JPS5962319A - 双性イオン分離用電気焦点化装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質のような双性イオンをその混合物から分
離するための電気焦点化（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｒｔｓ
ｉｎｇ　）装置に関する。

「電気焦点化法」は、アノードからカソードにかげて増
加する安定ｐＨ勾配中で実施されて分離を行う電気泳動
法を基本とする分離技法であり、これは相異なる等電点
（ｐＩ）を有する分離可能な双性イオン種に依存してい
る。この技法は今や蛋白質の混合物を分離するために商
業的に確立された技法であり、従って以下においては本
発明を主に蛋白質およびその分離に関して説明すること
にする。

蛋白質はアミン基とカルボン酸基との両者を有するか、
それらの両基は個々の蛋白質でその数および割合で変っ
ている。低ｐＨ溶液においては、アミン基は陽の電荷を
帯びる傾向があり、また酸基は中性となり、かくして蛋
白質に対して全体として陽の電荷を与える。ｐＨを次第
に増大させるならば、次第に増加する数の酸基がプロト
ンを失ない陰の電荷を帯びるようになり、そしてアミン
基は中性になる。従って高ｐＨ溶液においては、蛋白質
は全体として陰の正味電荷を有する。これらの二つの両
極端の間には、蛋白質がゼロの正味電荷をもつｐＨ値か
あり、これはその蛋白質の等電点（７１）工）である。

等電照点化操作中に、各蛋白質分子は個々の正味電荷に
応じて一方または他方の電極へ引き寄せられる。蛋白質
分子がそれを引き寄せる電極の方向へ移動するときに、
それはｐＨ勾配を上向きまたは下向きに移動し、そして
その移動方向は、カソードかｐＨ勾配の高い方の端部に
アノードか低い方の端部に配置されている故に、その正
味電荷を減少する方向となる。従って蛋白質はその正味
電極がゼロになる帯域にまで移動するに過ぎない（すな
わち、その帯域はｐＨがその蛋白質のρ工と等しいとこ
ろである）。同じｐＩ値を有する蛋白質分子はすべて同
様に同一帯域に焦点化され、その帯域にとどまることに
なる（なんとなれば、何らかの位置移動がなされると再
び陽または陰の正味電荷が生じ、それがその迷子分子を
そのρ■帯域へ戻すようにするからである）。異なるｐ
Ｉ値の蛋白質は、相異なるｐＨ帯域に焦点化され、従っ
てそれらが分離されることになる。

ｐＨ勾配は高分子イオン混合物を用いろことにより設定
することができ、これを達成するための公知の商業的方
法は、両性電解質の混合物の水性溶液を使用することで
ある。そのような両性電解質の例としては、商標”　ｋ
ｍｐｈｏｌｉｎｅ　”で市販されているものがある。こ
れらは種々の部分にアミン基および酸基を有しである範
囲にわたるｐＩ値を与えるような長鎖緩衝剤である。溶
液中で電場に付されると、それらの両性電解質はそれら
の個々の正味電荷に応じて場所を移動し、相互に作用し
合つて一定のｐＨ勾配（アノードゝ側で低く、カソービ
側で高い勾配）を生じさせる。分離されるべき蛋白質の
混合物を、次いで、装置中へ注入し、蛋白質の個々の平
衡位置へ移動せしめてよく、あるいは蛋白質の混合物を
画性電解質（普通は比較的低分子量のものであり、従っ
て蛋白質の個々の実質的な場所移動か起こる前に所要の
ｐＨ勾配を確立する両性電解質）と共に導入することも
できる。

分離された種々の部分部分は、次いでそれらのキャリヤ
ー両性電解質と共に、普通は、垂直分離カラムの底から
順次に種々の帯域（部分）を流出させろことにより、あ
るいは固体化したマスから蛋白質とキャリヤー両性電解
質との種々の帯域（部分）を掘り出すことにより、取出
すことができる。

両方の場合に、次いで個々の蛋白質部分をその関連キャ
リヤー両性電解質から分離することか必要である。

これらの公知方法は接近した等電値の蛋白質同志を分離
するのに非常に効果的であることが証さ＋ｔうるが、回
分式の操作であるので、それらの方法は商業的な製造手
段として非常に便宜であるとはいえない。さらには少量
の純粋蛋白質さえも分離するのに要する時間は、それら
をその関連キャリヤー両性電解質からさらに分離するの
に要する時間を含めると、非常に長く、また両性電解質
は各回分の多数の分離された蛋白質部分から分離される
までは再使用のために利用できないので、この操作は全
体として長時間を要しまた経費の嵩む操作となってしま
う。しかし、我々は、このような従来法の諸問題を回避
する方法を案出した。

本発明の一態様によれば： 相隔てられた電極およびそれらの電極間にｐＨ勾配を生
じさせるための高分子イオン混合物を有するセルからな
る電気焦点化装置であって、該セルは高分子イオン混合
物の対向する側面に配置された少なくとも一つの入口と
複数の出口とを有して液体のための流路か入口から高分
子イオン混合物を経て出口までセル内に与えられるよう
になっており、その液体流路は電場とｐＨ勾配とに対し
て横方向であり、複数の出口はその電場とｐＨ勾配とに
沿って間隔を設けて与えられており、高分子イオンは一
方の電極から他方の電極にかけてｐＨ勾配を与えそれを
維持するように配置され固定化され、従って水性媒質中
に浸漬されたときに電極によって電場が印加されるとプ
ロトンの移動が起きてρに勾配に対応するｐＨ勾配が電
極間に与えられ、かくして分離可能な諸成分の水性液体
混合物が該装置内を流動させられるときにはその電場お
よびｐＨ勾配によって少なくとも部分的にその諸成分に
分割されて、それらの諸成分が相異なる出口から該装置
を去るようになっていることを特徴とする上記電気焦点
化装置が提供されろ。

その最も単純な形態では、例えば動物の組織のエキスか
ら単一の蛋白質を分離する０挺適当である装置は、所要
の蛋白質を捕集するように配置された一つの出口と、残
部を排出するための一つの１発液出口とを有するもので
゛あってよい。しかし、普通は、例えば５個の出口を有
する多出口装置を用いて、各出口を混合物の相異なる分
離部分を捕集するように配置させるのが好ましい。

両性電解質を本発明装置の高分子イオンとして使用しつ
るか、前述のように装置内に自由に拡散しうる両性電解
質の代りに、高分子イオンは、両電極間にρに勾配を与
えそれを維持するように配列および固定化された異なる
７＞Ｋ値を有する複数の異なる両性電解質または両性電
解質群よりなる。

両性電解質は、反応性の重合可能な物質と反応させ（例
えば酸基とヒドロキシエチルメタクリレートとの反応、
または塩基とアクリル酸の酸クロライドとの反応）、電
場を掛けてそれらの両性電解質が一つのｐＨ勾配を形成
するよ５［し、次（・でその重合性物質を重合させ（好
ましくは光重合により、そして適当であるならばコモノ
マーの存在下で重合させ）ることにより、固定化できる
。

一つの好ましい固定化高分子イオン混合物は、酸性イオ
ン交換樹脂および塩基性イオン交換樹脂の緩衝作用混合
物からなり、その酸性および塩基性樹脂の相対割合を一
方の電極から他方の電極にかけての装置の幅にわたって
変化゛させることにより、ｐＨ勾配を与えろようにした
ものである。−般に市販のイオン交換樹脂は、遊離のカ
ルボン酸基およびアミン基を有する同定代用不活性本体
から主として構成され、遊離カルボン酸基は陰（負）の
電荷をもつ−ＣＯ〇−基と電荷をもたないカルボン酸Ｃ
０ＯＨ基との間に平衡を与え、また遊離アミン基は、電
荷をもたない−ＮＨ２基と陽（正）の電荷をもつプロト
ン化イオン−ＮＨ３＋どの間に平衡を与える。樹脂混合
物の正味ｐＫは樹脂の二つのタイプによって左右される
ので、装置の全幅にわたって順次に混合両樹脂の比を変
えることによって、あるｐＨ勾配が得られる。若干の市
販樹脂は、湿潤ビーズの形で供給されており、例えばそ
れぞれ酸性および塩基性樹脂を与えるようにアンカーさ
れたカルボキシル基またはアミン基を有する交叉結合ポ
リスチレンのビーズの形で供給される。

本発明の装置には、両電極に平行でかつ流動方向に並ん
だ仮数の帯状体を充填することができるか、それぞれの
帯状体は他の帯状体と異なる割合の両樹脂混合物からな
っている。このようにすると段階状のρに勾配を与える
が、相隣れる帯猷体同志の間にはバリヤーは全くないの
で、流動中の蛋白質含有液体内では水素イオンは一つの
帯状体から別の帯状体へ妨害なく流れることができ、か
くして生ずるｐＨ勾配においてその段階は平滑化される
。ｐＨ勾配を与えるためにイオン交換樹脂をこのように
用いることは、両性電解質の同様な使用方式と比較して
、非常に効果的でありかつ非常に低経費であることが判
明した。

普通はｐＨ勾配か一方の電極から他方の電極にかけて一
定の傾斜であるのが好ましい。しがし、混合物中の諸成
分の分布がそれらの７ｒＩ値に関して不均一に離れてい
る場合には、本発明の装置ではｐＨ勾配の傾斜を、一つ
の位置と別の位置とで変えることが容易にできる。従っ
て、例えば、混合物中の諸成分のρ１値が一方の端部で
他の端部よりも一層広（離れている場合には、ｐＨ勾配
の傾斜を一方の端部で他の端部よりも急傾斜にして、排
出される各液体に一層均一に離れたピークを与えること
ができる。

そのようなピークの鋭鈍は要求される分離への装置のマ
ツチングにより、また分離された流れの混合かいかに良
く防止しうるかにより、左右されろ。従って例えば、本
発明の装置は広範囲のｐＨをカバーできろけれども、類
似のρ１値の蛋白質同志を発頭（シようとする場合には
アノードからカソードにかけてのはるかに小範囲のｐＨ
を採用するのが好ましい。装置の長さ、および流体の流
量も、所要事項に応じて変えることができる。混合を可
及的に少なくするために、広い平た（・セルが好ましく
、そのようなセルでは両電極を画線部にして溶液が薄い
シート状で流通するようにできる。

本発明の別の一態様によれば： 異なる等電点を有する双性イオンの混合物から双性イオ
ンを分離するための電気焦点化方法であって、 一対の相隔てられた電極の間に、流動中の溶液内にその
流動方向に対し横方向のそして一方の電極から他方の電
極にかけて実質的に延在するｐＨ勾配を生じさせるよう
に配置された固定化高分子イオン混合物を有する装置内
に双性イオン混合物の水性溶液を流動させ；しかろ後に
その流動液体を少な（とも二つの相異なるｐＨの部分に
分割する；ことからなる上記方法か提供されろ。

実際の場合には、普通溶液を２よりも可成り多くの部分
、例えば１０の部分に分割するのが望ましく、これは、
アノービ側からカソード側にかけて、装置からの排出流
を再分割して部分部分にすることによって達成できる。

本発明を添付図に示した装置の特定例を参照して説明す
る。

装置は、約２０ＣｒｒＬ平方の２枚の透明アクＩＪ　）
し板の周縁を２朋厚のガスケット２で隔て形成した平坦
なセル１からなっている。セル内の各側面に下向きに電
極６，４が接続されてそれぞれアノードおよびカソード
を与えるようになっている。セルの頂部近くに多孔質バ
リヤ６があり、その上に閉鎖室７を与えている。セルは
その下端部で１０個の短い溝１０に分割されており、そ
れらの溝の各々から柔軟パイプ１１が出て、ぜん動ポン
プ（図示せず）を介して延びている。

セルは２種のイオン交換樹脂の種々の混合物で充填され
ており、それらの混合物は一方の電極から他方の電極に
かけて段階状に変る相対比（２種のイオン交換樹脂）を
もつ多数の垂直な帯状体の形で配列されている。カソー
ドに隣接しては、遊離カルボキシ基を有するポリスチレ
ンビーズか充填された帯状体がある。アノードに隣接し
ては、遊離アミン基を有するビーズで充填された帯状体
がある。これら両者の中間の帯状体は、アノード側帯状
体からカソード側帯状体にかけて（帯状体単位で）次第
に組成が変化するようにした２種のイオン交換樹脂の混
合物を含む。相隣れる帯状体同志の間には正式の区画は
なく、セルは一方の側から他方の側に充填されており、
各帯状体は、その前に置かれた（充填された）帯状体の
上に置かれて（充填されて）いる。

セルに液体を供給するために、ろ個の液溜かある。これ
らは、１個がサンプル液溜１４であり、他の２個が稀酸
溶液および稀塩基溶液の液溜１５゜１６である。サンプ
ル液溜１４は室１７へ接続されており、室７では分離さ
れるべき混合物を含む液体自体はセルの幅にわたって分
布しうろ。他の２個の液溜は２つの電極に対してそれぞ
れ酸性および塩基性の環境を与える？４ものであり、そ
れらからの管は２つの電極の頂部に隣接してセル内へ開
口している。ガス排出ロア８がそれぞれの電極の上位に
備えられている。

使用に際して、セルは水性溶液で満たされ、電極を電源
に′接続することによって電場が掛けられる。イオン交
換樹脂混合物中に固定化されたｐＨ勾配は、アノードか
らカソードにがけて上昇するｐＨ勾配を生じさせる。ぜ
ん動ポンプを作動させて１０個すべての管から同時に液
体を引き出し、それにより、樹脂充填セル内を均一に下
方に向けて（電場およびｐＨ勾配に横向きに）移動する
シート状の液体を与えるようｖｃする。しがし実際には
両縁部における流れに幾分かの強制されない不均一性が
生じる傾向かある。混合蛋白質（またはその他の分離可
能成分）の浴液をサンプル溜１４から供給し、室７を用
いることによりサンプル液体をその室から樹脂混合物の
ほぼ全幅にわたって引き出すことができる。溶液が下方
へ流れるに従って、それらの蛋白質は上述のように特定
のｐＨ帯域へそれぞれ焦点化されてくる。１０個の出口
での分析は、アノービ側からカソード側にかけて次第に
増加するｐＨを示し、蛋白質のそれぞれのｐＩ値に対応
する特定の出口においてピークを示すように蛋白質が分
配されることになり、それぞれの蛋白質か出てくる出口
の数が少な（なればなるほど（すなわち分配がシャープ
になればなるほど）、分離は一層効率的になる。

本発明を、添付図に示したものと実質的に同じであるが
、ガス排出口１８を備えず、またセルを水平にして使用
する装置で得られた下記の実験結果によりさらに説明す
る。その目的はｐＨ勾配がセル内を流れる液体中に確立
されるようになるかどうかを確かめ、また特定の蛋白質
が焦点化されるようになるかどうかを確めることであっ
た。使１−ｊｊ　ｔ、た蛋白質は工業用品位のウシ血清
アルブミンであり、これは１ｍ１ＵＶ分光分析セルで２
８０　ｒＬｍにおける光学吸収により測定した。使用し
た樹脂はＢＤＨケミカル亥社によって販売されているデ
ュオライト（Ｄｕ、ｏｌｉｔｅ　）　Ａ　Ｃ４３６およ
びデュオライトＡｉＡろ０６（商標）であった。

最初は、ぜん動ポンプが縁部効果（不均一流動）を防ぐ
ように流動を効果的に制御するか否か、あるいは電極部
における酸および塩基の供給が流動に影響を与えるか否
かは明かでなかった。電場を切ると、ｐＨ勾配か徐々に
崩れることか判明したので、初期の対照実験として、サ
ンプル溜に水を入れ、そして図示したような外側の両液
溜中に０．０１Ｍの酸溶液および塩基溶液を入れておい
て、ぜん動ポンプを始動させ、そして電場の電源を入れ
た。条件が平定したときに、電場を切り、サンプル溜中
の水を蛋白質の１％（重量／容量）水溶液で置き替えた
。得られた結果を下記の表１に示し、また得られた光学
吸収の結果を第２図のグラフに「電位差なし」の曲線で
示す。

表１ 次いで両電極の間に５００Ｖの電位差を印加し、１０個
の出口において再びサンプルを採り、上記の如き測定を
行ったっこれらの結果の数値を表２に示し、また第２図
のグラフに「電位差あり」で示す。

表２ 最適の流動条件下で、蛋白質は何らの焦点化電位差なし
で、セルの全幅にわたって均一に分配されるはずである
。従って印加電位差なしで得られたグラフはその場合に
セルの全幅にわたって一定の光学吸収を示す直線となる
はずである。結果に見られるように、このプロトタイプ
の装置においては可成りの縁部効果があった。しかし電
場を掛けたときに、ば、著しい焦点化か得られる。これ
は電場なしの対照実験で得られた結果のグラフと、１−
電位差あり］のグラフとを比較することによって明かに
示される。一つの鋭いピークが約５．３のｐＨで得られ
た。

【図面の簡単な説明】

第１°図は本発明装置の一例の概念図である。 第２図は実験で得られた光学吸収の結果を示すグラフで
ある。 セル・・・１．　　　　　　電極・・３，４゜サンプル
液溜・・・１４．酸痛・・・１５゜塩基溜・・・１６．
　　　　　分離液出口・・１１゜特許出願人　インＲリ
アルーケミカル・インダストリーズ・ヒ０−エルシー （外４名） 図面のｒｅＪＪ＜内容に変更なし） （％４３６７％３０３　）　ｔｉｌｌｌＷ　１ｌｆｆｌ
＆手　　続　　補　　正　　書 昭和計８年１０月７日 特許斤長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和Δビ年特許願第　／！２３丁７号 ２、発明の名称 ７７°１￥イオンゲ批団歪負ｑ左食老ｆろ、補正をする
者 事件との関係　　特許出願人 住所 外灯　イ／へ・リア１し・ブξｊル・イ／り７１−’Ｉ
−Ｚヒ０−二ルし〜 ４代理人 ５補正の対象

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）相隔てられた電極およびそれらの電極間にｐＨ勾
   配を生じさせるための高分子イオン混合物を有するセル
   からなる電気焦点化装置であって、 該セルは高分子イオン混合物の対向する側面に配置され
   た少なくとも一つの入口と複数の出口とを有して液体の
   ための流路か入口から高分子イオン混合物を経て出口ま
   でセル内に与えられるようになっており、その液体流路
   は電場とｐＨ勾配とに対して横方向であり。 複数の出口はその電場とｐＨ勾配とに沿って間隔を設け
   て与えられており、高分子イオンは一方の電極から他方
   の電極にかけてｐＫ勾配を与えそれを維持するように配
   置され固定化され、従って水性媒質中に浸漬されたとき
   に電極によって電場が印加されるとプロトンの移動が起
   きてｐＫ勾配に対応するｐＨ勾配が電極間に与えられ、
   かくして分離可能な諸成分の水性液体混合物が該装置内
   を流動させられるときにはその電場およびｐＨ勾配によ
   って少なくとも部分的にその諸成分に分割されて、それ
   らの諸成分が相異なる出口から該装置を去るようになっ
   ていることを特徴とする上記電気焦点化装置。
2. （２）少なくとも５個の出口を有し、それぞれの出口か
   分離可能成分の混合物の異なる部分を捕集するように配
   列されている特許請求の範囲第１項に記載の装置。
3. （３）高分子イオンは電極間ｆｐＫ勾配を与えてそれを
   維持するように配列され固定化された相異なるｐＫ値を
   有する複数の異なる両性電解質もしくは両性電解質群よ
   りなる特許請求の範囲第１または２項に記載の装置。
4. （４）両性電解質は、それらに反応性重合可能物質を反
   応させ、電場を印加してそれらをｐＨ勾配をなすよ５ｃ
   させ、次いでそれらの物質を、任意に共単単体の存在下
   で、重合させることにより固定化されたものである特許
   請求の範囲第６項に記載の装置。
5. （５）　　固定化高分子イオン混合物は、酸性イオン交
   換樹脂と塩基性イオン交換樹脂との緩衝混合物からなり
   、その酸性および塩基性イオン交換樹脂の割合は一方の
   電極から装置を横切って他方の電極にかけて変化してｐ
   Ｈ勾配を与えるようになっていることを特徴とする特許
   請求の範囲第１または２項に記載の装置。
6. （６）両電極に平行であり流動の方向に一致している複
   数の帯状体を含み、各帯状体が他の帯状体とは異なる割
   合の樹脂混合物よりなり階段状のρに勾配を与えるよう
   になっている％許請求の範囲第５項に記載の装置。
7. （７）異なる等電点を有する双性イオンの混合物から双
   性イオンを分離するための電気焦点化方法であって、 一対の相隔てられた電極の間に、流動中の溶液−内にそ
   の流動方向に対し横方向のそして一方の電極から他方の
   電極にかけて実質的に延在するｐＨ勾配を生じさせるよ
   うに配置された固定化高分子イオン混合物を有する装置
   内に双性イオン混合物の水性溶液を流動させ；しかる後
   にその流動液体を少なくとも二つの相異なるｐＨの部分
   に分割する；ことからなる上記方法っ