー（ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．）、１９７１，１０７．１４９５に記載のように行った。ここで、この文献を本発明の参考文献とする。

検定はプラスチック製のシリコン処理したチューブ内で約２２℃にて、０．０２５ＭＮａＣＣＯ，０４Ｍ硼酸ナトリウム、１　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａのバッファー系（ｐ１１約８．３）中で最終濃度的１５ｎｇ／ｄの１２５１−標識抗体で実施した。

Ｅ８診断系好ましくはキット形の診断系は、更に別の本発明の態様を構成する。この系は細胞表面表現された血液タンパク成分の血中での活性化および休止血小板間の差異を検出し、かつ識別する上で有用である。この系は少なくとも１つのパッケージを含み、これは本発明の生物学的に活性な受容体の有効量を含む。これは、活性化血小板に結合するが休止血小板には結合しない受容体である。

予め決められた量の受容体が、予め決められた量の血小板含有血液サンプルと、適当な指示手段の存在下で混合されるこの混合物を、該受容体がサンプル中に存在するかも知れない活性化血小板と免疫反応するのに十分な時間維持する。即ち、該混合物を、上記受容体と細胞表面表現タンパクとの間で錯体を形成するのに十分な時間維持する。該受容体は該細胞表面表現タンパクに対して生成されたものである。上記指示手段は、血小板が残りのサンプルから分離された後に、錯体の形成を検知し信号を発生ずるのに利用される。

ハイブリドーマ上澄液、腹水液またはバッファー中の受容体の水性溶液を指示体標識手段と混合して、液状試薬として血液サンプルと混合することができる。また、この試薬は微量滴定プレートの壁に被覆し、次いでトロンとンー感作血液サンプルと混合することができ、またこのトロンビン−感作血液サンプルは微量滴定プレート壁またはニトロセルロースシート上に塗布でき、あるいはまたここで混合された試薬を含むバッファー溶液、組織部ハイブリドーマ上澄液または腹水液中に存在してもよい。

本明細書で議論した結果は、本発明のハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ　８６８０およびＨＢ８６８１によって産生されたモノクローナル抗体につき得られた。しかしながら、本明細書で議論した結果は上記モノクローナル抗体を用いた態様の例示であり、かつ本発明はこのように限定することを意図するものではないものと理解すべきである。

手続補正書（方式）％式％３、補正をする者事件との関係　出願人住　所　東京都千代ヨ区丸の内３丁目３番１号電話（代）　２１１−８７４１国際調青報告Ａ　ｔ　ｔ　ａ　ｃ　ｈｍ　ｅ　ｎ　ｔＵ、Ｓ、　ＣＬ、　４３５／６８；　４３５／１７２；　５３０／３８７

Claims

【特許請求の範囲】

１．血小板細胞膜性抗原に対して動物宿主中に生成された受容体と指示手段を含む座位特異的像形成診断薬であって、前記受容体は、血小板が刺激状態にある場合には、該血小板の特異的細胞膜性抗原に選択的に結合することができるが、該血小板がそれ程刺激されていない場合には実質的に前記血小板には結合せず、かつ前記指示手段は、前記受容体を標識し、前記抗原の位置を像形成し、これによって前記診断薬は刺激状態にある血小板と刺激状態にない血小板を検出し、区別することができることを特徴とする上記診断薬。
２．前記受容体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の診断薬。
３．前記受容体がハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８６８０およびＡＴＣＣＨＢ８６８１から成る群から選ばれる１種のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の診断薬。
４．前記抗原がトロンボスポンジンであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の診断薬。
５．（ａ）ヒト血小板細胞膜性抗原を、該抗原に対し抗体産生を誘起するに十分な量で動物宿主に投与し、ここで前記抗体は前記抗原の受容体であり、（ｂ）前記免疫された宿主を前記抗原に対する抗体を形成するに十分な時間維持し、（ｃ）前記免疫された宿主から抗血清を取り出し、（ｄ）このようにして生成された受容体を実質的に純粋な形で回収し、および（ｅ）前記受容体を指示手段と混合する、工程を含む座位特異的診断薬の製造方法。
６．前記細胞膜性抗原がヒト血小板細胞内タンパク成分であることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。
７．（ａ）ヒト血小板細胞膜結合性抗原を、該抗原に対し抗体産生を誘起するに十分な量で動物に投与し、（ｂ）前記免疫された宿主を前記抗原に対する抗体を形成するに十分な時間維持し、（ｃ）前記免疫された宿主から抗血清を取り出し、（ｄ）前記抗血清から抗体産生細胞を回収し、（ｅ）前記抗体産生細胞を未融合ミエローマ細胞と融合することにより、細胞ハイブリドーマを形成し、（ｆ）融合された前記ハイブリドーマを適当な培地中で培養し（ｇ）血小板が刺激状態にある場合には該血小板の細胞膜性抗原に結合するモノクローナル受容体を生産する能力に対し前記ハイブリドーマを検定・選択し、ただし、前記受容体は、前記血小板が刺激状態にない場合には、実質的に前記血小板に結合せず、および（ｈ）前記ハイブリドーマ生成物として前記モノクローナル受容体を実質的に純粋な形で集める、工程を含む座位特異性診断薬として使用するためのモノクローナル受容体の形成方法。
８．前記受容体がハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８６８０およびＡＴＣＣＨＢ８６８１から成る群から選ばれる１種のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
９．前記細胞膜性抗原が、３００，０００ダルトンを越える見掛分子量を有する、シアロ種タンパクであるヒト血小板細胞内タンパク成分であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
１０．血小板細胞膜性抗原の試料中における存在の検出用、かつ像形成用診断用キットであって、前記系が少なくとも１つのパッケージ内に活性成分として、有効量の座位特異性試薬を含み、該試薬が前記抗原に対する受容体と、試料中に導入された場合に刺激状態にある血小板の特異的細胞膜性抗原とは選択的に結合するが、前記血小板が刺激状態にない場合には実質的に血小板には結合しない指示手段とを含むことを特徴とする上記診断用キット。