JPS58179357A - 定量分析装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は定量化学分析方法及び該方法に使用する装置に
関する本のであり、特にミルク、血液、尿その他のよう
な生物学的流体中の少量の化学物質の検出に特に適する
。

溶液中の化学物質濃度の定量法は多数知られている。こ
れらの方法の多くは長時間および面倒な操作を必要とし
、人為的誤差を生じ易い。

多くの方法は、検出すべき化学成分（分析成分）を反応
体と反応させて生成物を形成させる操作を含み、この操
作は消費された反応体の測定（例えば滴定）、生成した
生成物量の測定（例えば呈色反応生成物の吸光度測定）
ｔたは溶液から（例えば蒸留により）分離できる化学成
分もしくは反応生成物の測定等の工程が含まれる。

ラジオイムノアッセイで用すられるようなある種の定量
分析法においては、既知量のｍ織分析成分（例えば放射
性沃素、酵素、螢光、発色性もしくは螢光性分子等で標
識した分析成分）と、未知量の非標識分析成分とを競合
的に反応させ、未知溶液中の分析成分量を、反応もしく
は結合した分析成分と未反応もしくは結合しなかった分
析成分とを適当な方法で分離した後、テストで得られた
試料の放射活性もしくは他の特性と関連させることＫよ
りあるいは結合したもしくは結合しなかった識別可能な
標識分析成分−の特性により求めるようになっている。

それらの方法の多くは、色の変化（水素イオン濃度変化
に対して色の変化で反応する化学呈色成分を用いた時等
）、または濁度の変化（方法が固体反応生成物の形成を
伴なうとき等）を伴なう。

ある種の分析法は、流体（例えば空気）中の成分と接触
したとき色の変化を生じる反応体を含有するカラム中に
該流体を通過させることよりなる。例えば、米国特許第
４２８４５０６号＃ＪＭＪ書には、一定量のガスを指示
薬を含むガラスカートリッジに通過させ、カラム中で色
の変化を生じた指示薬の蓋に比例して検出すべきガス童
が判明するガスの分析技術が開示されている。

同様な装置は米国特許第４３１２．５２７号および第’
５，５４５，９５０号明細書にも記載されている。

分析分野においては迅速性、簡易性および人為的誤差の
少ない分析法を提供しようとする強い要望がなされてい
る。例えば、糖尿病診断のための血糖値の低置を測定す
るための簡単な迅速測定試薬は市販されている。しかし
ながら、そのような測定試薬は、しばしば比較的精度が
低い。一方において高感度という特徴を有し、しかも他
方において簡単、迅速かつ人為誤差が比較的小さいこと
を特徴とする化学成分の定量試験法を提供することが特
に望まれている。

本発明は、−態様において、流体例えば溶液中の化学的
に反応しうる物質（以下、分析成分という）の定量分析
用の装置を婢供するものである。この装置は、予め定め
られた数゛の連続的に隔置された反応帯を有し、該反応
帯を連続的に流体が流れるための流路を規定する流体浸
透性固体媒体を有する。この装置を用いるための流体の
典型は液体である。予め定められた量の反応体が前記反
応帯の固体媒体に結合しており、この結合反応体は分析
成分または分析成分の誘導体と反応して予め定められた
生成物を生じうるようになっている。本発明の装置は、
隔置された反応帯中で分析成分もしくはその誘導体、反
応体、または分析成分もしくはその誘導体と反応体との
反応により生じた予め定められた反応生成物の存在を検
出するだめの検出手段を更に有しても良い。さらに本発
明の装置は、微量の分析成分もしくはその誘導体、反応
体、または分析成分もしくはその誘導体と反応体との反
応により生じた予め定められた反応生成物の検出がされ
なくなるような手段を為してもよい。

本明細書中、「反応体」、「反応性」等の用語が分析成
分またはその誘導体と反応体との反応との関連において
使用されるときは、反応体が共有結合または水素結合あ
るいは他の任意の方法で、分析成分またはその誘導体と
結合して、予め定められた生成物を生成もしくは結果と
して生成する能力のことを意味する。即ち、これらの用
語は、最も広い意味で使用され、反応体が分析成分もし
くは分析成分誘導体と作用し、作用されまたは相互に作
用し合って分析成分もしくはその誘導体、反応体または
両者に検知可能な変化を与え、こうして反応生成物の生
成をもたらす全ての反応に用いられる。同様Ｋ「反応生
成物」とは分析成分もしくはその誘導体と反応体との反
応によって生じ、両者ｔｌｌｌｌ比検出る程度に異なる
任意の生成物を意味する。

「分析成分誘導体」とは、分析成分から酵導された本の
−で、好ましくは標識分析成分を意味し、即ち分析成分
とその標識された（　ｔａｇｇｅｄｔたは１ａｂｅｌｅ
ｄ　）誘導体との間の競合反応を含む分析方法で採用さ
れるような成分のことである。

本発明の装置においては、反応体は分析成分が通過する
連続的に隔置された反応帯中の浸透性固体媒体に結合さ
れている。この装置を採用して行なう方法は、分析成分
もしくはその誘導体が反応帯を通過する際に反応体と結
合し、反応帯内で分析成分ｔたはその誘導体の存在が色
の変化等で検出される様式で行なわれ氷。同様に、多少
変形した態様においては、分析成分もしくはその誘導体
は反応体と反応して、それ自体反応帯に結合保持される
生成物を形成し、次いで該生成物自体を検出してもよい
。これらの態様においては、上流の反応帯から始まって
、連続反応帯のいくつが分析成分もしくはその誘導体の
存在または反応体と分析成分本しくけその誘導体傘＃と
の反 応による生成物の存在を示すかを検出することにより、
非常に良好な精度をもって分析成分の濃度を決定するこ
とができる。他の態様においては、浸透性固体媒体に結
合している反応体自体が適当な検出手段によって検出可
能であ抄、分析成分もしくはその誘導体との反応によっ
て、そのような検出ができなくなるような態様であって
も良い。この方法においては、分析成分または分析成分
−分析成分誘導体混合物が連続反応帯を通過するＫっれ
、連続する反応帯中の反応体は分析成分または分析成分
〜分析成分誘導体混合物が実質的に全部消費されるまで
次々と検出不能にされ、残りの下流の反応帯にのみ検出
可能な反応帯を残すことになる。

変法においては、分析成分もしくは分析成分誘導体と反
応体との反応により、反応体が結合している固体媒体か
ら分離し、連続反応帯から洗い流されるようにしてもよ
い。分析成分もしくは分析成分誘導体又は両者がこうし
て消費された後、ひき続くもしくは下流での反応により
依然として浸透性媒体に結合し検出可能表反応体の存在
が検出される。この態様においては、上流反応帯から数
え・ていくつの反応帯の反応体が検出不能となったか数
えることができる。

本明細書において、「分析成分」とは、分析すべき特定
の化学成分のみならず、測定すべき成分と他の化学成分
との反応物質である化学成分を本意味子る。例えば、未
知量の化学成分を含有する生物学的流体を溶液その他の
状態で他の化学成分と反応させて生成物を得、該生成物
の濃度を測定すべき化学成分の最初の濃度に関連づける
ことができる。この場合の生成物も本発明の装置および
方法に使用する「分析成分」となりうる。従って「分析
成分」とは定量測定すべき任意の化学成分をいう。

好ましい態様においては、本発明は分析成分と反応体と
が、特定のりガント−抗体（抗リガンド）結合系の各成
分に相当する免疫反応を用いる。

第１図は本発明の装置を表わす一部欠損部分断面図を表
わし、 第２図は本発明の他の装置を表わす一部欠損部分断面図
を表わし、 第５図は第２図の線３−３に沿う断面図を表わし、 第４図は本発明の他の態様の平面図を表わし、第５図は
本発明のさらに別の試験装置の斜視図を表わし、 第６図は第５図の線６−６に沿う部分断面図を表わし、 第７図は本発明の他の試験装置の一部欠損斜視図を表わ
す。

第１図において、ガラス等の透明中空カラム１２は上端
開口部１２．１および下端開口部１′Ｌ２を有する。上
端開口部ＩＺ１は好ましくは外方へ拡大するフレア部１
２．３を有する。支持体１４がカラムの下端に設けられ
、該支持体１４は上方に開口する中空部１４１を有して
よく、ここにカラムの下端部１２．４がプレス止め等に
よりぴったり嵌合する。支持体１４は板状物のような平
らで水平方向を向く面を有する比較的へい底部１４．２
を有する。支持体の内部１４．４は好ましくは中空であ
り、支持体の上部壁部１４．５は好ましくは、カラムの
上端開口部１２．１へ液体を性別したとき空気を逃がす
ための通気孔１（６が設けられている。通気孔１毛６は
所望により綿栓等のゆるい多孔プラグを設け、くず入れ
等に廃棄したとき装置からの漏れの遅延を図ってもよい
。所望により、試験用カラム中の液体流速を調節する典
型的流速調整手段として、ポンプ〔例えばペリスタポン
プ（ｐａｒｉｓｔａｌ−ｔｉｃｐｕｍｐ）、シリンジド
ライブ式吸引ポンプ（ｓｙｒｉｎｇｅ　ｄｒｉｖｅ　ｗ
ｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｐｕｍｐ　）等と接続する柔軟な
チューブを設けてもよい。

カラム内には液体が浸透でき且つ分析成分、分析成分誘
導体、反応体および検出手段に適合性を有する浸透性固
体媒体、例えばビーズ状アガロース、ビーズ状ポリアク
リルアミド、有孔ガラス、セルロースまたは他の材料が
詰められた連続隔置された反応帯１６．１＆１．１＆２
゜１６５・・・が置かれている。反応帯中の媒体には後
で詳述するとお抄、反応体が結合している。

カラム内部は理解されるとおり、全体として垂直な液体
流路を規定し、反応帯中に位置する浸透性固体媒体は、
好ましくは流路の全断面を占める。間隔を置いて配列さ
れた（隔置された）反応帯の１１には、好ましくは、液
体が流れうる液体浸透性固体媒体よりなる非反応性スペ
ー誉−の噛１８，１＆１．１＆２，１１１Ｌ５・・・を
配置し、このスペーサーの層は好ましくは反応帯と密接
して存在する。このスペーサーの層は、好ましくけ反応
帯と同じ浸透性固体媒体よりなり、好ましくはスペーサ
ーの層１＆４および１１１５はカラムの頂部および底部
にも設けて、各反応帯は全てスペーサーの層で挾まれた
状態にするとよい。カラム１２の上端部付近には、スペ
ーサーの層１ａ４から一定距離だけ上方へ離して開口１
２．５を設け、スペーサーの層の上面と該開口との間の
カラム内に一定容積の空間を規定してもよい。公知の方
法により、液体１９をカラムの上端開口部１２．１に注
入すれば、カラム頂部の空間にたまるが、所望量より過
剰の液体２０は開口１２−５を通って流れ去抄、こうし
て予め決定された一定量以上の液体がカラムを下方に移
動することが防止される。上記一定容積の空間には、所
望によ抄全面的もしくは部分的に多孔性の非反応性材料
、例えばグラスウールまたは同様な材料を詰めて、カラ
ムの上端への液体注入時に液が跳ね返ることを防止して
もよい。隔置された反応帯１６，１４１・・・内の液体
浸透性固体媒体には、特定の分析成分又は分析ＦＪｙ分
誘分体導体応して反応生成物を生じうる反応体が結合し
ており、これらの成分は全て上記定義および本明細書に
例示するものであってよい。典型例としては、反応体と
反応成分とは、分析成分もしくは分析成分と分析成分誘
導体とを含む試験溶液がカラムを下方へ流下するとき、
反応成分もしくはその誘導体が反応体と化学結合するよ
うに選択されるが、カラム内の反応体の全量は、試験溶
液中に予想される量の分析成分および分析成分誘導体と
反応するに要するより過剰に存在させるよう注意する。

試験溶液がカラムを下方へ通過し始めたら、場合により
典型的には蒸留水又は脱イオン水を洗浄液としてカラム
の上端に注入して試験溶液のカラムの下方への通過を助
けることもできる。最後に、分析成分もしくは分析成分
誘導体、反応生成物または反応体の存在を検出する指示
薬もしくは検出剤、例えば反応帯１６，１４１等で色の
変化を生ずる物質をカラム上部から注入することができ
る。試験溶液がカラムを下方に移動すると、各反応層中
で一定量づつの分析成分もしくはその誘導体が反応体と
反応または結合して、試験溶液から分析成分もしくはそ
の誘導体を消費する。溶液中の分析成分の濃度は上部か
ら数えて色を変えた連続反応帯の数を数えるだけで決定
できる。他の態様において、反応帯の媒体に結合してい
る反応体を分析成分もしくはその誘導体又はその両者と
の反応により不活性化もしくは無効化して、不活性化さ
れなかった反応体を検出剤＋変色反応によ炒検出しても
よい。この態様において、試験溶液と接触した連続する
反応帯中の反応体は、試験溶液から分析成分および分析
成分誘導体が消費されるまで不活性化される。不活性化
されなかった反応体を含む反応帯はどれか調べることＫ
より、例えば反応体が検出されなかった反応帯の数をカ
ラム上部から数えるととくより、溶液中の分析成分の濃
度を決定することができる。もちろん、この態様（おい
て前記態様同様に反応帯の数を下から数えてもよい。

本発明の装置の他の物理的態様は第２図および第３図に
示されているが、この態様においては、連続隔置され九
反応帯を有するＦ紙片本しくけ類似物質の片を液体が浸
透もしくは毛細管現象で上昇する方法を採っている。こ
の態様において、浸透性固体媒体は、第２図および第３
図で番号２０が付され九Ｆ紙片の形状を有してよい。濾
紙片よ抄なる隔置された反応帯２１１１には、上記した
反応体が結合されており、反応帯の隔置はスペーサ一層
もしくはスペーサ一部２α２によねなされている。Ｆ処
片２ｏを製造する方法の一つは、長方形の小ｐ紙片各々
に反応体を結合させ、次いで、これら反応帯を形成する
濾紙片を反応体を含まない同様の濾紙片と交互に並べ、
並べた２紙片を例えば、薄い接着テープ片で接着するこ
とＫよる。他の変形された製造法が採用しうろことも当
業者により明らかである。

＠２図および第３図から明らかなとおり、濾紙片２０は
、断面路Ｃ字型の長いプラスチックホルダー中に保持し
てもよい。プラスチックホルダーの下端は綿もしくは他
の繊維材料のよりひもから成って良い芯２４の末端を受
は入れるように形成されている。プラスチックホルダー
の上端は同様の芯２４．１を受は入れるようになってい
る。芯２４，２４１の末端は夫々１紙片２０の各末端と
接触している。第２図に示すとおり、芯２４，２４１と
接触する濾紙片の上端および下端にはスペーサ一層２α
２を設けて、各反応帯２α１は全てスペーサ一層２α２
で挾まれた状態としである。濾紙片およびホルダーは、
試験管２６まだは他の容器に挿入できるよう釦なってお
９、従って、第２図に示すように、下部の芯２４は試験
管の底に接し、上部の芯２４．１は試験管外に延長し、
次いで試験管の底部へ向っている。試験管２６の底部の
試験溶液２８は、毛細管現象によって濾紙片の長さ方向
く沿って上方へ流れ、第１図に示したカラムに沿う試験
溶液の流れと同様に連続的に反応帯２（Ｌｌと接触する
。後で詳述するとおり、濾紙片およびホルダーは一つの
試験管から別の試験管に移し変えることができ、こうし
て異なる溶液をその長さ方向に連続的に流すことができ
る。

第４図に示す態様の本発明の装置は、Ｐ紙、多孔ガラス
等のような浸透性、固体媒体のディスクを有する。ディ
スク３０はペトリ皿のような適当な容器中に水平に置か
れている。ディスク３０は中心に試験溶液または他の溶
液を受けるｆ）ｘｘ５ｃＬ１を有する。このウェル５Ｑ
、　１　カら放射状に配された反応帯は、環状リング３
α２として示され、同様Ｋｆｉ状リング５０．５を形成
するスペーサ一層で互に隔てられている。ディスクの最
内リングおよび最外リングは好ましくはスペーサ一層で
ある。反応帯３ｆ１２およびスペーサ一層３Ｑ、３は同
心である。中心ウニ＾５α１に受は入れられた試験溶液
は、毛細管現象ま九は拡散により、所望により棒心力を
適用して放射状に移動し、試験溶液は連続的釦隔置され
た反応帯３ＣＬ２を通過する。

第５図および第６図は本発明の装置の他の態様を示すも
のである。この装置は、第２図および第３図の装置と同
様の濾紙片４０を有し、該濾紙片はスペーサ一層４α２
で隔てられた隔置反応帯４α１を有する。好ましくはプ
ラスチックよりなるホルダー４２は、平面基部４２．１
およびその両端に存在する上方へ延びる脚４２．２゜４
２．５を有する。脚４２．２には上方に開口するウェル
４２．４が設けられ、この中に濾紙片４０の上端を挿入
しうるようＫなっているが、この際濾紙片の末端４２．
５がウェルの底に達するように注意する必要がある。こ
の濾紙片はウェルから斜め下方に延長して、その下端は
脚４２．５に形成されたスロワ）４２．６中に支持され
ている。使用時には、試験溶液または他の溶液をウェル
４２．４に加え、重力および毛細管現象によって該溶液
を下方に移行させ、溶液を連続的に隔置反応帯４［Ｌｌ
と接触させる。

第７図は本発明の装置のさらに別の態様を示すものであ
り、この装置は同時に複数の試験を実施するために使用
できる。番号５０で示す装置は、一対のプレート５［Ｌ
ｌ、５Ｑ、２を対向して有する。第７図の右手部を参考
に説明すれば、該プレートに挾まれた空間は長い隔壁５
２゜５２．１によって略垂直なチャンネルに区分されて
いる。図に示すとおり、隔壁により形成されたチャンネ
ル５２．２は、広い上部セクションと狭い下部セクショ
ンを有する。下部セクシ目ンには反応体が結合した液体
浸透性固体媒体（この媒体は上記のいずれのものでもよ
い）よりなる一連の垂直方向に隔置された反応帯５４が
設けられている。各反応帯の間にはスペーサ一層５６が
置かれ、該層は間に反応帯５４を挾んでいる。チャンネ
ル上端の隔壁５２，５２．１の間には、チャンネルの上
部を２セクション５２．４および５２．５に分割する長
い垂直分割部５２．５が置かれている。隔壁と同じ材料
より成ってよいプラグ５８は、上部の指でつまむ部分５
＆１およびチャンネル５２．５に挿入しうる形状の下部
テーパープラグ部５１１２を有する。隔壁およびプラグ
各々の平面部は勿論両側のガラスプレートに接してチャ
ンネルから物質が漏れ出さないようになっている。

使用にあたって、試験溶液等の溶液を隔壁５２．５２．
１により形成されたチャンネル゛の上端から注入し、次
いでプラグ５８を挿入して１方のチャンネル５２．５の
上部の気体流通を遮断する。その結果、他方のチャンネ
ル５２．４中の液体は反応帯およびスペーサ一層を通っ
て選択的に下方へ流れる。チャンネル５２−４の液面が
分割部５２−３の下端より下方に下ると、空゛気の泡が
チャンネル５２−５を逸って上方へ移行し、該チャンネ
ルの内容物を反応帯を通って同様に下方へ移動させる。

こうして、最初はチャンネル５２．４から、次いでチャ
ンネル５２．５からの連続流れが自動化される。好まし
くは、一方のプレート（例えばプレート５α１）は透明
とし、反応帯におけるいかなる色の変化も容易に観察で
きるようにする。他方のプレート５（Ｌ２は透明でもよ
く、或いは不透明白または他の明るい色として、色の変
化が容易に対比しうる背景として役立ててもよい。

次に、分析成分−反応体の系について説明する。

本発明で検出しうる分析成分には、前記のとおり、反応
体と反応して生成物を形成しうる実質的に全ての化学物
質を含む。本発明は特定の分析成分又は反応体に限定さ
れるものでなく、実質的に任意の分析成分−反応体の組
合せに有用である。

本発明に公知化学反応を単に適用するだけで、多くの分
析成分が分析できる。

列えば、弱アルカリ性ｐＨにおいてフェノールフタレイ
ンを用いて二酸化炭素を分析できる。

カルモデーリン（ｃａｌｍｏｄｕｌ　ｉｎ　）および哺
乳類ホスホジェステラーゼまたは他のカルモデユリン感
受性酵素を使用してカルシウムイオンを分析すること本
できる〔前用および安倍バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミユニケージ璽ンズ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃｓｓｌ　　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
　　）。

９７：６２１　（１９８０））。反応体としてフェロセ
フ誘導体を使用して鉄イオンを分析できる〔カッッ（Ｋ
麿ｔｚ　）等、ジャーナ・ル・オブ・アメリカ７−ケミ
カル・ソサイエティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）、１０４：３４６（１９８２））、さらに別
の多くの例はジｌンーｊｌ−イチ、　　ヨー　（Ｊｏｈ
ｎ　Ｈ，Ｙｏｅ）の「化学及び物理ハ／ドブツク（Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈ
ｙｓｉｃｓ　）　Ｊ、　Ｐ、Ｄ　１２６−１２９゜第５
７［、ロバート・シー、ライ−スト（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｃ
，Ｗｅａｓｔ　）編、　　ＣＲＣ出版社、クリープラン
ド、　　１９７６および本明細書に引用の他の文献から
選択できる。有機化学分野から選ばれ九典型的分析成分
−反応体の組合せも同様に公知化学反応を本発明に適用
して選択できる。例えば、殆んどいかなるフェノールも
ジップス試薬（Ｇｉｂｂｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　）　（２
，６−ジク０　ロー　ｐ　−ベンゾキノン−４−クロル
イミン）を使用して分析できる〔ダクレ（Ｄａｃｒｅ　
）　、ジャーナル・オプ・アナリティカル・ケミストリ
ー（Ｊ。

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）、
　４３　：５８？　（Ｈ’７１）〕。

インドール用の試薬はｐ−ジメチルアミノ−ベンズアル
デヒドである〔フイーザー及びフィーザ−（Ｆｉｅｓｅ
ｒ　ａｎｄ　Ｆｆｅｓｅｒ　）　、「有機合成のための
試薬（Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｆｏｒ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）　Ｊ。

第１巻第２７３頁、ジ菅ン・ワイリー・アンド・サンズ
、インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆Ｓ
ｏｎ’ｓ、　Ｉｎｃ、　）、二ニーヨーク（１９４７）
）。　この文献はコーチシン及び°類似のステロイドに
対する反応体としての７エニルヒドラジンの使用オＬ　
Ｕ不飽和ステロールのリーバ−マン−バーチヤード試験
（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ　ｔｅｓｔ
　）でスルホ酢酸を反応体として使用することも示して
いる。ニンヒドリン試薬（インダン−１，２゜５−トリ
オン・ハイドレート）を使用してアミノ酸およびアンモ
ニウム塩を分析することもできる〔パス）　（Ｐａｍｔ
ｏ　）等、［有機構造決定（Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　）　Ｊ、第
４２９頁、７’レンチイス−ホール、インコーホレイテ
ッド（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、　Ｉｎｃ＋）、エ
ングルウッド　　クリア　ス（Ｅｎｇｌａｗｏｏｄ　Ｃ
１１ｆｆｓ　）　１ニネージャージー、１９６９））。

埋元糖はレッドテトラゾリウム（２，５，５−）リフエ
ール−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド）を使用して
測定できる〔フィーザー、「有機実験（Ｏｒｇａｎｉｃ
　Ｅｘ−ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　）　Ｊ、第１３５頁、レ
イｆオ７−エデエケーシ舊ン・カンバー＝−−（Ｒｍｙ
ｔｈｅｏｎ　Ｅｄｕｃａ−ｔｉｏｎ　Ｃｏ、　）、レキ
／／トン（Ｌｅｘｉａｇｔｏｎ　）、？サチュセッツ、
１９６８）。

化学分野から、他の種々の分析成分と試薬の組合せを選
択して本発明に適用することが可能であり、これらは例
えばシャース（５ｃｈｕｕｒｓ　）等、米国特許第４４
５４０９０号明細書〔酵素結合免疫吸着分析（Ｅｎｚｙ
ｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏｉｏｒｂｅｎｔＡｓ
ｓａｙ　）　）　；ケイ（Ｋａｙ　）　％米国特許第１
７８９，１１６号明細書〔螢光標識した抗体試薬（Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔＬａｂｅｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ
　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　）　）　；ルーベンジタイン（Ｒ
ｕｂｅｎｓｔｅｉｎ　）等、米国特許第５，８１７，８
５７号明細書〔均質酵素免疫分析ζＨｏｍｏｇｅｎｅｏ
ｕｓＥｎｚｙｍｅ　Ｉｍｎｕｎｏａｓｓａｙ　）　〕；
　　リング（ＬＩｎｇｌ、米国特許第に８６７．５１７
号明細書〔免疫放射分析（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ−ａ
ｓｓａｙ　）　）　；ジアエ、（−（に１ａｅ−ｖｅｒ
）、米国特許第４９０４４　？　０号明細書〔放射免疫
拡散（Ｒａｄｉａｌ　Ｉｒｎｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ　）　；ウルマン（ｕｌｌｍａｎ）、米国特許７１！
、１９９６．５４５号明細書〔螢光抑制均質免疫分析（
ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＱｕｅｎｃｈｉｎｇ　Ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）　）　
；　？ギオ（Ｍｍｇｇｉｏ）、米国特許第４．２５４４
０２号明細書（酵素チャネル均質酵素免疫分析）〕：ボ
グスラスキ（Ｂｏｇｕｓｌｉｓｋ量）等、カナダ国特許
第１．０８２，５．７７号〔ハゲテン−コファクター均
質酵素免疫分析（Ｈａｐｔｅｎ−Ｃｏｆａｃｔｏｒ　Ｈ
ｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓＥｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｌ
ａｙ　）　）　：ショーンフェルド・エイチ、　　（５
ｃｈｏｎｆｅｌｄ　Ｈ，）編、「免疫分析における新ら
友な進展（Ｎｅｗ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　
Ｉｍｍｕ−ｎｏａ＠５ａｙｓ　）　Ｊ、抗生物質および
化学療法（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒａｐｙ　）　、第２６巻、１７９；ｔ−サリ
バン（０°５ｕｌｌｉｖａｎ　）等、「酵素免疫分析二
現状（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　：Ａ
　Ｒ６ｖｉｅｗ　）　Ｊ、アナルス・オプ・クリニカル
・バイオケミストリー　（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃ１ｉ
ｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅ　）　１６　：２
２１　（１９７９）　；　　シーｙ　−ス（５ｃｈｕｕ
ｒｓ　）等、酵素免疫分析、クリ二カ、キミカ、アクタ
（Ｃ１１ｕ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　）、　８１　
：　１（１９７７）　；　７　ｘ　ルド−ｒ　ン（Ｆｅ
ｌｄｍｍｎｎ　）等親、「免疫酵素技術に関する第１回
国際シンポジウム（Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｉｍｍｕ−ｎｏｅ
ｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）　Ｊ　、
イ／セルム・シンプ（ＩＮＳＥＲＭ　Ｓｙｍｐ、　）　
Ａ　２　、　　ノース・ホラノド・パブリジング・カン
パニー（Ｎｏｒｔｈ　ＨｏｌｌａｎｄＰｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ　Ｃｏ、　）　、アムステルダム、１９７４；ウィ
リアムス（Ｗｉ　ｌｌｉａｍｓ　）等、「免疫および免
疫化学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｒｎｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　ａｎｄＩｆｆ！Ｉｎｕｎｏｃｈｅｍｉｍｔｒ
ｙ　）　Ｊ、第５巻、アカデミツク・プｖ　ｘ　（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）、ニューヨーク。

１９７１；および−？０つ（Ｙａｌｏｗ　）等、ジャー
ナル・オブ・クリニカル・インペスティゲーシロｙ　（
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）、５９：１１５
７（１９６０）Ｋ記載されている。

さらに別の分析成分−反応体の組合せは、次の文献中に
見出すことができる：ファイグル。

エフ、　　（Ｆｅ１ｇ！、　Ｆ、　）、「無機分析にお
けるスポットテスト（５ｐｏｔ　Ｔｅ５ｔｓ　ｉｎ　Ｉ
ｎｏｒｇａｎｌｃ　Ａｎａ−１ｙｓｉｓ　）　Ｊ　、第
６版、エルク−バー（Ｅｌｓｅｖｆｅｒ　）出版社、ニ
ューヨーク、１９７２年；ファイゲルおよびフリッノ（
Ｆｒ１ｔｚ　）、ｒ有機分析におけるスポットテスト（
５ｐｏｔ　Ｔｅ５ｔｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＡｎａｌ
ｙｓｉｓ　）　Ｊ、第７版、ｘ　ｘ　シー　／＜−出版
社、ニューヨーク、１９６６年；スネル、エフ、および
スネＡ、　　シ＋、（５ｎｅｌｌ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｓ
ｍｅｌｌ、　Ｃ，）、「呈色による分析法（Ｃｏｌｏｒ
ｉｍｅｔｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ　）　Ｊ、第１−ＡＡＡＡ巻、ファン・ノストランド
・レインホルト社（Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄＲｅｉｎ
ｈｏｌｄ　Ｃｏ、　）、ニューヨーク、１９６７−７４
年；およびプライバンチ、エイ、　（Ｂｒａｉｂａｎｔ
ｉ。

Ａ、）編、［生物熱力学および熱力学：モデルシステム
−合成及び天然キレート並びに生物学的！理学的研究の
モデんとしてのマクロサイクＡ　（Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅ
ｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ　：
Ｍｏｄｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａ
ｎｄ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｃｂｅｌａ−ｔｅｓ　ａｎｄ　
Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ　ａａ　Ｍｏｄｅｌｓ　ｆｏｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　）　Ｊ、ディー。

ライプＡ　（Ｄ、　Ｒｅ１ｄｅｌ　）出版社、ボストン
、１９８０年。

上記参考文献の内容も参考のため本明細書中に記載する
。

本発明にとって特に重要な組合せは、一方が抗体で、他
方が該抗体に特異的なリガンドである特定の結合ペアー
を構成する分析成分−反応体の組合せである。

そのような免疫化学的反応体の組合せは当該技術分野で
公知であゆ、分析成分の存在もしくは量またはその両者
を、特に該成分が非常に低濃度で存在している場合に検
出する丸めの広範な種類の試験法が考案されている。こ
れらも前記特許明細書および刊行物中に見出される。

次に検出剤について説明する０ 本発明に有用な検出剤は、連続する反応帯における分析
成分、分析成分誘導体、反応体または予め定められた反
応生成物（これらは全て前記した）を検出可能なもので
ある一０検出方法は種々の形態であって良い。好ましい
態様においては、検出は色の変化、または色の変化の欠
如が装置の個々の反応帯で生ずるか否かで行なわれる。

しかしながら、検出はまた他の方法、例えば反応帯の発
光もしくけ螢光、反応帯の放射活性その他で行なっても
よい。多くの反応にとって、検出ＦｉｐＨ変化で行なわ
れ、検出剤はフェノールフタレイン、ナイルブルーＡ、
ｆモールブルーおよびメチルバイオレットなどのｐＨ呈
色試薬の形であってよい。他の試験において、反応帯中
の適当な化学成分の存否を固体反応生成物が連続スペー
サ一層に貯ったかどぅがを観察して検出することもでき
る。当業者罠とって種々の検出機構は知られており、本
明細書中に砕述する必要はないａしかしながら、分析成
分または分析成分およびその誘導体と反応体との免疫反
応を使用する好ましい態様においては、しばしば非常に
低ＩＩｋ度の分析成分全測定する必要があり、従って拡
大もしくは増＠機構を採用すると良い。そのような機構
の１つは、反応生成物と検出剤との反応を促進させて目
に見える呈色奮起させる酵素を使用することである。ｈ
えば、ば験すべき分析成分を分析成分−導体としての既
知量の分析成分−グルコース酸化酵素鮎＠物と一緒に該
分析成分に特異的抗体を含む本発明装置の隔置連続反応
帯に供給して奄よいＧ信号発生系として、反応帯中の浸
透性固体媒体に結合した西洋ワサビパーオキシダーゼ、
及び０−ジアニシジン（グルコースとともに試験溶液に
加える）を採用することもできる。分析成分、分析成分
−グルコース酸化酵素結合物、グルコース、カタラーゼ
及び０−ジアニシジンヲ第１図に示すようなカラム罠性
別し１次いで装置に通過させる◎分析成分および分析成
分−グルコース酸化酵素結合物は・結合した抗体の結合
部を奪い合い、こうして０−ジアニシジンと（グルコー
ス酸化ｉ１素で触謀された酸素とグルコースとの反応で
生じた）過酸化水素との反応で呈色を生ずる。未反応の
分析成分および分析成分−グルコース酸化酵素結合物は
、混合物中のこれら成分が消費され終るまで連続反応体
合流れる。この方法の撫々の変法は当業者に公知である
〇 実施Ｎ１ 発色成分翫５［５−（２−ピリジル）−＄２゜４−トリ
アジン−５，６−ジイル〕ビスー２−フランスルホン酸
二ｔ　）　ＩＪ　ラム塩〔７エレ／（Ｆｅｒｅｎｅ）　
、ケミカルダイナミックス社（（ｈｅｍｉｃａｌ−４）
ｙｎａｍｉｃｓ　（ｏｒｐ、　）　ｔｙ）製品：登ａｍ
標〕を使用して血清中の鉄を５９３０ｍでの吸光度測定
による溶液分析で測定する：この５９３ｎｍの波長では
血清中の他の色素の影養が最も小さい。７エレンはニト
ロ化、還元、ジアゾ化およびアルブミンのような蛋白質
へのジアゾニウムカップリング（この蛋白質はアガロー
スビーズ、紙片、もしくは他の適当な浸透性固体媒体に
不溶化しておく）Ｋ、よって有用な担体鋳導体に共有結
合させることができる。この不溶化（固定化）信号発生
試薬（発色性キレート剤）は、試験溶液を移行せしめる
べき連続隔置層もしくはバンド（反応帯）中に物理的に
配される。

シラン化パスツールピペットの両ｍｔｉ　リ、下端（先
が狭くなった方）に短かいチェーンを接続し、ピペット
の下部にグラスクールの栓ｔするととくより、小カラム
を製造する。カラムには、アガロース−７エレンの層を
未変性アガロースの層で隔てて連続的に充填する。具部
的には、１：１７ガロ一ス分散箪α４−を直接綿１１に
充填し、次いでアガロース−フェレンの１：１分散液５
０マイクロリツターとアガロース分散液α２−の層を交
互に充填して行く・各層の充填終了後には、カラムの壁
をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で洗い、ゲル面上の溶液
をゲル内へ流入せしめ、その後火の層を充填する。

分析に使用するには、上記で調製したカラム底部のチュ
ーブ管ペリスタポンプ（ｐｅｒｉｓｔａＨｉｃｐｕｍｐ
）　Ｋ接続して分析時の流速を調節する・鉄を分析する
ための試験サンプルの適当希釈液をカラムに導入する・
この鉄溶液（試験溶液）を調節された流速、典盤的には
完全に液がカラム中に入るまでに１０〜１５分を要する
流速で分析カラムを通過させる。全溶液がゲルペッド中
に入ったとき、カラムを水で洗う。試験溶液が流れるに
つれて、フェレン含有反応帯中のいくつかに発色が生ず
る。こうして発色した反応帯の数が試験溶液中の鉄の濃
度の指標である。

実施ガ２ Ａ、酵素であるコリンエステラーゼは毒性の有［１１７
ン酸およびカルバメート剤と反応して不活化される・コ
リンエステラーゼおよび発色性スｋ　７　ｋ：　）’　
ＩＪ　ｓ、　試薬５．５−ジチオビス−（２−二トロ安
息香酸）〔エルマン試薬（ｇｌｌｆｆＬａｎ’ｓＲｅａ
ｇｅｎｔ）：］　をアガロースビーズに不溶化し、次い
でこれを実施偽１の方法でカラムに充填する・試験溶！
（希釈血清）をカラムに導入し、反応帯ｆ：、通過させ
、続いてブチリルチオコリンヨーシト奢加える◎触媒活
性を有するコリンエステラーゼを保持している反応帯は
、コリンエステラーゼの加水分解作用によシ生じたチオ
コリンと不溶化エルマン試薬との反応によシ黄色く呈色
する。試験溶液中にコリンエステラーゼの反応性を阻害
する毒物が存在すれば呈色反応はカラムの下端付近のわ
ずかな数の反応帯のみで生じる。

Ｂ、アミノ酸及び他の求核性アミン化合物を反応によシ
黄色生成物を生じる発色性試薬２．４−ジニトロフルオ
ロペンセン（ＦＤＮＢ）　を使用して測定する。アミノ
分析成分ｔ−ＩＦｌα１〜ｔｇ″ｖイクロモル有する水
性サンプル（Ｌ　１　ｄｔ−シリコン処理し次ガラス容
器に入れる・必要であれば９Ｈｆ７．ＯＫ調整し、Ｎａ
ＨＣｏ、　２　Ｗ　（２ｓ　マイクロモル）を加えて溶
解する・次いで無水アルコール中のα１５％ＦＤＮＢを
α１２ｍ１ｇ（１５−ｒイクロモル）加える・この溶液
は使用の直前に新たＫＩＳＩｌｌ製する。反応がほぼ完
了した後、その残存ＦＤＮＢ（反応体）量會実施例１で
用い次分析系の液体通過により分析する。この場合には
、同様のアミン含有分析成分を浸透性固体媒体中の反応
帯に公知濃度（例えば反応帯当シα１〜ａ２５マイクロ
モル）で不溶化する。５０％エタノール水溶液で洗浄後
、呈色して洗浄後にも保持される黄色反応帯の数は試験
サンプル中の分析成分量と負の相関を有する＠ 実施例３ クサギ抗−ペニジロイルー十ガンマグロブリンからのＩ
ｇＧフラクション’（，５５％飽和硫酸アンモニウムで
沈殿させて部分精製した。沈殿を再溶解し、リン酸緩衝
塩溶液（ＰＢＳ）で透析した＠このＩｇＧ１粒状アガロ
ースに抗体を結合させるために使用した。アガロースを
ジオキサンに懸濁し、次いでカルボニルジイミダゾール
と反応させた。ジオキサンで洗＃後、水に懸濁し、次い
でＰＨ９，０のホウ酸水性緩衝液に分散した。

ＩｇＧを次いで活性化アガロースに添加し、ゲル懸濁液
を４℃で２日間振って攪拌した・ＰＢＳで十分に洗浄し
た後、不溶化抗体を含むゲルは分析に直ちに使用可能で
あった。

シラン化パスツールピペットの両端を折シ、底部（先が
狭くなった方）Ｋ短かいチューブを取）付け、カラムの
底にグラスウールの栓を結め友。カラムに未変性アガロ
ースの層で隔てられたアガロース−ＩｇＧの繰返し層を
連続的に充填した。具部的には、栓の上に１：１アガΩ
−ス分散液α４ｗｔを直接充填し、続いて、反応帯を形
成するアガロース−ＩｇＧの１：１分散液５０マイクロ
リツターとスペーサ一層を形成する１：１アガロース分
散液１２ｓｇｏ繰返し層を充填した。各層の添加の後に
は、カラムの壁ｉ　ＰＢＳで洗い、グル面よｐ上の溶液
をゲル内に移行させてから次の層を重層した・ 分析に使用するため、調製したカラムの底のチューブを
−°リスタボンプに接続して分析ノ流速を調節した・適
当希釈したベニシロイル−グルコース酸化酵素（ｐｅｎ
−Ｇｏ）　（典型的にはＰＢＳｌ−中ｐｅｎ−ＱＱα１
マイクログラム）を、既知量の分析成分（ペニンロイル
ーイプシロンアミノカプロエート：　ｐｅａ　−ＥＡＣ
）と−緒Ｋ又は別にカラムに通した。ｐｅｎ−Ｇｏはペ
ニシリンＧ全グルコース酸化酵素と１）Ｈ９，Ｏのホウ
酸緩衝液中で４℃にて２〜５日間反応させて製造し良。

ＰｅＱ　−Ｇｏ浴溶液、調整された流速、典型的にはケ
ル中への完全移行が１０ないし１５分間圧終了する速度
で分析カラムに通した。全溶液がゲルペッド内に移行し
た後、カラムに検出溶液を加える。検出溶液は次のよう
に調製した：西洋ワサビパーオ中シダーゼ（ＨＲＰ）　
Ｓｔ　（２ｑ／ｓｇ）ａ、２ｏ−１１Ｂ５Ａグルコース
溶液２−・α２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨｔｏ）　１−およ
び１％０−ジ７二’／ジンＱ、１００ｗａｌをＰＢＳ中
に１：１゜に希釈し、１１１ｔもしくはそれ以下を前記
溶液と同じ流速でカラムに導入した・反応帯のいくつか
に茶色い色が生じた。Ｐｅｎ　−Ｇｏ　溶液中のベニシ
ロイル成分の存在は、上方の単数もしくは複数の反応帯
での呈色を僅かにし、カラムのよシ下方の反応帯で呈色
を生ずる＠ この実施例は、ペニシリン−グルブース酸化酵素結合物
を、アルブミン−グルコース酸化＃素結合物と置き代え
て、血清アルブミン（大きな蛋白分子）の分析にも使用
できる。

実施例５Ａ 抗ペニシリンウサギ血清から製造し九パーオキシダーゼ
標識１ｇＧを、実施例３に記載した方法で小Ｆ紙片に不
溶化した。別の同様な２紙片にカメラーゼを結合させた
。次いで先に示した２紙片と後に示した濾紙片を長方形
に切り堰って、夫々反応帯とスペーサ一層ＫＬＩ。次い
でＶ紙の長方形小片を接着テープのストリップ上に重ね
連続する濾紙片の端が互いに重なり合うか少なくとも互
いに触れ合うようＫして、連続毛細管流路を形成し次。

ヒト血清アルブミン（ＢＳム）ｉｌｔ中のベニシロイル
−グルコース酸化酵素（Ｐｅｎ−ＧＯ）を試験管内で凍
結乾燥した・光から内容物を保護する九め褐色ガラスで
出来た他の試験管Ｖｃ／ｆｉ、ＤＨ６Ｇのリン酸緩衝塩
溶液に溶解した０−ジアニシジン及びグルコースのＳ液
を凍結乾燥したＯ前記のようＫして製造した濾紙片の底
部に短芯を堰りつけ、該２紙片の上端には長い芯を接触
させ九〇Ｆ紙片はそれ自体冷所に保存でき、好ましくは
前記製造条件に由来する湿潤状態で保存てきる・ 一つの使用ガにおいては、既知濃度のペニシリンＧを含
有する一定量のミルクよシなる試験＃Ｉ液を凍結乾燥Ｐ
ｅｎ−ＧＯｔ含む試験管に加え、次いで内容物合算かに
振って混合する。次いでこのＰ紙片金試験管に挿入し、
上部の長芯は第２図に示すとおシ、試験管の口を越えて
外方へ延び次いで下方に延長するようＫする。全＃１′
＃。

が濾紙片に吸収されたとき（或いはその代りに、溶液が
上部芯に刻まれＩＩ２図中Ｆで示した任意に定められた
流れ指示線に違したとき）、−紙片を試験管から取り出
し、予め水を加えて凍結乾燥内容物を溶解しておいた褐
色ガラス試験管に入れる・この試験管の溶液もま九Ｐ紙
片を通って上方へ移行し、初めの試験溶液中のペニシリ
ンＧの量によって一定数の反応帯に呈色をひき起す。

こ０例において、ミルク中のペニシリンＧとＰｅｎ−Ｇ
Ｏのペニシリンが、−紙片の反応帯に不溶化されえ抗体
の結合部位を奪い合う。もちろん、ミルクサンプル中の
ベニシリ／Ｇ濃度が大きければ、ペニシリンＧ及びＰｅ
ｎ−ＱＯは濾紙片の遠くまで移動する。反応帯でのＰｅ
ｎ−ＱＯの存在社パーオキシダーゼで触媒された残Ｏｓ
と０−ジアニシジンとの反応で生じ九呈色によシ示され
るが、このＨＩ　Ｏｓａグルコースと酸素の存在下にグ
ルコース酸化酵素によ多形成されえもので参る。スペー
サ一層中のカタラーゼはＨ，０ρＯ１とル０への変換を
触媒し、し友がってＨ，へを−−’）（Ｄ反応帯から他
の反応帯へ移動することを防止する。

前記各装置について記載し九とおり、本実施例の装置線
試験操作の結果、反応帯のいくつが呈色し良かを決める
ととＫよシ定量する０例えば、ある反応帯では試験溶液
（例えばミルク）が少なくとも分析成分（例えばベニ７
リンＧ）を１−轟Ｊ）９ｎｇより多く含有しなければ、
色の変化を生じない。未知濃度のペニシリンＧを含有す
るミルクフンプルについて、色の変化し九反応帯の数を
数えるだけで、ペニシリンＧ濃度を狭い特定の濃度範囲
で知ることができる。

実施例４ 多価抗ＩＩ（例えば血清アルブミン）分析成分に対する
抗体をパーオキシダーゼで標識し、拠施例３に従つて浸
透性固体媒体に結合させて、カラム中に反応帯を形成し
良、同一まえはｍ位抗体を別のパッチとしてグルコース
酸化酵素のような酵素で標識した。カラム中に未知量の
分析成分（抗原）を含む試験す／プルを注入し九。

次いで、グルコース、カメラーゼ及び０−ジアニシジン
の存在下にカラムに液状０抗グルコ一ス酸化酵素抗体を
流した。生じ丸呈色バンドの数は、抗体層の抗原結合能
に応じて、試験溶液中の分析成分（抗原）の量と直接関
連す、る。この実施例において、抗原は先ず結合抗体と
反応してこの抗体に結合し、予め決定され九生成物を形
成する。この生成物は該抗原上の抗原決定部へのグルコ
ース酸化酵素抗体結合物の結合によシ、ひき続く呈色反
応で検出される。

実施ｆ４ｓ 分析成分またはそＱＩＩ導体（例えばペニシリン−パー
オキシダーゼ）を実施例３に従って浸透性固体媒体に共
有結合させた。酵素ａｍ受容体、（例えはグルコース酸
化酵素−抗ペニジリン抗体）を調製し、不溶化分析成分
に接触させて轡異緒合複合体く例えば免疫複合体）を製
造した６分析系は実施例３と同様に定めた。次いで未知
量の分析成分を含む試験サンプルとの接触を、高め九温
度（例えば６０℃）で行なつて。

不溶化分析成分および試験フンプル中の分析成分と一嵩
標一抗体との閾の競金的結会の平衡状態到達を速めえ。

このような条件下で試験サンプル中の分析成分は、不溶
化分析成分から競合的に標識抗体を置換する。この方法
で得られる呈色反応帯の数社、試験サンプル中の分析成
分の量に反比例する。これらのバンドはカラムの最後部
もしく社下流部に出現する。

実施例６ 実施例３に従って、各々４つの反応帯を有する分析カラ
ムを調製したが、但し、最上ｔｏ反応帯はＩｇＱ−アガ
ロース分散液（１：１）７５マイクロリツトルで形成し
、その下の５つの反応帯性５０マイクロリットルで形成
し友。α５０シよび２００　襲ｇのＰｅｎ−ＢＡＣを含
有し、且つ各々Ｐのｎ−ＧＯを２００ｎｇ　１ｇＪ含有
する試験テンプルを各カラムに注入し丸。試験フンプル
流入に１！し九時間紘２０分である。信号発生剤の溶液
の導入によシ、Ｏｎｇ　Ｐｅｎ−ｇＡｃナンフンでは２
つの呈色帯、ｓｏｎｇ？ｙプルでｆｉ　Ｂ　２．２００
ａｇ＄ンプルでは４つの呈色帯を生じた。

及応帯Ｏ数を増加させれば、よ〉広い範囲でよシ厳密に
分析成分量が求められる。

好ましい態様においては、一種の＃Ｌ状物質を１回だ妙
装置に通過させるだけでよい。分析成分性分析成分誘導
体、発色成分ｉ九は他の物質と混合し、装置に流して適
する試験結果を得る仁とができる。さらに好ましい態様
においては、本発明の装置は反応体および分析成分の定
量分析に必要もしくは好ましい他の化学成分全てを含む
ととＫよシ化学的に完成し、このようにすれば、分析に
！！する操作は液体担体中の分析成分を装置に流すこと
だけとなる。もし必要なら、分析成分不存在下に反応を
生ずる要素を装置に別の層として設けてもよい。例えば
、第２図のストリップの最底部０層、２α２に杜、隣接
反応層中の反応体と物理的に分離して−りの反応体含有
してよい。液体担体中の分析成分が最底部の層２α２を
通過するとき、この層の反応体性、分析成分および液体
担体と一緒に最初の反応体に流れ込む。所望により１反
応体は固体状で供給されてもよく、そして、第１図のカ
ラムの上方の層１Ｂ−４上に置かれるだけでもよい：反
応体は液体担体に溶解されて液体担体および分析成分と
一緒にカラム中へ運ばれる。

上記態様は、前記装置同様に本発明の好ましい態様を例
示する実施例７ないし９にょシ説明する。

この態様は、少なくとも二種の酵素を必要とし、その一
方は分析成分と結合して分析成分誘導体を形成して呈色
反応を触媒する：そして、他方の酵素祉分析成分に対す
る抗体をも含む反応帯に不溶化されておル、後者の酵素
は呈色反応酵素の基質を提供する。従って、この態様に
おいては、試験すべき分析成分よシなるもしく拡分析成
分を含む単一の溶液を、一体媒体に流すだけで反応帯に
呈色が生じ、その呈色反応帯の数を直接試験溶液中の分
析成分濃度Ｋｌｌ遅させることができる。

実施例７ 抗ベニシロイルー牛血清アルブミン・ウサギ抗体から、
５３％飽和硫酸アンモニタムで沈殿させてＩｇＧ分画を
部分精製した。こＯＩｇＧｊ［白質を、ジオキサｙ中の
セルレースとカルボニルジイミダゾールの反応後、洗浄
し、次いでこれを該ｌ５ｒＧ部分精製品とＰＨ９，０の
ホウ酸緩ｉ液中４℃にて２日間反応させることＫよ）、
微結晶セルロースに結合させた。次いでセルロースをＰ
ＢＳで十分洗浄し、バンド状ストリップの製造に使用し
友。グルコース酸化酵素も同様の方法で微結晶セルロー
スに結合させた。ベニシロイルパーオキシダーイは先ず
ポリアクリルアミドアミンをＨＲＰ　Ｋ結合させ、この
結合物にペニシリンＧを反応させて調製し友。ハプテン
（ペニシリンＧ）を酵素に結合させる友めに、線状ポリ
マーをスペーサーとして使用すると、各酵素分子！！＆
シのハプテン分子の結合量が増加し、ハプテン分子が抗
体と結合すべく抗体に接する機会を増して、結合速度を
速めると考えられている。ポリアクリルアミド祉、アク
リルアミドα５ｇを脱イオ／水２００−に溶解し、脱ガ
スし、次いでＮ、　Ｎ、　ｄ、　ｄ−テトラメチルエチ
レンジアミンα２−および過硫酸アンモニウムα１５９
を加えることにより調製した。この溶液を混合し、次い
で室温に５０分靜装し、次いで限外濾過膜を通過させ、
脱イオン水で透析して凍結乾燥し良。次いで、このポリ
アクリルアミドｔｔｐＨ７，７のα２Ｍリン酸＊Ｉｒ＆
ｔｏｇｚに溶解し、そして２５几ゲルタールアルデヒド
α３−を加えた。

この溶液を３７℃で１９時間加温し、その後セファデッ
クスＧ−２５カラムを通過させて過剰のゲルタールアル
デヒドを除去し良。２５０　ｎｍの吸光度の強いボイド
・ボリュームフラクシ璽ンを採取し、ｐＨ９，０のジア
ミノジグロビルアミン（水２０ｗＬｌ中にてα５−をと
かし丸もの）の溶液に性別した。この溶液を４℃で一夜
反応させた。次いで反応混合物をセフアゾ、ブクスＧ−
１５０カラムに通し、２５０　ｎｍで相当の吸光を示す
フラクシＷンを等量ずつ四フラクシ嘗ンに集め、篤２フ
２クシッンをパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）　Ｋ結合さ
せた。ＨＲＰを室温で１５時間ｐＨ７，０で１２５％ゲ
ルタールアルデヒドと反応させ友。反応混合物をセフ１
デブクスＧ−２５カラムに通過させた後、ＨＲＰ−含有
７ラクシ茸ンを一緒ＫＬ、前記ポリアクリルアミド−ジ
アミンに添加し、ｐＨを９０に調整し、この溶液を４℃
で一夜反応させた。このパーオキシダーゼーポリアクリ
ルアミドジアミンヲ、次いでバイオゲルＰ−１００カラ
ムに通し、ボイド・ボリューム部を集めて濃縮し、次い
でペニシリンと反応させた。ペニシリンＧは５０１ｖこ
のパーオキシダーゼ−ポリアクリルアミド−ジアミンに
添加し、ｐＨｔ９．０１１ｃ調整して４℃で一夜攪拌し
た。この調製物を次いで十分に透析し、次いで分析に使
用した。

親水性表面を有するα５Ｘ＆Ｏａｓのポリエステルフィ
ル五片を切シとυ、この表面にワットマン３ＭＭクロマ
トグラフィー用−紙片を貼夛つけてバンド状ストリップ
を調製した。一方の（デュポン社のマイラー（ＭＦＬ＆
ｒ　）　）　ｙイルム片に、長さｌ−の戸紙片３枚を各
々２簡のスペースを置いて貼如付けした。マイツー上゛
のＰ紙をα０２嚇０−ジアニシジン水溶液で湿めらせた
。

次いで各スペースをＩＫＧ−セルロースおよびグルコー
ス酸化Ｗ素−セルロース夫々の５０憾懸濁液を２０：１
に混合してｉ！１１ｍ１！した微結晶セルロ各々１０μ
を含浸させた。これらのストリップを風乾し、次ｉで使
用時まで乾燥状１１に保存した。

ストリップの長いｐ紙スペーテーを有する末端を現象液
の入った小バイアルに入れて現象した。この溶液は、パ
ーオキシダーゼ−ポリアクリルアミド−ジアミン−ペニ
シリン（α２５μ２／ｄ溶液にして２５ｓＬ分）、グル
コース（ｐＨ６，０のα２Ｍリン酸緩衝液中の１．１２
５１グルコース溶液としてα３−分）およびペニンロイ
ルーアミノカグロン酸（ＥＡＣ）の水中希釈液１０μｔ
を会む。上記条件において、２０〜３０分後にノ（ンド
が桃色に発色するが、現象液中にベニシロイル−ＥＡＣ
が存在しないときは、一つの）（ンドが発色し、ベニシ
ロイル−ＥＡＣ（〕１ブテン）か０．４マイク四モル存
在すれば二つのバンドが発色シ、ベニシロイル−ＥＡＣ
が１．０μＭ存在すれば三つのバンド全部が発色した。

所望もしくは必要により、パーオキシダーゼに対する抗
体、　ＨＲＰ−結合レクチンまたはその他のパーオキシ
ダーゼに対する結合剤もしくは不活性化剤をスペーサ一
層に含ませて、反応帯呈色掬定の鋭敏性および＃度を向
上させることもできる。さらに、スペーサ一層にカメラ
ーゼを不溶化して、該スペーサ一層に発色を生ずること
なく反応帯での発色をより速めることもできる。

実施例８ 実施例７と同様にしてバンド状ストリップを製造したが
、試験すべきサンプルを除く全分析成分をストリップに
含１せた。ノ（−オキシダーゼ−ポリアクリルアミド−
ジアミン−ペニシリンをｚ５鳴グルコースおよびｐ）１
４０リン酸緩衝１１１Ｏ，２Ｍを含む０．５ないし１０
％ゼラチン溶液に溶解し、そのα１−を下端ｐ紙片に含
ませて乾燥した。したがって、この実施例においては、
使用者は分析成分を含有すると思われる溶液にストリッ
プを浸漬し、所定時間経過するのを待ち、次いでストリ
ップ上の発色バンド数を数えて結果を判読するのみでよ
い。

実施例９ 実施例３と同様に分析カラムを製造したが、反応ＩＦは
ＩｇＧ−アガ四−スおよびグルコース酸化酵素−アガロ
ース（２０：１）の混合物よ〕形成シタ、バーオキシダ
ーゼ−ペニシリン１１例７と同様にして製造）、グルコ
ース、Ｑ−ジアニシジン、およびリン酸緩＠液（乾燥状
態で保存シておいたもの）を試鯉サンプル１．０−に溶
解し、次いでこれをカラムに導入して通過させた。所定
時間抜にカラム上の発色バンドの数から結果を判読した
。分析すべき試験溶液中に添加した試薬は、小ペレツト
状であってもよく、成る込はサンプル等の容積を淵ｊ定
するためのホ答器のキャンプの裏面に乾燥付着させてお
イテもよめ、後者の場合には、容器にサンプル液を歯し
、キャンプをかぶせ、容器を数回逆さにし、その後サン
プル液をカラム処性別する。さらに、サンプルと混合す
べき試薬はカラム頂部に被せてめる小プラグに乾燥付着
させておしてもよく、その場合ｄＸｆＸダンをカラムに
性別したとき溶解する。

反応帯で発色を得るために他にも種々の酵素の組合せを
使Ｊ隻することができる＝例えばアルカリホスファター
ゼを反応帯に不溶化Ｌ　、β−ガラクトシダーゼを分析
成分に結合させてもよ−、アルカリホスファターゼの基
質としてす７トール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−６
−ホスフェートを用いれば、ナフト−身−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドを生じ、これをβ−ガラクトシダーゼで
加水分解してす７トールを生成せしめ、これからジアゾ
ニウム塩の存在下に反応帯で呈色生成物を生じさせるこ
とができる。

本発明装置の精度および信頼度は、各々の反応帯での発
色もしくは他の検出可能な変化がどの程度容易に確保し
うるかによりある＠度決定される０分析成分の流れ方向
の反応帯は、好１しくは、分析成分または他の検出すべ
き物質が、先行する反応帯を有意である最低量だけ通）
抜けたときのみ検出しうる変化を示すことを要求される
；何故ならば、装置の物塩構造上、しばしば各反応帯で
反応が十分完了することを許さず、小さいテーリング、
例えば微量の物質が後段の反応帯に流れ込み、それらの
反応帯でかすかに検出されて、判読の困難な結果を与え
るこ、とかめるからである。しかしながら、この問題の
大部分は数種の方法で回避可能である。検出すべき最低
濃度以上の化学成分にのみ感受性を有する検出剤を使用
することができる。例えば上記実施例において０−ジア
ニシジンの代Ｊ）ｋ発色剤としてＯ−フェニレンジアン
ンを使用すれば、感度を低めることができる。別め方法
は、実施例７に記載したように、スペーサ一層中または
、あまル好ましくはないが、反応帯中に微量物質を不動
化もしくは不活性化する能力のある清浄剤を少量加える
ことよりなる。これにより、本発明の装置の感度および
使用性を物足の分析への所望に応じて調節することがで
きる。

感度および精度の調節は、固体反応帯中の反応体量にも
依存し、ある分析においては発色生成物のような物質の
溶解性にも依存する。

本発明を好ましいＮａＩに基づいて説明したが、本発明
および特許請求の範囲を逸脱することなく、種々の変法
、応用および修正を行ないうろことは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の一例の部分Ｗｒ面図を表わし、 第２図は本発明の他の装置例の部分断面図を表わし、 第３図は＃Ｉ２図の９３−３に沿う断面図を表わし、 ｆｊｇ４図は本発明の他の装置例の平面図を表わし、 ＪＩｓ図は本発明の他の装置例の斜視図を表わし、 第６図＃ｉ第５図の線６−６に沿う部分断面図を表わし
、 第７図は本発明の他の装置例の一部欠損斜視図を表わす
。 １２・・・　カラム １４・・・支技体 １６．１６．１，１６２．１ａ３−　　反応帯１８・・
・スペーサ一層 １９−　ｆｉ体 ２０・・・空間 ２２・・・プラスチックホルダー ２４・・・芯 ２６　・・・　試験管 ２８・・・試験溶液 ３０・・・　ｒ紙ディスク ３０．１・・・　ウェル ４０・・・沖紙片 特許出動人 バイオ　メトリック　システムズ　インコーホレイ・デ
ッド化　　理　　人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　分析成分もしくはその誘導体と反応して予定生
   成物を生じうる反応体を所定量不溶化して有する連続隔
   置された所定数の反応帯を下記通路内部に有する流体流
   れ通路を規定する流体浸透性固体媒体よりなり、前記各
   反応帯中で反応成分本しくはその誘導体、試薬または予
   定生成物の検出が可能であ妙、そして、これらが検出さ
   れた反応帯の数によって試験流体中の分析成分量を定量
   する装置。 （２）　　流体浸透性固体媒体が反応体との間に流体流
   通性であるが、該反応帯とは分離されたスペーサ一部を
   有する特許請求の範囲！［１項記載の装置。 （３）Ｉ６帯中の流体浸透性媒体がその中に定量分析す
   べき分析成分を不溶化して有する特許請求の範囲第１項
   記載の装置。 （４）　　反応帯中で分析成分もしくはその誘導体、試
   薬または予定反応生成物を検出するだめの検出手段を有
   する特許請求の範囲第１項記載の装置。 （５）　　反応帯がカラム中に垂直に重層された特許請
   求の範囲第２項記載の装置。 （６）反応帯が流体を毛細管現象で吸収しうる固体繊維
   状材料ストリップの長さ方向に沿って隔置された特許請
   求の範囲第２項記載の装置。 （７）　　反応帯が同心円状であ妙、そしてスペーサ一
   部が各々の間に反応帯を挾んだ同心円の形状である特許
   請求の範囲第２項記載の装置。 （８）流体流れ通路に沿う流体の流速を調節するための
   流速調節手段を有する特許請求の範囲第２項記載の装置
   ・ （９）反応帯またはスペーサ一層中に、微量の分析成分
   もしくはその誘導体、反応体または予定生成物の検出を
   抑制する手段を有する特許請求の範囲＠１項記載の装着
   。 （１０）反応帯がその内部に酵素を不溶化して有し、該
   反応体が分析成分−酵素結合物である分析成分と接触し
   たとき、前記酵素の一方が他方の酵素の基質を生ずる能
   力を有することＫよって、該反応帯が発色するに特に適
   するようにした特許請求の範囲第３項記載の装置。 （１１）分析成分−酵素結合物が反応帯の上流の層に含
   有され、これによ抄、担体流体に運ばれて分析成分が前
   記層に流れると分析成分結合物が反応帯へ運ばれる特許
   請求の範囲第１０項記載の装置。 （１２）分析成分もしくはその誘導体と反応して予定生
   成物を生じうる反応体を所定量不溶化して有する連続隔
   置された所定数の反応帯を下記通路内部に有する流体流
   れ通路を規定する流体浸透性固体媒体よりな抄、前記各
   反応帯中での反応成分もしくはその誘導体、試薬または
   予定生成物の検出が可能であ抄、そして、これらが検出
   された反応帯の数によって試験液中の分析成分量を定量
   する装置を用意し、試験流体を流体流路および隔置され
   た反応帯に連続的に流し、そして 反応帯各々における分析成分、分析成分誘導体、反応体
   または予定生成物の存否を検出し、該検出がされた反応
   帯の数を指標として流体中の分析成分を定量分析する方
   法。 （１３）分析成分および反応体の夫々が特定のりカント
   −抗リガンド結合の各成分のいづれか一方の成分である
   特許請求の範囲＠１２項記載の方法。 （１４）反応体が該反応体に特暴的な抗体金倉む特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 （１５）分析成分と反応体との反応が分析成分、分析成
   分誘導体、反応体または予定反応生成物を検出工程中に
   検出されなくするものである特許請求の範囲第１２項記
   載の方法。 （１６）流体が分析成分と検出工程で存在を検出しうる
   化学成分で標識された既知濃度の分析成分とを含有する
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （１７）　　化学成分が酵素である特許請求の範囲第１
   ６項記載の方法。 （１８）流体がミルクであり、分析成分がペニシリンで
   あり、反応体が抗−ペニジリン抗体を含む特許請求の範
   囲第１６項記載の方法。 （１９）流体が既知量の酵素標識ペニシリンを含む特許
   請求の範囲第１８項記載の方法。 （２０）　　ｆ＋析酸成分含有する単一流体のみが流れ
   通路に流される特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （２１）流体が実質的に分析成分および担体流体よりな
   る特許請求の範囲第２０項記載の方法。 （２２）流体が分析成分および分析成分誘導体を含有す
   る特許請求の範囲第２０項記載の方法。 （２５）微量の分析成分、分析成分誘導体、反応体また
   は予定生成物の検出を抑制する工程を有する特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。 （２４）標識分析成分との競合下に反応成分と反応して
   予定生成物を生成しうる反応体を不溶化して有する流体
   流れ通路を規定する流体浸透性固体媒体を用意し、 未知量の分析成分と既知量の標識分析成分を含有する流
   体を前記流れ通路に流し、そして 前記流れ通路に沿って、標識分析成分または予定生成物
   の存在を検出し、 それらが検出された流れ通路の長さを流体中の分析成分
   の１指標とする、 工程よりなることを特徴とする、分析成分の定量分析法
   。 （２５）抗ペニシリンおよび標識ペニシリン抗体を有し
   、標識ペニシリンと競合的に反応して予定生成物を生成
   しうる反応体を不溶化して有する流体流れ通路を規定す
   る流体浸透性固体担体を用意し、 未知量のペニシリンと既知量の標識ペニシリンを含有す
   る流体を前記流れ通路に流し、そして 前記流れ通路に沿って、＊＊ペニシリンまたは予定生成
   物の存在を検出し、 それらが検出された流れ通路の長さを流体中のペニシリ
   ン童の指標とする、 工程よりなることを特徴とする流体中のペニシリンの定
   量分析法。