JPS5817169B2 - シンセイコウシゲリワクチンノ セイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新生子牛下痢の発生原因である新しいコロナウ
ィルス状因子に対するワクチンならびにこのワクチンの
製法に関する。

より詳しくは、本発明は牛胎児の腎臓細胞中で連続継代
培養によりコロナウィルス状ウィルスを弱毒化させる方
法ならびにそれによって得られるワクチンに関する。

さらに、該コロナウィルス状因子を細胞培養培地上にて
増殖させた後、不活性化するワクチンの製法に関する。

新生子牛下痢（ｎｅｏｎａｔａｌ ｃａｌｆ ｄｉａｒ
ｒｈｅａ：ＮＣＤ と略称する）の病原学的要因は複雑
である。

この病気の原因としては、多種の細菌類が関係しており
、たとえばバクテリア、菌類（ｆｕｎｇｉ＼ミコプラズ
マ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミデア（ｃｈ ｌａ
ｍｙｄ ｉａ）およびウィルス類が挙げられる。

特に列挙されるウィルス類としては、牛の下痢ウィルス
、伝染性牛鼻気管炎ウィルス、アデノウィルス、エンテ
ロウィルスおよびヘーテ゛ン（）ＬＡＤＥＮ）ウィルス
が挙げられる。

ＮＣＤの病因学的因子として報告されている他のウィル
ス類としては、牛肺炎腸炎ウィルスおよびＮＣＤウィル
スといわれるレオウィルス状因子がある。

このＮＣＤレオウィルス状因子に対して有効なワクチン
の製法については、米国特許出願箱１９７，５２０号、
１９７１年１１月１０日出願、に記されている。

レオウィルス状因子から製造されたワクチンの野外試験
の過程において、西部ネブラス力のある動物群において
牛の病気の不適光な抑制結果が認められた（ Ｖｅｔ、
Ｍｅｄ、／Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ、ＣＩ ｉｎ、。

６７（２）、 １７３頁（１，９７２） ）。

代表例として、生後２４時間内にこのワクチンを投与さ
れた牛において、なお牛が５〜２０日に達したときでも
数群に下痢の発生がみられた。

これらの牛の下痢便を蛍光抗体法を用いてレオウィルス
状ウィルスの検査をしたが、陰性であった。

生後７〜１２田こ達したさきに牛の９０％が感染したワ
クチンの投与群の一つにおける下痢便を子宮切開（セザ
ーリアン： Ｃａｅｓａｒｅａｎ）で生まれ、初乳を与
えていない子牛に十二指腸注入により接種した。

この子牛は下痢を起こし、その下痢便から無バクテリア
の便沢液を調製し、ついでこれをグツトビオシスの（ｇ
ｎｏｔｏｂｉｏｔ ｉｃ）子牛に経口接種した。

これらの子牛は下痢を発生し、この際下痢の原因として
他のウィルス因子の存在が考慮された。

実験子牛からの下痢便を電子顕微鏡試験に付せば、コロ
ナウィルス状因子が観察された。

同種のウィルス粒体が野外試験に付したワク、チン投与
群およびワクチン不投与群の双方の下痢便中に認められ
た。

この新しいコロナウィルス状因子は精製され、そしてき
わめて詳細に同定された。

本発明者はこのコロナウィルス状ウィルスは増殖可能で
あり、かつ細胞培養培地にて有効なワクチンに変化可能
であることを発見し、さらに有効なワクチンがこのウィ
ルスを細胞培養培地で増殖させたのち、不活性化させて
製造可能なことを発見した。

よって、本発明はこの新しいコロナウィルス状因子に対
して有効なワクチンならびにこのワクチンの製造および
投与方法に関するものである。

この因子の精製および特徴についてはＡｍ。Ｊ 、Ｖｅ
ｔ、Ｒｅｓ、、３３巻、、１１４７〜１１５６頁（１９
７２）に記載されている。

コロナウィルス状因子の精製： 便試料を西部ネブラス力の１９の牧場動物群の下痢症子
牛から採取した。

１２〜１９群の子牛にあらかじめＮＣＤレオウィルス状
ウィルスワクチンを経口接種し、一方その他の群の子牛
はワクチン不投与とした。

下痢症子牛からの便塗沫標本をＮＣＤウィルス試験のた
めに免疫蛍光配合体で染色し〔ネブラスカ州立大、Ａｇ
ｒ ｉ 、Ｅｘｐｅｒ 、Ｓｔａ 。

Ｒｅｓ、Ｂｕｌ Ｉ 、 ２３３頁（１９６９））、そ
してＮＣＤウィルス陰性の試料のみを試験に供した。

牧場で自然感染した子牛および人工的感染させた子牛か
ら採集した下痢便材料をウィルス精製に着手するまで一
２０℃〜−６０℃で貯蔵した。

ショ糖濃度勾配（グレデイエント）液を各種調製し、使
用前に直接勾配を形成せしめるために一夜４℃にて放置
した。

各勾配液は蒸留脱イオン水１ｍｌ当りショ糖をそれぞれ
４００．３００．２００および１００〜含む８ｍＡより
なっている。

濃度の高い順に缶液を２．５Ｘ８．９ｃｒｆＬのニトロ
セルロース製遠心管に入れた。

すべてのウィルス精製操作は４℃で行い、医療用遠心法
および超遠心法を使用した。

下痢便材料を脱イオン水３容と混合し、３０分間５００
０Ｇで遠心分離した。

ついでこの上澄液を３時間２５．００ Ｏｒｐｍ に
てタイプ３０回転子（ローター）中で遠心分離した。

得た塊状物（ペレット）を５％（ｗ／■）ショ糖溶液中
で３０秒間超音波処理して分散させた。

この懸濁液を粗製ウィルス懸濁液という。

粗製ウィルス懸濁液５ｍｌを管中の勾配液上に注加成層
させ、２５，０００ｒｐｍにて２時間ＳＷ２７回転子中
で遠心分離した。

遠心分離後、各帯層を光散乱法により位置確認した。

各帯層中の物質を遠心管の頂部よりプロピペットをそな
えたパスツールピペットを用いて捕集した。

各試料を、電子顕微鏡検査を行う前に１％酢酸アンモニ
ウム溶液に対して透析した。

ウィルス（液面から６Ｃ１ｒＬにある帯層からの半精製
のウィルス）を含むフラクションをショ糖濃度勾配遠心
法または塩化セシウム（ＣｓＣ１）勾配遠心法によりさ
らに精製する。

半精製ウィルス調製物を上記したショ糖濃度勾配遠心法
の繰返しによってさらに精製した。

再び帯層を位置確認し、液面から６．０ＣＩ′ｒＬにあ
る帯層を捕集し、１％酢酸アンモニウムに対して透析す
れば、精製したウィルスを得る。

半精製ウィルス調製物の同濃度勾配遠心処理を３０％溶
液（ＣｓＣ１’ １５ ｇ＋脱イオン水３５ｒｒＬｌ）
で開始して行った。

この溶液（４ＩｎＪ）を二１−ｏ−１ｚルロース遠心管
に分取し、つぎに容管にウィルスの懸濁液１．４ｒ／ｌ
ｌを注加した。

５Ｗ６５回転子を用い６０．００ Ｏｒｐｍにて１８時
間遠心分離すれは、この時点で完全な平衝に達している
。

ウィルスが存在している帯層におけるＣｓＣ１の屈折率
をＴＳメーターにより測定する。

液面から２．９ＣｒｒＬの帯層を捕集し、１％酢酸アン
モニウム溶液に対して透析して精製ウィルスを得る。

また、前記した粗製ウィルス懸濁液（１５ｒｒＬｌ）を
４．２×４２ｃｒＩＬのゲルカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ２Ｂ：ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ、Ｉｎｃ、 ）ピスカタウエイ、ニューシャー
シー州）上にてゲル濾過に付して分別した。

カラムはあらかじめ０．９％ＮａＣ］で平衝させておき
、この食塩溶液で展開した。

流速６．０ｍｌ／時間で行った。５ｒｒＬｌのフラクシ
ョンを捕集し、吸光度を２６０μｍで分光光度計にによ
り測定した。

各ピークの物質をそれぞれ合併し、つぎに限外沖過によ
り別々に濃縮する。

また、試験用子牛からの下痢側材料からウィルスを調製
するのに簡略化した方法も適用される。

便材料を直接３，４００Ｇにて３０分間遠心分離する。

上澄液部分の一部をジクロロジフルオロメタンで２回抽
出する。

水溶液層（５ｄ）および未処理上澄液（５蛯）材料を前
記のごときショ糖濃度勾配遠心分離法に付する。

濃度勾配遠心分離法により濃縮されたウィルスは電子顕
微鏡による研究に用いられ、また免疫蛍光分析用の配合
体調製のためのウサギの免疫用抗原として用いられる。

生後約６ケ月の白色室ウサギの心臓から採血（１４ｍＪ
）ｊ、、ついで抗原０．４ｖｒ、ｌおよび完全フロイン
ト補助液０．６ｍｌの混合液を１カ所当り０．２５ ｍ
ｌにて４カ所に筋肉内注射した。

接種５週間後に、血液７０ｍ１を心臓穿刺により採血す
る。

フルオレセインでラベルしたガンマグロブリンを既知方
法Ｃｐｒｏｃ、Ｕ、Ｓ、ＬｉｖｅｓｔｏｃｋＳａｎ、Ａ
、ｓｓｎ、 １９６８年１０月、１３９〜１４４頁）に
より接種後の血清から調製する。

コロナウィルス状因子の存在は上記で調製した配合体を
用いる免疫蛍光法により感染した腸において検出可能で
ある。

コロナウィルス状因子に対するこの配合体の特異性は以
下に示す試験法により明確に示される。

コロナウィルス状因子に感染させた下痢症子牛の腸の切
片を配合体にて染色すると絨毛細胞の蛍光が観察された
。

同じ子牛の腸は前記したレオウィルス状因子に対する配
合体で染色した場合には蛍光を示さなかった。

レオウィルス状ウィルスに感染した下痢症子牛の腸の切
片はレオウィルス状因子に対する配合体で染色した場合
は陽性を示し、コロナウィルス状因子に対する配合体で
染色した場合は陰性を示した。

正常なグツトビオシスの子牛の腸の切片はコロナウィル
ス状因子に対する配合体で染色した場合には蛍光を示さ
なかった。

ウィルスの形態学： 勾配濃度超遠心分離精製法により得られるウィルス含有
帯層を電子顕微鏡により検査する。

帯層からの小滴を、あらかじめコロジオンで被覆しかつ
蒸着カーボンで補強した２００メツシユの銅格子に加え
る。

これらの小滴は試験中の帯層の光散乱度に従って３〜２
５分間格子上に残留させる。

過剰の液体を濾紙で吸い取り、ついでモリブデン酸バナ
ジウム−リンタングステン酸溶液の小滴を格子上に加え
る。

この染料はその過剰量を吸取紙としてのＰ紙で除去する
前、１〜１５分間にわたり格子上に残留させる。

試料は倍率３２，０００倍またはそれ以上の性能をもつ
電子顕微鏡により検査する。

寸法測定は試料の電子顕微鏡写真の寸法分析ならびに機
器のセットを変えずに試料の電子顕微鏡写真撮影の直後
にとった回折格子レプリカにより行う。

完全なウィルス粒体の寸法は同じ顕微鏡写真において１
０７〜１６０μｍの範囲にあり、そしてコロナウィルス
に見られるものと類似の表面突起を有していた。

電子顕微鏡検査で測定されたと同様に、表面突起を包含
した粒体の平均寸法は１２６μｍであった。

核キャプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓ ｉｄ）は多形性
であり、寸法および形状は円形ないし長円形に変化して
いた。

キャプシドの外皮は外縁（ｆｒｉｎｇｅ）が失なわれる
と特に明瞭となる。

外縁の巾は最大２３μｍまで変化する。

良好に保持された粒体の表面突起は花弁形をなし、細長
い茎状部により粒体に結合され、そして長さは平均１１
μｍである。

本発明に記したコロナウィルス状因子は新生子牛の下痢
の病原学的要因として証明され、あるいは提案されてい
る他種のウィルスからは寸法および形態学的特徴に基い
て容易に識別される。

ここに記したコロナウィルス状因子はエンテロウィルス
、牛−肺炎−腸炎ウィルス、牛下痢ウィルス、新生子牛
下痢ウィルス（レオ状）、およびヘーデンウイルスとは
異なった形態学的特徴を有し、これらよりも大型である
。

この新しい因子は牛伝染性鼻気管炎ウィルスより小型で
その代表的な形態学的特徴を欠いている。

精製したコロナウィルス状因子の浮揚性密度（ｂｕｏｙ
ｇｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ）はＣｓＣ１を用いれば１．２
４であり、一方レオウイルス状因子は浮揚性密度１３５
９である（Ｃａｎ、Ｊ。

Ｃｏｍｐ 、Ｍｅｄ 、 、 ３５頁（１９７１））。

コロナウィルス状因子の生理学的作用はまたレオ状ウィ
ルスの作用とは異なる。

レオウィルス状因子をグツトビオシスの牛に経口接種し
た後の潜伏期間は１３．５〜１４時間の短期であり得る
が、一方コロナウイルス状因子について認められる最小
潜伏期間は１８時間である。

さらに、レオウィルスに感染したグツトビオシスの牛は
５〜８時間下痢症状を示し、ついで下痢開始２４時間後
には正常に復する。

これに反し、コロナウィルス状因子に感染したグツトビ
オシスの牛は下痢が激化し、５日間またはそれ以上の日
数にわたり下痢を続け、あるいは下痢開始後２〜３日後
に死亡することすらある。

ワクチンの製法および使用法： 本発明を実施するに有効な方法を以下に例により説明す
るが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

前記の感染した牛から得られるコロナウィルス状因子は
牛脂児腎臓細胞上で増殖する。

また、このウィルスは牛その他由来の他の組織または細
胞系からの細胞上でも増殖しうる。

既知方法により単層の細胞培地を調製し、コロナウィル
ス状因子を接種する。

通常、単層培地をハンクス（Ｈａｎｋｓ）の平衡塩溶液
で洗浄し、ついでウィルス接種物を加え、数時間、通常
２時間、約３７℃で吸収させる。

０．５％ラクトアルブミン氷解物（ＬＡＨと略称する）
、０．１％イースト抽出物、および］、 ｒｕｌ当。

リペニシリン１００単位ならびにストレプトマイシン２
００μｇを含有するアール（Ｅａｒｌｅ）の平衡塩溶液
の保存培地を加え、ついで３０〜４０°Ｃ１好ましくは
約３７℃、で２〜１０日間培養する。

ウィルスを、たとえば細胞から上澄液を流出させ。

て採集する。

ウィルス接種物はコロナウィルス感染中から採取した便
またはコロナウィルス状ウィルス培地からの培地液でさ
しつかえない。

便は採取したままあるいはリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２
）稀釈して、これを１００ＯＧで２０分間遠心分離し、
。

上澄液を接種物として用いるこ吉ができる。

他の保存培地、たとえばラクトアルブミン水解物含有の
変形イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地を用いることができる
。

培地の選択は当技術者の常識に従えばよい。

効果的に弱毒化されたコロナ状ウィルスワクチンは接種
された牛が有毒なウィルスに攻撃されたときに病気にか
からないように十分な回数牛脂児臓胞細胞中で精製ウィ
ルスを継代培養して得られる。

通常はウィルスを５〜６０回継代培養する必要かあり、
この継代は一次またげ二次細胞（一次細胞は１回継代さ
れたもの）あるいは高次継代細胞または細胞系にて行う
。

１０回以上継代培養した高次継代細胞は細胞系と考えて
よい。

好ましい方法には一次才たは二次細胞と高次継代細胞ま
たは細胞系上での継代培養の糾合せかある。

ウィルス力価（ｔｉｔｅｒ）は標準方法により測定する
。

たとえば、ウィルス稀釈物を接種された細胞を牛胎児腎
臓細胞を入れた管中で５日間培養する。

ウィルスの存在は、たとえば細胞変性効果、免疫蛍光法
、または血液吸収法によって測定する。

さらに詳しくは、効果的に弱毒化されたワクチンが以下
に示す方法により製造される。

牛胎児を準備し、大量の一次腎臓細胞を調製する。

数個のビンおよびカバーグラス培地を一次細胞から調製
し、残った一次細胞に０．５％ＬＡＨ，１，０％成年牛
血清、および１０％ジメチルスルホキシドを含有するア
ールの平衡塩溶液を加えて凍結する。

このビンおよびカバーグラス培地にここに記したごとき
ウィルス含有溶液を接種し、３７℃で培養する。

数個の蛍光細胞がカバーグラス培地上で観察されたなら
ば、同じ胎児からの凍結−次細胞を解凍し、標準方法に
より単層培地を形成させる。

感染させたこの一次細胞培地からの液体をこれらの二次
細胞培地で継代培養する。

接種してから６〜７日後に、二次細胞培地からの液体を
別の二次細胞培地に接種するのに用いる。

１代から１５代の継代培養においては、前記のごとく液
体２ｍｌ！を８オンスピンに接種するために用いる。

１５代から２５代の継代培養においては、液体２ｍｌを
ビン中の保存培地に加える。

２５代継代後、各ビン中の保存培地に１ ｒｕｌの接種
物を加える。

コロナウィルス状因子を５代〜２０代組織培地中で継代
培養したら、二次細胞からの細胞で一連の連続的継代培
養を始める。

各継代において、細胞はごく一部のみが感染し、他の未
感染細胞は二次培養して以後の高次継代培養水準の細胞
とする。

この種の細胞培地は継代細胞培地と称される。

継代細胞培地でウィルスの連続的二次培養継代を続ける
ことによって、適当な細胞−ウィルス系が形成される。

二次細胞培地にてビールスを５〜２０回継代培養した後
、ウィルスを継代細胞培地で５〜４０回またはそれ以上
継代培養すれば、効果的に弱毒化されたコロナウインル
ス状ウィルスワクチンを得る。

ウィルスの継代培養における培養期間は継代回数の増加
につれて減少し、そして高次継代細胞または細胞系上で
の継代培養は２〜７日間で行うことができる。

各継代は細胞変性効果が起こるまで行う。

ワクチンは牛胎児の腎臓または牛その他由来の他の組織
または細胞系からの細胞系、たとえば牛の肺、牛鼻介骨
細胞系またはブタ腎臓細胞または細胞系を用い、該組織
培地に約３７℃で適描なウィルス力価か得られるまで培
養し、ついでウィルスを採集することにより製造するこ
とができる。

１０２〜１０６．５、好ましくは１０４〜１０６の力価
が得られる。

ワクチンは液状でもまたは凍結乾燥したものでも用いる
ことができる。

後の使用時において、蒸留水のごとき滅菌稀釈剤で稀釈
して復元させることができる。

好適な生成物は二次細胞上で１２回、ついで自体が９〜
２７回継代継代された細胞上で１５回継代培養して弱毒
化したウィルスよりなっている。

全部の継代培養水準はかくして２７回である。

３５回まで継代培養されたワクチンが製造されている。

さらに、効果的な不活性化ワクチンがコロナウィルス状
因子を不活性化して製造される。

通常、これはまずこの因子を前記のごとく適当な力価が
得られるまで牛脂児腎臓細胞上で培養して製造される。

力価は前記の範囲内でできるだけ高くすべきである。

いかなる細胞継代培養水準にあるウィルスはもちろん、
非弱毒化ウィルスでさえも、、用いることができる。

ついでウィルスはそれを当技術者に既知の、ホルマリン
、β−プロピオラクトン、紫外線、または熱のごとき、
不活性化剤または手段を用いて２０〜４０℃で、ウィル
スを効果的に不活性化するような時間および濃度で処理
して不活性化せしめる。

これらの詳細は当技術者に既知である。

補助薬を抗原性の促進のために加えることができる。

補助薬は当技術者に既知のいずれでもよく、たとえば水
酸化アルミニウムゲル、カリウム明ばん、アルギン酸塩
、または油基剤あるいは鉱油または有機物油のごとき他
の補助薬が挙げられる。

不活性化ワクチンを製造する代表的な方法は以下の通り
である。

前記のごとき２７回継代培養水準にあるコロナウィルス
状因子を用いる。

ホルマリンを０．２％濃度になるまでウィルス含有培養
液に加える。

つぎにこれらの液体を１〜２日間３７℃にて放置する。

この不活性化ウィルスに水酸化アルミニウムゲル補助薬
を１０％濃度まで加える。

ｐＨを水酸化アルミニウムで約７．２に調節する。

この弱毒化ワクチンは１０２〜１０６・５ＴＣＩＤ／Ｉ
Ｌｌを含有した１〜５ｍｌの投与量にて子牛、好ましく
は新生子牛に投与して有毒なウィルスに対する免疫を付
与することができる。

不活性化ワクチンは出産３０〜９０日前の姐娠牛または
出産後できるだけ早い新生子牛に対し１〜５ｍｌの投与
量で非経口的に投与され、コロナウィルス状因子に対す
る保護効果を付与する。

さらに、好ましくは不活性化したコロナウィルスと他の
いずれかのウィルス因子からなる複きワクチンが子牛ま
たは成牛に免疫を付与するのに用いられる。

好ましい複合例としては不活性化されたコロナウィルス
およびレオウィルスが挙げられ、これらの両者ともに非
弱毒化または弱毒化生ウィルスを化学薬剤、放射線また
は熱により不活性化して製造喬れる。

また、コロナウィルスは牛アデノウィルス、牛下痢つイ
リス、またはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）あるいはクロストリジウム属の菌（Ｃ
１ｏｓｔｒｉｄｉａ Ｓｐ、）のごとき他の牛病原体と
複合させることができる。

コロナウィルスおよびレオウィルスを含有する複合ワク
チンは両方の不活性化ウィルス因子の等量を混合して製
造する。

ついで、これにホルマリンを０２％濃度および水酸化ア
ルミニウムゲルを１０容量％添加する。

このワクチンの投与は姐娠牛に対し非経口的に１〜５ｒ
ｕｌの投与とする。

この複合ワクチンは子牛ならびに姐娠牛のいずれにも投
与できる。

複合ワクチンは、初乳および／または牛乳抗体を経由し
て、新生子牛に対し保護効果を付与する。

さらに、両因子に対する保護効果は姐娠牛を不活性化レ
オウィルス状ワクチンで免疫を付与し、ついで弱毒化コ
ロナウィルス状ワクチンを子牛に投与することにより行
うことができる。

また、両因子に対する保護効果は姐娠牛を不活性化コロ
ナウィルス状ワクチンで免疫を付与し、ついで弱毒化レ
オウィルス状ワクチンを子牛に投与することによっても
与えることができる。

さらに、弱毒化コロナウィルスおよびレオウィルス状因
子を含有せしめた複合ワクチンは姐娠牛に投与すること
ができる。

種々の細胞培地継代培養水準で製造されたワクチンを生
後約７時間のグツトビオシスの子牛に投与し、その後、
子牛を有毒なウィルスで攻撃して弱毒化ウィルスワクチ
ンの効力を試７験した。

これらの試験結果を第１表および第２表に示す。

二次牛胎児腎臓細胞上でウィルスを１４回継代培養して
得た細胞培養液１０ｍ１を経口接種した子牛１は下痢を
起こし、ついで回復した。

生後９臼田こ、この子牛に下痢便（有毒ウィルス’）
］、 ＯｍｌをＰＢＳ２０ｍｌに加えたものを経口接種
したが、発病しなかった。

二次牛胎児腎臓細胞上でウィルスを１５回継代培養した
もの１０ｒＩＬｌを子牛２に接種したが下痢を起こさず
、そして有毒ウィルスの接種で攻められた後でも発病し
なかった。

二次牛胎児腎臓細胞上で１６回継代培養したウィルス１
０ｒｎｌを子牛３および４に接種すれは弱い下痢発病が
みられた。

子牛３を下痢開始後しばらくしてから殺し、小腸および
結腸の切片をコロナウィルス状因子に対する配合体で染
色すれば、腸繊毛および結腸の上皮に免疫蛍光が認めら
れた。

子牛４を生後６白目に下痢便中の有毒ウィルスを接種し
たが、発病しなかった。

二次牛胎児腎臓細胞上で１９回継代培養したウィルス５
ｒＩ′ｌｌを子牛６に経口接種すれば、下痢発病した。

高次継代牛胎児腎臓細胞上で少なくとも５継代代培養し
たウィルスを１３回〜２５回継代培養したもの５ｍｌを
１２頭の子牛（／１６．７〜１３および痛１５〜１９）
に経口接種したところ下痢発病せず、そして、子牛１８
を除いて、有毒ウィルスを含む便を経口接種した後でも
発病しなかった。

不活性化コロナウィルスおよびレオウィルスを含有する
複合ワクチンを２つの牧場の成牛について試験した。

このワクチンはホルマリンで不活性化した２７回継代培
養したコロナウィルスおよびホルマリンで不活性化した
２０１回継継代養（−次子腎臓および牛腎臓細胞系上）
したレオウィルスより製造した。

この不活性化した各ウィルスを等量ずつ互いに混合し、
水酸化アルミニウムゲルを１０％添加した。

第１表および第２表の試験結果について表の説明：Ｄ−
下痢発病、Ｎ−異常なし、 ｂ−ウィルスの継代培養回数は一次または二次細胞上な
らびに継代培養細胞上での継代の回数。

以下に本発明の実施態様を列記する １、 コロナウィルス成牛下痢ウィルスを該ウィルスの
生育を維持する組織培地にて、該ウィルスを新生子牛に
接種した場合に以後の有毒ウィルスの攻撃に対して発病
を抑制せしめるまで５〜約６０回継代接種することを特
徴とするコロナウィルス成牛下痢ウィルスの弱毒化方法
。

２、前記ｊにおいて、継代培養を牛胎児腎臓細胞の組織
培地にて３０〜４０℃で行う方法。

３、前記２において、全継代培養回数が１０〜４０回で
あり、そのうち５〜１０回継代継代を一次または二次牛
胎児腎臓細胞培地にて行ない、残余の継代培養を高次継
代培養した牛胎児腎臓細胞培地にて行なう方法。

４、前記１の方法により製造した、弱毒化したコロナウ
ィルス成牛下痢ウィルスを含有してなる牛下痢ワクチン
。

５、前記２の方法により製造され、弱毒化したコロナウ
ィルス成牛下痢ウィルスを含有してなる牛下痢ワクチン
。

６、前記３の方法により製造され、弱毒化したコロナウ
ィルス成牛下痢ウィルスを含有してなる牛下痢ワクチン
。

７、コロナウィルス成牛下痢ウィルスを牛胎児腎臓細胞
培地で、該ウィルスの大量を増殖させるに十分な期間増
殖せしめ、ついで生成するウィルス性物質を採集するこ
とを特徴とする弱毒化したコロナウィルス成牛下痢ウィ
ルスの大量製造方法。

８、前記７の方法により製造され、弱毒化したコロナウ
ィルス成牛下痢ウィルスを含有させた牛下痢ワクチン。

９、 コロナウィルス成牛下痢ウィルスを不活性化し、
これを補助薬に配合することを特徴とする不活性化コロ
ナウィルス成牛下痢ワクチンの製造方法。

１０、前記９において、不活性化剤がホルマリンである
方法。

１１、前記９の方法により製造され、不活性化したコロ
ナウィルス成牛下痢ウィルスおよびその補助薬を含有さ
せた不活性化コロナウィルス成牛下痢ワクチン。

１２、不活性化コロナウィルス成牛下痢ウィルスおよび
牛の病原に対し効果的な他の免疫剤を含有させた複合牛
下痢ワクチン。

１３、不活性化コロナウィルス成牛下痢ウィルスおよび
不活性化レオウィルス成牛下痢ウィルスを含有させた複
合牛下痢ワクチン。

１４、前記１に記したワクチンを新生牛に経口投与する
ことを特徴とする、コロナウィルス成牛下痢ウィルスに
より起こされる新生牛下痢に対する新生牛の免疫方法。

１５、前記９に記したワクチンを新生牛用産前に成年の
姐娠牛に非経口的投与することを特徴とする、コロナウ
ィルス成牛下痢ウィルスにより起こされる新生牛下痢に
対する新生牛の免疫方法。

１６、前記１３に記した複合ワクチンを新生牛用産前に
成年の姐娠牛に非経口的投与することを特徴とする、コ
ロナウィルス状またはレオウィルス成牛下痢ウィルスに
より起こされる新生牛下痢に対する新生中の免疫方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コロナウィルス状牛下痢ウィルスを牛胎児腎臓細胞
   の組織培養中で５〜約６０回継代培養して弱毒化コロナ
   ウィルス状牛下痢ウィルスを得ることを特徴とする新生
   子牛下痢ワクチンの製法。 ２ コロナウィルス状牛下痢ウィルスを牛胎児腎臓細胞
   の組織培養中で５〜約６０回継代培養して該ウィルスの
   弱毒化株を得、これをさらに、牛胎児腎臓、牛の肺、牛
   鼻介骨細胞系、ブタ腎臓細胞およびブタ腎臓細胞系から
   なる群から選ばれる糾。 織善後中で増殖させて力価１０２〜１０６・５の該弱毒
   化株を大量に得、ついで生成したウィルスを採集するこ
   とを特徴さする新生子牛下痢ワクチンの製法。