JPS5817427B2 - 酵素電極 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の特異的触媒作用を受ける基質に対して
電気化学的活性を有し、基質の濃度を迅速かつ簡便に測
定することができ、しかも連続使用、繰り返し使用の可
能な高選択性の酵素電極を得ることを目的とする。

酵素の有する特異的触媒作用を工業的に利用する試みの
一例として、酵素反応系と電気化学反応系を結びつける
ことにより、酵素と特異的に反応する物質である基質の
濃度を検出することが試みられている。

酵素反応を電気化学反応として扱うには、例えは、酵素
反応系にこれと共役する適当なレドックス化合物を介在
させ、このレドックス化合物の酸化還元反応を電気化学
的に検出する方法が用いられている。

具体的には酵素との共役反応で還元（又は酸化）された
レドックス化合物を電気化学的に酸化（又は還元）し、
基質濃度をこのとき流れる電流として検出することがで
きる。

しかしながら、実際の食品、血液等の分析においては、
分析試料中に電極（集電体）上で直接酸化還元反応を受
けやすい成分の存在することも十分考えられる。

このような物質が存在すると、目的物質（基質）の分析
値（電流値）に正負の誤差を与える原因となる。

この一例としては、血液あるいは食品中に含まれる尿酸
やアスコルビン酸などがある。

例えは、グルコースオキノダーゼを用いた酵素電極でグ
ルコース濃度を測定する場合に、サンプル中に酸化され
やすい尿素やアスコルビン酸などが共存すると、電極反
応により得られる電流値としては、グルコースの酵素−
レドックス化合物共役反応に基づく電流に加えて、上記
共存物質の集電体−Ｌでの直接酸化に基づく電流も含ま
れることも考えられる。

そこで、実用的には、この様な共存妨害物質に対しても
高選択性を有する酵素電極か望まれる。

これらの点について種々検討した結果、選択性に優れた
酵素電極を見い出した。

本発明の特徴は、目的とする物質（基質）に選択的に作
用する酸化還元酵素の他に、いわめる共存妨害物質に対
して選択的に作用する酸化還元酵素をも用いて酵素電極
を構成し、かつ妨害物質を基質とする酵素が用いたレド
ックス化合物と実質上共役しない点にある。

すなわち、酸化還元酵素と、この酵素と接触しかつ共役
するレドックス化合物と、レドックス化合物と接触する
集電体とから構成した酵素電極の被検液側に、銅を活性
中心とし前記レドックス化合物と実質的に共役しない銅
酵素を有することを特徴とする。

具体的には、例えは尿酸が共存するサンプル中のグルコ
ース濃度を測定する場合には、基質酵素としてグ／ｌコ
ースオキシグーセを用い、妨害物質となる尿酸に対して
ウリカーゼを使用する。

共役レドックス化合物としてＰ−ベンゾキノンを用いた
場合以下の反応が進行する。

グルコース＋Ｐ−ペンゾキノン グルコースオキシダーセ グルコノラクトン 十ハイドロキノン （１） ハイドロキノンー−一→Ｐ−ベンゾキノン （２）（１
）式は酵素反応に基づくものであり、（２）式は（１）
式で生成したハイドロキノンを電極上で電気化学的に酸
化する反応である。

グルコース濃度は（２）式の反応で流れる電流値として
検出される。

妨害物質である尿酸に対しては、ウリカーゼの作用で以
下の反応が進行し、電気化学的酸化を受けにくいアラン
トインとなる。

尿酸＋０２＋２Ｈ２０ ウリカーゼ アラントイン＋Ｈ２Ｏ２＋ＣＯ２（３） 反応式（３）において、電子受容体として溶存酸素のか
わりにＰ−ベンゾキノンが作用する可能性はほとんどな
く、尿酸とＰ−ベンゾキノンの中にウリカーゼを添加し
ても酸化電流の増加は認められない。

これは、ウリカーゼがいわゆる銅酵素であり、活性中心
の銅の酸化還元電位が比較的高く、Ｐ−−−ベンゾキノ
ンと共役しにくいことによるものと考えられる。

このことはアスコルビン酸を基質トスるアスコルビン酸
オギシグーセやＰ−ジフェノールを基質とするＰ−ジフ
ェノールオキシダーゼなどの銅酵素についても同様であ
る。

一方、（１）の反応において酸素が存在すると電子受容
体として働き、以下の反応も同時に進行する。

グルコースオキングーセ グルコース＋０２ グルコノラクトン＋Ｈ２Ｏ２（４） しかしながら、酸素とＰ−ベンゾキノンの反応速度を比
較すると、Ｐ−ベンゾキノンの方が十分に大きいので、
グルコースに関しては反応（１）が大部分を占める。

マタ、（３） 、 （４）の反応で生成したＨ２０□の
一部が電極へ拡散し電気化学的に酸化されることも懸念
されるが、カーボンなどの不活性な物質を集電体として
用いることにより、Ｈ２Ｏ２の電極上での酸化を大幅に
１＠２．することができる。

μ上のごとく、分析の対象となる物質を基質とする酸化
還元酵素のみがレドックス化合物と共役し、妨害物質を
基質とする酵素が銅酵素であり、レドックス化合物と実
質上共役しない構成であるので、これら妨害物質に対す
る酵素電極の選択性は大幅に向上する。

酵素電極の構成要素である各種酵素やレドックス化合物
は溶液の状態で使用できることは熱論のことであるが、
電極の繰り返し使用、長期使用を可能なものとするには
、各構成要素の一部又は全部を固定化（不溶化）し、適
切な状態に一体化することが望ましい。

以下、本発明をその実施例により説明する。

第１図は本発明による酵素電極の一構成例を示す断面模
式図である。

図中、１はウリカーゼを固定してなる層、２はグルコー
スオキソダーゼ固定化層、３は例えはクロルアニル等の
レドックス化合物と集電体としてのグラファイトの混合
物層、４はグラファイト層である。

この酵素電極の製造法は以下の通りである。

まずグラファイトとクロルアニルを重量比で１：１の割
合で混合し、この混合物とグラファイトを直径約１０ｍ
７ｎの円板状にプレス成型する。

得られた成型体は第１図に示すごとくグラファイト層４
および表面付近の混合物の層３からなる。

この成型体上にｐＨ７、０のリン酸緩衝液に溶解したグ
ルコースオキングーセを展開し、乾燥の後グルタルアル
デヒドにより固定化する。

さらにウリカーゼを前記と同様にして固定する。

この場合、アルブミン等を併用すれは、固定化が容易に
なり、固定化に伴う酵素活性の低下を減することができ
る。

こうして得られた電極をＡとする。

さらに以下の各電極を比較のために用いた。

前記成型体上にグルコースオキシダーゼだけを固定化し
てなる電極をＢ、同じく前記成型体上にウリカーゼだけ
を固定化してなる電極をＣ１酵素を固定化していない前
記成型体よりなる電極をＤとする。

これらの電極を用いて第２図に示す測定系により、グル
コース、尿酸の濃度変化に対するＡ〜Ｄ各電極の応答特
性を測定した。

第２図において、５は記録計、６はポテンショスタット
、Ｉは飽和カロメル参照極、８は下端に電極９を装着し
た電極ホルダーであり、白金リードを介してポテンショ
スタットに接続されている。

１０は基質を含む緩衝液、１１は塩橋、１２は対極であ
る。

電極を液中に浸漬し、電極電位を参照極に対し＋０．４
０■に保持した後、グルコースあるいは尿酸を添加し、
このとき流れる電流の変化を測定した。

グルコースに対するＡ −Ｄ各電極の応答特性を第３図
に示す。

グルコースオキシダーゼを固定化した電極Ａ、Ｂではい
ずれも良好な応答が得られる。

これに対し電極Ｃ，Ｄでは、電流の増加はほとんど認め
られない。

第４図に尿酸に対する各電極の応答特性を示す。

ウリカーゼを固定化していない電極Ｂ、Ｄでは尿酸の直
接酸化による電流増加が大きいが、ウリカーゼを固定化
した電極Ａ。

Ｃでは電流増加が小さい。

すなわち、グルコースオキシダーゼに加えてウリカーゼ
を固定化することにより、酵素電極の選択性が大幅に向
上している。

分析対象となる基質の酵素としては、グルコースオキソ
ダーゼの他に、キサンチンオキングーセ、アミノ酸オキ
ンダーゼ、コレステロールオキ／ダーゼ、アルコールオ
キ／ダーゼなどを同様に使用することができる。

また、レドックス化合物と実質上共役しない銅酵素とし
て、アスコルビン酸オキンダーゼ、Ｐ−ジフェノールオ
キングーセを用いた場合にも前記と同様の効果が得られ
た。

またこれらの銅酵素を併用すれは、尿酸、アスコルビン
酸、Ｐ−ジフェノールのいずれに対しても効果が認めら
れた。

使用可能な共役レドックス化合物としては、既に述べた
Ｐ＝ベンゾキノン、クロラニルに限定されるものではな
い。

分析対象基質の酵素と共役し、これ以外に用いる銅酵素
と実質上共役しない性質を有する各種のキノン類縁化合
物、あるいは各種レドックスポリマーなど可溶性、不溶
性のレドックス化合物を用いることが可能である。

以上述べたように、本発明によりきわめて容易に優れた
性能を有する酵素電極を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による酵素電極の構成例を示す断面模式
図、第２図は測定系を示す図、第３図は各種電極のグル
コースに対する応答特性を示す図、第４図は各種電極の
尿酸に対する応答特性を示す図である。 １・・・・・・銅酵素固定層、２・・・・・・酸化還元
酵素固定層、３・・・・・・レドックス化合物と集電体
の混合層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸化還元酵素と、この酵素と接触しかつ前記酵素と
   共役するレドックス化合物と、前記レドックス化合物と
   接触する集電体とからなる酵素電極の被検液側に、銅を
   活性中心とし前記レドックス化合物と実質的に共役しな
   い銅酵素を有することを特徴とする酵素電極。 ２ レドックス化合物と共役する酵素が、グルコースオ
   キンダーゼ、キサンチンオキンダーゼ、コレステロール
   オキンダーゼ、アルコールオキシダーゼおよびアミノ酸
   オキシダーゼよりなる群から選ばれた酵素である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素電極。 ３ 銅酵素が、ウリカーゼ、アスコルビン酸オキンダー
   ゼおよびＰ−ジフェノールオキングーセよりなる群から
   選ばれた少なくとも１種である特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の酵素電極。