JPS5820960B2 - 抗生物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規抗生物質ＭＸ−Ａに関する。

本発明者らはバチルス属に属するある種の菌株の培養物
中にシュードモナス属細菌に対して強い発育阻止作用を
示す有効物質が生産、蓄積されることを知り、この有効
物質につきその性状を調べた結果、新規抗生物質である
ことを知り、これを抗生物質ＭＸ−Ａと命名し、本発明
を完成するに至った。

本発明の抗生物質ＭＸ−Ａを製造するにはバチルス属に
属する抗住物質ＭＸ−Ａ住産菌（以下ＭＸ−Ａ生産菌と
略省する）、例えば特開昭４８−６２９９３号公報に記
載のバチルス・ビテリナス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｔ
ｅｌｌｉｎｕｓ ） ＆、Ｚ−１１５９株及び特開昭４
９−１３３９４号公報に記載のバチルスＶ−７株（本菌
は現在バチルス・サーキュランスとして同定されている
）等が用いられる。

なお、財団法人 発酵研究所、工業技術院微生物工業技
術研究所およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クショ７ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅ −ｃｔｉｏｎ ）に、バチルス・ビテ
リナスＡＺ−１１５９株はＩＦ’０ １３２９６、微工
研菌寄第１２０３号、ＡＴＣＣ３１０７８として、バチ
ルス・サーキュランスＡ、Ｖ ７株はＩＦＯ１３：３
２０、微工研菌寄第１４８０号、ＡＴＣＣ２１９３３と
してそれぞれ寄託されている。

また本発明の抗生物質を製造するのに使用するＭＸ−Ａ
生産菌は例えばＸ線、ＵＶ照射、変異誘起剤処理等通常
用いられる変異処理方法によって抗生物質ＭＸ−Ａ（以
下単にＭＸ−Ａと称することがある）の生産量を高める
ことができる。

ＭＸ−Ａ生産菌を培養し、ＭＸ−Ａを生産せしめるに肖
り、培地としては通常の醗酵に用いられる各種の培地が
使用される。

即ち炭酸源としてはグリセリン、グルコース、マルトー
ス、テンプン、テキストリン等、窒素源としては大豆粉
、乾燥酵母、ペプトン、肉エキス、尿素、各種のアミノ
酸等の有機窒素化合物、あるいは硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム等の無機窒素化合物が用いられる。

さらにカリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウ
ム、鉄、燐酸等の無機物が併用される。

必要により、ビタミン類、酵母エキス、有機酸その他の
生育促進物質や消泡剤が併用される。

培養方法としては、静置培養でも良いが、振盪培養また
は深部通気攪拌培養が適当である。

培養温度は２０゜〜４０°で培養時間は２４〜９０時間
が適当である。

培養中の培地はｐＨは５〜９、好ましくは６〜８である
。

ＭＸ−Ａは主として培養液内に蓄積される。

培養液中の有効成分は菌体およびその他の不溶性物質を
ｒ過、遠心分離等の方法により除去後、アンバーライト
ＩＲＣ−５０（ローム・アンド・バース社製）、アンバ
ーライ）ＣＧ−５０（ローム・アンド・・・−ス社製）
等の陽イオン交換樹脂のＨ型あるいはＮＨ４型に吸着さ
れ、各種アルカリ溶液や鉱酸で溶出される。

溶出液は微アルカリ性（好ましくは約ｐＨ１，０）に調
節後活性炭で処理される。

この際、有効成分は活性炭に吸着され、酸含有のアルコ
ールで溶出される。

この溶出液を中和後減圧濃縮し、ｎ−ブタノールで抽出
し、抽出液を減圧乾固するとＭＸ−Ａの粗粉末が得られ
る。

この粗粉末中にはＭＸ−Ａ以外にシュードモナス属細菌
に対して発育阻止作用のある数種のＭＸ−Ａ関連物質が
含まれるが、主成分はＭＸ−Ａである。

ＭＸ−Ａ関連物質としては、例エバクロロフォルムーメ
タノール−２８％アンモニア水−ｎ−ブタノール−水（
５：３：２：１：１ 下層）を用いるシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーでＲｆＯ，３３にスポットを与える物
質やＲｆＯ９４５にスポットを与える物質等があげられ
る。

同じ条件でのＭＸ−ＡＯＲｆ値は０．２３である。

上記の粗ＭＸ−ＡからＭＸ−Ａを単離するにはセファデ
ックスＧ−１５（ファルマシア・ファインケミカル社製
）、ＣＭ−セファデックス（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）、シリカゲル（メルク社製）、アンバーラ
イトＸＡＤ−２（ローム・アンド・・・−ス社製）等の
吸着剤もしくは吸着性樹脂を用いるクロマトグラフィー
が有効に利用される。

例えば上記粗粉末の水溶液をシリカゲルのカラムに吸着
させ、クロロフォルム−メタノール−２８％アンモニア
水−水（１：８：２：１）で溶出し、活性区分を集めて
減圧濃縮すれば、ＭＸ−Ａの白色粉末が得られる。

後記実施例３の方法で得られたＭＸ−Ａの理化学的性状
は次の通りである。

（１）融点：２３６℃〜２３９℃（発泡分解）（２）
溶解性： 水、メタノール、エタノール、プロパツー
ル、ブタノールには可溶であるが、アセトン、ベンゼン
、酢酸エチル、クロロフォルム、エチルエーテル等には
難溶もしくは不溶である。

（３）薄層クロマトグラフィー：シリカゲルの薄層クロ
マトグラフィーでは、クロロフォルム−メタノール−２
８％アンモニア水−ｎ−ブタノール−水（５：３：２：
１：１ 下層）ＲｆＯ，２３、クロロフォルム−メタ
ノール−２８％アンモニア水−水（１：８：２：１）Ｒ
ｆ Ｏ，５３゜ｎ−ブタノール−酢酸−水（５：４：４
上層）を用いるセルロースの薄層クロマトグラフィ
ーではＲｆＯ，６５゜ （４）比旋光度：〔α〕昭−−５９° （ｃ−１％、Ｈ
２Ｏ）を示す。

（５）紫外部吸収曲線は特異吸収は認められず末端吸収
を示すのみである。

（６）光外部吸収曲線（臭化カリ錠）は第１図に示す通
りで１６５０ｃＴＬ ’付近に著明に酸アミド結合吸収
が認められる。

（７）呈色反応：ニンヒドリン、ブレイブ・リーベルク
各試薬には陽性であるが、オルシノール、アンモニア性
硝酸銀、モーリッシュ各呈色反応は陰性である。

（８）構成成分：氷晶を５規定塩酸に溶解し、１１０℃
で４８時間加水分解し、セルロースの薄層クロマトグラ
フィー及びアミノ酸アナライザーで構成アミノ酸を調べ
た結果、α・γ−ジアミノ酪酸、ロイシンが検出され、
両者のモル比は４：３であった。

氷晶４０Ｉｎ９を４ｍｌのメタノールに溶解し、０、８
ｍｌの無水酢酸添加後室温で１時間放置する。

次にこれを乾固し、メタノール２ｍｌに溶解しエチルエ
ーテル１０ｍ１を加えると、ＭＸ−ＡのＮ−テトラアセ
チル化物の白色沈澱が得られる。

この沈澱を集め再び２ｒｒｔｌのメタノールに溶解し、
エチルエーテル１０ｍ１を加えてＮ−テトラアセチルＭ
Ｘ−Ａ４２ｍ９が得られた。

このようにして得られたＮ−テトラアセチルＭＸ−Ａの
元素分析値は実測Ｃ５２，７０％、Ｈ８，３４％、Ｎ１
６．０６％、０２２．８９％（差）となり、α・γ−ジ
アミノ酪酸とロイシンのモル比を４；３として水を２分
子含めて計算したＮ−テトラアセチルＭＸ−Ａの元素分
析値Ｃ５２，４０％、Ｈ８，３０％、Ｎ１６．００％、
０２３．３０％とよく一致する。

ここに得たＮ−テトラアセチルＭＸ−Ａを次の方法で、
Ｎ−ウンデカメチル化した。

すなわち水素化ナトリウム３０即をドライ・エチルエー
テルで洗浄後ジメチルスルホキサイド１．５ｒｎｌ中に
加え、８０℃に加熱する。

これにＮ−テトラアセチルＭＸ−１５ｍ９を加え、ヨウ
化メチル１ｍｌを加え室≠温で４０分間反応させ、反応
物をクロロフォルムで抽出し、濃縮後乾燥すると、Ｎ−
テトラアセチル、Ｎ−ウンデカメチル ＭＸ−Ａ６〜が
得られた。

水晶のマススペクトルにはｍ／ｅ１０６１にＭ＋ピーク
が認められた。

従ってＭＸ−Ａはロイシン３、α・γ−ジアミノ酪酸４
分子から成るペプチドであろうと思われる。

現在までに、多（のペプチド系抗生物質が報告されてい
るが、ＭＸ−Ａと同様に構成アミノ酸にα・γ−ジアミ
ノ酪酸を含有する抗生物質としてはポリミキシン（Ａ、
Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｍ）、コリスチン（Ａ、Ｂ）、サーク
リン（Ａ、Ｂ）、ポリペブチン、チアノシン及び特開昭
４８−５６８９５号公報に記載のＢＮ−７、特開昭４８
−４６８８号公報に記載のＥＭ−４９（α、β、γ、δ
）が知られている。

これらの抗生物質およびＭＸ−Ａの構成アミノ酸は第１
表に示す通りである。

※１ アンティバイオティックス（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃｓ ： Ｄ、 Ｇｏｔｔｌｉｅｂｕ 、 Ｐ、 Ｄ。

ｓｈａｗ）２巻２５５頁（１９６７年） ※２ ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティック
ス（Ｔ ｈｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ ： Ｙ、 Ｋｉｍｕｒａ等）２２巻９号
４４９頁（１９５９年）※３ 特公昭４６−１６１５２
号公報 ※４ ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｔ
ｈｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆＢ ｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ： Ｔ、 ５ｕｚｕｋｉ等）５４巻１号２
５頁（１９６３年）※５ エクスペリメンシア（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｉａ ： Ｋ、Ｈａｙａｓｈｉ等）２４
巻６５６頁（１９６８年） ※６ ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミスト
リー（Ｔ ｈｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ：Ｗ、 Ｈａｕｓｍ
ａｎ等）１９８巻４０５頁（１９５２年） ※７ 特開昭４８−５６８９５号公報 ※８ 特開昭４８−４６８８号公報 ※９ 特公昭４６−４２９５９号公報 第１表から明らかなどと（、ＭＸ−Ａはスレオニンを含
有しない事からポリミキシン群、コリスチン群、サーク
リン群、ポリペブチン、チアノシン及びＢＮ〜７と区別
され、フェニルアラニンを含有しない事からＥＭ−４９
の内のγ、δと区別される。

ＥＭ−４９α及びＥＭ−４９βは構成アミノ酸の種類が
ＭＸ−Ａと同一であるが、α・γ−ジアミノ酪酸とロイ
シンの比が前者では５対３であるのに対し、後者では４
対３である点と後者には脂肪酸が含まれない点で両者の
相異は明白である。

さらにＭＸ−Ａの抗菌活性はＥＭ−４９α及びＥＭ−４
９βの抗菌活性と異なる。

以上の点からＭＸ−Ａは既知抗性物質とは異なる新規な
抗生物質であると判断された。

抗生物質ＭＸ−Ａの代表的菌株に対する最小発育阻止濃
度は第２表の通りである。

急性毒性はマウスにおいて静脈注射でＬＤ５゜５０ｍ９
／ｋｇであった。

一方シュードモナス・エルギノーザＮ−１８の１００Ｌ
Ｄ５゜投与量をマウスに腹腔内注射し、感染直後ＭＸ
−Ａ １００７Ｖ／ｋｇを皮下投与する生体試験を行っ
た結果、マウス生残り率５０％を示した。

抗生物質を投与しないマウスの生残りは０であった。

本発明の抗生物質ＭＸ−Ａは緑膿菌（シュードモナス・
エールギノサ）に特異的に有効な抗菌力を有する。

それ故、抗生物質ＭＸ−Ａ又はその生理学的に許容し得
る塩は抗菌剤として使用することが出来る。

例えば抗生物質ＭＸ−Ａの０．３〜１．０％量を適尚な
担体に配合し、スプレー剤、液剤として器物や環境の消
毒に使用することが出来る。

また種々の動物の緑膿菌による感染を防御するのに適用
される。

たとえば抗生物質ＭＸ−Ａの０．３〜１．０％量を含む
常套の局所用クリームや軟こうとして使用しうるし、あ
るいは注射剤として１日当り通常２０〜２００〜／ｋｇ
を投与しうる。

さらに、その抗菌スペクトルの特異性から緑膿菌の検出
試薬として使用することができるし化学的、生化学的ま
たは微生物学的方法を用いて他の抗生物質を得るための
出発原料としても有用である。

以下実施例により本発明の抗生物質の製造法を詳細に説
明するが、これらの実施例によって本発明の範囲が限定
されるものではない。

実施例 ｌ グリセリン・ブイヨン寒天斜面培地に培養したＭＸ−Ａ
生！菌バチルス・サーキュランスＡＶ−７株（ＩＦ”０
１３３２０ 微工研菌寄第１４８０号をポリペプト
ン３．０％、肉エキス１．０％、塩化ナトリウム０．５
％を含有する液体培地（ｐＨ７，２）に接種し、２８℃
で２４時間振盪培養して種培養液を得た。

種培養液を移植率１．５％で２００１容タンク内の可溶
性デンプン２．０％、ポリペプトン１゜０％、肉エキス
１．０％、硫酸マグネシューム０．５％を含む主醗酵培
地（ｐＨ７，５）１００１に接種し、２８℃、通気１０
０％、回転数毎分２００回転の条件下で６６時間培養し
た。

得られた培養液から遠心分離で固形物を除き、上澄液９
０Ｊを得た。

上澄液をｐＨ７，０に調整し、アンバーライトＩＲＣ−
５０（ＮＨ４型）（ローム・アンド・ハース社製）５１
を充填した塔を通過させると有効物質はイオン交換樹脂
に吸着された。

樹脂を２０Ｊの水で洗浄後、５％アンモニア水で溶出し
得られた溶出液中の活性区分８１をクロマトグラフィー
用活性炭２１を充填した塔を通過させた。

活性炭をＩＯＪの水及び２０Ｊの０．３規定の塩酸で洗
浄後５％塩酸含有メタノールにて溶出した。

溶出液中の活性区分６１を減圧濃縮し、アンバーライト
ＩＲ−４５（ＯＨ型）（ローム・アンド・・・−ス社製
）で中和後、減圧下に濃縮した。

濃縮液５００ｒｒｌｌを苛性ソーダでｐＨ１０，０に調
整し、５００Ｔ／ｌｌのｎ−ブタノールで抽出する。

ｎ−ブタノール層を濃縮乾固させると、抗生物質ＭＸ−
Ａの粗粉末（純度２０％）１５２が得られた。

実施例 ２ グリセリン・ブイヨン寒天斜面培地に培養したＭＸ−Ａ
生産菌であるバチルス・ビテリナスＡＺ−１１５９株（
ＩＦＯ１３２９６微工研菌寄第１２０３号）をポリペプ
トン１．０％、肉エキス０．７％、塩化ナトリウム０．
５％を含む液体培地（ｐＨ７，２）に接種し、２８℃で
２４時間振盪培養して種培養液を得た。

得られた種培養液を移植率１．５％で２００ ｅ容タン
ク内のデキストリン２．０％、ポリペプトン１．０％、
肉エキス０．７％、硫酸マグネシューム０．５％を含む
醗酵培地（ｐＨ７，５）１００Ｊに接種し、２８℃、通
気１００％、回転数毎分２００回転の条件のもとに、６
６時間培養した。

得られた培養液にｒ過助剤としてノ・イフロスーパーセ
ル（ジョーンズ・マンビル・プロダクト社製）１ｋｇを
加えて沢過した。

得られた涙液をｐＨ７，０に調整し、以下実施例１と同
じ方法で処理し、抗生物質ＭＸ−Ａ粗粉末（純度１５％
：１５１を得た。

実施例 ３ 実施例１で得られた粗粉末２０．Ｏｆを水１００ｒｎｌ
に溶解し、アンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ４型）（口
＝ム・アンド・・・−ス社製）を充填した径３ｃｍ、、
高さ１００ｃｍの塔に吸着させたアンモニア水で０から
３％までの濃度勾配溶出をおこなうとＭＸ−Ａはアンモ
ニア水濃度１．５％から２．０％の間に溶出された。

溶出曲線はシュードモナス・エルギノーザを用いるペー
パーディスク法で調べ、薄層クロマトグラフィーでＭＸ
−Ａを検出した。

得られたＭＸ−Ａ区分を減圧下に濃縮してＭＸ−Ａ約６
０％を含む粗粉末６．５２を得た。

この粗粉末６．５Ｓ’をクロロフォルム−メタノール−
２８％アンモニア水−水（１：８：２：１）の混合物に
溶解し、シリカゲル６０（メルク社製）を充填した径２
ｃｒｆＬ、高さ１５０ｃｒｆＬの塔に吸着させた。

吸着に用いたと同じ組成の溶液を用いて溶出をおこなう
と、ＭＸ−Ａは５５０ｒｆｌｌから９００ｍ＃）間に溶
出された。

この区分を減圧下に濃縮、凍結乾燥をおこない抗生物質
ＭＸ−Ａの白色粉末３グを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は臭化カリウム錠による抗生物質ＭＸ−Ａの赤外
部吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗生物質ＭＸ−Ａ、そしてそのＭＸ−Ａは次の物理
   化学的性質を有する。 （１） 融点：２３６℃〜２３９℃（発泡分解）（２
   ）溶解性：水、メタノール、エタノール、プロパツール
   、ブタノールには可、溶であるが、アセトン、ベンゼン
   、酢酸エチル、クロロフォルム、エチルエーテルには難
   溶もしくは不溶である。 （３）薄層クロマトグラフィー：シリカゲルの薄層クロ
   マトグラフィーでは、クロロフォルム−メタノール−２
   ８％アンモニア水−ｎ−ブタノール−水（５：３：２：
   １ 下層）ＲｆＯ１２３、クロロフォルム−メタノー
   ル−２８％アンモニア水−水（１：８：２：１）Ｒｆ
   Ｏ，５３゜ｎ−ブタノール−酢酸−水（５：４：４
   上層）を用いるセルロースの薄層クロマトグラフィーで
   はＲｆＯ，６５゜ （４）比旋光度：〔α〕賃−−５９° （ｃ−１％、Ｈ
   ２Ｏ） （５）紫外部吸収曲線：特異吸収は認められず末端吸収
   を示すのみである。 （６）光外部吸収曲線（臭化カリ錠）：１６５０儂−１
   付近に著明に酸アミド結合吸収が認められる。 （７）呈色反応：ニンヒドリン、ブレイブ・リーベルク
   各試薬には陽性であるが、オルシノール、アンモニア性
   硝酸銀、モーリッシュ各呈色反応は陰性である。