JPS58181716A - アミノ含有生物的活性物質用の支持マトリツクス - Google Patents

アミノ含有生物的活性物質用の支持マトリツクス

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物的活性物質、特に酵素を共有結合によっ
てカップリングすることので會る珪質キャリヤーＯ改良
活性化法に関する。よシ特定的には、本発明は、単位容
量当シの活性度が高いことを特徴とする、多層式の不動
化酵素複合体（１ｍ１ｇ＋ｏｂｉｌｉｇ＠ａ　＠ｎｇｙ
ｍｅ　ｏｏｍｐａｍｉｔｓ　）の調製に有用な珪質キャ
リヤーの製造に関する。
＃素は、工業的にきわめて有用な蛋白性触媒物質である
。まえ、酵素はしばしば高価な物質でもある。一般に酵
素はそれぞれの基質に可溶性であｐ１転化生成物が着る
しく価値あるものでない限ｐ１酵素を再使用する九めに
回収することは困難であるか、又は不可能である。処理
条件下で酵素が破壊される場合もある。酵素が破壊され
ない場合でも、食料品のように酵素の活性が続いている
と１ｉ１箇しくない影響が生じるような時には、これを
砿壊しなけれはならないこともおこ９うる。
これらの問題を（ロ）避する目的で、最近固定又は不動
化された酵素系が一発された。獣着、力ｆ−にル化及び
共有結合が多くの酵素について日常的に用いられている
。多くの方法から選ばれる不動化方法は、パッチ又は連
続法Ｏいずれに％８用できる組成＃を生成するが、経済
的な面から見て連続法で用いるのが最も有利である。
例えば米国特許第３，５１９，５３８号におけるごとく
、「非可溶化酵素」という用語が、共有化学結合によっ
て不溶性の無機キャリヤーに力ツノリングされ、水に不
溶性となった＃ｊＩをさすものとして過去に用いられ九
ことがあるが、本明細書で用いる「不動化」という用語
は、キャリヤーに固定された酵素又は他の生物的活性物
質について用いるものとする。
本明細書で用いる「安定化され九」という用語は、老化
もしくは高められ九温直にさらされること、又は触媒と
して反応に利用することに起因して、さもなくば起こる
であろう活性のロスに対して安定化された酵素のような
生物的活性物質について用いる。
酵素の不動化法を行うに蟲っては、多くの重要な点を考
慮する必要がある。酵素活性のロスを極力少なくしなく
てはならない。不動化の費用は低摩でなくてはならない
。キャリヤーは、酵素の利用期間中、酵素の作用に有害
な影響を与えないもＯでなくてはならない。特に食品加
工に応用する際、不動化された酵素は、反応混合物中に
酵素又は他の物質を漏出してはならない。長期の操作（
反応）時間にわた夛、工業的方法では一般に半減期（ｈ
ａｌｆ−１１ｆ・）として一定される酵素の活性度が轟
く維持される必要がある。さらに、不動化されｆｉｃｗ
Ｉ素は、適当の生産量を可能にする良好なハイドロリッ
ク％性（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｌｓ
ｔｉａｓ）を示さなくてはならない。また、不動化され
た酵素が、適当な操作温度に耐え、実用的な操作速度管
許容することが可能であって、しかも活性のロスを可能
な１ａｊｌ少なくするものでなくてはならないことも、
同じように重要である。
また、経済性から考えて、好ましくはできるだけ四半な
方法による、廃不動化酵素を再活性化する丸めの再装填
が可能であることがｉｌましい。
当技術分野における研究の成果として、当初は単に水不
溶性のキャリヤーに酵素を不動化させようとする試みか
ら、前掲Ｏ実際的な問題点のすべてを解決するような不
動化酵素の生産を目的とする高度の研究がなされるよ５
になった。
今までに行われた研究の代表的なものが、いくつかの米
１ｉ！１％許に開示されている。
米国特許第３，５１９，５３８号におりて、メッシング
（Ｍ＠ｓｓｉｎｇ　）及びライ−トール（Ｗｔｅｔａｌ
ｌ　）は、中間シランカツプリング剤を介して無機キャ
リヤーに共有結合で酵素がカップリングされ、カップリ
ング剤の珪素部分がキャリヤーに結合し、そしてカップ
リング剤の有機部分が酵素に結合している不動化酵素組
成物を開示している。制御された気孔率を有するガラス
がキャリヤーとして好ましいとされてはいるが、しはし
ば珪質である、広範囲の無機キャリヤー物質が有用であ
るとＩＩｅ載されている。硝酸に実質的にさらした後、
＃［素雰囲気内における焙焼を行ってキャリヤーが製造
されていゐ。
粒子状（ｐａｒｔｉｏｕｌａｔ＊　）で珪質のキャリヤ
ーを最初のオルガノシランとの反応に用いる例のほとん
どすべてにおいて、キャリヤー粒子は、まず活性化され
ることＫよって、それらの表面に酸素基もしくはヒドロ
キシル基、又は両方の基がもたらされる。普通ヒドロキ
シル基は、珪質物質と強酸との反応によって生成する。
従って、メッシング及びライ−トールの米ａｔ特許第３
，５１９，５３８号においては、少なくとも連続的に６
時間高周波音による分解（ａｏｎｉｃａｔｉｏｎ　）　
を施しながら、多孔質の石英ガラス粉￥ｔ８０℃ＯＯ，
２Ｍ硝酸中で洗っている。このガラスを次に蒸留水で数
回洗浄し１次いで酸素の存在下において１夜６２５℃に
加熱する。このように処理されたガラスは、γ−アミノ
プロピルトリエトキシ　シランとの反応にその１１利用
できると考察された。共有結合原子価のカップリング剤
を用いることによシ、トリノシンがシル化処理されたガ
ラスにカップリングされ九米国籍許第３，５５６，９４
５号において、メツシングは有効アミン基を有する酵素
を用いておル、アミン−シリケート結合及び水素結合に
よシ、反応性シラノール基を介して酵素を多孔質のガラ
スキャリヤーにカップリングしている。この場合にも、
キャリヤーは酸処理の後、加１ＩｂＩＰ内で加熱すは、
酵素がキャリヤーのシル化及び架橋剤による結合によっ
て珪質物質に結合されている不動化酵素組成物を開゛示
して騒る。キャリヤー粒子の予備処理について祉言及し
ていない。該特許明細書の例１においては、γ−アミノ
プロピルトリメトキシ　シランを粒子状のシリカと反応
させ、次いでかく押下に酵素を加え、そして次にホルム
アルデヒドの水溶液を加えている。例６においては、特
定されていない形態の珪緻カルシウムキャリヤーを、ｒ
［１，２５３ｉｔｌＤｒ−７＜ノノロビルトリメトキシ
　シランによって乾式カップリングし、水中（５０ｍ）
にスラリー化し、枯草Ｉ（ム５ｕｂｔｉ１１ａ　）　酵
母混合物」を該スラリーに添加している。スラリーの−
は８．０に調節され、共有結倉カツノリング剤としては
ゲルタール　アルデヒｙが用いられている。この例にお
いては、−がアルカリ性である時点において、珪酸カル
シウムキャリヤーはオルガノシランとの反応をすでに終
えている。
本発１１ｉＫよシ、不動化され九酵素又はその複合体ｔ
−製造するえめの篇−の１定としてのオルガノシラ／と
の反応に用いるための粒子状の珪質キャリヤー物質が製
造される。その製造方法は、アルカリと反応させ友後、
峡で処理し、単位容量当シ多数の反応性−〇Ｈ基を中ヤ
リャー物質の表面上に生じさせるものである。この際包
含される加水分解Ｏ根皮は、−１温度及び反応時間によ
って左右される。
本発９１１Ｏ好ましい態様においては、米国標準篩寸法
で約６５１にいし約２３０メツシユの粒径を有する市販
Ｏシリカゲルを、強塩基、次いで強繊と反応させること
により、キャリヤー粒子０表面に遊ｇｏヒドロキシル基
を発生させる。活性化された珪質のキャリヤー粒子を次
にオルガノシランと反応させるととＫより、シル化され
九ベースを得、そのペースに対し、シアル−ヒトのよう
な二官能性のカップリング剤を用いて有効アミン基含有
の酵素又は他の生物的活性物質管カップリングする。
生物的活性物質は、好ましくは＃素、そして最も好まし
くはラクターゼ（１１１０３，２，１，２３）であるが
、カップリング用の反応性基、好ましくはアミン基が生
物的活性物質に含まれている＠ｐは、抗原、抗体、ホル
モン、又は他の蛋白性物質であってもよい。
一般には、アミン置換基を有する加水分解性のシランが
、活性化されたキャリヤー粒子上のヒＰロキシル基にカ
ップリング畜れる。次に多官能性のカップリング剤がシ
ラン上Ｏア建ン基と反応する。多官能性の物質はＩリア
ンド又はビスーイｔデートであるのがｉｉｌましいが、
他の同種Ｏ物質も使用で寝る。次に１未反応の物質ｔ−
除去し九俵、有効アミン基を有する生物的活性物質、例
えば酵素を遊離（未反応）のアルデヒド基と反応させる
。
この１楓で、酵素その他の物質が活性の実質的な一スを
伴わずにキャリヤーに共有結合される。
こｔ）８階においては、単一の量、すなわち「層」の物
質、例えば酵素が、共有結合によってキャリヤーに不動
化されている。単一容量Ｍｋりの珪質キャリヤー上の有
効な反応性とＶロキシル基の濃度が高いため、単一容量
ｍｊＩｏ有効活性度は、従来Ｏものよルも高いはずであ
る。
不動化され喪物質、好ましくは酵素は、有効アミン基を
有しているので、これらの物質は、今度は追加量の／　
ｌｊアルデヒド、好ましくはグリオキナールと反応する
ことになる。洗浄した後、追加Ｏ物質、例えば酵素を加
え、その有効アミン基を通じて未反応のアルデヒド基と
共有結合させ、最初に不動化された物質と追加の物質と
の間に共有結合を形成させる。
不動化され喪物質のすべてが酵素であれに、二つの不動
化された酵素の「層」が生じ、一つの層はキャリヤーに
共有結合し、他の層は最初に不動化堪れ九鯵素Ｏ「層」
に共有結合している。「層」ということばは表現として
適切ではないが、便利であるし、また当業者であれば意
味がわかると思うので、本明細書ではこの用語を用いる
ことにする。
この方法を所望の回数繰返すととＫよ）、多層式の不動
化組成物を生成する。この組成物祉、高活性度を保持す
るように製造することが可能であ如、単位容量蟲シの高
活性度を有し、ｉ九抜群に良好な熱安定性、良好な牛滅
期及び実質的な機械的強度を有するようＫｌｉ造できる
。
好ましい態様においては、キャリヤー物質は微細に分割
された自由流動性の粒子状の珪素物質であυ、シリカゲ
ルであるのが最も好ましく、そして不動化される物質は
酵素、ラクターゼ（ｎ。
３、２．１．２３　）である。こ０１１の不動化ラクタ
ーゼを用いることによシ、ホエーをさらに有用な製品に
転化することができる。
本発明によって不動化された酵素組成物を製造するため
には、キャリヤー物質は粒子状の形態であるのが望まし
く、微細に分割され、そして自由ａｗｋ妹であるのが最
も望ましいが、それ以、外にも、ＩＩ＃１、管、シート
、ビーズ又は多孔質のガラスの形態とすることができる
。いずれの形態であっても１単位容量轟）Ｏ表面積がき
わめて大でなくてはならない。
キャリヤーは、任意の化学的に不活性である、天然又は
合成の珪質物質であってよい。この稲の物質には、粒状
、ＩＩＩＩｊＡ状及び微細粒子のシリカが包含される。
またキャリヤー物質は、例えば多孔質のガラス又はこの
種の任意の珪質物質であって、所Ｉｉｉの目的用途にお
ける加工処理が可能な形１１を有するか、又は有するよ
うに形成しうみもの、単位容量轟多Ｏ＊面積が大である
もの、及びオルガノシランもしくは臭化シアン　カップ
リング剤の加水分解可能基と反応しうる活性ヒドロキシ
ル基【その表面に有するか、又は有するように処理でき
る物質とすることができる。
好ましい態様においては、ダル粒子の表面にヒｙ−キシ
ル基を生じることによる活性化を目的とし、シリカゲル
ｔ−強塩基で処理し、次に強酸で処通ずる。シリカゲル
の粒子０表１ｉＫおけるｌｌ−０４基の加水分解は、−
に依存する。加水分解の速度及び稠度は、−が一定であ
れば温度が高いはと大とな〕、又−が高いほど大となる
。素置−０実施に好ましい条件には、１１０！　（重量
で約２１１０機度）又はＩｏｎのｏ、５ｍ１ｌｔｔ−用
いることが包含される。これらは共に＞１５ｔ）ＦＨを
有する。
２０℃において、中性又は酸性−の場合。に較へ〉１１
の−においては最低で４５倍の一８１０Ｈ基（８１０１
１ａ、８１０ｘ等の形のもの）をシリカゲル上に生成さ
せる仁とかで龜る。別のことばを借シれば、中性又は酸
性−の時よシも５倍以上も多い単位容量ごとの加水分解
が、ｐＨ）１１０場合に起こることになる。
強塩基性の条件下、すなわち、ｐＨ＞１１にあっては、
シラノール基は−１１１０−Ｈａ”、−８１０−に＋等
として存在するので、硝酸のような強敵による中和によ
って金属イオンを除き、爾後の化学反応に役立つように
ヒドロキシル基音取戻すことが必要である。
本発明の一つの目的は、キャリヤーの完全一体性【着る
しく損うことなしに、単位容量ｍ夛可能最大＠Ｏ多ａＯ
有効な反応性ａｔｏｍ　ｔｉ　を生成することである。
最善ＯＭ釆を得るためには、−１温度及び反応時間とい
う三つの重要パラメータについて慎重な注意を払わなく
てはならない。
好ましい強塩基は、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウ
ムの＊＊であＪ）、２０”０〜４５℃において％６０分
ないし２時間又はそれ以上的０．１ないし約５−１好ま
しくは１−ないし５−の濃度で用いるのが望ましい。例
えばアルカリ金属及びアルカリ土類金属の各水酸化物の
混合物、炭酸す）＄７ｔム及び炭酸カリウム（ＰＨ＞１
２）、水酸化アン峰二りム、ならびにとｎらの２種又は
それ以上の混合物のような他の高度に塩基性の物質も用
いることができる。水酸化カルシウム（−約１０．５　
）は、ｉｌｍＫが低いか、又は不溶性の物質に関連した
間離【生じる恐れがあるので、良好な選択とはいえない
。しかしながら、少なくとも理論的には、−〉１０の任
意の水性反応体を用いてシリカゲルの活性化を開始する
ことができる。特定的な反応温度、反、応待間及びアル
カ９性の強度の遍択は、使用する珪質キャリヤーの安定
性によって変わる。
キャリヤーから金属イオンを除去し、反応性のヒト四キ
シル基を発生させる九めに用いる酸は、洗い流しが容易
となるように金属イオンと反応して可溶性の塩を形成す
るもＯであることが望ましい。任意の鉱酸を用いること
ができ、他の有機及び無機の酸のうちのなんｍｍかは使
用できる。効率、経済性及び入手容易性の点で鉱酸が好
ましい。
油性化されたキャリヤーを、カップリング剤、好ましく
はシランと反応させる。シランは、シラン分子の一部分
においてキャリヤーのヒＰロキシル基にカップリングし
、そしてシラン分子の他の離れた部分において反応性の
アミン基を提供する。
好ましい柚類のシラン系カップリング剤は、弐Ｈ，Ｎ−
Ｒ−８１（ＯＲ１）３ （式中、Ｒはアルキレン基で６９、そして１分子当９６
個會筐れるＲ１はアルキルであるのが望ましく、低級ア
ルキルであるのが最も望ましい）を賽する。６個のＲ１
置換基は、所与の分子において同一であってもよいし、
又は異なっていてもよい。
次Ｏ工１においては、適幽な溶剤媒質中に溶解し九適量
の多官能性の反応体、好ましくはポリアルデヒド、そし
て最も好ましくはグリオキサール（エタンジアール）′
ｔア電ノン−反応性シリカゾル又は他のキャリヤーと接
触させる。好ましい態１１においては、この処理によっ
てシリカゲルがアルデヒド−反応性すなわちアルデヒＰ
−官能性となる。
次に、このアルデヒド−官能性のキャリヤーと、有効ア
ζン基を有する酵素（又は他の生物的活性物質）とを混
合する。Ｗ／ＩＩ素の有効アミン基は、キャリヤーの遊
離アルデヒド基と反応して酵素をキャリヤー上に不動化
する。次にこの複合体（ｃｏｍｐｏｓｔｔ・）を洗浄し
て過剰の未反応物質を除く。
この段階においては、不動化された酵素は、第一〇量又
は層の酵素が共有結合したキャリヤーで梼戚嘔れている
。その酵素は、有効アきン基を有する酵素である。
すでに指摘し九とお）、アルカリ処１１によ）％酸処理
の５倍以上の数のヒト四キシル部位が生成されるべ亀で
ある。酵素Ｏ不動化工ｌ！において実際に生じることで
あるが、理論上及び実際上の困難によシ、酵素の不動化
に関する上記増加の１０１饅達成は不可能である。しか
しながら、ある程度の確実な利得は保証される。下記の
第１１１は、酸処理によってシリカダルを活性化した第
一の場合と、前記のようにアルカリ−酸処理によってシ
リカゲルを活性化した第二〇場合との不動化されたツク
ターぜの活性度の比較を示すものである。用いた活性化
用試薬を除き、不動化技法は本質的に同じであつ九。比
較実験３及び６においては、比較のため、酸による活性
化処理と、アルカリ−酸による活性化処理の両方を用い
た。第１表のデータかられかるとお夛、本発明によるア
ルカリ−酸処理による単位谷量当シの活性度は、酸処理
によるものよシも常に高かった。
第　　１　　課 ６０℃における不動化ラクターゼの活 性度（単一層） エタンジオール 実験１　　　　　３．４３　　　　　　−実験２　　　
　　４．４７ 実験３　　　　　４，３２　　　　　５．５０実験４　
　　　　　　　　　　　　７．２９実験５　　　　　　
　　　　　　　６．０３ｒルタールアルデヒド 実験６　　　　　３．１　？　　　　　　４．９３実験
７　　　　　　　　　　　　　５．２３貢験８　　　　
　　　　　　　　　５．１８注：　ｔ　ラクターゼ基質
として０ＮＰＧ（ｏ−ニトロフエ二ルガラクトビラノシ
ド）ｔ−使用した。
多層式の不動化酵素複合体製造０次の工程においては、
単一層の不動化−嵩複合体を多官能性の物質、最も好ま
しくはグリオキナールと反応させて、アルデヒＶ−官能
性となるようＫする。次にそれを第二の量の酵素と反応
させる。＃酵素がζんどけグリオキサールを介して最初
に不動化された酵素の層に共有結合される。この方法を
次いで反復し、所望どおシの多量のｌｌ素を組成物に付
加することかで龜る。一般には、１０層以下であるのが
実用的であシ、酵素がラクターゼであって、キャリヤー
がシリカゾルである場合には、合計４層を施すのが最も
望ましい。反応体の量についての慎重な制御と、過剰の
反応体の除去とを行って適切な手Ｉ［を用いるならば、
酵素の活性度のロスは比較的少なくてすむ。
アルデヒド基とアミン基との反応は、低温でも容易に起
きやすいので、滴液中において５℃、及び１℃ｍ性から
適度の一範囲で反応を実施で龜る。
大抵のｗＩ素及び他のポリペＩチドのｐＫｆ［は、約７
ないし約８の範囲内である。従って、大抵ＯｗＩＩ素及
び４１Ｉ！０１１ｔリペプチドの不動化は、活性度が失
われないようなａＳな条件である。中性にきわめて近い
−で実施することができる。
装置−を！Ｊ麹するに轟っては、望ましくない架り＃倉
が生じる。Ｏを避けることが重要である。架橋麟倉の１
度は、用いる架橋剤、例えばグリオキナールの量及び澱
度を慎重に制御すること、及び共有結合が完了するため
の適尚な機会があっ先後、なるべく早目に洗浄を行って
未反応の過剰の架橋剤を除去することによって制限する
ことが可能である。
本ｉＩＡ明に従い、多官能性の試薬としてグリオキすダ
ルを用いてシリカダル上に多重層としてツクターｔ１１
１−不動化する場合、架橋剤及びその反応を適切に制限
することにより、保持される酵素活性度Ｏ量は、６層式
構造について１０〇一対７０鋒〜９５一対７０−〜９５
−Ｏ比率によって記述される活性度に相幽する。この比
率の関係は、蓄積活性ｔｏ記述子（ａ＠５ａｒｉｐｔｏ
ｒ　）として採用されるが、今Ｏ時点においてはどの層
で（いずれかの単一層で起電たとして）活性低下が生じ
九かは不明である。架橋結合を限定することによって不
動化酵素が安定化されるが、過度になると活性が低下す
る。活性度の低下をきたす若干の架橋結合は避は得ない
ように思われる。
本発明によって達成される、最初の不動化層における単
位容量ミルの酵素活性度を高めることは、追加の層を施
した時に見られる増催効釆（ｍｕｌｔｉｐｈｉ・ｒ　＠
ｆｆ・ａｔ）Ｋ起因して重要である。すなわち、最初の
不動化された酵素分子によってもたらされる反応部位に
、別の酵素が不動化されることができ、従って最初の不
動化された層の「密度」によって爾後のすべての層の「
密度」を制御できることを思えば、不動化された酵素の
「密度」は重要なｌ！素である。
本発明によって製造されるシリカゲル　キャリヤー上の
不動化された多重層式ラクターゼは、単位容量ｍｂの有
利な高活性度、機械的及び熱的に高い安定度、及び長期
間の牛滅期によって一般に特徴づけられる。
以下、装置＠０ｆｆＬい態様をいくつか例示することに
よって、本発明をさらに評しく説明することにする。特
に記載のない限り、これらの応用ｆＩＫおけるすべて０
部及び百分率は重量によるものであ如、そしてすべての
１度は摂氏度による。
例　　１ ドイツ国ダルム　シェタットのイー・メルク（１，Ｍｅ
ｒａｋ　）　製ｔ）ム、８．テ、Ｍ、３５〜７０メツシ
ュ（１’す＊　ｌ’　ル（５ｔｏｐ）ｎｌ　０　ｊ’　
ｔ　％　２１１　ＯＭａｉｎ溶ｉ［５〇−中に懸濁させ
ることによって活性化し九搗合物を加熱し、４０℃に１
時間半保ち、時々静かにかく拌した。次いでプラスチッ
クの７リツト漏斗を用いて、アルカリ性溶液ｔＦ別し先
後、漏斗に残ったゲルを２０１のＨＮＯ３１’ｌ液５Ｏ
ＷＬｌ中に懸濁して残存アルカリを中和し、デルから金
属イオンを除去した。
次に、この得られた親水性のシリカゲルを、酢酸でｐＨ
５，０に調節しておい九Ｔ−ア建）ｌロビルトリエトキ
シ　シラン０４−溶１［５０ｍ中に加えた。このｒルー
試薬混合物をかく押下に加熱して６５〜７５℃に１時間
保つえ。次いでこのシラン溶液をデカンテーシ冒ンし良
。
このプロピルアミン　シリカダル生成物ｔ４５１Ｋｏｎ
溶液で１約７．５に中和し、次にプラスチックの７リツ
ト漏斗上にて蒸留水で完全に洗浄し先後、保存用に真空
乾燥しえ。こＯもＯは、乾燥せずＫそのｔまで使用する
ことかで１１九。このプロピルアミン　シリカダル生！
ｉＬ愉は、例えばグリオキナールのようなジアルヂヒＰ
Ｋよる共有結合１−利用して、有効ア建ン基を有する任
意の生物的活性愉質、例えば酵素、ホル篭ン、免疫反応
体等を咳生成物上に不動化させるためのキャリヤーとし
て用いることができる。＃素電極の製造用の一般的技法
が特に有用で参る。
工＠Ｂ、　　アルデヒド　シリカゲル０製造工程ムのプ
ロピルアミン　シリカゲル２５ｉａＺｔフラスコ内に入
れ、試薬アルコールｌ５ｔｔむ、０．１Ｍ燐鐵カリウム
　バッファー液（ｐｉ−１８，０）中０Ｏ０１−エタン
ジアール（グリオキナール）溶液５０−と混合した。フ
ラスコを直ちに真空排気し、Ｍｌ　ｆスを満たした後、
約４０℃に１時間半加熱し、時々静かに振とうした。次
にプラスチックの７９ツト漏斗でこのアルデヒ？シリカ
ダルを一過し、蒸留水で洗い、直ちに真空乾燥して保存
しえ。酸化を防ぐため、容器にＮ、を満たした。
７にテに−Ｖ　Ｖ　リｌｙ　ｌ’ル２５　ｄｆ、０．１
Ｍ１ｌｌｊｌｌ＊Ｊウム−５ｔ！ＪＭ　　Ｍｇ１ｉＯ，
（ｐＨ７，３）中の希釈ツタトテム（Ｌａ＃ｔＯｊ７ｍ
　）　７５　ＣＩ　Ｌラクターゼ〔デンマータ圓の）が
・インダストリ社（ＭＯｖＯＩｎｄｕｓｔｒｉム８）〕
５０ｄ中に加えた。酵素の量は、カッ！リングに必要な
量よｐも過剰である。反応薯器を直ちに真空排気した。
１ｉｌＩＩｌで１時間反応させ、その開時々静かに振と
うした。
プラスチックのフリット漏斗上でラクターゼ−シリカ　
ｒル生成物ｔＦ’遇して過剰の酵素ｔ−除き、洗浄バッ
ファー液（０，０２Ｍ　Ｏ燐酸カリウム、５建りＭ　（
Ｄ　Ｍｇ８０．．４７．０’　）で洗つ九。次にラタタ
ーゼーシリカダルを酵素バッファーｔ　（０，０４Ｍの
燐酸カリウム、５ミリＭ　Ｑ　Ｍｇ８０．、Ｐ）１７．
０）中に懸濁し、４℃において貯蔵した。
工１！Ｄ、ａ％素の多重層式不動化 ２５１１／のラクターゼ　シリカゲル（沈降デル容量）
ｔｘ試薬アルコール１嗟を含む、酵素バッファー液（・
０．１Ｍの燐酸カリウム、５ミリＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ
７，３）中の０．１％ｘｌンジアール溶液５０１／に加
えてから、フラスコの真空排気を行った。時々静かに振
とうしながら、室温で１時間半反応させ九。
アルデヒＰ−官＊ｉ１酵素ダルｔＦ遇し、ＰＨ７の洗浄
バッファー液で洗った後、直ちに酵素バッファー［（０
，１Ｍ　　燐　自ｋ　カ　　リ　　ウ　ム　、　　　５
　　ミ　　リ　　Ｍ　　　　ＭｇＳＯ４、ｐＨ７，３）
中の希釈ラクトチム７５０Ｌツクターゼ（容量で２０倍
に希釈したもの、デンマーク国のハ←インダストリ社製
）溶［５０ｍに加えた。
この混合智を室温で約１時間反応させた。
七０表面上に不動化させたラクターゼの二つの「層」又
社塗布を有するシリカゾルキャリヤーｔ−−過し−ＰＩ
（７，０Ｏ洗浄バッファー液で洗い、−７，０の酵素バ
ッファー液中に懸濁し、４℃で保存し喪。
この同じ方法を反復することにより、第６、第４及びそ
れ以上のｗＩ嵩の「層」を不動化させたが、活性度のロ
スは比較的少なかった。
使用後、比較的低水準のラクターゼ活性度を多少保持し
ている、単一層又は多重層式不動化生成物から得られる
廃ラクターゼシリカゾルを再生することによル、そのラ
クターゼ活性度を増加及び回復させることが、工程りに
記載したと同じ手法に従って達成できる。廃酵素ｒルに
は、有効ア（ン基を有する共有結合された蛋白性の物質
がま友含まれており、工ｆｉｐにおけるごとくエタンジ
アールと反応させた後、ラクターゼの不動化を行うこと
かで亀る。
例　　２ 多重式の酵素不動化 第１の層の後に施す酵素層に、ラクトチム７５０Ｌの代
やにリパーゼ〔マイロス・うざラドリーズ社（Ｍｉｌｅ
ｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ・−２℃ｍｅ、）のマーシャ
ル（Ｍａｒ＋５ｈａｌｌ　）リパーゼ〕を用いた以外は
、例１の工１！Ｄにおけると同様の手法によった。
この不動化酵素組成物は、ラクターゼとリパーゼの両方
の酵素の活性を示しえ。従って、この組成物は、脂肪分
解クリーム及びパター油を製造するのに有用である。こ
のような生成物の制御された脂肪分解は、バター風味を
改良すること、及び（又は）種々の製品に利用すること
ができる。
同じように、第１層の次に施す酵素として、プロテアー
ゼであるデｐメリン〔米国のミツドウェスト・バイオケ
ミカル社（Ｍｌｗｅｓｔ　Ｂｉｏａｈ＠ｍ１ｃａｌｏｏ
ｒｐ、）製品〕を用い先取外は、例１のＤの方法を繰返
した。この不動化酵素組成物は、ラクターゼとプロテア
ーゼの両方の＃素の活性を示した。
この組成物は、チーズホエーの糖及び蛋白を加水分解さ
せるのに有用であった。
同じような方法によル、例１の工程りの手法に従い、第
１の層に続いて施す酵素として、リパーゼとプロテアー
ゼとの混合物を用いることができよう。得られる不動化
酵素組成物は、６種の酵素のすべて、すなわち、ラクタ
ーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼの活性を示すであろう
。このような組成物は、酪農製品を加工する際、乳糖及
びホエー蛋白の加水分解ならびに脂質の脂肪分解を制御
して風味全高めるのに有用である。
別法として、廃不動化酵素を用い、それをベースとして
、もとの酵素以外の酵素を、例１の工程ＩＯ方法におお
むね準じてペースに不動化させることもできる。
例　　６ カツ！リング剤としてグリオキサールを用い、また比較
のためにグリオキサールの代りに他のジアルデヒド【用
いて例１の方法を夾施し、シリカゲルの上にラクターゼ
會不動化した。
４ｆ１［類の構造的に好ましい異種のジアルヂヒＶを用
い、不動化に対する好適性の試験を行った。
それらの化学式を示すと次のとおシである：エタンジア
ール　　　　　　０ＨＯ−ＯＨＯ（グリオキサール） ｎ−ペンタン　ジアール０ＨＣ−ＯＨ，−ＯＨ，％−（
！ＨＯ（ゲルタール　アルデヒｒ） 不動化剤としてのジアルヂヒｒ類の濃度依存度を第１図
に示す。エタンジアールは、最高の活性度保持力（約ｏ
、ｏ　ｓ　ｓないし約１嘔のエタンジアールの濃度）を
有しておシ、最も良好なジアルデヒｒであると思われる
。グルタールアルデヒＰ及び０−フタル　ジアルデヒｒ
は、効果が劣シ、非常に狭い低濃度範囲（＜　０．３　
％　）でわずかに対等の効果を示すにすぎない。ｐ−フ
タル　ジアルデヒＶは、亀わめて低水準の有用性を示し
ていると−められる。
アルデヒドシリカダル上に不動化され九ラクターゼにつ
いての酵素の量及び不動化反応速度は、エタンジアール
の場合と、ゲルタール　アルデヒドの場合とで若干位て
いる。ラクターゼの第１層不動化及び第２層不動化につ
いての不動化時間コースと、上澄み液中の酵素濃度の消
失とを第２図に示す。
不動化されたラクターゼ活性度の温度依存度及び温度安
定性をそれぞれ第６図及び第４図に示す。
エタンジアール及びゲルタールアルデヒドで不動化した
ラクターゼの熱安定性ｔ−第２表及び第６−に示す。第
２、第６及び第４表に示すとおｐ１酵素の活性度及びそ
の活性構造的安定性（ａｃｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎａｌ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　）は、多重層式不動
化技法を用いることによって有効に高めることができる
。
また、積層不動化（ｌａｙ＠ｒｅｄ−１ｍｍｏｂｉｌｉ
ｇａｔｉｏｎ）によル、相対的熱安定度及び不動化ラク
ターゼの活性度は共に着るしく改曹されるが、グルター
ルアルデヒげによるよシもエタンジアールを用いた時の
方がはるかにまさるように思われる。一般論トシては、
ゲルタールアルデヒドは嵐好な不動化剤ではあるが、エ
タンジアールの方がより好ましいといえる。
例１の不動化＃素組成物は、ホエーを処理してその甘味
全改良するのに有用である。不動化酵素がラクターゼと
ぶどう糖イソメラーゼとの組合せである場合には、きわ
めて甘い製品が生成される。
定義 酵素の活性度の単位及び分析法 ラクターゼの活性度：　　１　０ＮＰＧ単位とは、遊隙
′ｔ＃素については、バッファー液（０，０２Ｍの燐酸
カリウム、Ｉ　Ｏ−’　Ｍ　ＯＭｎ−Ｃ１Ｂ　％　ＰＨ
７−０）中３０℃にかける毎分１μモルの０ＮＰＧの加
水分解として定−され、不動化酵素については、ｐＨ６
，７５の０．０６６モルの燐酸カリウム中で御ｊ定する
。
ＱＩＩＰＧ：　　ｏ−ニトロフェニルガラクトピラノシ
ド乳糖掬定：　シャツファーーソモギイ（Ｅｌｈａｆｆ
ｅｒ−１ｉｏｍｏｇｙｉ　）の微量法、ム、０．ム、０
．．５１．０５２　’ｉ用いる。
ｊｐ、Ｅう等測定：　ワースイントン　スタッチム（Ｗ
ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　８ｔａｔｇｙｍｅ　）のグルコ
ース（５０Ｑｎ虱）を用いる。
第５表　アッセイ　バッファー条件下で５０℃における
不動化ラクターゼの平均半減期。
ラクターゼは、不動化剤としてエタンジアールを用いて
シリカダル上に不動化しラクターゼの層　　　５０℃に
おける半減期６　　層　　　　　　　　　　　１１．５
分２　　層　　　　　　　　　　　　　８．５分１　　
層　　　　　　　　　　　　５．５分注：ｔ　不動化ラ
クターゼＯ活性度は、その最適−において測定しえ。
２、　ラクターゼの基質としてＯＭＰＧ　ｌ用いた。
総論 本発明′ＩｋｌＩ施するためには、珪質物質をアルカリ
で処理し、金属イオンを除き、次いで親水性の珪質物質
と、オルガノシランとの反応を、任意の好都合な方法で
、前者と後者とｔ−接触させることにより、オルガノシ
ランの加水分解可能基を介して所望の結合を得る方法で
達成することができる。
塩基による珪質キャリヤーの処理は、水酸化ナトリウム
もしくは水域化カリウム、又はそれら、の混合物、ある
いはその同等物といった強塩基の溶液を、−０Ｍ基（式
中、Ｍは金属である）を生じるに適し九温度及び充分な
時間でキャリヤーと接触させ、次にａｔ−用いて金属イ
オ７ｆ除去することによって残留ヒドロキシル基を生成
し、オルガノシロキサンとの最適な反応に供することを
包含する。もしも、キャリヤー物質の底面が清浄化され
ていない場合には、アルカリ処理と同時に、高周波音に
よる分解その他を清浄化の目的に採用することがで龜る
。
一般には、アルカリ金属水酸化物のような強塩基の溶液
は、約０．１％、好ましくは約１−から約５−までの範
囲内の濃度、及び室温（２０℃）又はわずかに高められ
た温度において用いられる。
好ましい温度範囲は約２５℃から約４５℃まであるが、
所望によっては、それよｐも高い温度を用いることもで
きる。塩基が例えに水酸化ナトリウムの水溶液であって
、その濃度が１−〜５−であシ、温度が約２５℃ないし
約４５℃の範囲であるならば、珪質キャリヤーＯ塩基溶
液による処理管、約６０分ないし約２時間で行うべきで
ある。
珪質キャリヤーの処理に際しては、キャリヤーが固形の
形態を維持し、処理が無効になる程度に浴液中にとけこ
むことのないように注意を払わなくてはならない。キャ
リヤーの溶解を防ぐＫは、強アルカリで長期間処理して
いる間にｆｆＩ液中に溶けこむ傾向を有する他のキャリ
ヤー１質よシも、シリカゾル、多孔質のガラス粒子、多
孔質のガラス円板（ｇｌａｓｓ　ｄｉｓｋ　）等管用い
るのが望ましい。
これらのキャリヤー物質よ如も溶けやすい珪質キャリヤ
ー物質に対しては、塩基として炭鈑ナトリラム、炭戸カ
リウム、これらの炭酸塩と水酸化物と０１１会物、高度
に塩基性の燐酸す）　ＩＪウム、水酸化アンモニウム（
ＰＨ約１０）等を用いることができる。
本ａｖｔｔｖＩ的には、水酸化アンモニウムはアル力り
全真水酸化物の同等物であると考えてよく、またアンモ
ニウムイオンはアルカリ金属イオンであると考えてよい
。
強酸性の物質、一般には鉱酸を用いて金属イオン【除去
する。この酸性物質は、溶液中に溶けこみ、キャリヤー
から洗い流されて、キャリヤーの表面に多数のヒドロキ
シル基を残留させるような可溶性の塩を形成するもので
なければならない。
通常オルガノシランは、トルエン、キシレン等のような
不活性彦溶剤に溶解し、その溶液を用いて珪質物質を処
理する。また、水浴性シランの水ｍａｔ用いてもよい。
オルガノシラン系カップリング剤の使用量は、珪質物質
の性質及び表面積によって変わる。通常珪質物質の１量
を基準にして、少なくとも約０．０１重量饅のオルガノ
シランを用いる。約０．２５ないし約２重量−の範囲と
するのが望ましい。
適当なオルガノシランには置換オルガノ　シランが包含
され、それらは式 ％式％］ （式中、Ｘはヒドロキシル基と反応しうる加水分解可能
基であＣ１Ｙは水素又は−価の炭化水素基であり、Ｒは
１から約２０壕での炭素数のアルキレン基であＪ）、ｚ
は架橋剤と反応しうる官能基で′１）Ｄ、ｎＦｉＯ又は
１の値を有する整数であシ、ａは１〜３の値を有する整
数であシ、ｂは０〜２の値を有する整数であ夛、０は１
〜６の値を有する整数で１りシ、そしてａ　十’ｂ　＋
ａの合計は４に勢しいものとする）で表わすことができ
る。
適当なＹ基の例には、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、
シクロアルコキシ、アリールオキシ、β−メトキシエト
キシ等のようなアルコキシ置換アルコキシ、アルコキシ
カルボニル、アリールオキシ　カルボニル、アルキルカ
ルボキシレート及びアリールカルメキシレート基が含ま
れ、それらの炭素数は８又はそれ以下であるのが望まし
い。
前記の式における適当なＹ基の例は、水素、メチル、エ
チル、ビニル、イソブチル及びその他のヒドロカルビル
基であって、それらの炭素数は１０又はそれ以下である
のが望ましい。
前記の式中のＲ基は、最高的２０、好ましくは約２ない
し約１８の炭素数の任意のアルキレンとすることができ
る。このような基の例は、エチレン、プロピレン、エチ
レン、デシレン、ウンデシレン、オクタデシレン等であ
る。
２基は、後に定義する架橋剤と反応しうる任意の官能基
であってよい。この種の基の例としては、アミノ、第−
及び第ニアミＰ１イソシアナト、ヒドロキシ、アルコキ
シカルボニル、アリールオキシカルボニル、ビニル、ア
リル、クロロ又はゾロモのようなハロ、その他があげら
れる。
こ０１ｓの官能基で特に好ましいのはアミノである。
本発明の目的に特に好ましいオルガノシランは、―−ア
ミノアルキル及びアミノアり−ルトリアルコキシ各シラ
ン、例えばｒ−アミノゾロピルトリメトキシシラン、ア
ミノフェニル　トリエトキシシラン等である。
本発明の目的に適する架橋剤は、ジアルデヒｒ１ビスー
イミドエステル、ビスプロピオレート及びジスルホニル
ハリｒである。
ジアルデヒドの例には、ｒリオキサール、ゲルタールア
ルデヒド、脅ロンアルデヒｒ１スクシンジアルデヒＰ等
があるが、炭素数２以上８以下であるのが望ましい。
ビスーイミＶエステルの例には、ジメチルアジピン酸イ
建デート（ＤＭＡ　）　、ジメチルスペリン酸（１デー
ト（ＤＭｓ）、Ｍ　、　Ｍ’−ビス（２−カルメキシイ
ｔＶエステル）、酒石酸イｔｙジメチルニスｆｋ　（Ｏ
］ｌ１ＴＤ　）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロ
ピオン識イミデート等がある。
ビスプロピオレートの例には、ジオールゾロビオレート
、例えはエチレングリコール　ピスデロビオレート、プ
ロピレングリコール　ビスプロピオレート、ゾチレング
リコールピスゾロピオレート、ヘキサメチレン　グリコ
ール　ビスゾロビオレート、デカメチレングリコール　
ビスプロピオＬ／−）％　シクロヘキサン　グリコール
　ビスプロピオレート、メチロールゾロパンジオールビ
スプロピオレート等、ならびにビスフェノールムプロピ
オレート、ペンタエリトリトールビスデロピオレート等
がある。
ジスルホニルハリドの例にハ、ヘンゼンー１．３−ジス
ルホニル　クロリド、ナフタレン−１，５−ジスルホニ
ルクロリド、ナフタレン−１，６−シスルホニルクロリ
ケ、ナフタレン−２９５−スルホニルクロリＰ等がおる
。
架橋剤の使用量は、複合体への添合が所望される＃嵩又
は酵素類の量に主として依存する。通常、′＃索と架橋
剤とのモル比は約１：１又はそれ以下である。約０．０
１〜０．０００１　／　１．０の割合が望ましい。
酵素と、架橋剤と、アルカリ処理された珪質物質に結合
しているオルガノシランとの結合は、任意の好都合な不
活性媒質、水性媒質中にお・いて、＃素を不活性化する
傾向のない一条件及び温度の下で行うことができる。約
６０℃以上の温度は一般に避けるべきである。本発明の
方法は、周囲室温において容易に実施できる。温度の選
択は、使用する特定の酵素又は酵素の混合物に主として
依存する。通常、温度範囲は約−５℃から約６０℃まで
とすることができる。約０℃から約１０℃までの温度と
するのが望ましい。
一般には、最初の酵素層の不動化について述べた上記の
条件と同じ条件を、第２層以下の酵素の不動化に適用す
ることができる。
ジアルデヒドは、本発明に用いるのに好ましい多宴能性
試薬である。第１図及び第２表が示すように、ジアルデ
ヒド類は性能において等価である。
一般に、２〜４個の炭素原子を含むジアルデヒド類は同
等揚度に嵐好な性能を有するものと期待される。炭ＩＩ
Ａ原子′ｌｔ６個及び４個含むゾアルデヒＰは現在市販
されていない。
ゲルタールアルデヒド（ｎ−ペンタンジアール）／ｆｉ
、簡単な５炭素分子であるとは現在考えられていない。
市販されているものは、むしろオリ！マー、実質的には
三量体として存在するものと考案されている。三量体の
形態は所与の層内にある酵素分子間の架橋結合形成の傾
向が強いと予想されるし、また実際にもそうであるので
、本発明に用い九場合に尚咳ジアルデヒドの性能に実質
的な差異が生じるのはこのためである。このような層内
架橋結合は、得られたデータに基づくと活性度を低下さ
せる傾向を有しており、概して望ましくないものと認め
られる。
１１ｇ１図から、共有緒＆を生じるのに充分な最低限度
量のジアルデヒドを使用すべきであること、及び最低限
度をこえて用いると、層内架橋結合が起きて酵素の活性
度が低下するという結論を容易に引出すことかで龜る。
第１図に再現されるデータを展開させると、用いるジア
ルデヒドの鎖度に関係なく、２容量のジアルデヒドと共
に、アルカリ処理シリカゲル上に沈積させた不動化酵素
１容量管用いるのが確実な方法ということになる。
グリオキサール（エタンジアール）は卓越した架橋剤で
あるが、なぜその性能がすぐれているのかは明らかでな
い。落１図にプロットされたデータから明らかなように
、カップリングに必要な量よシも過剰にグリオキサール
を使用して層内、架橋結合を起こすに至った場合、酵素
活性度の低下は他のジアルデヒｒの場合に比べてはるか
に軽微である。
架橋結合用ジアルデヒ−の選択は、酵素の性能に多少形
４１ｔ−及ばず。例えば、本発明に従ってシリカゲル上
に不動化させたラクターゼの最適ｐＨは、架橋剤がグリ
オキサールであれば−６，７５であシ、そして架橋剤が
ゲルタールアルデヒドのときには−６，５０であシ、一
方遊離のラクターゼではそれが７．０である。これらの
データは、不動化もれたラクターゼが、メルタール５ア
ルデヒドとカップリングされた時よυも、グリオキサー
ルとカップリングされた時の方がいちだんと活性の構造
全珠りということを示唆している。この°比較データは
、ＯＭＰＧについての６０℃における不動化ラクターゼ
の性能評価を通じて展開されたものである。
選択される基質も不動化酵素の性能に影響を与える。従
って、カッｌリング剤としてグリオキサールを用い、ア
ルカリ／酸処理で活性化したシリカゲル上にラクターゼ
を不動化した場合、不動化酵素の性能は、０ＮＰＧの場
合よルも低−の乳糖の場合の方が良好である。
アルカリ／＃ｌ［による活性化を行ったシリカゲル上の
不動化ラクターゼは、普通的２０℃（室温もしくは周囲
温度）又はそれ以下の温度及び個々のラクターゼについ
ての最適−においてホエーの加工に用いられる。例えば
、アスペルギルス　ニガーる。
纂２表に示すとおり、不動化ラクターゼを基質としての
０ＮＰＧに５０℃で作用させ九場合、ラクターゼの活性
度のロスが観察された。不動化酵素を普通用いる時の温
度よりもかなシ高いこの温度においては、反応は急激に
進行するが、酵素活性度も急激に落ちる。第２１！のデ
ータから、活性度全体のロスは、単一層の場合よシも二
重層の不動化ラクターゼの方が少ないことがわかシ、こ
のことは、不動化処理によって酵素が安定化され九こと
を示すものである。
第６表においては、１層、２層及び６層について、ま九
カップリング剤としてグリオキサールを用いた場合と、
ゲルタール　アルデヒｙｔ用いた場合とについて、６０
℃における単位容量ａｂの酵素活性度を比較している。
２層及び６層についての数字は、単一層と比較した活性
度の増加百分率金示すものである。二重層不動化酵素に
ついての活性度「密度」は龜わめて高く、この物質の工
業的方法への応用を興味深いものにしている。
基質としての０ＮＰＧ上５０℃におけるシリカダル上ラ
クターうＯｆ！＃索安定度ｔ−第４嵌に１また半減期を
第５表にそｎぞれ示しである。三重層物質がきわめて有
意な程度に熱安定化され、かつ、半減期が有意に延長さ
れていることが明らかである。
他の実験から、おおむね四重層をこえると、多重積層化
に要する費用がかさみ、利得が相殺されることが認めら
れ九が、恐らく層と層との間に若干の架橋結合の生じる
ことが原因であろう。一般的には、アルカリ／ａｌで活
性化したシリカゾル上に不動化されたラクターゼを用い
る場合、０ＮＰＧ上６０℃において、沈降ゲル容量の１
当り約７．５単位ないし約６０単位の範囲内の活性度水
準が容易に得られる。本発明の実施に用いるラクターゼ
酵素は、任意の所望の供給源からのものでよいが、サツ
カロミセス　フラジリス（Ｓａｃｏｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ　）からのものが好適である。アルカ
リ処理を受けたシリカゾル上にグリオキサールによって
二重層に不動化された場合、普通観察される活性度につ
いての安定性は、−約６．７の５０℃において７．５分
後に、最初の活性度゛の少なくとも２０％が存続してい
る程度である。
ジアルデヒド架橋剤、とシわけグリオキサールは代衣的
な好ましい物質であるが、ジーイミドエステル及びビス
−イミデートも好ましい物質である。イミドエステルで
あるジメチルアゾビン酸イミデートはカップリング剤と
しての性能においてグリオキサールに近似している。
不動化に適した酵素は、有効アミン基含有する酵素であ
る。蛋白質性の酵素の大部分がこれに包含される。ラク
ターゼ及びぶどう糖イソメラーゼは、単一層又は多重層
として良好に不動化可能な商用的に価値のある酵素であ
る。ぶどう糖イソメラーゼを多重層で不動化するには、
例１に記載したと同じ方法が有用である。不動化された
ぶどう糖イソメラーゼは、単位容量当υの活性度が高い
ので、高果糖分のコーンシロップを製造するのに特に有
用である。
酵素は、植物、動物又は微生−を問わず、任意の供給源
からのものであってよい。前記に述べたもののほか、殿
粉及び糖に作用する酵素は特に重要視される。本発明に
従って用いることのできる他の＃索には、例えばセルラ
ーゼ、エステラーペヌクレアーゼ、インベルターゼ、ア
ミノグルコシダーゼをはじめ他のタイプの加水分解酵素
、ヒーラーゼ、ペクチナーゼ、ペプシン、レニン、キモ
トリプシン、トリプシン、ウレアーゼ、アグリナーゼ、
リゾチーム、チトクローム、１１−β−ヒドロキシラー
ゼ、及びこれらと他の酵素との混合物が包含される。
さらに、他の生物的活性物質も単一層又は多重層方式で
不動化すると六ができる。このようにして得られる多重
層式に不動化された生物的活性物質は、単位容量ｉｐの
活性度水準が高いので、診断検査への応用、精製操作及
びクロマトグラフィーへの応用における価値がきわめて
大である。例えば、多くの抗体及び抗原は有効アミン基
を有している。もし、抗体又は抗原を本発明に従って不
動化すれは、その補体をなす免疫化学的反応体を単離す
るための価値ある手段が得られ、診断検査上重要な役割
を釆友す。
同じようにして、有効アミン基を有するホルモンを多重
層式に不動化することにょシ、高度に濃縮されたホルモ
ン作用源が得られる。
本発明の％像及び利点として、不動化され良生物的活性
物質の高度の機械的安定性、高度の熱安定性、及び高度
の操作安定性又は半減期をあげることができる。これら
の利点及び特徴のいくつかを達成するＫは、架橋剤及び
架橋結合度の選択が重要である。酵素が有効であるよう
な種々の反応に対し、多重層式不動化酵素の触媒として
の性能は特に抜群である。
キャリヤーが好ましい物質、アルカリ／酸で活性化され
たシリカゲルであるならば、液体とまったく同じように
作用する粒子状の自由流動性粒子管注入することによシ
、一つの容器から他の容器に不動化酵素を移すことがで
きて便利である。このため、不動化酵素を慣用の反応器
、例えば加圧葉状ｐ過器及び垂直反応塔に用いることが
可能となる。シリカゾル上にラクターゼ【四層に不動化
すると番は、乳糖上いちだんと同化しやすい、甘味の強
い形に転化する良好な機能が得られるので、牛乳、ホエ
ーをはじめ他の酪農物質の加工に本発明が有用となる。
本発明をその４Ｉ定の態様に関して上記のとおり説明し
九が、さらにこれを修正することが可能であること、及
び本発明は、その原理におおむね従ったいっさいの変法
、利用又は適用をその範晴内に含むものと意図されるこ
とは理解されよう。また、当技術分野における公知又は
常用の技術範囲内圧含まれるような本発明についての前
記の変法等、及び上記に説明した本発明の特徴に適合す
るような前記の変法等がいずれも前記特許請求の範囲に
含まれることも理解されよう。
【図面の簡単な説明】
ｇｉ図は、本発明のある態様に従って製造した単一層成
不動化酵素のｄ当シの活性度の単位をプロットしたグラ
フであって、４ｓ類のジアルデヒド系架橋剤の各１種を
種々の濃度で用いて比較し喪、ジアルデヒド類の鎖度依
存度を示す図であり、第２図は、反応時間（分）に対す
る蛋白（＃素）の濃［ｋプロットしたグラフであって、
不動化の進行とｗＩ素濃度の低下とを、グルタールアル
デヒげによるラクターゼの第１層不動化（曲線ム）、な
らびにグリオキサールによる第１層不動化（曲線Ｂ）及
び第２層不動化（曲線０）について示す図であシ、 第３図は、種々の温度における、基質としての０−ニト
ロフェニル　ガラクトぎラノシｙ（ＯＮＰＧ）に対する
不動化ラクターゼの活性度のプロットであ夛、そして 第４図は、種々の温度において、基体としての０ＮＰＧ
　Ｋよる培養時間に対して、不動化ラクターゼの活性度
をプロットしたものであって、いくつかの曲線上の矢印
は、適用時間単位、すなわち、時間を分で測ったか、日
数で測定したかを示すものである。 代理人　浅　　村　　　皓 外４名 ０８７σ０ １１１’＠％’４１１神１ｓｗ ミ　　迦　−−毫　　ζ ρ、λ−６どＬｑｊ愕Ｊψτ力ｄＮ０ 手続補正書（方式） 昭和Ｓり年り月／’１日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和９７年特許願第　１．Ｚ２ｂ’７　　　号３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和隊年り月２２′日 ＆補正の内容　　別紙のとおり

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　　粒子状Ｏ黴ＪｉｌｌＫ分割され九邊質の無機
    キャリヤー物質を反応させて、七〇Ｓｍ領域をヒドロキ
    シル基で活性化する方法において、 該キャリヤー物質がそ・Ｏ粒子形ｌＩｔ保持しうる強塩
    基性ｓｎｉと、前記珪質キャリヤー物質とを、咳キャリ
    ヤー物質の粒子上にタイｆ　！１１０−Ｍ”　　（式中
    、Ｍは金属イオン、アン篭二つェ　イオン又はそれらの
    混合物を表わす）の衆雨基を生じさせるのに充分な時間
    １０ＪｊＩＬ上〇−で反応させ、そして次に 鎖中ヤリャー物質と強ＩＩ性溶液とを反応させることに
    よってＭ＋を菖で置換し、咳キャリヤーの表面上に反応
    性Ｏヒドロキシル基を配置することを特徴とする方法。 （２）珪質Ｏ無機キャリヤー物質がシリカゾルであ今上
    記（１）　０方沫。 （２）強塩ａ性Ｓ液が、少なくとも０．１重量−の濃を
    會有するアルカリ金属水酸化−の溶液、又は七〇　Ｍ　
    ４１　Ｉ　ｆ　＆　１上ｇ　（１）　又ａ　（２）　Ｏ
    方法。 （６）反応ａＸを少なくとも２０℃とする上記（３）の
    １法。 φ）　　＊Ｉ［基性＊＊中ての反応を少なくとも３０分
    分割ゐ上記（４）Ｏ方法。 （２）強塩基性＃ｌ１ｌＥが、最高約５重量−までの濃
    度Ｏアルカリ金属本駅化物Ｏ＊溶箪である上記（５）の
    方法。 （７）反応時開を約６０分ないし約２時間の範囲とし〜
    そｏｉｌでキャリヤー物質を強酸で＃＆ｌしてＶ音電で
    Ｉ鵜する上記（荀Ｏ方法。 （＃）　　＃が＃緻で参る上記（７）Ｏ方法。 ψ）　　ｍ１ｌｌに分割されたｙリカダル０粒子の表面
    上に高蜜度Ｏ反応性ヒドロキシル基を生じ畜せる方法に
    おいて、 約６０分ないし約２時間の間、シリカゲルがそ０粒子の
    形１ｉｉｔｔ−保つようにしながら、シリカゲルと、ア
    ルカリ金属水酸化−、アルカリ金属炭纜塩及びそれらＯ
    混合物からなる評から遥ばれＪ１強塩基性物質Ｑ水ＩＩ
    ｗＬとを、＃２０℃ないし約４５℃の範囲内の温度にお
    いて、少なくとも約１００−で反応ｉｉぜ、 アルカリと反応した粒子状Ｏｔ／リカダルを該塩基性溶
    液から分離し、そして次に 前記のアルカリと反応したシリカゲル粒子を鉱酸の水濠
    液と反応させることによ〉、金属イオンを１ＩＩＥデル
    から除去し、かつ、反応性のヒドロキシル基で骸デルの
    表面を活性化することを特徴とする方法。 に）強塩基性Ｓ箪０．Ｈが少なくとも１１である上記（
    ９）の方法。 ｃＬ論　　有効アンン基を有すｈｆｋ性酵素物質を、単
    位答量幽ｐ高密度の不動化率で不動化する方法において
    、 上記（９）の方法による活性化Ｏすん友、微細に分割さ
    れ一＃：、粒子状のシリカゲル　キャリヤーと、多価共
    有原子価のカップリング剤とを反応させることによ）、
    皺活性化シリカｒルに訣カップリング網を不動化し、次
    に 蒙活法酵嵩−貫と不動化された該カップリング剤とを反
    応させることによｐ１該シリカゲル粒子に該活性ｌ１１
    ′ｇ物質を不動化することを％黴とする方法。 に）アミノシラン及び臭化シアンからなる群からカップ
    リング剤を選ぶ上記（ロ）の方法。 （２）　カップリング剤がアミノシランであシ、アミノ
    シランがγ−アミノ！ｐピルトリエトキシシランであル
    、そして酵素が２クターゼである上記（Ｌｌ）の方法。 α◆　有効アきン基を有する生物的活性物質が、珪質Ｏ
    無機キャリヤー物質の表面からの懸−基に対する共有納
    会によυ、咳キャリヤー物質に不動化されている複合体
    において、該キャリヤーが微細に分割された粒子状の珪
    質の無機キャリヤーであり、かつ、その粒子形ａｔを保
    持しうる、ｐｉ４１０以上の強塩基性浴液との高められ
    九温度における、Ｉイノ８１０”−Ｍ”　　（式中、Ｍ
    は金属イオン、アンモニウム　イオン又はそれらｖｉａ
    倉物を表わす）の嵌固着が生じるに充分な時間０灰応、
    及びそれに続くＭ＋を水嵩に置換して、腋キャリヤー粒
    子が有効な反応性のヒＰロキシル基ｔそ０１１面に有す
    るための強酸性溶液との反応によって骸無機キャリヤー
    が活性化されていることをｌＩ＃黴とする複合体。 （２）珪質Ｏ無機キャリヤー物質がシリカゲルである上
    記α◆の複合体。 （ロ）約３０分ないし約２時間にわたる、約２０℃ない
    し約４５℃の温度及び少なくとも１１１ＤＨにおけるア
    ルカリ金属水酸化物０水溶液との最初の反応工程によっ
    て、キャリヤーが活性化されたものである上記曽の複合
    体。 （ロ）生物的活性物質が酵素である上記（２）の複合体
    。 斡　キャリヤー物質の表面上のヒＰロキシル基にオルガ
    ノシランが共有結合されてシシ、そして生物的活性物質
    が酵素である上記（ロ）の複合体。 （至）酵素がラクターゼである上記（至）の複合体。 翰　固体物質であるキャリヤー、腋キャリヤーに対する
    化学的結合によって賦キャリヤーに不動化されてはいる
    が、その活性管保持している第一の蛋白性Ｏ生物的活性
    物質、及び前記の第一の蛋白性物質との間の化学的結合
    によって咳物質に不動化されてはいるが、パその活性管
    保持している、少なくとも１種の追加量の蛋白性の生物
    的活性物質からなる反応性複合体において、該キャリヤ
    ーが、上記輪の方法で活性されたことにより、活性化さ
    れなかった場合よ多も大量に前記の第一〇生物的活性物
    質を不動化させて有するシリカゲルであることを特徴と
    する複合体。 轄　蛋白性物質が両方とも酵素である上記−の複合体。 （２）蛋白性物質が両方とも同一物質である上記（ハ）
    の複合体。 輪　前記の第二の蛋白性物質が、共有結合によって第一
    の蛋白性物質に不動化されている上記−、四又は四の複
    合体。 −固形で自由流動性の粒子であるキャリヤー、鋏キャリ
    ヤーに不動化されている第一〇量の＃素、及び二価のカ
    ップリング剤による共有結合によって、前記の第一にあ
    げた酵素に不動化されている第二の量の酵素からな夛、
    前記酵素の実質上すべてがその特徴とする活性を保持し
    ている不動化された酵素複合体において、前記の第一〇
    量の酵素が上記（ロ）の方法によって皺キャリヤーに不
    動化されているととｔ−特徴とする複合体。 に）前記の第一にあげた酵素と、第二にあげた酵素とが
    同じ酵素である上記−〇複合体。 四　前記の第一にあげた酵素と、第二にあげ九酵素とが
    ラクターゼである上記四の複合体。 に）複数の追加量の酵素が含まれ、各追加量が同一の酵
    素で＃）シ、かつ、各追加量の酵素が、さきに追加され
    た量の酵素に対して共有結合されている上記−の複合体
    。 −酵素がラクターゼである上記−の複合体。 四　ジアルデヒｒ及び（又は）インドエステルである多
    官能性反応体を介して共有結合のカップリングがなされ
    ている上記（ロ）の複合体。 ■　多官能性反応体が、１分子蟻ｊ１２領のイミド基を
    含むインドエステルである上記四の複合体。
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