JPH119281A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH119281A JPH119281A JP9169753A JP16975397A JPH119281A JP H119281 A JPH119281 A JP H119281A JP 9169753 A JP9169753 A JP 9169753A JP 16975397 A JP16975397 A JP 16975397A JP H119281 A JPH119281 A JP H119281A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 臨床検査、とりわけ食中毒・下痢症にかかる
検査における、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣ（Ｖ
ＴＥＣ）の検査法を提供する。 【解決手段】 本発明は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ
１遺伝子およびＶＴ２遺伝子に選択的にハイブリダイズ
する配列番号１〜４のオリゴヌクレオチドを作製し、こ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に
用い、本菌の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２のどち
らか一方のみを産生する菌、もしくはＶＴ１とＶＴ２の
両方を産生する菌のみを選択的に検出することを特徴と
している。
検査における、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣ（Ｖ
ＴＥＣ）の検査法を提供する。 【解決手段】 本発明は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ
１遺伝子およびＶＴ２遺伝子に選択的にハイブリダイズ
する配列番号１〜４のオリゴヌクレオチドを作製し、こ
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に
用い、本菌の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２のどち
らか一方のみを産生する菌、もしくはＶＴ１とＶＴ２の
両方を産生する菌のみを選択的に検出することを特徴と
している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、とりわ
け食中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまた
はＶＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子とＶＴ２遺伝子の検出
に関するものである。
け食中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまた
はＶＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子とＶＴ２遺伝子の検出
に関するものである。
【０００２】
【従来技術】ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣは、出血性大腸炎
に代表される食中毒症状のみでなく、重篤な疾患である
溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic syndrome ）の
原因菌でもあることが認められ、近年、臨床検査では、
本菌の迅速な検出が重要視されつつある。
に代表される食中毒症状のみでなく、重篤な疾患である
溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic syndrome ）の
原因菌でもあることが認められ、近年、臨床検査では、
本菌の迅速な検出が重要視されつつある。
【０００３】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）にかかる検査では、
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現
在、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であるが、ＥＨＥＣ（ＶＴ
ＥＣ）の起病性はベロ毒素の産生能に由来しており、血
清型と起病性とは必ずしも一致するものではない。した
がって、血清型による同定だけでは起因菌としての判定
に困難が生じる場合が多い。このような理由から、現在
のＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）検査法は、迅速性および簡便性
に欠け、実効的でない。
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現
在、Ｏ１５７：Ｈ７が代表的であるが、ＥＨＥＣ（ＶＴ
ＥＣ）の起病性はベロ毒素の産生能に由来しており、血
清型と起病性とは必ずしも一致するものではない。した
がって、血清型による同定だけでは起因菌としての判定
に困難が生じる場合が多い。このような理由から、現在
のＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）検査法は、迅速性および簡便性
に欠け、実効的でない。
【０００５】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およ
びＶＴ２遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ
食中毒・下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、か
つ高感度なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供するこ
とにある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およ
びＶＴ２遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ
食中毒・下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、か
つ高感度なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供するこ
とにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＥＨＥＣ（Ｖ
ＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝子に選択的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
い、本菌の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２のどちら
か一方のみを産生する菌、もしくはＶＴ１とＶＴ２の両
方を産生する菌のみを選択的に検出することを特徴とし
ている。
ＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝子に選択的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
い、本菌の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２のどちら
か一方のみを産生する菌、もしくはＶＴ１とＶＴ２の両
方を産生する菌のみを選択的に検出することを特徴とし
ている。
【０００７】ここで、オリゴヌクレオチドは、ＶＴ１遺
伝子およびＶＴ２の遺伝子とその変異型遺伝子（ＶＴ２
ｖｈａ，ＶＴ２ｖｈｂ，ＶＴ２ｖｐ１, およびＶＴ２ｖ
ｐ２）をコードするヌクレオチド配列を標的とし、その
ヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された
オリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下
の配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・・ ・・（ａ、配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’）・・・・・ ・・（ｂ、配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’）・・・ ・・（ｃ、配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’）・・・・ ・・（ｄ、配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
伝子およびＶＴ２の遺伝子とその変異型遺伝子（ＶＴ２
ｖｈａ，ＶＴ２ｖｈｂ，ＶＴ２ｖｐ１, およびＶＴ２ｖ
ｐ２）をコードするヌクレオチド配列を標的とし、その
ヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された
オリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下
の配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・・ ・・（ａ、配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’）・・・・・ ・・（ｂ、配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’）・・・ ・・（ｃ、配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’）・・・・ ・・（ｄ、配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００８】なお、遺伝子増幅は、Saiki らが開発した
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１遺伝子およ
びＶＴ２遺伝子において、ほぼ共通な塩基配列を有する
領域）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱
変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、
２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコ
ピー数が増大してくる。
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１遺伝子およ
びＶＴ２遺伝子において、ほぼ共通な塩基配列を有する
領域）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖
を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーシ
ョンするようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱
変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、
生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な
反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すことで、
２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコ
ピー数が増大してくる。
【０００９】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１０】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺
伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基
から２, ０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,
０００塩基となればよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺
伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基
から２, ０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,
０００塩基となればよい。
【００１１】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出は、ＰＣＲを終えた反応液
をそのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増
幅されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確
認できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべ
き配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判
定することができる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝
子またはＶ２遺伝子、またはその両遺伝子をもつＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィー、臭化エチジウムによる核酸染色
も有効である。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜９
５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング
操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃
で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイ
クル行って増幅させる。検出は、ＰＣＲを終えた反応液
をそのままアガロースゲル電気泳動にかけることで、増
幅されたヌクレオチド断片の存在、およびその長さを確
認できる。その結果から検体中にプライマーが認識すべ
き配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどうか判
定することができる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝
子またはＶ２遺伝子、またはその両遺伝子をもつＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィー、臭化エチジウムによる核酸染色
も有効である。
【００１２】
（実施例１）検体の調製 使用したＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）は、患者等から由来した
もので、総計３２０株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０. ５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウムに接種し、３７℃、好気的条件下
で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１
０倍に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った
後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
もので、総計３２０株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０. ５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウムに接種し、３７℃、好気的条件下
で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１
０倍に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った
後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１３】プライマーの合成 下記の文献に記載されたＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１
遺伝子およびＶＴ２遺伝子の塩基配列から、請求項１に
示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌク
レオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラ
スＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）
を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により
行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
遺伝子およびＶＴ２遺伝子の塩基配列から、請求項１に
示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌク
レオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプラ
スＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）
を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法により
行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００１４】文献；Takao, T. et al., Microb. Patho
g., 5:357-369, 1988 Jackson, M. P. et al., FEMS Microbio. Lett., 44:10
9-114, 1987 Ito, H., et al., Microb. Pathog., 8:47-60, 1990 Weinstein, D. L., J. Bacteriol., 170:4223-4230, 19
88ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
g., 5:357-369, 1988 Jackson, M. P. et al., FEMS Microbio. Lett., 44:10
9-114, 1987 Ito, H., et al., Microb. Pathog., 8:47-60, 1990 Weinstein, D. L., J. Bacteriol., 170:4223-4230, 19
88ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１５】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 0.1%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー: 請求項( １) に前述した４種のオリゴクク
レオチド化学合成精製品の水溶液（濃度3.75 OD/ml）を
等量混合して使用した。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 0.1%(w/V)ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー: 請求項( １) に前述した４種のオリゴクク
レオチド化学合成精製品の水溶液（濃度3.75 OD/ml）を
等量混合して使用した。
【００１６】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus 社製） 反応条件は、次のとおりである。
ポリメラーゼ（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus 社製） 反応条件は、次のとおりである。
【００１７】熱変性： ９４℃、１分 アニーリング： ５５℃、 重合反応： ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１８】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）とし、臭化エチジ
ウム（0.5 μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版
（1989）に記載されている技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
によりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１９】コロニーハイブリダイゼーション試験 ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子に特異的なオリゴヌク
レオチドプローブをそれぞれ用いて、Grunstein の方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961(1975)）にしたがって行った。
レオチドプローブをそれぞれ用いて、Grunstein の方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961(1975)）にしたがって行った。
【００２０】結果 前述したようにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子お
よびＶＴ２遺伝子は、すでに塩基配列が決定されてお
り、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマ
ーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオチドの大きさは容
易に推定できる。それによるとプライマー(a：配列番号
１) と(b：配列番号２) の組合せでは、３４９塩基（ま
たは３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されて
くるはずである。同様に、プライマー(c：配列番号３)
と(d：配列番号４) の組合せでは、１１２塩基（または
１１２塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されるはず
である。これらの推定値とＰＣＲ法によって実際に増幅
されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライ
マーの組合せは、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株はＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を有していると判
断した。
よびＶＴ２遺伝子は、すでに塩基配列が決定されてお
り、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマ
ーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオチドの大きさは容
易に推定できる。それによるとプライマー(a：配列番号
１) と(b：配列番号２) の組合せでは、３４９塩基（ま
たは３４９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されて
くるはずである。同様に、プライマー(c：配列番号３)
と(d：配列番号４) の組合せでは、１１２塩基（または
１１２塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅されるはず
である。これらの推定値とＰＣＲ法によって実際に増幅
されたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライ
マーの組合せは、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株はＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を有していると判
断した。
【００２１】被験菌株３２０株で調べた結果を表１に示
す。各プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼ
ーション試験で、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を有
すると判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺伝
子およびＶＴ２遺伝子の両方をもたない菌株のＤＮＡと
は全く反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子または
ＶＴ２遺伝子を正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ
２遺伝子、もしくはその両方の遺伝子をもつＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）を正確に検出していることを示している。
す。各プライマーの組合せは、コロニーハイブリダイゼ
ーション試験で、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ２遺伝子を有
すると判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺伝
子およびＶＴ２遺伝子の両方をもたない菌株のＤＮＡと
は全く反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子または
ＶＴ２遺伝子を正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子またはＶＴ
２遺伝子、もしくはその両方の遺伝子をもつＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）を正確に検出していることを示している。
【００２２】
【表１】 （実施例２）実施例１で得られた結果がＶＴ１遺伝子ま
たはＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対し
て、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査に
おいて検査対象となる、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下
痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマーが反応す
るかどうかを調べた。方法は検体の調製法を除いて、実
施例１で示したものと同じである。
たはＶＴ２遺伝子をもつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対し
て、選択的なものかどうかを確かめるため、臨床検査に
おいて検査対象となる、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下
痢症菌等の遺伝子について本発明のプライマーが反応す
るかどうかを調べた。方法は検体の調製法を除いて、実
施例１で示したものと同じである。
【００２３】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７. ５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、
およびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ
／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７. ５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、
およびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ
／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
【００２４】結果 表２に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。表中のプライマーの全ての組合せは、一部の赤痢菌
（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮＡを除いて、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。また、Shig
ella dysenteriae type I がＶＴ１遺伝子を有してお
り、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、ＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）とShigella dysenteriae type I との鑑別が不可能
なことは、学界で周知である。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ１遺伝
子またはＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応
するものと断言できる。なお、本発明の実施例で用いて
いるアガロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、
１００塩基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレ
オチドであれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１
００から５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドで
あれば、１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの
長さの違いを区別可能である。さらに、アクリルアミド
などをゲル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測
定精度を向上させることができ、ＶＴ１遺伝子およびＶ
Ｔ２遺伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高ま
るものと考えられる。
す。表中のプライマーの全ての組合せは、一部の赤痢菌
（Shigella dysenteriae type I ）のＤＮＡを除いて、
下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、
それらのＤＮＡを増幅することはなかった。また、Shig
ella dysenteriae type I がＶＴ１遺伝子を有してお
り、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、ＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）とShigella dysenteriae type I との鑑別が不可能
なことは、学界で周知である。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ１遺伝
子またはＶＴ２遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応
するものと断言できる。なお、本発明の実施例で用いて
いるアガロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、
１００塩基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレ
オチドであれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１
００から５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドで
あれば、１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの
長さの違いを区別可能である。さらに、アクリルアミド
などをゲル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測
定精度を向上させることができ、ＶＴ１遺伝子およびＶ
Ｔ２遺伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高ま
るものと考えられる。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子であるＶＴ１およ
びＶＴ２の各遺伝子（ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝
子）を標的とするプライマーを用いたことにより、ＶＴ
１遺伝子またはＶＴ２遺伝子、もしくはその両方の遺伝
子を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高
い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライ
マーで反応が規定されることによる高い選択性とが得ら
れる。また、検出感度が高いので、多量の検体を必要と
せず、検体の前処理も簡便で済む。本発明における実施
例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３０分で
あった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳動法と
臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プラ
イマー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅された
ヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結果の信頼
性は高いものとなる。
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子であるＶＴ１およ
びＶＴ２の各遺伝子（ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝
子）を標的とするプライマーを用いたことにより、ＶＴ
１遺伝子またはＶＴ２遺伝子、もしくはその両方の遺伝
子を有する菌の検出において、遺伝子増幅作用による高
い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプライ
マーで反応が規定されることによる高い選択性とが得ら
れる。また、検出感度が高いので、多量の検体を必要と
せず、検体の前処理も簡便で済む。本発明における実施
例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３０分で
あった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳動法と
臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プラ
イマー等を標識せずに検出が行える。しかも増幅された
ヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結果の信頼
性は高いものとなる。
【００２７】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査には、発見患
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２を
コードしている遺伝子（ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝
子）を選択的に検出するものである。したがって、本発
明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検出
を正確に行うことが可能となる。
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の病原因子であるＶＴ１またはＶＴ２を
コードしている遺伝子（ＶＴ１遺伝子およびＶＴ２遺伝
子）を選択的に検出するものである。したがって、本発
明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検出
を正確に行うことが可能となる。
【００２８】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ
【００２９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ
【００３０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ
【００３１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ
Claims (2)
- 【請求項１】 検体中に存在する腸管出血性大腸菌（en
terohemorrhagic Es cherichia coli、以下、ＥＨＥＣ）
またはベロ毒素産生性大腸菌（Verocytotoxin-producin
g Escherichia coli、以下、ＶＴＥＣ）の産生するベロ
毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子（以下、ＶＴ１遺伝
子）およびベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以
下、ＶＴ２遺伝子）とその変異型遺伝子（ＶＴ２ｖｈ
ａ，ＶＴ２ｖｈｂ，ＶＴ２ｖｐ１, およびＶＴ２ｖｐ
２）をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列群、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・（ａ、配列番号１） （５’）ｄ−ＣＣＣＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＡＡＴＡ−（３’） ・・（ｂ、配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴ−（３’） ・・（ｃ、配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ−（３’） ・・（ｄ、配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載された各配列を有する
オリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能
させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させること
を特徴とする方法であって、 (a) 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b) 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (c) これら２種のプライマーによるハイブリダイゼーシ
ョンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が
増幅され、電気泳動、またはクロマトグラフィーで増幅
されたヌクレオチド断片を検出し、 (d) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでＥＨＥＣまたはＶＴＥ
Ｃの検出、ベロ毒素遺伝子の型別を行う方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9169753A JPH119281A (ja) | 1997-06-26 | 1997-06-26 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9169753A JPH119281A (ja) | 1997-06-26 | 1997-06-26 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119281A true JPH119281A (ja) | 1999-01-19 |
Family
ID=15892217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9169753A Pending JPH119281A (ja) | 1997-06-26 | 1997-06-26 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH119281A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057880A1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method of quantifying nucleic acid and kit for quantifying nucleic acid |
-
1997
- 1997-06-26 JP JP9169753A patent/JPH119281A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003057880A1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-17 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method of quantifying nucleic acid and kit for quantifying nucleic acid |
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