JPH1192343A

JPH1192343A - 毛髪成長期延長剤

Info

Publication number: JPH1192343A
Application number: JP27526197A
Authority: JP
Inventors: Eriko Takeoka; 永里子武岡; Yosuke Nakazawa; 陽介中沢; Chika Hamada; 千加浜田; Jun Suzuki; 順鈴木; Tsutomu Soma; 勤相馬; Masashi Ogo; 正志尾郷; Masahiro Tajima; 正裕田島
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1997-09-22
Publication date: 1999-04-06

Abstract

(57)【要約】【課題】毛髪伸長の促進をすることによって毛周期にお
ける成長期を維持又は延長する毛髪成長期延長剤を提供
すること。【解決手段】不飽和脂肪酸、特に式Ｃ_ｎＨ_ｍＯ_２〔炭素原子数ｎは１２〜２８，水素原子数ｍ＝ｎ＋１〜
２ｎ−２〕で表される、その二重結合がｃｉｓ体である
不飽和脂肪酸である及び／又はその誘導体を有効成分と
する毛髪成長期延長剤を提供することにより、上記課題
を解決し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、毛髪成長期延長剤
に関する技術分野に属する発明である。より詳細には、
毛髪伸長の促進をすることによって毛周期における成長
期を維持又は延長する毛髪成長期延長剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢化社会、ストレス社会といわれる現
代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機に
さらされる機会がますます多くなってきている。これに
対応して、より優れた「育毛料」を提供すべく様々な試
みがなされている。育毛料が毛髪に与える効果として主
なものに、発毛誘導効果（発毛促進効果，成長期誘導
効果），毛髪を太くする効果，毛髪成長期延長効
果，５α−レダクターゼ阻害効果，血行促進効果，
殺菌効果，フケ防止効果，保湿効果，抗酸化効
果等の効果が挙げられる。

【０００３】しかしながら、前記のように種々の試みが
なされているにもかかわらず、従来の育毛料では、その
脱毛防止，発毛効果等の育毛作用は必ずしも十分なもの
ではなかった。これはおそらく脱毛の原因がさまざまで
あり、また発毛の機構も非常に複雑であるためと考えら
れている。今まで提供されている「育毛料」は、脱毛を
比較的大雑把な概念、言い換えれば漫然と「脱毛」とい
う現象のみを捉えて開発されており、そのメカニズムに
まで突っ込んで着目して開発されたものは決して多くな
い。その大きな理由が、これらのメカニズムに着目した
育毛効果を簡便に検定することが可能な育毛薬剤検定方
法が十分に提供されていなかったという面を否定できな
いことである。特に上記の毛髪成長期延長効果を検定
する育毛薬剤検定方法の確立は難しく、結果としてこれ
まで提供されてきた育毛料は、毛周期の成長期へと毛髪
を誘導して育毛する上記の発毛誘導効果に着目したも
のや，の５α−レダクターゼ阻害効果に着目したもの
が多かった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者はin
vitroで行う簡便な上記の毛髪成長期延長効果を検定
する育毛薬剤検定方法を確立し、その育毛薬剤検定方法
を用いて上記の毛髪成長期延長効果を有する成分を有
効成分とする毛髪成長期延長剤を見出すことを目指し
た。

【０００５】本願は、その一連の課題のうち、特に上記
の毛髪成長期延長効果を有する成分を見出し、これを
有効成分とする毛髪成長期延長剤を提供することをその
課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、種々の物質
における上記の毛髪成長期延長効果を有する成分につ
いて、本発明者が見出した育毛薬剤検定方法を用いて鋭
意検討したところ、不飽和脂肪酸及びその誘導体に、所
望する毛髪成長期延長効果が認められることを見出し、
本発明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、不飽和脂肪酸及び／又
はその誘導体を有効成分とする毛髪成長期延長剤を提供
する。この不飽和脂肪酸は、通常、式Ｃ_nＨ_mＯ₂ 〔炭素原子数ｎは１２〜２８，水素原子数ｍ＝ｎ＋１〜
２ｎ−２〕で表される不飽和脂肪酸である。

【０００８】そして、さらにこれらの不飽和脂肪酸のう
ち、その二重結合部分がcis 体である不飽和脂肪酸を選
択することが好ましい。これらの条件を満たす不飽和脂
肪酸として、例えばドデセン酸，トリデセン酸，ヘプタ
デセン酸，ペトロセリン酸，パルミトレイン酸，オレイ
ン酸，バクセン酸，リノール酸，α−リノレン酸，γ−
リノレン酸，エイコセン酸，エイコサトリエン酸，エル
カ酸(cis-13-ドコセン酸），ドコサジエン酸，ドコサト
リエン酸，ドコサテトラエン酸，ドコサペンタエン酸，
アラキドン酸，ネルボン酸又はドコサヘキサエン酸から
なる群の不飽和脂肪酸から選ばれる１種又は２種以上の
不飽和脂肪酸を挙げることができる。

【０００９】なお、これらの不飽和脂肪酸のうち、ペト
ロセリン酸，ドコサヘキサエン酸又はオレイン酸を選択
することが特に好ましい。

【００１０】前記したように、本発明において「毛髪成
長期延長剤」は、主に後述する育毛薬剤検定方法によっ
て少なくとも毛包上皮系細胞の分裂増殖活性若しくは毛
幹伸長活性を維持又は促進することで毛髪の成長期を延
長する効果を有する成分を有効成分として配合した、特
に上記の毛髪成長期延長効果に着目した毛髪関連薬剤
であり、いわば「個別効能育毛料」としての特徴を有す
る。

【００１１】この「毛髪成長期延長剤」は、例えば毛根
近傍における毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等
により成長期が短くなって、相対的に成長期毛よりも休
止期毛の割合が多くなってしまうことに起因する脱毛症
に特に有効な薬剤である。また、他の個別効能を有する
育毛料と組み合わせて用いることにより、幅広くの脱毛
症においては，総合的かつ相乗的な効果を上げることが
可能である。すなわち、この「毛髪成長期延長剤」は、
前記した〜の効果を包含する概念を有する一般的な
育毛料用途とは一線を画する用途を有するものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明毛髪成長期延長剤は、上述したよう
に不飽和脂肪酸及び／又はその誘導体をその有効成分と
する毛髪関連薬剤である。

【００１３】本発明毛髪成長期延長剤の有効成分となり
得る不飽和脂肪酸は、人体に対する安全性が担保されて
いる限りにおいて特に限定されるものではないが、炭素
数が１２以上２８以下で，かつ二重結合たcis 体をとる
不飽和脂肪酸が好ましい。具体的には例えばドデセン
酸，トリデセン酸，ヘプタデセン酸，ペトロセリン酸
（cis-6-オクタデセン酸），パルミトレイン酸（cis-9-
ヘキサデセン酸），オレイン酸，バクセン酸，リノール
酸，α−リノレン酸，γ−リノレン酸，エイコセン酸，
エイコサトリエン酸，エルカ酸(cis-13-ドコセン酸），
ドコサジエン酸，ドコサトリエン酸，ドコサテトラエン
酸，ドコサペンタエン酸，アラキドン酸，ネルボン酸
（cis-15- テトラコセン酸）又はドコサヘキサエン酸等
を挙げることができる。

【００１４】これらの不飽和脂肪酸のうち、ペトロセリ
ン酸，ドコサヘキサエン酸及び／又はオレイン酸を選択
することが特に好ましい。

【００１５】なお、これらの不飽和脂肪酸の原料が、植
物、例えばコリアンダー，コンフリー等である不飽和脂
肪酸を本発明毛髪成長期延長剤の有効成分として選択す
ることもまた好ましい。

【００１６】また本発明毛髪成長期延長剤の有効成分と
して、これらの不飽和脂肪酸の誘導体を選択することも
可能である。

【００１７】具体的にこの誘導体の態様としては、例え
ば不飽和脂肪酸モノグリセライド、不飽和脂肪酸ジグリ
セライド、不飽和脂肪酸トリグリセライド、製薬学上許
容される不飽和脂肪酸塩，不飽和脂肪酸エステル，不飽
和脂肪酸アミド、不飽和脂肪酸二塩基酸若しくはその製
薬学上許容される塩等が挙げられる。これらの不飽和脂
肪酸又はその誘導体は、それぞれ通常公知の方法で製造
することができる。また、市販品を用いることもできる
のは勿論である。

【００１８】これらの不飽和脂肪酸又はその誘導体は、
強い毛包上皮系細胞の増殖作用及び毛幹の伸長作用を有
しており、これらを単独で又は２種以上を組み合わせ
て、本発明毛髪成長期延長剤の有効成分とすることがで
きる。

【００１９】本発明毛髪成長期延長剤における上記不飽
和脂肪酸及び／又はその誘導体の配合量は、本発明毛髪
成長期延長剤の具体的形態等に応じて適宜選択し得るも
のであり、特に限定されるべきものではないが、概ね本
剤全体に対して１．０×１０^-9重量％以上，２０．０重
量％以下、好ましくは同０．０１重量％以上，１０．０
重量％以下となるように配合される。

【００２０】本剤全体に対して１．０×１０^-9重量％未
満の配合量では、本発明の所期の効果である毛包上皮系
細胞増殖作用に基づく毛髪成長期延長効果が十分に発揮
されず好ましくなく、同２０．０重量％を超えて配合し
ても、配合量の増加に見合った効果の増大を見込めない
ばかりではなく、製剤上支障をきたす傾向が顕著となり
好ましくない。

【００２１】このようにして、上記不飽和脂肪酸又はそ
の誘導体を有効成分として配合した本発明毛髪成長期延
長剤は、優れた毛包上皮系細胞増殖作用に基づく毛髪成
長期延長効果を有し、前記したように、例えば毛根近傍
における毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等によ
り成長期が短くなって，相対的に成長期毛よりも休止期
毛の割合が多くなってしまうことに起因する脱毛症に特
に有効な薬剤である。また、他の個別効能を有する育毛
料と組み合わせて用いることにより、特定の脱毛症にお
いては相乗的な効果を上げることもまた可能である。

【００２２】本発明毛髪成長期延長剤の所期の効果であ
る毛髪成長期延長効果における本質的作用である、毛周
期における成長期の維持又は延長作用を特定する手段
は、その特定法自体がその作用を特定するために妥当な
ものである限り特に限定されず、例えばin vitro にお
ける特定法も，in vivo における特定法も用いることが
できるが、その簡便性と有効性を考慮すると、in vitr
o における特定法を用いることが好ましい。

【００２３】以下、このin vitro における特定法の一
つである、毛包上皮系培養細胞の増殖効果を検討するこ
とを特徴とする特定法について簡単に説明する（より具
体的には、実施例において記載する。）。

【００２４】すなわちこの特定法は、「毛包上皮系培養
細胞に無血清培地中で対象物質を接触させて、その細胞
の増殖活性の有無及び／又は強弱を特定することによ
り、その対象物質の毛周期における成長期を延長する効
果を検定する一次スクリーニングを行い、この一次スク
リーニングにより効果の認められた対象物質について、
この対象物質を添加した無血清培地中でヒト毛包を培養
し、毛幹の伸長が認められた対象物質をさらに選択する
二次スクリーニングを行うことを特徴とする育毛薬剤検
定方法」、すなわち毛髪の伸長に直接的に関係する毛包
上皮系細胞に着目し、この培養細胞を用いることによっ
て、所望する毛周期における成長期を延長する効果を特
定する、in vitroの育毛薬剤検定方法である。

【００２５】この育毛薬剤検定方法の一次スクリーニン
グにおいては、においては、動物（ヒトを含む，以下同
様である）の毛包上皮系細胞を単離して得た培養細胞で
ある「毛包上皮系培養細胞」に対象物質を接触させて、
その増殖の有無及び／又は強弱を特定する。

【００２６】毛包上皮系細胞は、特に毛根近傍の外毛根
鞘細胞とマトリクス細胞等の毛包由来の上皮系細胞のこ
とを指し、内側の毛乳頭細胞は除外される。

【００２７】毛周期における成長期は、まさにこの毛幹
の伸長，すなわち毛包上皮系細胞が分裂して増殖してい
る時期であり、同退行期及び休止期はこれが鈍化して休
止する時期である。

【００２８】つまり、毛周期における成長期を延長又は
維持する物質は、その投与により毛包上皮系細胞の分裂
及び増殖活性を維持することによって、毛髪が毛周期に
おける退行期及び休止期への移行を防ぐ物質、すなわち
毛包上皮系細胞の増殖を促進又は維持し続ける物質であ
ることが結論付けられる。

【００２９】また、二次スクリーニングにおいては、ヒ
ト毛包を培養し、毛幹の伸長が認められた対象物質をさ
らに選択する。この二次スクリーニングに際しては、ま
ず毛包断片を調製することが必要である。通常は、ヒト
の健毛部の頭髪の中から成長期の頭髪を選択して、この
毛髪の毛球部から約２mm上部を切断して毛包断片を調製
することができる。

【００３０】この毛包断片は、インシュリンを含む基礎
培地で培養すれば成長期の状態が比較的長期に維持され
るが、インシュリンを含有しない基礎培地で培養すると
１週間程度の短期間のうちに退行期の毛包に類似する状
態に変化する。

【００３１】従って、インシュリンを含まない基礎培地
中で培養する場合は、１週間程度のうちに評価すること
が好ましく、インシュリンを含む培地を用いる場合には
２週間程度まで培養期間を延長することが可能になる。
どちらの培地においても、この毛包を対象被験物質の存
在下で培養することにより、毛幹の伸長の程度を観察す
ることができる。

【００３２】なお、この二次スクリーニングにおいて用
いる基礎培地は、一般的に用いられている動物細胞培養
用培地を用いることが可能であり、汚染防止のために抗
生物質や抗菌剤を添加することができる。

【００３３】毛包の培養条件は、５％ＣＯ₂・３７℃等
の動物培養における通常の条件で行うことができる。培
養は通常５〜１４日間行われる。ヒト毛包における毛幹
の伸長は、例えばミクロメーターを装着した実体顕微鏡
において目視で確認することができる。

【００３４】このように上記一次スクリーニングと二次
スクリーニングとを行うことにより、毛周期における成
長期の維持又は延長作用並びに毛幹の伸長作用を特定す
ることができる。

【００３５】なおin vitroの育毛薬剤検定方法として
は、他に対象物質を動物の毛乳頭細胞に作用させて、そ
の増殖促進効果を判定する方法も用いることができる。

【００３６】また、in vivo における特定法としては、
例えば「ヌードマウスに対象物質を投与し，このヌード
マウスの体表の発毛部位の状態を特定して，対象物質の
毛周期における成長期を延長する効果を検定する育毛薬
剤検定方法」、すなわち原則的には無毛であるが、その
体表に経時的にその発毛部位が移動する特徴的な発毛を
するヌードマウスにおける発毛部位の広さと発毛部位の
移動速度を特定することによって、毛周期における成長
期の長さを検定する方法等を挙げることができる。

【００３７】本発明毛髪成長期延長剤が採り得る剤型
は、外皮に適用可能な剤型であれば特に限定されず、例
えば液状，乳液，軟膏等を選択可能である。また、本発
明毛髪成長期延長剤の形態は任意であり、例えばトニッ
ク，ヘアークリーム，ムース，シャンプー，リンス，ク
リーム，乳液，化粧水，パック等の形態を採ることがで
きる。

【００３８】本発明毛髪成長期延長剤前記の必須成分に
加えて必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損なわ
ない限りにおいて、化粧品，医薬部外品，医薬品等にお
いて一般的に用いられる各種油性若しくは水性成分．保
湿剤，増粘剤，防腐剤，酸化防止剤，香料，色剤，各種
薬剤等を配合することができる。

【００３９】例えば、高級飽和脂肪酸，固形パラフィ
ン，流動パラフィン，シリコーン油，スクワラン，モノ
オレイン酸グリセリル，オリーブ油，高級アルコール等
の油分；グリセリン，ヒアルロン酸，プロピレングリコ
ール，マルチトール，アテロコラーゲン，乳酸ナトリウ
ム等の保湿剤；マルメロ粘質物，カルボキシビニルポリ
マー，キサンタンガム等の増粘剤；ニコチン酸アミド，
ニコチン酸ベンジル，ビタミンＥアセテート，センブリ
抽出物，塩化カルプロニウム，アセチルコリン誘導体等
の血管拡張剤；セリン，メチオニン，アルギニン等のア
ミノ酸類；ビタミンＢ₆，ビタミンＥ（若しくはその誘
導体），ビオチン，パントテン酸（若しくはその誘導
体）等のビタミン類；ニコチン酸，ニコチン酸メチル，
ニコチン酸トコフェロール等のニコチン酸エステル類；
セファランチン等の皮膚機能亢進剤；エストラジオール
等の女性ホルモン剤；グリチルレチン酸（若しくはその
誘導体）等の消炎剤；ヒノキチオール，ヘキサクロロフ
ェン，ベンザルコニウムクロリド，ビチオノール等の抗
菌剤；メントール等の清涼剤；サリチル酸，亜鉛（若し
くはその誘導体），乳酸（若しくはそのアルキルエステ
ル）等；クエン酸等の有機酸類等を配合することができ
る。本発明毛髪成長期延長剤の具体的処方は後述する。

【００４０】

【実施例】以下、実施例等により本発明をさらに具体的
に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲
が限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の
実施例等において「％」と表示され，かつ内容量を示す
ものは、特に断らない限り重量％を意味する。まず、本
実施例等において用いた植物の抽出物の毛髪成長期延長
作用を評価するためのin vitroの細胞増殖試験について
説明する。

【００４１】〔試験例１〕毛包上皮系培養細胞を用い
た細胞増殖試験Ａ．ヒト毛包上皮系細胞１．ヒト毛包上皮系細胞の採取外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周
期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取
した。この成長期の毛包を1000 U/ml dispase・0.2 ％
コラゲナーゼを含むダルベッコの改変ＭＥＭ（ＤＭＥ
Ｍ）で３０分間，３７℃で処理し、注射針の先を用いて
dermal sheath やdermal papilla、毛球部上皮組織を除
去して、0.05％トリプシン・0.02％ＥＤＴＡを含むリン
酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）：（−）とはカルシウムイオン
やマグネシウムイオンを含まない意味である〕で５分
間，３７℃で処理した。

【００４２】次にコラーゲン（Type I）コーティングし
た培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。なおこ
の際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte Growth Medi
um（ＫＧＭ）〕を用いた（Keratinocyte Serum Free Me
diumを用いることもできる）。この培養の４〜５日後
に、毛包の培養皿への接着及び細胞の増殖が確認できた
時点で培地を交換し、これ以降２日おきに培地交換を行
った。

【００４３】このようにして増殖させた細胞を、0.05wt
％トリプシン-0.02 ％含有ＰＢＳ（−）で３７℃で５分
間処理した後、等量の0.1 ％トリプシンインヒビターで
反応を停止させ、遠心処理(800×g,5 分間) を施して細
胞を回収した。

【００４４】次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させ
て、5000 cells/cm²の密度でコラーゲンコーティング
（Type I）した培養皿に播種し、細胞がsubconfluentに
なるまで２日おきに培地交換を行い、再び0.05wt％トリ
プシン-0.02 ％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）で３７℃で５
分間処理した後、等量の0.1 ％トリプシンインヒビター
で反応を停止させ、遠心処理(800×g,5 分間) を施し
て、これにより得られたヒト毛包上皮系細胞に細胞凍結
液（セルバンカー：ダイヤトロン製）を添加し、１．０
×１０⁶cell/ml の濃度に調整して、各凍結チューブに
１．０×１０⁶cellずつ入れ、これを凍結保存した。な
お、これらの細胞数は、血球算定板で算出した。

【００４５】２．対象物質のアッセイ上記工程により得た毛包上皮系細胞の線維芽細胞混入率
（ＦＢ混入率）を測定（３０００倍，５視野）し、その
結果ＦＢ混入率が３％以上のものは、アッセイの対象か
ら除外した。そして、この毛包上皮系細胞を培養フラス
コ中に播種後、これを０．２５％トリプシン−０．０２
％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）で処理した後、０．１％ト
リプシンインヒビターで反応を停止後、系を１５００rp
m で５分間遠心処理を施し、上清を除去し、残渣にＫＧ
Ｍ培地２０mlを添加して、細胞懸濁液を調製した。

【００４６】０．２ml/well の割合で、９６well-plate
（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社
製）に播種し（３．０×１０³cell/well）、細胞がウエ
ルの底に沈むまで約２０分間室温下で放置した。その
後、３７℃，５％ＣＯ₂で１日間培養を行い、所望する
ヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００４７】Ｂ．ラット毛包上皮系細胞１．ラット毛包上皮系細胞の採取：（１）毛包の採取新生児（３〜４日令）のラットを二酸化炭素で屠殺した
後、エタノールで消毒し、これらのラットの背部皮膚を
ハサミで採取した。次いで、この採取した背部皮膚を５
％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に浸漬後、皮膚脂肪層から下
の皮下脂肪や皮膜等を解剖用ハサミで除去した。次い
で、再びこの背部皮膚を１％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に
浸し、さらにこれを０．２５％トリプシン−０．０２％
ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）中に４℃で一晩浸した。

【００４８】このトリプシン溶液中における浸漬後、背
部皮膚の真皮層と表皮層をピンセットで剥がした後、真
皮層を０．３５％コラゲナーゼ含有Ｈａｍ'ｓＦ１２培
地〔組成(mg/L)：l-Alanin(8.9),l-Arginine（HCl:21
1),l-Asparagine(13.2),l-Asparatic acid(13.3),l-Cys
teine （HCl:31.5),l-Glutamic acid(14.7),l-Glutamin
e(146),Glycine(7.5),l-Histidine （HCl:19),l-Isoleu
cine(3.9),l-leucine(13.1),l-Lysine(HCl:36.5),l-Met
hionine(4.5),l-Phenylalanin(5.0),Proline(34.5),l-S
erine(10.5),l-Threonine(11.9),l-Tryptophane(2.0),l
-Tyrosine(5.4),l-Valine(11.7),Biotine(0.0073),Chol
ine(Cl:14.0),VitaminB12(1.36),葉酸(1.32),Inositol
(18.0),Nicotinamide(0.037),パントテン酸(Ca:0.477),
VitaminB6(HCl:0.062),VitaminB2(0.038),VitaminB1(HC
l:0.337),CaCl₂(2H₂O:44.0),CuSO₄・5H₂O(0.0025),FeSO
₄・7H₂O(0.834),KCl(224.0),MgCl₂(6H₂O:122)，"Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,53,288(1965)" 以下同様である〕中
で、ハサミで裁断した。この裁断物を含む培地を３７℃
で３５分間浸透を行った（６０rpm ）。浸透後、このコ
ラゲナーゼ反応物中に塊状のものが見えなくなるまでピ
ペッティングを行い、ＤＮase （10000 unit) 含有Ｈａ
ｍ'ｓＦ１２培地を添加し、５分間放置した。

【００４９】放置後、得られた懸濁液をさらにピペッテ
ィングした後、ナイロンメッシュ（Nytex 157 mesh) で
濾過した。懸濁液をＰＢＳ（−）で希釈し、次いでこの
希釈した懸濁液に遠心処理を施した（４℃，４００rpm
，５分間）。遠心後、上清を除いて脂肪分を系から除
去した。

【００５０】次いで、残渣にＰＢＳ（−）を添加して懸
濁後、これにさらに遠心処理を施した〔（４℃，４００
rpm ，５分間）×３回〕。この遠心操作により得られた
残渣が、ラットの背部皮膚における毛包である。

【００５１】（２）毛包上皮系細胞の採取上記操作により得られた毛包に、０．２５％トリプシン
−０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）を５ml添加し
て、細胞懸濁液を３７℃で５分間インキュベートした。

【００５２】インキュベート終了後、等量の０．１％ト
リプシンインヒビターとＨａｍ'ｓＦ１２培地を添加し
て、細胞懸濁液をセルストレーナー（100 μm Nalgene
社製）で濾過後、この細胞懸濁液に遠心処理を施した
（４℃，１５００rpm ，５分間）。この系から上清を除
去して、残渣として所望する毛包上皮系細胞を得た。こ
の毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバンカー：ダイヤ
トロン製）を添加し、１．５×１０⁷cell/ml の濃度に
調整して、各凍結チューブに１．５×１０⁷cellずつ入
れ、これを凍結保存した。

【００５３】２．毛包上皮系細胞の前培養：系に混入し
ている線維芽細胞を可能な限り系から除去するために、
上記工程により得られた毛包上皮系細胞の前培養を行っ
た。以下、その手順について説明する。

【００５４】３７℃の恒温槽で、上記工程により得た凍
結細胞を融解した。次いでＦＡＤ培地〔Ｈａｍ'ｓＦ１
２培地（後述）とＭＥＮ培地を容量比で３対１で混合し
たものに、インシュリン(5.0μg/ml），ハイドロコルチ
ゾン（0.45μg/ml），エピダーマルグロウスファクター
(EGF)(10.0ng/ml)，コレラトキシン(10^-9Ｍ）及びウシ
胎児血清(10 ％) を含有させた培地、以下同様である〕
を添加し、細胞溶液を希釈して系に遠心処理を施した
（１０℃以下，１５００rpm ，５分間）。遠心後、上清
を除去し、系にＦＡＤ培地を添加して、細胞塊が認めら
れなくなるまでピペッティングを繰り返した。

【００５５】次いで、ＦＡＤ培地で細胞濃度が２．５×
１０⁵cell/ml になるように調整した。Ｉ型コラーゲン
でコーティングした７５cm³の培養フラスコに細胞を播
種して、これを３７℃，５％ＣＯ₂で一晩培養した。培
養後、系をＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％トリプシ
ン−０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）を添加して、
これを３７℃，５％ＣＯ₂で４分間インキュベートし
た。次に、系にトリプシン溶液と等量の０．１％トリプ
シンインヒビターを添加して、１回軽くゆすった後で上
清を除去して、系に混入している線維芽細胞を除去し
た。

【００５６】さらに、系にＫＧＭ培地〔表皮角化細胞基
礎培地(Keratinocyto growth medium)：Keratinocyto b
asal medium （ＫＢＭ培地（改変ＭＣＤＢ１５３培地
（クローネティックス社製）））に，ウシ脳下垂体エキ
ス(BPE)(0.4vol％),インシュリン(0.5μm/ml),ハイドロ
コルチゾン(0.5μm/ml),h-EGF(0.1 ng/ml)を添加した培
地、以下同様である〕を添加し、３７℃，５％ＣＯ₂で
３日間培養した。

【００５７】３．対象物質のアッセイ上記工程により得た毛包上皮系細胞を播種した培養フラ
スコの線維芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を測定（３００
０倍，５視野）し、その結果ＦＢ混入率が２％以上のも
のは、アッセイの対象から除外した。

【００５８】系をＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％ト
リプシン−０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）を添加
して、これを３７℃で３分間インキュベートした。次い
で上皮系細胞と線維芽細胞とのトリプシンに対する反応
性の違いを利用して，系から線維芽細胞を除去するため
に、トリプシンを除去し、再び０．２５％トリプシン−
０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）を添加して、３７
℃，２０rpm で５分間振盪した。

【００５９】次いで、細胞のはがれを顕微鏡下で確認し
た後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加してピペッ
ティングを行い、系を１５００rpm で５分間遠心処理を
施した。上清を除去し、ＫＧＭ培地を添加して、細胞塊
がなくなるまでピペッティングを行った。

【００６０】懸濁液をセルストレーナー（100 μm Nalg
ene 社製）で濾過後、懸濁液中の生細胞数を血球算定板
で算出し、系にＫＧＭ培地を添加して、系の中の細胞濃
度が２．０×１０⁴cell/mlになるように調整した。次い
で、０．２ml/well の割合で、９６well-plate（Ｉ型コ
ラーゲンコーティングプレート：ファルコン社製）に播
種し（４．０×１０³cell/well）、細胞がウエルの底に
沈むまで約２０分間室温下で放置した。その後、３７
℃，５％ＣＯ₂で１日間培養を行い、所望するヒト毛包
上皮系培養細胞を得た。

【００６１】Ｃ．試験培地の調製：（１）対象物質添加培地の調製対象物質を培地全体に対して１．０×１０^-6mol/l ，溶
媒（ＤＭＳＯ）濃度が０．１％となるように、前記ＫＢ
Ｍ培地に添加した。

【００６２】（２）コントロール培地の調製・ネガティブコントロール：ＫＢＭ培地に、ＤＭＳＯ
（溶媒）を最終濃度が０．１％となるように添加した培
地を調製した。・ポジティブコントロール：ネガティブコントロール培
地に、最終濃度が５μg/mlのインシュリン，０．５μg/
mlのハイドロコーチゾンを添加して調製した。

【００６３】Ｄ．対象物質培地交換：上記Ａ，Ｂにおい
てヒト毛包上皮系培養細胞及びラット毛包上皮系培養細
胞を調製した９６well-plate中のＫＧＭ培地を、対象物
質添加培地及びコントロール培地（２００μl/well）と
交換して、交換後３７℃，５％ＣＯ₂で２日間培養し
た。

【００６４】なお、この培地の交換はウエル内のＫＧＭ
培地を，底面に付着している細胞を傷つけないように留
意しつつマルチピペットで抜いて、その後速やかに対象
物質添加培地等をウエルの両端から添加することにより
行った。

【００６５】Ｅ．細胞増殖の測定：アラマーブルー(ala
mar blue：アラマーバイオサイエンス社製) を培地量
（容量）に対して、１／１０量を添加して、３７℃（５
％ＣＯ₂）で６時間インキュベートした。インキュベー
ト後、系の５９５nm及び５７０nmでの吸光度をマイクロ
プレートリーダー（Micro plate reader:Bio RAD社製)
を用いて測定し、下記計算式に従って，細胞増殖度を算
出した。

【００６６】

【数１】

【００６７】さらに細胞増殖促進指標を、下記計算式に
従って算出した。

【数２】

【００６８】Ｆ．結果：測定した上記各対象物質におけ
る、上記細胞増殖促進指標を下記第１表に示す。

【表１】

【００６９】この結果より、上記不飽和脂肪酸に毛包上
皮系培養細胞の増殖活性が確かに認められた。すなわ
ち、上記不飽和脂肪酸には毛髪上皮系細胞の分裂増殖活
性の維持による、毛髪における成長期の維持，延長作用
が認められることが明らかになった。

【００７０】Ｇ．毛幹の伸長の検討（二次スクリーニン
グ）さらに、上記不飽和脂肪酸について、毛髪伸長効果を検
討した。ヒト毛包の器官培養実体顕微鏡下でマイクロせん刃を用いて、ヒトの頭皮か
ら成長期の毛包を単離した。単離した毛包は「Williams
Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）にペニシリン，ストレプトマイシ
ン及びファンギゾン（Fungizone)を加えた培地」（以
下、（−）培地ともいう）で洗浄した後に長さを測定
し、この（−）培地にさらに１０ng/ml のヒドロコーチ
ゾン，１０μg/mlのインスリン，１０ng/ml のナトリウ
ムセレナイト及び１０μg/mlのトランスフェリンを添加
した培地（以下、（＋）培地ともいう）（２４穴のマイ
クロプレート使用：１穴当り１ml）中に沈ませて、５％
ＣＯ₂下，３７℃で一晩培養した（前培養）。この前培
養後に再度培養した毛包の長さを測定して、伸長が０．
２５mm以上の毛包を選択して、その伸長の程度が均等に
なるように９本ずつの３群に分けた。毛包における毛幹
の伸長は、上記のマイクロプレートをミクロメーターを
装着した倒立顕微鏡を用いて目視で観察した。

【００７１】対象物質の評価対象物質である上記不飽和脂肪酸を最終濃度が１．０×
１０^-5mol/l （ＤＭＳＯ０．１％）となるように、
（−）培地に対象物質のＤＭＳＯ溶液を添加して調製し
た。また、同時に（−）培地に有機溶媒（ＤＭＳＯ）を
最終濃度が０．１％になるように添加した培地（コント
ロール培地）を調製した。

【００７２】前述した３つの毛包群の培地を、上記の培
地にそれぞれ交換し、さらに５日間５％ＣＯ₂下，３７
℃で培養した。培養開始５日目のそれぞれの毛包の長さ
を測定し、コントロール群と対象物質添加群との毛包に
おける毛幹の伸長を比較した。その結果を第２表に表
す。

【００７３】

【表２】

【００７４】この結果より、不飽和脂肪酸においては毛
包上皮系細胞の増殖を促進するのみならず、毛包におけ
る毛幹の伸長を促進し、毛包器官として調和のとれた毛
髪成長期延長効果が認められることが明らかになった。
以下、本発明毛髪成長期延長剤の処方を実施例として示
し、さらにこれらの育毛効果の検討を行った。

【００７５】〔実施例１〕液状毛髪成長期延長剤の調
製ペトロセリン酸０．１％及びオレイン酸０．１％を、７
０％エタノール９０％、ドデシルベンゼンスルホン酸
０．４９％、硬化ヒマシ油エチレンオキシド（４０モ
ル）付加物０．５％及びイオン交換水（残余）と攪拌混
合して溶解させた。さらにイオン交換水（１０％）を添
加混合して、液状の毛髪成長期延長剤を得た。この液状
の毛髪成長期延長剤の処方において、ペトロセリン酸と
オレイン酸とを除去して調製した液状の剤を対照として
調製した（比較例１）。

【００７６】〔実施例２〕乳液状毛髪成長期延長剤の
調製以下の処方により、乳液状の毛髪成長期延長剤を調製し
た。配合成分配合量（重量％）（Ａ相）ペトロセリン酸１．０ポリオキシエチレン（６０モル）付加硬化ヒマシ油２．０グリセリン１０．０ジプロピレングリコール１０．０１，３−ブチレングリコール５．０ポリエチレングリコール１５００５．０（Ｂ相）セチルイソオクタネート１０．０スクワラン５．０ワセリン２．０プロピルパラベン２．０（Ｃ相）カルボキシビニルポリマー１％水溶液３０．０ヘキサメタリン酸ソーダ０．０３イオン交換水８．３５（Ｄ相）イオン交換水４．５（Ｅ相）ＫＯＨ０．１２イオン交換水５．０

【００７７】＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ６０℃で
加熱溶解し、混合してホモミキサー処理しゲルを作り、
これにＤ相を徐々に添加しホモミキサーで分散した。次
にこれに溶解したＣ相を加え、最後に溶解したＥ相を添
加しホモミキサーで乳化してＯ／Ｗ乳液型の毛髪成長期
延長剤を得た。

【００７８】〔実施例３〕クリーム状毛髪成長期延長
剤の調製以下の処方により、クリーム状の毛髪成長期延長剤を調
製した。配合成分配合量（重量％）（Ａ相）流動パラフィン５．０セトステアリルアルコール５．５グリセリルモノステアレート３．０ＥＯ（２０モル）−２−オクチルドデシルエーテル８．０プロピルパラベン０．３香料０．１（Ｂ相）ペトロセリン酸５．０グリセリン８．０ジプロピレングリコール２０．０ポリエチレングリコール４０００５．０ドデシル硫酸ナトリウム０．１ヘキサメタリン酸ソーダ０．００５イオン交換水３９．９９５

【００７９】＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加熱溶解
し混合し、ホモミキサーで乳化してクリーム状の毛髪成
長期延長剤を得た。

【００８０】〔試験例２〕本発明毛髪成長期延長剤の
育毛作用の検討本発明毛髪成長期延長剤の脱毛防止、発毛効果等の育毛
作用を調べるために、以下の方法でヒトに対してトリコ
グラム試験を実施した。被験試料及び対照試料は、実施
例１〜３の本発明毛髪成長期延長剤、比較例１の剤及び
７０％エタノールである。

【００８１】試験方法上記試料の使用前と使用後の抜去毛髪の毛根を顕微鏡下
で観察し、毛根の形態から，成長の止まった毛の毛根で
ある「休止期毛根」数（脱毛を訴える人は正常な人より
もこの休止期毛根の割合が多いことが認められている）
を計数し、その割合の増減によってこれらの試料の育毛
作用を比較した。

【００８２】すなわち、被験試料及び対照試料をそれぞ
れ男性被験者１０名の頭皮に１日２回，１回２mlずつ６
カ月間連続して塗布し、塗布直前及び６カ月間塗布終了
直後に被験者１名につき１００本ずつ毛髪を抜去し、そ
れぞれの毛根を顕微鏡下で観察した。また、上記試料に
おける育毛効果が有効か無効かに関する実使用テストを
行った。これらの試験の結果を、下記第３表に示す。

【００８３】

【表３】

【００８４】この第３表の結果から、不飽和脂肪酸であ
るペトロセリン酸を有効成分として配合した本発明毛髪
成長期延長剤には、このペトロセリン酸の毛髪成長期延
長効果に基づく育毛効果が認められた。また、上記した
ペトロセリン酸以外の不飽和脂肪酸等においても、ペト
ロセリン酸と同様に毛髪成長期延長効果が認められたこ
とから、これらの植物抽出物等を有効成分として配合し
た本発明毛髪成長期延長剤においても、上記の実施例と
同様に育毛効果が認められることは明らかである。

【００８５】

【発明の効果】本発明により、毛髪伸長の促進をするこ
とによって毛周期における成長期を維持又は延長する毛
髪成長期延長剤が提供される。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年１月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４７】Ｂ．ラット毛包上皮系細胞１．ラット毛包上皮系細胞の採取：（１）毛包の採取新生児（３〜４日令）のラットの背部皮膚を採取し、こ
の採取した背部皮膚を５％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に浸
漬後、皮膚脂肪層から下の皮下脂肪や皮膜等を解剖用ハ
サミで除去した。次いで、再びこの背部皮膚を１％ＰＳ
Ｆ含有ＰＢＳ（−）に浸し、さらにこれを０．２５％ト
リプシン−０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）中に４
℃で一晩浸した。

フロントページの続き (72)発明者鈴木順神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１株式会社資生堂第２リサーチセンター内 (72)発明者相馬勤神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１株式会社資生堂第２リサーチセンター内 (72)発明者尾郷正志神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１株式会社資生堂第２リサーチセンター内 (72)発明者田島正裕神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地株式会社資生堂第１リサーチセンター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不飽和脂肪酸及び／又はその誘導体を有効
成分とする毛髪成長期延長剤。
【請求項２】不飽和脂肪酸が、式Ｃ_nＨ_mＯ₂ 〔炭素原子数ｎは１２〜２８，水素原子数ｍ＝ｎ＋１〜
２ｎ−２〕で表される不飽和脂肪酸である、請求項１記
載の毛髪成長期延長剤。
【請求項３】不飽和脂肪酸の二重結合がcis 体である請
求項１又は請求項２記載の毛髪成長期延長剤。
【請求項４】不飽和脂肪酸がドデセン酸，トリデセン
酸，ヘプタデセン酸，ペトロセリン酸，パルミトレイン
酸，オレイン酸，バクセン酸，リノール酸，α−リノレ
ン酸，γ−リノレン酸，エイコセン酸，エイコサトリエ
ン酸，エルカ酸(cis-13-ドコセン酸），ドコサジエン
酸，ドコサトリエン酸，ドコサテトラエン酸，ドコサペ
ンタエン酸，アラキドン酸，ネルボン酸及びドコサヘキ
サエン酸からなる群の不飽和脂肪酸から選ばれる１種又
は２種以上の不飽和脂肪酸である、請求項１乃至請求項
３のいずれかの請求項記載の毛髪成長期延長剤。
【請求項５】不飽和脂肪酸がペトロセリン酸，ドコサヘ
キサエン酸及び／又はオレイン酸である請求項４記載の
毛髪成長期延長剤。