JPH07236500A - サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH07236500A JPH07236500A JP6030277A JP3027794A JPH07236500A JP H07236500 A JPH07236500 A JP H07236500A JP 6030277 A JP6030277 A JP 6030277A JP 3027794 A JP3027794 A JP 3027794A JP H07236500 A JPH07236500 A JP H07236500A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体中に存在するサルモネラ属菌のara C 遺
伝子を検出することを目的とする。 【構成】 サルモネラ属菌のara C 遺伝子と選択的にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１〜
５）を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こすara C 遺伝
子のみを選択的に検出することを特徴としている。
伝子を検出することを目的とする。 【構成】 サルモネラ属菌のara C 遺伝子と選択的にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド（配列番号１〜
５）を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こすara C 遺伝
子のみを選択的に検出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのサルモネラ
属菌の検出に関するものである。
中毒にかかる検査、あるいは、食品検査でのサルモネラ
属菌の検出に関するものである。
【０００２】
【従来技術】サルモネラ属菌の検出は、種々の医学およ
び公衆衛生に関して重要で、従来より各種の方法が行わ
れている。
び公衆衛生に関して重要で、従来より各種の方法が行わ
れている。
【０００３】その代表的なものとしては、検査材料の患
者の糞便、嘔吐物、食品または拭き取り材料を増菌培養
した後、ＴＳＩ寒天、ＳＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地およ
びリシン脱炭酸試験用培地に接種し、３７℃で１晩培養
する確認培養を行い、さらに市販のＯ血清およびＨ血清
セットを用い抗原（血清型）を決定する方法である。
者の糞便、嘔吐物、食品または拭き取り材料を増菌培養
した後、ＴＳＩ寒天、ＳＩＭ培地、ＶＰ−ＭＲ培地およ
びリシン脱炭酸試験用培地に接種し、３７℃で１晩培養
する確認培養を行い、さらに市販のＯ血清およびＨ血清
セットを用い抗原（血清型）を決定する方法である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、増菌培養、確
認培養等を行う方法は、サルモネラ属菌は多数の血清型
に分けられるが、完全な血清型別には１００種類にもお
よぶ抗血清と十分な経験とを必要とするため、一般検査
室におけるサルモネラ検査の実施は困難であった。ま
た、各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であ
り、抗原型決定までを含めた総所要時間は約３日とな
り、迅速性にも欠けた。
認培養等を行う方法は、サルモネラ属菌は多数の血清型
に分けられるが、完全な血清型別には１００種類にもお
よぶ抗血清と十分な経験とを必要とするため、一般検査
室におけるサルモネラ検査の実施は困難であった。ま
た、各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であ
り、抗原型決定までを含めた総所要時間は約３日とな
り、迅速性にも欠けた。
【０００５】更に、確認培養、抗原型決定は、費用もか
かり、操作も煩雑である。
かり、操作も煩雑である。
【０００６】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法がサルモネラ検査にも試みられるようになってきた。
しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾したプローブに
より、膜上、あるいは他の支持体上でハイブリダイゼー
ションを行い、これを検出する場合に、細菌検査におい
て十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法がサルモネラ検査にも試みられるようになってきた。
しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾したプローブに
より、膜上、あるいは他の支持体上でハイブリダイゼー
ションを行い、これを検出する場合に、細菌検査におい
て十分な検出感度と選択性を得るのが難しい。
【０００７】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして用いた遺伝子増幅技術
により、サルモネラ属菌由来の核酸を検出するもので、
簡便、迅速かつ高感度なサルモネラ属菌の検査法を提供
することにある。
核酸合成反応のプライマーとして用いた遺伝子増幅技術
により、サルモネラ属菌由来の核酸を検出するもので、
簡便、迅速かつ高感度なサルモネラ属菌の検査法を提供
することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、オリゴヌクレ
オチドをプライマーとして機能させた遺伝子増幅法によ
り、サルモネラ属菌を選択的に検出することを特徴とし
ている。
オチドをプライマーとして機能させた遺伝子増幅法によ
り、サルモネラ属菌を選択的に検出することを特徴とし
ている。
【０００９】ここで、本発明のプライマーとしては、検
体中におけるサルモネラ属菌（Salm onella spp. ）のＬ
−アラビノースオペロン遺伝子（以下、araC 遺伝子）
をコ−ドするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレ
オチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴ
ヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列
群の少なくとも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌク
レオチド、 （５’）−ＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴ−（３’） ・・・・(a：配列番号１) （５’）−ＧＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧ−（３’） ・・・・(b：配列番号２) （５’）−ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡ−（３’） ・・・・(c：配列番号３) （５’）−ＧＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＡ−（３’） ・・・・(d：配列番号４) （５’）−ＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ−（３’） ・・・・(e：配列番号５) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
体中におけるサルモネラ属菌（Salm onella spp. ）のＬ
−アラビノースオペロン遺伝子（以下、araC 遺伝子）
をコ−ドするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレ
オチド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴ
ヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列
群の少なくとも連続した１０塩基以上を含むオリゴヌク
レオチド、 （５’）−ＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴ−（３’） ・・・・(a：配列番号１) （５’）−ＧＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧ−（３’） ・・・・(b：配列番号２) （５’）−ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡ−（３’） ・・・・(c：配列番号３) （５’）−ＧＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＡ−（３’） ・・・・(d：配列番号４) （５’）−ＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ−（３’） ・・・・(e：配列番号５) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１０】遺伝子増幅の方法については、Saiki らが
開発した Polymerase Chain Reaction 法（以下、略し
てＰＣＲ法；Science 230, 1350 (1985)）をもとに行っ
ている。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域
（本発明の場合は、サルモネラ属菌の araC 遺伝子）を
検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするよ
うなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により
１本鎖状態にした試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２
本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起
こさせる。この一連の操作を繰り返すことにより２つの
プライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数
が増大してくる。
開発した Polymerase Chain Reaction 法（以下、略し
てＰＣＲ法；Science 230, 1350 (1985)）をもとに行っ
ている。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域
（本発明の場合は、サルモネラ属菌の araC 遺伝子）を
検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするよ
うなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により
１本鎖状態にした試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２
本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起
こさせる。この一連の操作を繰り返すことにより２つの
プライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数
が増大してくる。
【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１２】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持った核酸フラグメントで、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、とくに検出用と
して標識されていなくてもよい。プライマーが規定して
いるサルモネラ属菌の araC 遺伝子の増幅領域は、５０
塩基から２, ０００塩基、望ましくは、１００塩基から
１, ０００塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド
重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いている
が、この酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活
性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱変性
温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせ
るアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は
５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ反応を
２０から４２サイクル行って増幅させる。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持った核酸フラグメントで、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、とくに検出用と
して標識されていなくてもよい。プライマーが規定して
いるサルモネラ属菌の araC 遺伝子の増幅領域は、５０
塩基から２, ０００塩基、望ましくは、１００塩基から
１, ０００塩基となればよい。鋳型依存性ヌクレオチド
重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いている
が、この酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活
性を保持していれば、どの生物種由来でもよい。熱変性
温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせ
るアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は
５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ反応を
２０から４２サイクル行って増幅させる。
【００１３】検出は、ＰＣＲ後の反応液をそのままアガ
ロースゲル電気泳動にかけることで増幅されたヌクレオ
チド断片の存在およびその長さが確認できる。その結果
から、検体中に目的とするヌクレオチドが存在している
かどうか判定することができる。この判定は、そのまま
サルモネラ属菌の有無を判定するものとなる。増幅され
たヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動やク
ロマトグラフィーも有効である。
ロースゲル電気泳動にかけることで増幅されたヌクレオ
チド断片の存在およびその長さが確認できる。その結果
から、検体中に目的とするヌクレオチドが存在している
かどうか判定することができる。この判定は、そのまま
サルモネラ属菌の有無を判定するものとなる。増幅され
たヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動やク
ロマトグラフィーも有効である。
【００１４】また、アガロースゲル電気泳動および臭化
エチジウムによる核酸染色、前記オリゴヌクレオチドを
プローブとして機能させ、膜上あるいはその他支持体上
の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出する方法でも良
い。
エチジウムによる核酸染色、前記オリゴヌクレオチドを
プローブとして機能させ、膜上あるいはその他支持体上
の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出する方法でも良
い。
【００１５】
【作用】サルモネラ属菌（Salmonella spp. ）のaraC
遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て遺伝子増幅に用いて、本菌のみを選択的に検出する
遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て遺伝子増幅に用いて、本菌のみを選択的に検出する
【００１６】
（実施例１）検体の調製 サルモネラ属菌は、表１の縦の見出しに示した患者およ
び食品から分離された各サルモネラ属の菌１３３株（内
訳：Salmonella typhimurium ６７株、S. havana １
株、S. ora-nienburg ２株、S. london ３株、 S. senf
tenberg ３株、S.blockley ４株、S. agona ３株、S.
infantis ４株、S. litchfield １４株、S. enteritidi
s ６株、S. thompson １３株、S. paratyphi B ６
株、 S. montevideo ２株、S. gallinarum １株、S. c
holerae-suis １株、S. derby １株、S. give １株、
および S. heidelberg １株）を使用した。それぞれの
菌株を適当な増菌培地に接種し、３７℃の好気的条件下
で終夜培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下、ＴＥ緩衝液）で希釈し、
９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心
し、その上清を検体とした。
び食品から分離された各サルモネラ属の菌１３３株（内
訳：Salmonella typhimurium ６７株、S. havana １
株、S. ora-nienburg ２株、S. london ３株、 S. senf
tenberg ３株、S.blockley ４株、S. agona ３株、S.
infantis ４株、S. litchfield １４株、S. enteritidi
s ６株、S. thompson １３株、S. paratyphi B ６
株、 S. montevideo ２株、S. gallinarum １株、S. c
holerae-suis １株、S. derby １株、S. give １株、
および S. heidelberg １株）を使用した。それぞれの
菌株を適当な増菌培地に接種し、３７℃の好気的条件下
で終夜培養を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下、ＴＥ緩衝液）で希釈し、
９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心
し、その上清を検体とした。
【００１７】プライマーの合成 ネズミチフス菌（S. typhimurium）の araC 遺伝子（Ho
rwitz, A. H., et al., Gene 14, 309-319 (1981) 、Cl
arke, P., et al., Gene 18, 157-163 (1982)Lee, J.-
H., et al., Gene 46, 113-121 (1986) ）から請求項第
１項に示した配列(a) 〜(e) を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成はサ
イクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリ
サーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダ
イト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精
製はＣ１８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
rwitz, A. H., et al., Gene 14, 309-319 (1981) 、Cl
arke, P., et al., Gene 18, 157-163 (1982)Lee, J.-
H., et al., Gene 46, 113-121 (1986) ）から請求項第
１項に示した配列(a) 〜(e) を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成はサ
イクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリ
サーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダ
イト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精
製はＣ１８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
【００１８】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１６．０５
μｌ，１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
μｌ，１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
【００１９】使用した各溶液の内容、およびプライマー
(1) および(2) の組合せは次のとおりである。
(1) および(2) の組合せは次のとおりである。
【００２０】１０ｘ反応用緩衝液： 500mM KCl, 100mM
Tris-HCl pH8.3,15 mM MgCl2 ,0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液： dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させた
もので各終濃度が1.25 mM プライマー(1) および(2) ： 前述した化学合成精製品
の各水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ：前述の化学合成精製品で次のとお
りに３組つくり、実験に供した。
Tris-HCl pH8.3,15 mM MgCl2 ,0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液： dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させた
もので各終濃度が1.25 mM プライマー(1) および(2) ： 前述した化学合成精製品
の各水溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ：前述の化学合成精製品で次のとお
りに３組つくり、実験に供した。
【００２１】プライマー（１） プライマー（２） （ａ） （ｂ） （ｃ） （ｄ）（ｅ） （ｂ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ： Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus 社製） 反応条件は次のとおりである。
ーゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus 社製） 反応条件は次のとおりである。
【００２２】熱変性： ９４℃、１分 アニーリング： ５５℃、１分 重合反応： ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２３】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するため
に、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
に、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（終濃度0.5 μg ／ml）を含むもの
を用いた。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０
分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Maniatis等
著Molecular Cloning （1982）に記載されている技法で
行った。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行
い、相対移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さ
を算出した。
し、臭化エチジウム（終濃度0.5 μg ／ml）を含むもの
を用いた。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０
分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Maniatis等
著Molecular Cloning （1982）に記載されている技法で
行った。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行
い、相対移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さ
を算出した。
【００２５】結果 前述したように、ネズミチフス菌の araC 遺伝子は、す
でに塩基配列が決定されており、この塩基配列はサルモ
ネラ属のそれぞれの菌種に共通であると見なされてい
る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレオチ
ド断片の大きさは推定できる。それによると、プライマ
ーとして、オリゴヌクレオチド(a) および(b) を用いた
場合には、３６１塩基の長さのヌクレオチドが増幅され
てくるはずである。同様に、オリゴヌクレオチド(c) と
(d) 、およびオリゴヌクレオチド(e) と(b) を用いた場
合には、それぞれ４９３塩基および３３４塩基の長さの
ヌクレオチドが増幅される。これらの推定値と増幅され
たヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライマー
の組合せは、araC 遺伝子の標的としている領域を正し
く増幅していると判断した。表１に各サルモネラ属菌に
おける araC 遺伝子の検出結果を示す。表１から明かな
ように試験された全てのサルモネラ属菌の araC 遺伝子
が正しく検出されていることがわかる。
でに塩基配列が決定されており、この塩基配列はサルモ
ネラ属のそれぞれの菌種に共通であると見なされてい
る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわ
ちプライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレオチ
ド断片の大きさは推定できる。それによると、プライマ
ーとして、オリゴヌクレオチド(a) および(b) を用いた
場合には、３６１塩基の長さのヌクレオチドが増幅され
てくるはずである。同様に、オリゴヌクレオチド(c) と
(d) 、およびオリゴヌクレオチド(e) と(b) を用いた場
合には、それぞれ４９３塩基および３３４塩基の長さの
ヌクレオチドが増幅される。これらの推定値と増幅され
たヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライマー
の組合せは、araC 遺伝子の標的としている領域を正し
く増幅していると判断した。表１に各サルモネラ属菌に
おける araC 遺伝子の検出結果を示す。表１から明かな
ように試験された全てのサルモネラ属菌の araC 遺伝子
が正しく検出されていることがわかる。
【００２６】
【表１−１】
【００２７】
【表１−２】
【００２８】
【表１−３】
【００２９】
【表１−４】
【００３０】
【表１−５】
【００３１】
【表１−６】 （実施例２）実施例１で得られた結果が、サルモネラ属
菌の araC 遺伝子に対して特異的なものかどうかを確か
めるため、臨床検査において検査対象となるサルモネラ
属菌以外の下痢症菌やその他の病原細菌について比較検
討した。とりわけ、従来法ではサルモネラ属菌との鑑別
が困難な Citrobacter属菌との鑑別が可能かを検討し
た。
菌の araC 遺伝子に対して特異的なものかどうかを確か
めるため、臨床検査において検査対象となるサルモネラ
属菌以外の下痢症菌やその他の病原細菌について比較検
討した。とりわけ、従来法ではサルモネラ属菌との鑑別
が困難な Citrobacter属菌との鑑別が可能かを検討し
た。
【００３２】方法は、実施例１に示したものと同じであ
るが、表２中の Clostridium perfr ingens、Campylobac
ter jejuni、Campylobacter coli、Bacteroides fragil
is、Bacteroides vulgatus、Lactobacillus acudophilu
s 、および Bifidobacterium adolescentis について
は、３７℃、嫌気的条件下で培養を行い、Neisseria go
norrhoeae および Neisseria meningitidis について
は、３−１０％ＣＯ2 存在下で培養した。
るが、表２中の Clostridium perfr ingens、Campylobac
ter jejuni、Campylobacter coli、Bacteroides fragil
is、Bacteroides vulgatus、Lactobacillus acudophilu
s 、および Bifidobacterium adolescentis について
は、３７℃、嫌気的条件下で培養を行い、Neisseria go
norrhoeae および Neisseria meningitidis について
は、３−１０％ＣＯ2 存在下で培養した。
【００３３】また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は１μg ／mlの濃度のものを調製し、これも同
様にＰＣＲを行わせた。結果を表２に示す。本発明のオ
リゴヌクレオチド(a) および(b) をプライマーとして用
いた場合、サルモネラ属菌のＤＮＡを除いて、各種細菌
のＤＮＡおよびヒト胎盤由来ＤＮＡを増幅することはな
かった。とくにサルモネラ属菌とは系統的にも近縁で、
しかも従来法では鑑別困難な事例が多々あった Citroba
cter属菌のＤＮＡとも全く反応しなかった。
ta DNA）は１μg ／mlの濃度のものを調製し、これも同
様にＰＣＲを行わせた。結果を表２に示す。本発明のオ
リゴヌクレオチド(a) および(b) をプライマーとして用
いた場合、サルモネラ属菌のＤＮＡを除いて、各種細菌
のＤＮＡおよびヒト胎盤由来ＤＮＡを増幅することはな
かった。とくにサルモネラ属菌とは系統的にも近縁で、
しかも従来法では鑑別困難な事例が多々あった Citroba
cter属菌のＤＮＡとも全く反応しなかった。
【００３４】したがって、本発明のオリゴヌクレオチ
ド、すなわちプライマーはサルモネラ属菌にのみ特異的
に反応するものであり、信頼性の高いものと断言でき
る。なお、本発明の実施例で用いているアガロースゲル
電気泳動を前述の泳動条件で行えば、１００塩基対以下
の長さのヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、１
００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであれば、
１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別
可能である。さらに、アガロースゲルの代わりにポリア
クリルアミドゲルを使用することで、ヌクレオチドの長
さの測定精度を向上させることができ、araC 遺伝子の
特異的検出における信頼度は、さらに高まるものと考え
られる。
ド、すなわちプライマーはサルモネラ属菌にのみ特異的
に反応するものであり、信頼性の高いものと断言でき
る。なお、本発明の実施例で用いているアガロースゲル
電気泳動を前述の泳動条件で行えば、１００塩基対以下
の長さのヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、１
００から５００塩基対の範囲のヌクレオチドであれば、
１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別
可能である。さらに、アガロースゲルの代わりにポリア
クリルアミドゲルを使用することで、ヌクレオチドの長
さの測定精度を向上させることができ、araC 遺伝子の
特異的検出における信頼度は、さらに高まるものと考え
られる。
【００３５】
【表２−１】
【００３６】
【表２−２】
【００３７】
【表２−３】
【００３８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、
サルモネラ属菌の検出において、遺伝子増幅作用による
高い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプラ
イマーで反応が規定されることによる高い特異性を得る
ことができる。また、高い検出感度のため多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。しかも、反応
時間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なた
め同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例
では、ＰＣＲの反応時間が約３時間、検出にかかる操作
が３０分である。また、検出にアガロースゲル電気泳動
法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出を行うことができる。し
かも、検出されるＤＮＡの長さを確認できるので、信頼
性の高い結果が得られる。食中毒菌としてのサルモネラ
属菌を検出する場合には、サルモネラ属に属する全ての
菌種が対象となるので、個々の種あるいは個々の血清型
のサルモネラ菌を逐一検出する方法に比べて、本発明の
ようにサルモネラ属菌全てを検出できるような試薬もし
くは検出法は、より迅速・簡便な方法であり、非常に効
果的な検出法となる可能性が大である。
サルモネラ属菌の検出において、遺伝子増幅作用による
高い検出感度と、２つ、あるいは、それ以上の数のプラ
イマーで反応が規定されることによる高い特異性を得る
ことができる。また、高い検出感度のため多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。しかも、反応
時間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なた
め同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例
では、ＰＣＲの反応時間が約３時間、検出にかかる操作
が３０分である。また、検出にアガロースゲル電気泳動
法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、
プライマー等を標識せずに検出を行うことができる。し
かも、検出されるＤＮＡの長さを確認できるので、信頼
性の高い結果が得られる。食中毒菌としてのサルモネラ
属菌を検出する場合には、サルモネラ属に属する全ての
菌種が対象となるので、個々の種あるいは個々の血清型
のサルモネラ菌を逐一検出する方法に比べて、本発明の
ようにサルモネラ属菌全てを検出できるような試薬もし
くは検出法は、より迅速・簡便な方法であり、非常に効
果的な検出法となる可能性が大である。
【００３９】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella spp. 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴ
【００４０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella spp. 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡ
ＣＣＧ .
ＣＣＧ .
【００４１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella spp. 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡ
【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ １８塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella spp. 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＡ
【００４３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Salmonella spp. 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴ
Ｃ
Ｃ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:42）
Claims (2)
- 【請求項１】 検体中におけるサルモネラ属菌（Salmon
ella spp. ）のＬ−アラビノースオペロン遺伝子（以
下、araC 遺伝子）をコ−ドするヌクレオチド配列を標
的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化
学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレ
オチドが以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以
上を含むオリゴヌクレオチド、 （５’）−ＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴ−（３’）・・・・(a) （５’）−ＧＣＡＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＧ−（３’）・(b) （５’）−ＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡ−（３’）・・・・(c) （５’）−ＧＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＡ−（３’）・・・・(d) （５’）−ＧＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ−（３’）・・・(e) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項第１項に記載されたオリゴヌクレ
オチドの配列のうち、少なくとも１つを有するオリゴヌ
クレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能させ、標
的ヌクレオチドを選択的に増幅させることを特徴とする
方法であって、 (a) 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレ
オチド配列にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の
ヌクレオチドの重合反応により、鎖長反応を行わせ、 (b) 得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に分
離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長
反応の鋳型として機能し、 (c) これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、プ
ライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプ
ライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこと
により特定のヌクレオチド配列が増幅させ、増幅された
ヌクレオチド断片を検出し、 (d) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでサルモネラ属菌の検出
を行うことを含む方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6030277A JPH07236500A (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP00111578A EP1036846A3 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| DE69433201T DE69433201T2 (de) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien |
| EP94116416A EP0669399B1 (en) | 1994-02-28 | 1994-10-18 | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| US08/328,710 US5795717A (en) | 1994-02-28 | 1994-10-25 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US08/968,046 US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 1997-11-12 | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| US10/138,381 US20030064388A1 (en) | 1994-02-28 | 2002-05-06 | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6030277A JPH07236500A (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236500A true JPH07236500A (ja) | 1995-09-12 |
Family
ID=12299226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6030277A Pending JPH07236500A (ja) | 1994-02-28 | 1994-02-28 | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07236500A (ja) |
-
1994
- 1994-02-28 JP JP6030277A patent/JPH07236500A/ja active Pending
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