JPS6124370B2 - - Google Patents
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Description
本発明は新生子牛下痢の発生原因である新しい
コロナウイルス状因子に対するワクチンならびに
このワクチンの製法に関する。より詳しくは、本
発明は牛胎児の腎臓細胞中で連続継代培養により
コロナウイルス状ウイルスを弱毒化させる方法な
らびにそれによつて得られるワクチンに関する。
さらに、該コロナワクチン状因子を細胞培養地上
にて増殖させた後、不活性化するワクチンの製法
に関する。 新生子牛下痢（neonatal calf diarrhea：NCD
と略称する）の病原学的要因は複雑である。この
病気の原因としては、多種の細菌類が関係してお
り、たとえばバクテリア、菌類（fungi）、ミコプ
ラズマ（mycoplasma）、クラミデア
（chlamydia）およびウイルス類が挙げられる。
特に列挙されるウイルス類としては、牛の下痢ウ
イルス、伝染性牛鼻気管炎ウイルス、アデイウイ
ルス、エンテロウイルスおよびヘーデン
（HADEN）ウイルスが挙げられる。NCDの病因
学的因子として報告されている他のウイルス類と
しては、牛肺炎腸炎ウイルスおよびNCDウイル
スといわれるレオウイルス状因子がある。この
NCDレオウイルス状因子に対して有効なワクチ
ンの製法については、米国特許出願第197520号、
1971年11月10日出願、に記されている。 レオウイルス状因子から製造されたワクチンの
野外試験の過程において、西部ネブラスカのある
動物群において牛の病気の不適当な抑制結果が認
められた〔Vet.Med.／Small Anim.Clin.，67
（２）、173頁（1972）〕。代表例として、生後24時
間内にこのワクチンを投与された牛において、な
お牛が５〜20日に達したときでも数群に下痢の発
生がみられた。これらの牛の下痢便を螢光抗体法
を用いてレオウイルス状ウイルスの検査をした
が、陰性であつた。 生後７〜12日に達したときに牛の90％が感染し
たワクチンの投与群の一つにおける下痢便を子宮
切開（セザーリアン：Caesarean）で生まれ、初
乳を与えていない子牛に十二指腸注入により接種
した。この子牛は下痢を起こし、その下痢便から
無バクテリアの便液を調製し、ついでこれをグ
ノトビオシスの（gnotobictie）子牛に経口接種
した。これらの子牛は下痢を発生し、この際下痢
の原因として他のウイルス因子の存在が考慮され
た。実験子牛からの下痢便を電子顕微鏡試験に付
せば、コロナウイルス状因子が観察された。同種
のウイルス粒体が野外試験に付したワクチン投与
群およびワクチン不投与群の双方の下痢便中に認
められた。この新しいコロナウイルス状因子は精
製され、そしてきわめて詳細に同定された。本発
明者はこのコロナウイルス状ウイルスは増殖可能
であり、かつ細胞培養培地にて有効なワクチンに
変化可能であることを発見し、さらに有効なワク
チンがこのウイルスを細胞培養培地で増殖させた
のち、不活性化させて製造可能なことを発見し
た。よつて、本発明はこの新しいコロナウイルス
状因子に対して有効なワクチンならびにこのワク
チンの製造および投与方法に関するものである。
この因子の精製および特徴についてはAm.J.Vet.
Res.，33巻、1147〜1156頁（1972）に記載され
ている。 コロナウイルス状因子の精製： 便試料を西部ネブラスカの19の牧場動物群の下
痢症子牛から採取した。12〜19群の子牛にあらか
じめNCDレオウイルス状ウイルスワクチンを経
口接種し、一方その他の群の子牛はワクチン不投
与とした。下痢症子牛からの便塗〓標本をNCD
ウイルス試験のために免疫螢光配合体で染色し
〔ネブラカス州立大、Agri.Exper.Sta.Res.
Bull.233頁（1969）〕、そしてNCDウイルス陰性の
試料のみを試験に供した。牧場で自然感染した子
牛および人工的感染させた子牛から採取した下痢
便材料をウイルス精製に着手するまで−20℃〜−
60℃で貯蔵した。 シヨ糖濃度勾配（グレデイエント）液を各種調
製し、使用前に直線勾配を形成せしめるために一
液４℃にて放置した。各勾配液は蒸留脱イオン水
１ml当りシヨ糖をそれぞれ400，300，200および
100mg含む８mlよりなつている。濃度の高い順に
各液を2.5×8.9cmのニトロセルロース製遠心管に
入れた。 すべてのウイルス精製操作は４℃で行い、医療
用遠心法および超遠心法を使用した。 下痢便材料を脱イオン水３容と混合し、30分間
5000Gで遠心分離した。ついでこの上澄液を３時
間25000rpmにてタイプ30回転子（ローター）中
で遠心分離した。得た塊状物（ペレツト）を５％
（ｗ／ｖ）シヨ糖溶液中で30秒間超音波処理して
分散させた。この懸濁液を粗製ウイルス懸濁液と
いう。 粗製ウイルス懸濁液５mlを管中の勾配液上に注
加成層させ、25000rpmにて２時間SW27回転子中
で遠心分離した。遠心分離後、各帯層を光散乱法
により位置確認した。各帯層中の物質を遠心管の
頂部よりプロピペツトをそなえたパスツールピペ
ツトを用いて捕集した。各試料を、電子顕微鏡検
査を行う前に１％酢酸アンモニウム溶液に対して
透析した。ウイルス（液面から６cmにある帯層か
らの半精製のウイルス）を含むフラクシヨンをシ
ヨ糖濃度勾配遠心法または塩化セシウム
（CsCl）勾配遠心法によりさらに精製する。 半精製ウイルス調製物を上記したシヨ糖濃度勾
配遠心法の繰返しによつてさらに精製した。再び
帯層を位置確認し、液面から6.0cmにある帯層を
捕集し、１％酢酸アンモニウムに対して、透析す
れば、精製したウイルスを得る。 半精製ウイルス調製物の同濃度勾配遠心処理を
30％溶液（CsCl 15ｇ＋脱イオン水35ml）で開始
して行つた。この溶液（４ml）をニトロセルロー
ス遠心管に分取し、つぎに各管にウイルスの懸濁
液1.4mlを注加した。SW65回転子を用い
60000rpmにて18時間遠心分離すれば、この時点
で完全な平衝に達している。ウイルスが存在して
いる帯層におけるCsClの屈折率をTSメーターに
より測定する。液面から2.9cmの帯層を捕集し、
１％酢酸アンモニウム溶液に対して透析して精製
ウイルスを得る。 また、前記した粗製ウイルス懸濁液（15ml）を
4.2×42cmのゲルカラム（Sepharose 2B：
Pharmacia Fine Chemicals，Inc.、ピスカタウ
エイ、ニユージヤージー洲）上にてゲル過に付
して分別した。カラムはあらかじめ0.9％NaClで
平衝させておき、この食塩溶液で展開した。流速
6.0ml／時間で行つた。５mlのフラクシヨンを捕
集し、吸光度を260μｍで分光光度計により測定
した。各ピークの物質をそれぞれ合併し、つぎに
限外過により別々に濃縮する。 また、試験用子牛からの下痢便材料からウイル
スを調製するのに簡略化した方法も適用される。
便材料を直接3400Gにて30分間遠心分離する。上
澄液部分の一部をジクロロジフルオロメタンで２
回抽出する。水溶液層（５ml）および未処理上澄
液（５ml）材料を前記のごときシヨ糖濃度勾配遠
心法に付する。 濃度勾配遠心分離法により濃縮されたウイルス
は電子顕微鏡による研究に用いられ、また免疫螢
光分析用の配合体調製のためのウサギの免疫用抗
原として用いられる。生後約６ケ月の白色家ウサ
ギの必臓から採血（14ml）し、ついで抗原0.4ml
および完全フロインド捕助液0.6mlの混合液を１
カ所当り0.25mlにて４カ所に筋肉内注射した。接
種５週間後に、血液40mlを心臓穿刺により採血す
る。フルオレセインでラベルしたガンマグロブリ
ンを既知方法（Proc.U.S.Livestoek San.Assn.
，1968年10月、139〜144頁）により接種後の血清
から調製する。 コロナウイルス状因子の存在は上記で調製した
配合体を用いる免疫螢光法により感染した腸にお
いて検出可能である。コロナウイルス状因子に対
するこの配合体の特異性は以下に示す試験法によ
り明確に示される。コロナウイルス状因子に感染
させた下痢症子牛の腸の切片を配合体にて染色す
ると絨毛細胞の螢光が観察された。同じ子牛の腸
は前記したレオウイルス状因子に対する配合体で
染色した場合には螢光を示さなかつた。レオウイ
ルス状ウイルスに感染した下痢症子牛の腸の切片
はレオウイルス状因子に対する配合体で染色した
場合は陽性を示し、コロナウイルス状因子に対す
る配合体で染色した場合は陰性を示した。正常な
グノトビオシスの子牛の腸の切片はコロナウイル
ス状因子に対する配合体で染色した場合には螢光
を示さなかつた。 ウイルスの形態学： 勾配濃度超遠心分離精製法により得られるウイ
ルス含有帯層を電子顕微鏡により検査する。帯層
からの小滴を、あらかじめコロジオンで被覆しか
つ蒸着カーボンで補強した200メツシユの銅格子
に加える。これらの小滴は試験中の帯層の光散乱
度に従つて３〜25分間格子上に残留させる。過剰
の液体を紙で吸い取り、ついでモリブデン酸バ
ナジウム−リンタングステン酸溶液の小滴を格子
上に加える。この染料はその過剰量を吸取紙とし
ての液で除去する前、１〜1.5分間にわたり格
子上に蒸留させる。 試料は倍率32000倍またはそれ以上の性能をも
つ電子顕微鏡により検査する。寸法測定は試料の
電子顕微鏡写真の寸法分析ならびに機器のセツト
を変えずに試料の電子顕微鏡写真撮影の直後にと
つた回析格子レプリカにより行う。 完全なウイルス粒体の寸法は同じ顕微鏡写真に
おいて107〜160μｍの範囲にあり、そしてコロナ
ウイルスに見られるものと類似の表面突起を有し
ていた。電子顕微鏡検査で測定されたと同様に、
表面突起を包含した粒体の平均寸法は126μｍで
あつた。核キヤプシド（nueleocapsid）は多形性
であり、寸法および形状は円形ないし長円形に変
化していた。キヤプシドの外皮は外縁（fringe）
が失なわれると特に明瞭となる。外縁の巾は最大
23μｍまで変化する。良好に保持された粒体の表
面突起は花弁形をなし、細長い莖状部により粒体
に結合され、そして長さは平均11μｍである。 本発明に記したコロナウイルス状因子は新生子
牛の子牛の病原学的要因として証明され、あるい
は提案されている他種のウイルスからは寸法およ
び形態学的特徴に基いて容易に識別される。ここ
に記したコロナウイルス状因子はエンテロウイル
ス、牛−肺炎−腸炎ウイルス、牛下痢ウイルス、
新生子牛下痢ウイルス（イオ状）、およびヘーデ
ンウイルスとは異なつた形態学的特徴を有し、こ
れらよりも大型である。この新しい因子は牛伝染
性鼻気管炎ウイルスより小型でその代表的でその
代表的な形態学的特徴を欠いている。精製したコ
ロナウイルス状因子の浮揚性密度（buoyant
density）はCsClを用いれば1.24であり、一方レ
オウイルス状因子は浮揚性密度1.359である
〔Can.J.Comp.Med.，35頁（1971）〕。 コロナウイルス状因子の生理学的作用はまたレ
オ状ウイルスの作用とは異なる。レオウイルス状
因子をノトビオシスの牛に経口接種した後の潜伏
期間は13.5〜14時間の短期であり得るが、一方コ
ロナウイルス状因子について認められる最小潜伏
期間は18時間である。さらに、レオウイルスに感
染したノトビオシスの牛は５〜８時間下痢症状を
示し、ついで下痢開始24時間後には正常に復す
る。これに反し、コロナウイルス状因子に感染し
たノトビオシスの牛は下痢が激化し、５日間また
はそれ以上の日数にわたり下痢を続け、あるいは
下痢開始後２〜３日後に死亡することすらある。 ワクチンの製法および使用法： 本発明を実施するに有効な方法を以下に例によ
り説明するが、これらは本発明を何ら限定するも
のではない。 前記の感染した牛から得られるコロナウイルス
状因子は牛胎児腎臓細胞上で増殖する。また、こ
のウイルスは牛その他由来の組識または細胞系か
らの細胞上でも増殖しうる。既知方法により単層
の細胞培地を調製し、コロナウイルス状因子を接
種する。通常、単層培地をハンクス（Hanks）の
平衡塩溶液で洗浄し、ついでウイルス接種物を加
え、数時間、通常２時間、約37℃で吸収させる。
0.5％ラクトアルブミン水解物（LAHと略称す
る）、0.1％イースト抽出物、および１ml当りペニ
シリン100単位ならびにストレプトマイシン200μ
ｇを含有するアール（Earle）の平衡塩溶液の保
存培地を加え、ついで30〜40℃、好ましくは約37
℃、で２〜10日間培養する。ウイルスを、たとえ
ば細胞から上澄液を流出させて採集する。ウイル
ス接種物はコロナウイルス感染牛から採取した便
またはコロナウイルス状ウイルス培地からの培地
液でさしつかえない。便は採取したままあるいは
リン酸塩緩衝液（PH7.2）稀釈して、これを
1000Gで20分間遠心分離し、上澄液を接種物とし
て用いることができる。 他の保存培地、たとえばラクトアルブミン水解
物含有の変形イーグル（Eagle）培地を用いるこ
とができる。培地の選択は当技術者の常識に従え
ばよい。 効果的に弱毒化されたコロナ状ウイルスワクチ
ンは接種された牛が有毒なウイルスに攻撃された
ときに病気にかからないように十分な回数牛胎児
腎臓細胞中で精製ウイルスを継代培養して得られ
る。通常はウイルスを５〜60回継代培養する必要
があり、この継代は一次または二次細胞（一次細
胞は１回継代されたもの）あるいは高次継代細胞
または細胞系にて行う。10回以上継代培養した高
次継代細胞は細胞系と考えてよい。好ましい方法
には一次または二次細胞と高次継代細胞または細
胞系上での継代培養の組合せがある。ウイルス力
価（titer）は標準方法により測定する。たとえ
ば、ウイルス稀釈物を接種された細胞を牛胎児腎
臓細胞を入れた管中で５日間培養する。ウイルス
の存在は、たとえば細胞変性効果、免疫螢光法、
または血液吸収法によつて測定する。さらに詳し
くは、効果的に弱毒化されたワクチンが以下に示
す方法により製造される。牛胎児を準備し、大量
の一次腎臓細胞を調製する。数個のビンおよびカ
バーグラス培地を一次細胞から調製し、残つた一
次細胞に0.5％LAH、10％成年牛血清、および10
％ジメチルスルホキシドを含有するアールの平衡
塩溶液を加えて凍結する。このビンおよびカバー
グラス培地にここに記したごときウイルス含有溶
液を接種し、37℃で培養する。数個の螢光細胞が
カバーグラス培地上で観察されたならば、同じ胎
児からの凍結一次細胞を解凍し、標準方法により
単層培地を形成させる。感染させたこの一次細胞
培地からの液体をこれらの二次細胞培地で継代培
養する。接種してから６〜７日後に、二次細胞培
地からの液体を別の二次細胞培地に接種するのに
用いる。１代から15代の継代培養においては、前
記のごとく液体２mlを８オンスビンに接種するた
めに用いる。15代から25代の継代培養において
は、液体２mlをビン中の保存培地に加える。25代
継代後、各ビン中の保存培地に１mlの接種物を加
える。コロナウイルス状因子を５代〜20代組織培
地中で継代培養したら、二次細胞からの細胞で一
連の連続的継代培養を始める。各継代において、
細胞はごく一部のみが感染し、他の未感染細胞は
二次培養して以後の高次継代培養水準の細胞とす
る。この種の細胞培地は継代細胞培地と称され
る。継代細胞培地でウイルスの連続的二次培養継
代を続けることによつて、適当な細胞−ウイルス
系が形成される。二次細胞培地にてビールスを５
〜20回継代培養した後、ウイルスを継代細胞培地
で５〜40回またはそれ以上継代培養すれば、効果
的に弱毒化されたコロナウイルス状ウイルスワク
チンを得る。ウイルスの継代培養における培養期
間は継代回数の増加につれて減少し、そして高次
継代細胞または細胞系上での継代培養は２〜７日
間で行うことができる。各継代は細胞変性効果が
起こるまで行う。ワクチンは牛胎児の腎臓または
牛その他由来の他の組織または細胞系からの細胞
系、たとえば牛の肺、牛鼻介骨細胞系またはブタ
腎臓細胞または細胞系を用い、該組織培地に約37
℃で適当なウイルス力価が得られるまで培養し、
ついでウイルスを採集することにより製造するこ
とができる。102〜106.5、好ましくは104〜106の
力価が得られる。ワクチンは液状でもまたは凍結
乾燥したものでも用いることができる。後の使用
時において、蒸留水のごとき減菌稀釈剤で稀釈し
て復元させることができる。 好適な生成物は二次細胞上で12回、ついで自体
が９〜27回継代培養された細胞上で15回継代培養
して弱毒化したウイルスよりなつている。全部の
継代培養水準はかくして27回である。35回まで継
代培養されたワクチンが製造されている。 さらに、効果的な不活性化ワクチンがコロナウ
イルス状因子を不活性化して製造される。通常、
これはまずこの因子を前記のごとく適当な力価が
得られるまで牛胎児腎臓細胞上で培養して製造さ
れる。力価は前記の範囲内でできるだけ高くすべ
きである。いかなる細胞継代培養水準にあるウイ
ルスはもちろん、非弱毒化ウイルスでさえも、用
いることができる。ついでウイルスはそれを当技
術者に既知の、ホルマリン、β−プロピオラクト
ン、紫外線、または熱のごとき、不活性化剤また
は手段を用いて20〜40℃で、ウイルスを効果的に
不活性化するような時間および濃度で処理して不
活性化せしめる。これらの詳細は当技術者に既知
である。補助薬を抗原性の促進のために加えるこ
とができる。補助薬は当技術者に既知のいずれで
もよく、たとえば水酸化アルミニウムゲル、カリ
ウム明ばん、アルギン酸塩、または油基剤あるい
は鉱油または有機物油のごとき他の補助薬が挙げ
られる。 不活性化ワクチンを製造する代表的な方法は以
下の通りである。前記のごとき27回継代培養水準
にあるコロナウイルス状因子を用いる。ホルマリ
ンを0.2％濃度になるまでウイルス含有培養液に
加える。つぎにこれらの液体を１〜２日間37℃に
て放置する。この不活性化ウイルスに水酸化アル
ミニウムゲル補助薬を10％濃度まで加える。PHを
水酸化アルミニウムで約7.2に調節する。 この弱毒化ワクチンは102〜106.5TCID／mlを
含有した１〜５mlの投与量にて子牛、好ましくは
新生子牛に投与して有毒なウイルスに対する免疫
を付与することができる。不活性化ワクチンは生
産30〜90日前の妊娠牛または出産後できるだけ早
い新生子牛に対し１〜５mlの投与量で非経口的に
投与され、コロナウイルス状因子に対する保護効
果を付与する。 さらに、好ましくは不活性化したコロナウイル
スと他のいずれかのウイルス因子からなる複合ワ
クチンが子牛または成牛に免疫を付与するのに用
いられる。好ましい複合例としては不活性化され
たコロナウイルスおよびレオウイルスが挙げら
れ、これらの両者ともに非弱毒化または弱毒化生
ウイルスを化学薬剤、放射線または熱により不活
性化して製造される。また、コロナウイルスは牛
アデノウイルス、生下痢ウイルス、またはエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）あるいはクロ
ストリジウム層の菌（Clostridia Sp.）のごとき
他の牛病原体と複合させることができる。 コロナウイルスおよびレオウイルスを含有する
複合ワクチンは両方の不活性化ウイルス因子の等
量を混合して製造する。ついで、これにホルマリ
ンを0.2％濃度および水酸化アルミニウムゲルを
10容量％添加する。このワクチンの投与は妊娠牛
に対し非経口的に１〜５mlの投与とする。この複
合ワクチンは子牛ならびに妊娠牛のいずれにも投
与できる。複合ワクチンは、初乳および／または
牛乳抗体を経由して、新生子牛に対し保護効果を
付与する。さらに、両因子に対する保護効果は妊
娠牛を不活性化レオウイルス状ワクチンで免疫を
付与し、ついで弱毒化コロナウイルス状ワクチン
を子牛に投与することにより行うことができる。
また、両因子に対する保護効果は妊娠牛を不活性
化コロナウイルス状ワクチンで免疫を付与し、つ
いで弱毒化レオウイルス状ワクチンを子牛に投与
することによつても与えることができる。さら
に、弱毒化コロナウイルスおよびレオウイルス状
因子を含有せしめた複合ワクチンは妊娠牛に投与
することができる。 種々の細胞培地継代培養水準で製造されたワク
チンを生後約７時間のグノトビオシスの子牛に投
与し、その後、子牛を有毒なウイルス（感染牛の
下痢便から採取した毒力コロナウイルス状ウイル
ス）で攻撃して弱毒化ウイルスワクチンの効力を
試験した。これらの試験結果を第１表および第２
表に示す。 二次牛胎児腎臓細胞上でウイルスを14回継代培
養して得た細胞培養液10mlを経口接種した子牛１
は下痢を起こし、ついで回復した。生後９日目
に、この子牛に下痢便（有毒ウイルス）10mlを
PBS20mlに加えたものを経口接種したが、発病し
なかつた。二次牛胎児腎臓細胞上でウイルスを15
回継代培養したもの10mlを子牛２に接種したが下
痢を起こさず、そして有毒ウイルスの接種で攻め
られた後でも発病しなかつた。二次牛胎児腎臓細
胞上で16回継代培養したウイルス10mlを子牛３お
よび４に接種すれば弱い下痢発病がみられた。子
牛３を下痢開始後しばらくしてから殺し、小腸お
よび結腸の切片をコロナウイルス状因子に対する
配合体で染色すれば、腸絨毛および結腸の上皮に
免疫螢光が認められた。子牛４を生後６日目に下
痢便中の有毒ウイルスを接種したが、発病しなか
つた。二次牛胎児腎臓細胞上で19回継代培養した
ウイルス５mlを子牛６に経口接種すれば、下痢発
病した。高次継代牛胎児腎臓細胞上で少なくとも
５回継代培養したウイルスを13回〜25回継代培養
したもの５mlを12頭の子牛（No.７〜13およびNo.15
〜19）に経口接種したところ下痢発病せず、そし
て、子牛１８を除いて、有毒ウイルスを含む便を
経口接種した後でも発病しなかつた。 不活性化コロナウイルスおよびレオウイルスを
含有する複合ワクチンを２つの牧場（毒力コロナ
ウイルス状ウイルスで汚染された牧場）の成牛に
ついて試験した。このワクチンはホルマリンで不
活性化した27回継代培養したコロナウイルスおよ
びホルマリンで不活性化した201回継代培養（一
次牛腎臓および牛腎臓細胞系上）したレオウイル
スより製造した。この不活性化した各ウイルスを
等量ずつ互いに混合し、水酸化アルミニウムゲル
を10％添加した。 第１表および第２表の試験結果について表の説
明： Ｄ＝下痢発病、Ｎ＝異常なし、 ｂ＝ウイルスの継代培養回数は一次または二次細
胞上＋より高次の継代培養細胞上での継代の回
数。
コロナウイルス状因子に対するワクチンならびに
このワクチンの製法に関する。より詳しくは、本
発明は牛胎児の腎臓細胞中で連続継代培養により
コロナウイルス状ウイルスを弱毒化させる方法な
らびにそれによつて得られるワクチンに関する。
さらに、該コロナワクチン状因子を細胞培養地上
にて増殖させた後、不活性化するワクチンの製法
に関する。 新生子牛下痢（neonatal calf diarrhea：NCD
と略称する）の病原学的要因は複雑である。この
病気の原因としては、多種の細菌類が関係してお
り、たとえばバクテリア、菌類（fungi）、ミコプ
ラズマ（mycoplasma）、クラミデア
（chlamydia）およびウイルス類が挙げられる。
特に列挙されるウイルス類としては、牛の下痢ウ
イルス、伝染性牛鼻気管炎ウイルス、アデイウイ
ルス、エンテロウイルスおよびヘーデン
（HADEN）ウイルスが挙げられる。NCDの病因
学的因子として報告されている他のウイルス類と
しては、牛肺炎腸炎ウイルスおよびNCDウイル
スといわれるレオウイルス状因子がある。この
NCDレオウイルス状因子に対して有効なワクチ
ンの製法については、米国特許出願第197520号、
1971年11月10日出願、に記されている。 レオウイルス状因子から製造されたワクチンの
野外試験の過程において、西部ネブラスカのある
動物群において牛の病気の不適当な抑制結果が認
められた〔Vet.Med.／Small Anim.Clin.，67
（２）、173頁（1972）〕。代表例として、生後24時
間内にこのワクチンを投与された牛において、な
お牛が５〜20日に達したときでも数群に下痢の発
生がみられた。これらの牛の下痢便を螢光抗体法
を用いてレオウイルス状ウイルスの検査をした
が、陰性であつた。 生後７〜12日に達したときに牛の90％が感染し
たワクチンの投与群の一つにおける下痢便を子宮
切開（セザーリアン：Caesarean）で生まれ、初
乳を与えていない子牛に十二指腸注入により接種
した。この子牛は下痢を起こし、その下痢便から
無バクテリアの便液を調製し、ついでこれをグ
ノトビオシスの（gnotobictie）子牛に経口接種
した。これらの子牛は下痢を発生し、この際下痢
の原因として他のウイルス因子の存在が考慮され
た。実験子牛からの下痢便を電子顕微鏡試験に付
せば、コロナウイルス状因子が観察された。同種
のウイルス粒体が野外試験に付したワクチン投与
群およびワクチン不投与群の双方の下痢便中に認
められた。この新しいコロナウイルス状因子は精
製され、そしてきわめて詳細に同定された。本発
明者はこのコロナウイルス状ウイルスは増殖可能
であり、かつ細胞培養培地にて有効なワクチンに
変化可能であることを発見し、さらに有効なワク
チンがこのウイルスを細胞培養培地で増殖させた
のち、不活性化させて製造可能なことを発見し
た。よつて、本発明はこの新しいコロナウイルス
状因子に対して有効なワクチンならびにこのワク
チンの製造および投与方法に関するものである。
この因子の精製および特徴についてはAm.J.Vet.
Res.，33巻、1147〜1156頁（1972）に記載され
ている。 コロナウイルス状因子の精製： 便試料を西部ネブラスカの19の牧場動物群の下
痢症子牛から採取した。12〜19群の子牛にあらか
じめNCDレオウイルス状ウイルスワクチンを経
口接種し、一方その他の群の子牛はワクチン不投
与とした。下痢症子牛からの便塗〓標本をNCD
ウイルス試験のために免疫螢光配合体で染色し
〔ネブラカス州立大、Agri.Exper.Sta.Res.
Bull.233頁（1969）〕、そしてNCDウイルス陰性の
試料のみを試験に供した。牧場で自然感染した子
牛および人工的感染させた子牛から採取した下痢
便材料をウイルス精製に着手するまで−20℃〜−
60℃で貯蔵した。 シヨ糖濃度勾配（グレデイエント）液を各種調
製し、使用前に直線勾配を形成せしめるために一
液４℃にて放置した。各勾配液は蒸留脱イオン水
１ml当りシヨ糖をそれぞれ400，300，200および
100mg含む８mlよりなつている。濃度の高い順に
各液を2.5×8.9cmのニトロセルロース製遠心管に
入れた。 すべてのウイルス精製操作は４℃で行い、医療
用遠心法および超遠心法を使用した。 下痢便材料を脱イオン水３容と混合し、30分間
5000Gで遠心分離した。ついでこの上澄液を３時
間25000rpmにてタイプ30回転子（ローター）中
で遠心分離した。得た塊状物（ペレツト）を５％
（ｗ／ｖ）シヨ糖溶液中で30秒間超音波処理して
分散させた。この懸濁液を粗製ウイルス懸濁液と
いう。 粗製ウイルス懸濁液５mlを管中の勾配液上に注
加成層させ、25000rpmにて２時間SW27回転子中
で遠心分離した。遠心分離後、各帯層を光散乱法
により位置確認した。各帯層中の物質を遠心管の
頂部よりプロピペツトをそなえたパスツールピペ
ツトを用いて捕集した。各試料を、電子顕微鏡検
査を行う前に１％酢酸アンモニウム溶液に対して
透析した。ウイルス（液面から６cmにある帯層か
らの半精製のウイルス）を含むフラクシヨンをシ
ヨ糖濃度勾配遠心法または塩化セシウム
（CsCl）勾配遠心法によりさらに精製する。 半精製ウイルス調製物を上記したシヨ糖濃度勾
配遠心法の繰返しによつてさらに精製した。再び
帯層を位置確認し、液面から6.0cmにある帯層を
捕集し、１％酢酸アンモニウムに対して、透析す
れば、精製したウイルスを得る。 半精製ウイルス調製物の同濃度勾配遠心処理を
30％溶液（CsCl 15ｇ＋脱イオン水35ml）で開始
して行つた。この溶液（４ml）をニトロセルロー
ス遠心管に分取し、つぎに各管にウイルスの懸濁
液1.4mlを注加した。SW65回転子を用い
60000rpmにて18時間遠心分離すれば、この時点
で完全な平衝に達している。ウイルスが存在して
いる帯層におけるCsClの屈折率をTSメーターに
より測定する。液面から2.9cmの帯層を捕集し、
１％酢酸アンモニウム溶液に対して透析して精製
ウイルスを得る。 また、前記した粗製ウイルス懸濁液（15ml）を
4.2×42cmのゲルカラム（Sepharose 2B：
Pharmacia Fine Chemicals，Inc.、ピスカタウ
エイ、ニユージヤージー洲）上にてゲル過に付
して分別した。カラムはあらかじめ0.9％NaClで
平衝させておき、この食塩溶液で展開した。流速
6.0ml／時間で行つた。５mlのフラクシヨンを捕
集し、吸光度を260μｍで分光光度計により測定
した。各ピークの物質をそれぞれ合併し、つぎに
限外過により別々に濃縮する。 また、試験用子牛からの下痢便材料からウイル
スを調製するのに簡略化した方法も適用される。
便材料を直接3400Gにて30分間遠心分離する。上
澄液部分の一部をジクロロジフルオロメタンで２
回抽出する。水溶液層（５ml）および未処理上澄
液（５ml）材料を前記のごときシヨ糖濃度勾配遠
心法に付する。 濃度勾配遠心分離法により濃縮されたウイルス
は電子顕微鏡による研究に用いられ、また免疫螢
光分析用の配合体調製のためのウサギの免疫用抗
原として用いられる。生後約６ケ月の白色家ウサ
ギの必臓から採血（14ml）し、ついで抗原0.4ml
および完全フロインド捕助液0.6mlの混合液を１
カ所当り0.25mlにて４カ所に筋肉内注射した。接
種５週間後に、血液40mlを心臓穿刺により採血す
る。フルオレセインでラベルしたガンマグロブリ
ンを既知方法（Proc.U.S.Livestoek San.Assn.
，1968年10月、139〜144頁）により接種後の血清
から調製する。 コロナウイルス状因子の存在は上記で調製した
配合体を用いる免疫螢光法により感染した腸にお
いて検出可能である。コロナウイルス状因子に対
するこの配合体の特異性は以下に示す試験法によ
り明確に示される。コロナウイルス状因子に感染
させた下痢症子牛の腸の切片を配合体にて染色す
ると絨毛細胞の螢光が観察された。同じ子牛の腸
は前記したレオウイルス状因子に対する配合体で
染色した場合には螢光を示さなかつた。レオウイ
ルス状ウイルスに感染した下痢症子牛の腸の切片
はレオウイルス状因子に対する配合体で染色した
場合は陽性を示し、コロナウイルス状因子に対す
る配合体で染色した場合は陰性を示した。正常な
グノトビオシスの子牛の腸の切片はコロナウイル
ス状因子に対する配合体で染色した場合には螢光
を示さなかつた。 ウイルスの形態学： 勾配濃度超遠心分離精製法により得られるウイ
ルス含有帯層を電子顕微鏡により検査する。帯層
からの小滴を、あらかじめコロジオンで被覆しか
つ蒸着カーボンで補強した200メツシユの銅格子
に加える。これらの小滴は試験中の帯層の光散乱
度に従つて３〜25分間格子上に残留させる。過剰
の液体を紙で吸い取り、ついでモリブデン酸バ
ナジウム−リンタングステン酸溶液の小滴を格子
上に加える。この染料はその過剰量を吸取紙とし
ての液で除去する前、１〜1.5分間にわたり格
子上に蒸留させる。 試料は倍率32000倍またはそれ以上の性能をも
つ電子顕微鏡により検査する。寸法測定は試料の
電子顕微鏡写真の寸法分析ならびに機器のセツト
を変えずに試料の電子顕微鏡写真撮影の直後にと
つた回析格子レプリカにより行う。 完全なウイルス粒体の寸法は同じ顕微鏡写真に
おいて107〜160μｍの範囲にあり、そしてコロナ
ウイルスに見られるものと類似の表面突起を有し
ていた。電子顕微鏡検査で測定されたと同様に、
表面突起を包含した粒体の平均寸法は126μｍで
あつた。核キヤプシド（nueleocapsid）は多形性
であり、寸法および形状は円形ないし長円形に変
化していた。キヤプシドの外皮は外縁（fringe）
が失なわれると特に明瞭となる。外縁の巾は最大
23μｍまで変化する。良好に保持された粒体の表
面突起は花弁形をなし、細長い莖状部により粒体
に結合され、そして長さは平均11μｍである。 本発明に記したコロナウイルス状因子は新生子
牛の子牛の病原学的要因として証明され、あるい
は提案されている他種のウイルスからは寸法およ
び形態学的特徴に基いて容易に識別される。ここ
に記したコロナウイルス状因子はエンテロウイル
ス、牛−肺炎−腸炎ウイルス、牛下痢ウイルス、
新生子牛下痢ウイルス（イオ状）、およびヘーデ
ンウイルスとは異なつた形態学的特徴を有し、こ
れらよりも大型である。この新しい因子は牛伝染
性鼻気管炎ウイルスより小型でその代表的でその
代表的な形態学的特徴を欠いている。精製したコ
ロナウイルス状因子の浮揚性密度（buoyant
density）はCsClを用いれば1.24であり、一方レ
オウイルス状因子は浮揚性密度1.359である
〔Can.J.Comp.Med.，35頁（1971）〕。 コロナウイルス状因子の生理学的作用はまたレ
オ状ウイルスの作用とは異なる。レオウイルス状
因子をノトビオシスの牛に経口接種した後の潜伏
期間は13.5〜14時間の短期であり得るが、一方コ
ロナウイルス状因子について認められる最小潜伏
期間は18時間である。さらに、レオウイルスに感
染したノトビオシスの牛は５〜８時間下痢症状を
示し、ついで下痢開始24時間後には正常に復す
る。これに反し、コロナウイルス状因子に感染し
たノトビオシスの牛は下痢が激化し、５日間また
はそれ以上の日数にわたり下痢を続け、あるいは
下痢開始後２〜３日後に死亡することすらある。 ワクチンの製法および使用法： 本発明を実施するに有効な方法を以下に例によ
り説明するが、これらは本発明を何ら限定するも
のではない。 前記の感染した牛から得られるコロナウイルス
状因子は牛胎児腎臓細胞上で増殖する。また、こ
のウイルスは牛その他由来の組識または細胞系か
らの細胞上でも増殖しうる。既知方法により単層
の細胞培地を調製し、コロナウイルス状因子を接
種する。通常、単層培地をハンクス（Hanks）の
平衡塩溶液で洗浄し、ついでウイルス接種物を加
え、数時間、通常２時間、約37℃で吸収させる。
0.5％ラクトアルブミン水解物（LAHと略称す
る）、0.1％イースト抽出物、および１ml当りペニ
シリン100単位ならびにストレプトマイシン200μ
ｇを含有するアール（Earle）の平衡塩溶液の保
存培地を加え、ついで30〜40℃、好ましくは約37
℃、で２〜10日間培養する。ウイルスを、たとえ
ば細胞から上澄液を流出させて採集する。ウイル
ス接種物はコロナウイルス感染牛から採取した便
またはコロナウイルス状ウイルス培地からの培地
液でさしつかえない。便は採取したままあるいは
リン酸塩緩衝液（PH7.2）稀釈して、これを
1000Gで20分間遠心分離し、上澄液を接種物とし
て用いることができる。 他の保存培地、たとえばラクトアルブミン水解
物含有の変形イーグル（Eagle）培地を用いるこ
とができる。培地の選択は当技術者の常識に従え
ばよい。 効果的に弱毒化されたコロナ状ウイルスワクチ
ンは接種された牛が有毒なウイルスに攻撃された
ときに病気にかからないように十分な回数牛胎児
腎臓細胞中で精製ウイルスを継代培養して得られ
る。通常はウイルスを５〜60回継代培養する必要
があり、この継代は一次または二次細胞（一次細
胞は１回継代されたもの）あるいは高次継代細胞
または細胞系にて行う。10回以上継代培養した高
次継代細胞は細胞系と考えてよい。好ましい方法
には一次または二次細胞と高次継代細胞または細
胞系上での継代培養の組合せがある。ウイルス力
価（titer）は標準方法により測定する。たとえ
ば、ウイルス稀釈物を接種された細胞を牛胎児腎
臓細胞を入れた管中で５日間培養する。ウイルス
の存在は、たとえば細胞変性効果、免疫螢光法、
または血液吸収法によつて測定する。さらに詳し
くは、効果的に弱毒化されたワクチンが以下に示
す方法により製造される。牛胎児を準備し、大量
の一次腎臓細胞を調製する。数個のビンおよびカ
バーグラス培地を一次細胞から調製し、残つた一
次細胞に0.5％LAH、10％成年牛血清、および10
％ジメチルスルホキシドを含有するアールの平衡
塩溶液を加えて凍結する。このビンおよびカバー
グラス培地にここに記したごときウイルス含有溶
液を接種し、37℃で培養する。数個の螢光細胞が
カバーグラス培地上で観察されたならば、同じ胎
児からの凍結一次細胞を解凍し、標準方法により
単層培地を形成させる。感染させたこの一次細胞
培地からの液体をこれらの二次細胞培地で継代培
養する。接種してから６〜７日後に、二次細胞培
地からの液体を別の二次細胞培地に接種するのに
用いる。１代から15代の継代培養においては、前
記のごとく液体２mlを８オンスビンに接種するた
めに用いる。15代から25代の継代培養において
は、液体２mlをビン中の保存培地に加える。25代
継代後、各ビン中の保存培地に１mlの接種物を加
える。コロナウイルス状因子を５代〜20代組織培
地中で継代培養したら、二次細胞からの細胞で一
連の連続的継代培養を始める。各継代において、
細胞はごく一部のみが感染し、他の未感染細胞は
二次培養して以後の高次継代培養水準の細胞とす
る。この種の細胞培地は継代細胞培地と称され
る。継代細胞培地でウイルスの連続的二次培養継
代を続けることによつて、適当な細胞−ウイルス
系が形成される。二次細胞培地にてビールスを５
〜20回継代培養した後、ウイルスを継代細胞培地
で５〜40回またはそれ以上継代培養すれば、効果
的に弱毒化されたコロナウイルス状ウイルスワク
チンを得る。ウイルスの継代培養における培養期
間は継代回数の増加につれて減少し、そして高次
継代細胞または細胞系上での継代培養は２〜７日
間で行うことができる。各継代は細胞変性効果が
起こるまで行う。ワクチンは牛胎児の腎臓または
牛その他由来の他の組織または細胞系からの細胞
系、たとえば牛の肺、牛鼻介骨細胞系またはブタ
腎臓細胞または細胞系を用い、該組織培地に約37
℃で適当なウイルス力価が得られるまで培養し、
ついでウイルスを採集することにより製造するこ
とができる。102〜106.5、好ましくは104〜106の
力価が得られる。ワクチンは液状でもまたは凍結
乾燥したものでも用いることができる。後の使用
時において、蒸留水のごとき減菌稀釈剤で稀釈し
て復元させることができる。 好適な生成物は二次細胞上で12回、ついで自体
が９〜27回継代培養された細胞上で15回継代培養
して弱毒化したウイルスよりなつている。全部の
継代培養水準はかくして27回である。35回まで継
代培養されたワクチンが製造されている。 さらに、効果的な不活性化ワクチンがコロナウ
イルス状因子を不活性化して製造される。通常、
これはまずこの因子を前記のごとく適当な力価が
得られるまで牛胎児腎臓細胞上で培養して製造さ
れる。力価は前記の範囲内でできるだけ高くすべ
きである。いかなる細胞継代培養水準にあるウイ
ルスはもちろん、非弱毒化ウイルスでさえも、用
いることができる。ついでウイルスはそれを当技
術者に既知の、ホルマリン、β−プロピオラクト
ン、紫外線、または熱のごとき、不活性化剤また
は手段を用いて20〜40℃で、ウイルスを効果的に
不活性化するような時間および濃度で処理して不
活性化せしめる。これらの詳細は当技術者に既知
である。補助薬を抗原性の促進のために加えるこ
とができる。補助薬は当技術者に既知のいずれで
もよく、たとえば水酸化アルミニウムゲル、カリ
ウム明ばん、アルギン酸塩、または油基剤あるい
は鉱油または有機物油のごとき他の補助薬が挙げ
られる。 不活性化ワクチンを製造する代表的な方法は以
下の通りである。前記のごとき27回継代培養水準
にあるコロナウイルス状因子を用いる。ホルマリ
ンを0.2％濃度になるまでウイルス含有培養液に
加える。つぎにこれらの液体を１〜２日間37℃に
て放置する。この不活性化ウイルスに水酸化アル
ミニウムゲル補助薬を10％濃度まで加える。PHを
水酸化アルミニウムで約7.2に調節する。 この弱毒化ワクチンは102〜106.5TCID／mlを
含有した１〜５mlの投与量にて子牛、好ましくは
新生子牛に投与して有毒なウイルスに対する免疫
を付与することができる。不活性化ワクチンは生
産30〜90日前の妊娠牛または出産後できるだけ早
い新生子牛に対し１〜５mlの投与量で非経口的に
投与され、コロナウイルス状因子に対する保護効
果を付与する。 さらに、好ましくは不活性化したコロナウイル
スと他のいずれかのウイルス因子からなる複合ワ
クチンが子牛または成牛に免疫を付与するのに用
いられる。好ましい複合例としては不活性化され
たコロナウイルスおよびレオウイルスが挙げら
れ、これらの両者ともに非弱毒化または弱毒化生
ウイルスを化学薬剤、放射線または熱により不活
性化して製造される。また、コロナウイルスは牛
アデノウイルス、生下痢ウイルス、またはエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）あるいはクロ
ストリジウム層の菌（Clostridia Sp.）のごとき
他の牛病原体と複合させることができる。 コロナウイルスおよびレオウイルスを含有する
複合ワクチンは両方の不活性化ウイルス因子の等
量を混合して製造する。ついで、これにホルマリ
ンを0.2％濃度および水酸化アルミニウムゲルを
10容量％添加する。このワクチンの投与は妊娠牛
に対し非経口的に１〜５mlの投与とする。この複
合ワクチンは子牛ならびに妊娠牛のいずれにも投
与できる。複合ワクチンは、初乳および／または
牛乳抗体を経由して、新生子牛に対し保護効果を
付与する。さらに、両因子に対する保護効果は妊
娠牛を不活性化レオウイルス状ワクチンで免疫を
付与し、ついで弱毒化コロナウイルス状ワクチン
を子牛に投与することにより行うことができる。
また、両因子に対する保護効果は妊娠牛を不活性
化コロナウイルス状ワクチンで免疫を付与し、つ
いで弱毒化レオウイルス状ワクチンを子牛に投与
することによつても与えることができる。さら
に、弱毒化コロナウイルスおよびレオウイルス状
因子を含有せしめた複合ワクチンは妊娠牛に投与
することができる。 種々の細胞培地継代培養水準で製造されたワク
チンを生後約７時間のグノトビオシスの子牛に投
与し、その後、子牛を有毒なウイルス（感染牛の
下痢便から採取した毒力コロナウイルス状ウイル
ス）で攻撃して弱毒化ウイルスワクチンの効力を
試験した。これらの試験結果を第１表および第２
表に示す。 二次牛胎児腎臓細胞上でウイルスを14回継代培
養して得た細胞培養液10mlを経口接種した子牛１
は下痢を起こし、ついで回復した。生後９日目
に、この子牛に下痢便（有毒ウイルス）10mlを
PBS20mlに加えたものを経口接種したが、発病し
なかつた。二次牛胎児腎臓細胞上でウイルスを15
回継代培養したもの10mlを子牛２に接種したが下
痢を起こさず、そして有毒ウイルスの接種で攻め
られた後でも発病しなかつた。二次牛胎児腎臓細
胞上で16回継代培養したウイルス10mlを子牛３お
よび４に接種すれば弱い下痢発病がみられた。子
牛３を下痢開始後しばらくしてから殺し、小腸お
よび結腸の切片をコロナウイルス状因子に対する
配合体で染色すれば、腸絨毛および結腸の上皮に
免疫螢光が認められた。子牛４を生後６日目に下
痢便中の有毒ウイルスを接種したが、発病しなか
つた。二次牛胎児腎臓細胞上で19回継代培養した
ウイルス５mlを子牛６に経口接種すれば、下痢発
病した。高次継代牛胎児腎臓細胞上で少なくとも
５回継代培養したウイルスを13回〜25回継代培養
したもの５mlを12頭の子牛（No.７〜13およびNo.15
〜19）に経口接種したところ下痢発病せず、そし
て、子牛１８を除いて、有毒ウイルスを含む便を
経口接種した後でも発病しなかつた。 不活性化コロナウイルスおよびレオウイルスを
含有する複合ワクチンを２つの牧場（毒力コロナ
ウイルス状ウイルスで汚染された牧場）の成牛に
ついて試験した。このワクチンはホルマリンで不
活性化した27回継代培養したコロナウイルスおよ
びホルマリンで不活性化した201回継代培養（一
次牛腎臓および牛腎臓細胞系上）したレオウイル
スより製造した。この不活性化した各ウイルスを
等量ずつ互いに混合し、水酸化アルミニウムゲル
を10％添加した。 第１表および第２表の試験結果について表の説
明： Ｄ＝下痢発病、Ｎ＝異常なし、 ｂ＝ウイルスの継代培養回数は一次または二次細
胞上＋より高次の継代培養細胞上での継代の回
数。
【表】
【表】
【表】
以下に本発明の実施態様を列記する。
１ コロナウイルス状牛下痢ウイルスを該ウイル
スの生育を維持する組織培地にて、該ウイルス
を新生子牛に接種した場合に有毒ウイルスの攻
撃に対して発病を抑制せしめるまで５〜約60回
継代接種することを特徴とするコロナウイルス
状牛下痢ウイルスの弱毒化方法。 ２ 前記１において、継代培養を牛胎児腎臓細胞
の組織培地にて30〜40℃で行う方法。 ３ 前記２において、全継代培養回数が10〜40回
であり、そのうち５〜10回の継代培養を一次ま
たは二次牛胎児腎臓細胞培地にて行ない、残余
の継代培養を高次継代培養した牛胎児腎臓細胞
培地にて行なう方法。 ４ 前記１の方法により製造した、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ５ 前記２の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ６ 前記３の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ７ コロナウイルス状牛下痢ウイルスを牛胎児腎
臓細胞培地で、該ウイルスの大量を増殖させる
に十分な期間増殖せしめ、ついで生成するウイ
ルス性物質を採集することを特徴とする弱毒化
したコロナウイルス状牛下痢ウイルスの大量製
造方法。 ８ 前記７の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有させた牛
下痢ワクチン。 ９ コロナウイルス状牛下痢ウイルスを不活性化
し、これを補助薬に配合することを特徴とする
不活性化コロナウイルス状牛下痢ワクチンの製
造方法。 10 前記９において、不活性化剤がホルマリンで
ある方法。 11 前記９の方法により製造され、不活性化した
コロナウイルス状牛下痢ウイルスおよびその補
助薬を含有させた不活性化コロナウイルス状牛
下痢ワクチン。 12 不活性化コロナウイルス状牛下痢ウイルスお
よび牛の病原に対し効果的な他の免疫剤を含有
させた複合牛下痢ワクチン。 13 不活性化コロナウイルス状牛下痢ウイルスお
よび不活性化レオウイルス状牛下痢ウイルスを
含有させた複合牛下痢ワクチン。 14 前記１に記したワクチンを新生牛に経口投与
することを特徴とする、コロナウイルス状牛下
痢ウイルスにより起こされる新生牛下痢に対す
る新生牛の免疫方法。 15 前記９に記したワクチンを新生牛出産前に成
年の妊娠牛に非経口的投与することを特徴とす
る、コロナウイルス状牛下痢ウイルスにより起
こされる新生牛下痢に対する新生牛の免疫方
法。 16 前記13に記した複合ワクチンを新生牛出産前
に成年の妊娠牛に非経口的投与することを特徴
とする、コロナウイルス状またはレオウイルス
状牛下痢ウイルスにより起こされる新生牛下痢
に対する新生牛の免疫方法。
スの生育を維持する組織培地にて、該ウイルス
を新生子牛に接種した場合に有毒ウイルスの攻
撃に対して発病を抑制せしめるまで５〜約60回
継代接種することを特徴とするコロナウイルス
状牛下痢ウイルスの弱毒化方法。 ２ 前記１において、継代培養を牛胎児腎臓細胞
の組織培地にて30〜40℃で行う方法。 ３ 前記２において、全継代培養回数が10〜40回
であり、そのうち５〜10回の継代培養を一次ま
たは二次牛胎児腎臓細胞培地にて行ない、残余
の継代培養を高次継代培養した牛胎児腎臓細胞
培地にて行なう方法。 ４ 前記１の方法により製造した、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ５ 前記２の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ６ 前記３の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有してなる
牛下痢ワクチン。 ７ コロナウイルス状牛下痢ウイルスを牛胎児腎
臓細胞培地で、該ウイルスの大量を増殖させる
に十分な期間増殖せしめ、ついで生成するウイ
ルス性物質を採集することを特徴とする弱毒化
したコロナウイルス状牛下痢ウイルスの大量製
造方法。 ８ 前記７の方法により製造され、弱毒化したコ
ロナウイルス状牛下痢ウイルスを含有させた牛
下痢ワクチン。 ９ コロナウイルス状牛下痢ウイルスを不活性化
し、これを補助薬に配合することを特徴とする
不活性化コロナウイルス状牛下痢ワクチンの製
造方法。 10 前記９において、不活性化剤がホルマリンで
ある方法。 11 前記９の方法により製造され、不活性化した
コロナウイルス状牛下痢ウイルスおよびその補
助薬を含有させた不活性化コロナウイルス状牛
下痢ワクチン。 12 不活性化コロナウイルス状牛下痢ウイルスお
よび牛の病原に対し効果的な他の免疫剤を含有
させた複合牛下痢ワクチン。 13 不活性化コロナウイルス状牛下痢ウイルスお
よび不活性化レオウイルス状牛下痢ウイルスを
含有させた複合牛下痢ワクチン。 14 前記１に記したワクチンを新生牛に経口投与
することを特徴とする、コロナウイルス状牛下
痢ウイルスにより起こされる新生牛下痢に対す
る新生牛の免疫方法。 15 前記９に記したワクチンを新生牛出産前に成
年の妊娠牛に非経口的投与することを特徴とす
る、コロナウイルス状牛下痢ウイルスにより起
こされる新生牛下痢に対する新生牛の免疫方
法。 16 前記13に記した複合ワクチンを新生牛出産前
に成年の妊娠牛に非経口的投与することを特徴
とする、コロナウイルス状またはレオウイルス
状牛下痢ウイルスにより起こされる新生牛下痢
に対する新生牛の免疫方法。
Claims (1)
- １ 非弱毒化コロナウイルス状牛下痢ウイルスを
ホルマリン、β．プロピオラクトン、紫外線照射
または熱により処理して不活性化し、これを、水
酸化アルミニウムゲル、カリウム明ばん、アルギ
ン酸塩、油基剤、鉱油および有機物油からなる群
から選ばれる補助薬と合することを特徴とする新
生子牛下痢ワクチンの製法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30217972A | 1972-10-30 | 1972-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5531058A JPS5531058A (en) | 1980-03-05 |
| JPS6124370B2 true JPS6124370B2 (ja) | 1986-06-10 |
Family
ID=23166611
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP48122156A Expired JPS5817169B2 (ja) | 1972-10-30 | 1973-10-30 | シンセイコウシゲリワクチンノ セイホウ |
| JP12675178A Granted JPS5531058A (en) | 1972-10-30 | 1978-10-13 | Manufacture of newly born calf diarrhea vaccine |
| JP56215939A Granted JPS57131726A (en) | 1972-10-30 | 1981-12-28 | Composite diarrhes vaccine for new born calf |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP48122156A Expired JPS5817169B2 (ja) | 1972-10-30 | 1973-10-30 | シンセイコウシゲリワクチンノ セイホウ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56215939A Granted JPS57131726A (en) | 1972-10-30 | 1981-12-28 | Composite diarrhes vaccine for new born calf |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (3) | JPS5817169B2 (ja) |
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| BE (1) | BE806568A (ja) |
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-
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-
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