JPS58210567A - 競争的蛋白結合分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は競争的蛋白結合分析法に関するものであり、特
にジゴキシン、Ｉ３取り込み、チロキシン、コルチゾー
ル、インシュリンのような種々の低分子量のりガントに
対してのおよび葉酸およびビタミンＢ、２の同時分析に
対しての競争的蛋白結合分析法に関するものである。

一般的に、葉酸あるいはビタミンＢ、２のような内生の
低分子量のリガンドを競争的蛋白結合手法により測定す
ることはよく創られている。例えば、葉酸あるいはビタ
ミンＢ、２の分析に対しての競争的蛋白結合は血清ある
いはその他の媒体中の標識してない葉酸あるいはビタミ
ンＢＩ２が葉酸蛋白バインダーあるいはビタミンＢＩ２
蛋白バインダーの特定の部位を求めて、既知量の家職し
た葉酸あるいは標識したビタミンＢ１２と競争し、これ
によって標識した葉酸あるいはビタミンＢ１２の結合す
るのを妨げる能力を含む。競争的阻害の結果、標識して
ない葉酸あるいはビタミンＢ１２の濃度が増加するのに
応じて、結合した標識した葉酸あるいはビタミンＢ、２
のフリーの標識した葉酸あるいシまビタミンＢＩ２に対
する比は減少する。従って、患者の血清のような未知の
サンプルの葉酸あるいはビタミンＢ１□の濃度は観察さ
れた阻害（フリーの標識した葉酸あるいはビタミンＢＩ
２に対する結合した標識した葉酸あるいはビタミンＢ１
□の比）を標準曲線に示されるような既知量の葉酸ある
いはビタミンＢＩ２により生じた阻害と比較することに
より求められる。このような測定は葉酸およびビタミン
Ｂ、２の分析には、一般に連続的な測定が心安である。

Ｇｒｂｔｃｈｏ等による米国特許第４．１４６．６０２
に葉酸およびビタミンＢ１２の同時放射能分析法の記載
がある。上のＧｕｔｃｈｏ等の特許の方法では、葉酸お
よびビタミンＢ１２を含むサンプル（外部からの葉酸お
よびビタミンＢ１２のバインダーに含−まない）を葉酸
に対する蛋白バインダー、ビタミンＢ１□に対する別の
蛋白バインダー、放射団ヨウ素で標識した葉酸トレ−サ
ーおよび放射性コバルトで標識したビタミンＢＩ２トレ
ーサーと接触させる。次いて、葉酸およびビタミンＢＩ
２の結合した部分を葉酸およびビタミンＢＩ２のフリー
の部分から分離する。結合した部分およびフリーの部分
の少なくとも１つの放射活性を次に測定し、標準曲線と
比較し葉酸濃度およびビタミンＢ１２の濃度を決定する
。勿論、放射性ヨウ素と放射性コバルトを決定するため
に別々の（放射能）測定が必要とされる。

Ｇｕｔｃｈｏ等の特許に記載さｎているように、結合し
ているおよびフリーの部分の葉酸およびビタミンＢ１２
は当業者に知られている方法により分離される。Ｇｕｔ
ｃｈｏ等の特許に記載のように、このような分離方法は
概して粒状の吸着剤の使用に依っている。結合している
およびフリーの部分の標識および非標識の葉酸およびビ
タミンＢ、２を含むサンプルを粒状の吸着剤と混合する
。吸着剤とサンプルの混合物を通常は激しく攪拌し、標
識した葉酸およびビタミンＢ、２が粒状の吸着剤と接触
するのに適当な時間、室温に保つ。サンプルと粒状の吸
着剤は次にしばらく、普通は１５分間遠心し、このす／
プルを、吸着剤に結合している結合部分から結合してい
ない部分をデカンテーションにより、結合した部分と結
合していない部分に分ける。

Ｇｕｔｃｈｏ等の特許はイオン交換樹脂および無機の吸
着剤のような種々の吸集剤が結合した部分と結合してい
ない部分を分離するのに使用されることを示している。

しかしながら、指摘されている唯一の吸着剤はデキスト
ランで外装した活性炭である。更に、種々の有用な吸着
剤の文献資材ばＧｕｔｃｈｏ等の特許において用いられ
る分離法に関連している。すなわち、この分離法はバッ
チ分離であり、長い接触時間および遠心操作を心安とす
る。

ビタミンＢ、２／葉酸の同時分析システムのような競争
的蛋白結合分析を結合した部分と結合していない部分と
を分離に使用できる自動化した方法に適合させることが
望まれる。このような自動化システムは抗原／抗体結合
、吸着あるいはその他の物理的手段によりサンプルから
結合していない部分を除くことができる分離メディウム
を含むカラムを通して、処理したサンプルを連続的に流
すことを利用するものである。このようなシステムは通
常は結合緩衝液および溶出緩衛ｇを連続的に流すことに
より、放射性ヨウ素および放射性コバルトの両者の測定
およびフリーの部分および結合した部分の両方をモニタ
ーできる自動力つ／ターが付いている。次いで、統制さ
れたプログラムを用いて、パーセント結合に換算して直
接読み出しくリードアウト）できる。カラム中の分離メ
ディウム（で結合しているパーセントは、次に標準曲線
と比較しサンプル中に存在する葉酸、ビタミンＢ１２あ
るいは他の分析試料の濃度の測定値を与える。

放射能分析システムにおいて有用であるためには、結合
材料は安定性および結合したフラクションの放射能測定
のための溶出能および次回の測定に対して樹脂の回収の
みならず高い分離効率（フリーのフラクションの最大の
結合）を有しなければならない。競争的蛋白結合分析法
に関しては、分離メグイウムはサンプルマトリクス中の
蛋白に対して、および標識したおよび標識してない分析
試料の競争的結合を効果的に行なうために用いられる蛋
白に対して低い親和性を有することも必要である。驚く
ことに、競争的蛋白結合放射能測定法において最も広範
囲に用いられている分離メディアは葉酸およびビタミン
Ｂ１２の同時分析には不適当であることがわかった。Ｇ
ｕｔｃｈｏ等の特許に記載のデキストランでおおわれた
活性炭は水性の環境においてはうまく作用することが見
出さｎた−が、血清のような蛋白マトリクス中の試料と
は艮＜　７，１’い最大の結合を示した。

本発明に従って、シリカゲルと結合した有機ケイ素は競
争的蛋白結合分析法の分離メディウムとして大いに有用
であり、自動化システムにおける葉酸およびビタミンＢ
１□の同時分析を含む種々の分析試料の競争的蛋白結合
放射能分析法にとって特別に有用であることが確足した
。競争的蛋白結合分析法によれば所望の分析試料の極端
に低レベル（１０”ミリモル）の特異的な検出および定
量分析が可能である。そのシステムの感度が本来の化合
物の検出限界によって制限さ扛る直接的分析法とは異な
って、間接的な方法である競争的蛋白結合の感ｒ￥ζ・
よ高い親和力をもつ結合蛋白における限定された結合ｒ
’ＪｍＣｃ対して内生の分析試料と競争する標識したト
レーサーを使用することにより著しく同上する。競争的
蛋白結合分析法に必要な特徴は蛋白に結合したフラクシ
ョ／を結合していない（フリーの）フラクションから識
別できる簡便な方法である。これは典型的には上記の２
つのフラクションを物理的に分離することにより行なわ
れる。しかしながら、自動化システムにおける２つのフ
ラクションの物理的な分離は分離メディウムが短時間で
高い分離効率を有することが必要とさｎる。

一般的シては、本発明は競争的蛋白結合分析の改良法に
回けられている。本測定は放射性同位体で標識した分析
試料トレーサーおよび飯山バインダーの存在下に分析試
料をインキュベートするステップを含む。蛋白バインダ
ーは分析試料および分析試料トレーサーによる競争的結
合活性がフリーの分析試料、フリーの分析試料トレーサ
ー、結合した分析試料および結合した分析試料トレーサ
ーを調製するのに適したものである。次にフリーの分析
試料およびフリーの分析試料トレーサーｋ１Ｍ合した分
析試料および結合した分析試料トレーサーから分離し、
実質的にフリーの分析試料およびフリーの分析試料トレ
ーサーを含む第１フラクンヨンおよび実質的に結合した
分析試料および結合した分析試料トレーサーを含む第２
フラクシヨンとする。この分離はシリカゲルに結合した
有機ケイ素の層を通して前もって測定した量の調製した
サンプルを流すことにより効果的に行なわれる。

その後に、第１のおよび第２のフラクションの少なくと
も１つの放射能を測足し標準曲線の放射能測定と比較し
て分析試料の濃度を決定する。

従って、種々の分析試料に対して競争的蛋白結合分析の
改良法を提供することが本発明の主目的でるる。

種々の分析試料に対して自動化システムにおいて使用で
きるように適合させた競争的蛋白結合分析の改良法を提
供するのが本発明の別の目的である。

種々の分析試ｔ・Ｆに対する競争的結合分析の改良法に
使用できるように適合させた分離メディウムを含む自動
化システム用のカートリッジを提供することも更にまた
本発明の目的である。

葉酸およびビタミンＢ１２の同時測定に適合させた競争
的蛋白結合分析法を提供することもさらにまた本発明の
目的である。

上記の寂よびその他の目的は下記の詳細な説明および付
記した図から更にはっきりとなるであろう。

図１は自動化放射能測定システムの概要のダイアダラム
であり、ビタミンＢ１□および葉酸の競争的蛋白結合分
析法に対する血清サンプルの調製における種々の段階を
表わしたフローチャートを示している。

図２から６はブ、タ射能測定時における自動化牧射能額
１１定システムの種々の段階および位置を示しである。

上述したように、本発明の種々の％微は葉酸およびビタ
ミンＢ１２の同時放射能分析に特に適合させである。更
に詳細な以下の説明では葉酸およびビタミンＢ１□の同
時放射能分析に関して種々の特徴を述べる。しかしなが
ら、本発明は実施例および添付の特許請求の範囲に記載
したようにその他の競争的蛋白結合分析法にも適してい
ることは理解されるべきである。

一般に、本発明の実施の一例に従って、葉酸およびビタ
ミンＢ　１２　ｋ含んだサンプルを処理し葉酸およびビ
タミンＢ１２をそれらの内生のバインダーから遊離させ
る。遊離した葉酸およびビタミンＢ、２を含むサンプル
を葉酸のバインダー、ビタミンＢ１２のバインダー、第
１の放射活性な同位体で標識した葉酸トレーサーおよび
第２の放射活性な同位体で標識したビタミンＢ１□トレ
ーサーと接触させる。

葉酸、ビタミンＢ８２、および葉酸とビタミンＢ１□の
バインダー、および葉酸とビタミンＢ１２のトレーサー
を含むサンプルは次いでインキュベートし、標識した葉
酸および標識していない葉酸間で、および標識したビタ
ミンＢ、１２および標識していないビタミンＢＩ□間で
それぞれの対応するバインダーの結合部位に競争的に結
合させる。標識したおよび標識してない葉酸の結合した
部分および標識したおよび標識していないビタミンＢ、
２の結合した部分は標識したおよび標識してない葉酸の
フリーの部分および標識したおよび標識してないビタミ
ンＢ１２のフリーの部分から有機ケイ素で皮膜したシリ
カゲルの層を通して調製したす／プルを流すことにより
同時に分離する。その後に、結合した部分およびフリー
の部分の少なくとも１つの放射活性を測足し、標準曲線
から葉酸およびビタミンＢ１□の量を決定する。

図ＩＫ示したように、血清サンプルは葉酸およびビタミ
ンＢ、２をそれらの内生のバインダーから遊離させるた
めに先ず分解する。次に、葉酸の蛋白バインダー、ビタ
ミンＢ１２の蛋白バインダー、葉酸のトレーサーおよび
ビタミンＢ１２のトレーサーの存在下にインキュベート
を行なう。こうして得た調製さｎたサンプルは自動化放
射能測定システム１１におけるサンプルループを通して
連続的にポンプで注入する。図１ｖｃ示すように、調製
さｎたサンプルは単一の分析試料の種々の形で衣ゎして
あり、これらはＢ１２、葉酸あるいはその他の分析試料
である。勿論、両分析試料は調製されたサンプル中に示
された形において存在している。

自動化放射能測定システム１１＆″ｉ調整したサンプル
ループ１３、緩衝液バイパスゾーン１５、ブレフィルタ
ー−Ｐｅ１ｔｉｅｒクーラー１７、分離メディウム２１
を含んでいる分離チェンバー１９および放射能検出器２
３を有している。三路バルブ２５および２７は前もって
決められたサイクルに従って、調製したサンプルおよび
種々の緩衝液を流すのに用いる。一方向バルブ２９は調
製したサンプルを流したり、洗浄溶液を流したりするの
に用いる。

調製したサンプルの分解、インキュベーションおよび保
持の段階は図１の概要図において別々のブロックとして
表示されているけれどもｔサンプル調製のこれらの種々
の段階は同一のコンテナで行なうことができ、これらの
段階は競争的蛋白結合分析のｆこめの児全に統制された
自動システムで行なわられる様Ｖこ自動化することが可
能であることは理解さｎるべきである。

図１１／Ｃ示したように、バルブ２５．２７および２９
は調製したす／プルをプロセスするための準備にシステ
ムを洗浄するために、緩衝液Ａ（ここでは時々、吸着用
緩衝液と述べである）が分離チェンバーを通して分離メ
ディウムを流九るようｔＣセットされている。バルブは
調製したサンプルがサンプルループ１３全通して連続的
に流れるように合わせである。図２においては、バルブ
２６および２７は緩衝液Ａの直接分離チェンバーへの流
れを止め、サンプルルーズに緩衝液Ａが流れるように切
り換えである。バルブ２９は同時に止められ、緩衝液が
サンプルループ内のＢ６１　ｔ　ｉ　ｅ　ｒクーラー１
７を越えて分離チェンバー１９にまで調製したサシプル
を運ぶ。緩衝液Ａ（吸着用緩衝液）が流れている間に、
一部のフリーの標識したおよび標識してない分析試料は
分離メディウムに結合するようになる。本発明の重要な
特徴は分離メディウムを通して調整したサンプルが流れ
る速度がフリーの標識したおよび標識してない分析試料
の結合の効率に関係しているという発見である。すなわ
ち、フリーの標識したおよび標識してない分析試料の結
合の最大のパーセントはある特定の流扛る速度にて最大
に達する。一般に、流れる速度は分離メディウム体積（
２５−１０００１ｎ９）　１１ｎｇ当り毎分的０．０１
ないし０．２０ｍＪのサンプルであるのが良く、好まし
い流速は分離メディウム（５０−１５０Ｉｎ９）の約０
．０７ないし０．１０ｍｅ／Ｃｃ／分である。

図３に示すように、緩衝液Ａは結合した標識したおよび
標識してない分析試料および残った結合蛋白を放射能検
出器を経由して運ぶように流れ、ここで結合した標識し
た分析試料を測定する。

図４ｆｃ示すように、バルブ２５．２７および２９は図
１の最初の位置に戻される。洗浄液をサンプルポンプ８
１からサンプルループに流し込む。

緩衝液Ｂ（ここでは時々、溶出緩衝液と述べである）を
緩衝液バイパス１５に流し入れ、緩衝ｇＡの流れている
間に分離メディウムに結合したフリーの分析試料を遊離
除去する。図５に示すように、洗浄液を市め、緩衝液Ｂ
ヶ流し続け、検出器での測定のために分離メディウムに
結合しているフリーの分析試料を遊離させる。このよう
にして、本発明の自動化測定システム（でよれば、緩衝
液Ａを流した時に分離メディウムを通過・する物質（結
合したもの）２よび緩衝液Ｂを流した時に遊離する分離
メディウム（で結合した物質（フリーのもの）の両者を
容易に測定できる。本状ではすべての物質のカウント（
放射能）の合計を合わせることができ、より正確な放射
能測定結果を得られる。図６に示すように、緩衝液Ｂを
止め、緩衝液Ａでシステムを洗浄し、残存する緩衝液Ｂ
を除去し、次のサイクルに分離メディウムを用意する。

再び、特に葉酸およびビタミンＢ、２の同時放射能測定
法に関して述べると、葉酸およびビタミンＢＩ□は葉酸
およびビタミンＢＩ２を含むサンプルを加熱することに
より内在するバインダーから遊離される。例えば内在す
るバインダーの存在する血清あるいは血漿サンプルはこ
のような加熱により分解される。加熱は広い範囲のｐＨ
値において、一般にはｐＨは５以上にて、効果的に行な
われる。

ｐＨは最も一般には最低７．０（中性あるいはアルカリ
性ｐＨ）で、好ましくは最低９．０で、最高９．６であ
る。最も好ましいｐＨは９．２ないし９．４（一般には
９．３）であり、この条件で、標品として還元型の葉酸
のメチル誘導体の代わりに葉酸を用いる引き続いての測
定と同じｐＨで上記の遊離を効果的に行なえる。ビタミ
ンＢ１２および葉酸をそれらの内在するバインダーから
遊離させるための加熱は約９５℃ないし約１１０℃にて
、好−ましくけ約９８℃ないし約１０５℃にて行なわれ
る。

葉酸およびビタミンＢ、２の内生のそれらのバインダー
からの遊離は、還元型で血清中に存在する内在の葉酸を
保護するために適当な還元剤の存在下においても行なわ
れる。加熱ステップにおいて　　　　　１用いられる還
元剤はビタミンＢ１２に悪影響を与えることなしに還元
型の葉酸を保護でき、また測定の条件下で安定なもので
ある。適当な還元剤の例としてはアスコルベート、Ｃ１
ｅｔａｎｃｌ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（ジチオスレイトー
ル）、ジチオエリスリトール、モノチオグリコール、チ
オジグリコール、チオグリコール酸、システィン、ホモ
システィン、ミルクチオン、メルカプトエタノール、ス
ルフヒドリル還元剤、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸
ナトリウム、硫化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムの
ような無機の還元剤が挙げられ、この中で有機還元剤が
好ましい。

葉酸およびビタミンＢ１ｔｋ内在するそれらのバインダ
ーから遊離し、このような内在するバインダーを分解後
、サンプルを必要なトレーサー、すなわち葉酸に対する
トレーサーおよびビタミンＢ！２に対するトレーサーお
よび必要な蛋白バインダー、すなわち葉酸に対する蛋白
バインダーおよびビタミンＢ１□に対する蛋白バインダ
ーと接触させる。

葉酸に対する天然に存在するバインダーおよび抗体は当
業者にはよく仰られており、このようなバインダーのい
ずれか一つが本発明の分析に使用される。このようなバ
インダーの典型的な例にはβ−ラクトグロブリン調製、
乳牛のミルク、イルカの血清等のような種々の動物の組
織、特に肝臓および胎盤から抽出したバインダーが含ま
れ、この中でミルクバインダーが好ましい。同様に、ビ
タミンＢ１２に対するバインダーは当業者にはよく知ら
れている。適当なバインダーにはダ液、にわとりの血清
、内因子が含まれ、この中で内因子が好ましい。

葉酸トレーサーは、放射性同位体、好ましくはヨウ素の
放射性同位体で標識した葉酸（ペテロイルモノグルタミ
ック酸ＣＰＧＡ）Ｃあるいは還元型の葉酸の５−メチル
誘導体、５−メチルテトラヒドロ葉酸ＣＭＴＦＡ）〕あ
るいはその適当なアナログである。葉酸トレーサーとい
う語は総括的に放射能標識した葉酸、放射能標識した還
元型の５−メチル誘導体および放射能標識したそれらの
アナログを意味する。５−メチル誘導体は安定性に難が
あるためにトレーサーとしては一般には用いられない。

トレーサーとして使用される放射能標識した葉酸は好ま
しくは放射能標識した葉酸であり放射能標識した葉酸と
いう語は放射能標識したその誘導体、すなわち放射能標
識した残基で置換された葉酸を含む。好ましい放射性同
位体はヨウ素の放射性同位体であり、最も好ましくは１
１２５である。トレーサーは通常は、ヨウ素の放射性同
位体で置換された、ヒスチジン、ヒスタミン、チロシン
あるいはチラミンのような放射性ヨウ素化したフェノー
ルあるいはイミダゾール基を含む置換基を含有する葉酸
である。特に好ましいトレーサーはグルタミル部分のα
カルボキシル基が放射性ヨウ素化すしたチロシルあるい
はヒスチジＡ４テｌＮ換されたものである。しかしなが
ら、トレーサーは米国特許第８，９８９，８１２号に開
示されたように、γカルボキシル基が置換されたもので
もよいことは理解されるべきである。

ビタミンＢＩ２トレーサーは好ましくは放射能標識した
ビタミンＢ、２であり、”Ｃｏで標識したビタミンＢ１
２がよい。

好ましい方法に従って、測定はアルカＩＪ　ｐＨで行な
われる。すなわち、測定および結合剤からの葉酸および
ビタミンＢ１□の遊離は両者共にアルカリｐＨで効果的
に行なわれる。遊離は当業者によく知られた温度、すな
わち約９８°ないし５℃の範囲で行なわれる。遊離およ
び引き続いての測定は異なるｐＨ値においても行なえる
ことは理解されるべきである。しかしながら、同一のｐ
Ｈ値が、ｐＨの調整をする必要がないために好んで用い
られる。

測定を好果的に行なうのに最も好ましい方法に従って、
葉酸およびビタミンＢ１２はそれらの内在する結合剤か
ら約９．２ないし９．４のアルカリｐＨにて遊離させ、
次いで約９．２ないし約９．４のｐＨにて測定を行なう
。葉酸トレーサーは放射性ヨウ素化された葉酸の形であ
り、放射性ヨウ素化された葉酸は好ましくは、例えば放
射性ヨウ素置換のあるヒスチジル、チロシル、あるいは
チラミル基、好ましくはチロシル基、のような放射性ヨ
ウ素化された葉酸のアナログである。ビタミンＢ、２の
トレーサーは５７Ｃｏで標識したビタミンＢＩ２である
。

上記のｐＨにて放射能で標識した葉酸を使用することお
よび内在の葉酸全測定することに依り、米国特許第８．
９８８，４８１号に記載のように、ＭＴＦＡの代わりに
標準品として葉酸の使用が可能となる。

標品として葉酸ヲ使用する好ましい方法に従って、分析
ｆ　ｐＨ９，２−９，４で行なうとしても、分離メディ
ウムからの溶出は異なるｐＨ値にて行ない得る。同様に
、もし分析の標品がＭＴＦＡであるとしても、分析およ
び／または溶出は９．２−９．４以外のｐＨ値で行なう
ことができる。

結合したおよびフリーの部分は有機ケイ素と共有結合あ
るいはその他の方法で結合したシリカゲルの層を通して
あらかじめ測定した体積の調製したサンプルを流すこと
により分離される。一般に、有機ケイ素は鎖状のＣ３−
Ｃｕ有機部分を有する。

特に好ましい有機ケイ素はオクタデシルシラン（ＯＤＳ
）である。シリカゲルは好ましくは約２５ないし約２５
０ミクロンの粒子の大きさを有する。

有機ケイ素−シリカゲル分離メディウムは好ましくは自
動化測定システムに使用するために、入り口と出口のあ
るチェンバーから成るカートリッジに入れられる。この
チェンバーの形状は、種々の形を用いることができるが
、好ましくは円筒状であり、約５ないし約２０龍の長さ
で、約２ないし約８ｘｍの直径であり、最も好ましくは
１２闘の長さ、４朋の直径である。分離メディウムは約
５０ないし約１５０〜の、最も好ましくは約９５〜の量
でチェンバー内に存在する。

調製したサンプルを有機ケイ素−シリカゲル層を通して
流す速度は好ましくは約０．０１ないし約０．２Ｑｍｌ
／江／分で、最も好ましくは約０．０７ないし約０．１
０酎／ｃｃ、７分である。

明らかなことであるが、葉酸トレーサーおよびビタミン
Ｂ１□トレーサーを標識するのに異なる放射性同位体を
使用しているので、それぞれのトレーサーは放射能測定
器の異なるチャンネルで測定されるか、または、もし測
定器に１つのチャンネルしか無いときは、異なる測定器
のセットで一度に一つの同位体を測定するように検量す
ることができる。

以下の実施例で更に本発明の種々の特徴を例示する。し
かしこれは添付の特許請求の範囲に定めた本発明の範囲
に制限を与えるものではない。

実施例１゜ ビタミンＢ、２および葉酸の同時分析は１００μｌの血
清あるいは被験サンプルを０．０５Ｍホウ酸、３０μｔ
／ｍｅ、シアン化カリウム、０．０３η／　１Ｆ１８デ
キストラフ（ＭＷ＝’Ｉ　Ｏ，０００）、０．１５ｍ９
ＩＭＥヒト血清アルブミン（Ｂ１２’／葉酸を含まない
もの）、０．２％チメロザール、１．０μ？／ｍｌ加水
分解したンアノコバラミン、０６１％ジチオスレイトー
ルおよび０．０２％エチレンジアミン・４酢酸を含む溶
液１、ＱｍｌにｐＨ９，３にて加えることにより行なわ
れる。このサンプルをガラスの試験管に入れ、湯浴中で
１５分間加熱し、再び室温に保つ。そのサンプル全定量
的に、ポリスチレンのサンプル容器に移し、放射能分析
装置にかける。このサンプルに、５０−７０％の程度に
５７Ｃｏ−Ｂ、２トレーサー標識が結合している、精製
した内因子５５−７５％の程度に１２５１−プテロイル
グルタミン酸（ＰＧＡ）トレーサー標識が結合している
、葉酸ミルク結合剤、０．０１５Ａ／ホウ酸、０．００
１４Ｍホウ酸ナトリウム、０．１２％デキストラン（Ｍ
Ｗ＝７０．０００）。

０．０７％塩化ナトリウム、ｏ、ｏｏｓ％チメロザール
および、０．０６％ヒト血清アルブミンｌ、□／葉酸を
含まないもの）を含む１１０μｌの溶液をｐＨ８，０に
て加える。

次に、５７ｃｏで標識されたビタミンＢ１２を０．０８
８１’Ｃ４／：ｎｌ　（比活性＝　１００−８００　μ
ｃｉ／ａｔ）、１２５１で標識されたチラミン−プテロ
イルグルタミン酸を０．２６　ｔｔｃｉｌａｖｌ　（比
活性＝　１−２　ｍｃｉ／ｐ幻、０．０５Ｍホウ酸、８
０μにりｅシアン化カリウム、０、’　０８　ｍｙ　／
　：ｎｚデキストラン（Ａ／Ｗ＝　７０．０００　）お
よび０．１５η／Ｍヒト血清ア／ｌ＜ブミン（Ｂ＋ｚ／
葉酸を含まないもの、熱変性したもの）を含む１２５μ
ｌの溶液をｐＨ９，８にて加える。サンプル全量　　　
　　□を、３０分間室温でインキュベーションする。イ
ンキュベーション後ｓ　Ｏ−９６ｍ１Ｂの処理ずみのサ
ンプルを、シリカゲル粒子（５５−１０５ミクロン）に
共有結合している、９５Ｉｎ９のオクタデシルシラｙ　
（ＯＤＳ　）を含むテフロンチャン・（−に通して流す
。

円筒状チャンバー空孔の内側の寸法は、直径４龍で、長
さＬ２ｍｍである。チャンバー空孔の底の覆いは、円周
０．３インチの２５ミクロンメツシュのナイロンである
。ＯＤＳは乾燥したまま、その空孔に注ぎ、直径４關で
、厚さ２市の円形のテフロンウールで覆う。そして、そ
の空孔の上端は、さらに円周０．８インチの２５ミクロ
ンメツシュナイロンで覆う。空孔内のＯＤＳは、直径４
ｍｍ、高さ１０朋の円柱状カラムを形成する。サンプル
全量を０．８ｍ１１分の割合でＯＤＳに通して流す。こ
の結果蛋白に結合していないビタミンＢｔｔと葉酸（標
識したものも、標識していないものも）はＯＤＥに吸着
され、一方、蛋白と結合したものは、放射能検出器のフ
ローセル中へ続けて流れ、そこで定量される。蛋白と結
合したフラクションは、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４
，０，０５Ｍ塩化ナトリウム；　０．００５％ゲンタミ
シン硫酸塩；および０．００８Ｍアジ化ナトリウムを含
む緩衝液で、８．０ｍ８１分の割合で０，６８分間定量
のために検出器中へ洗い導く。

吸着されたフラクションは０．０２５Ｍグリシン、０．
０２５％安息香酸、０．０４２５Ｍリン酸および５０％
のアセトニトリルを含む溶液でｐＨ２，０にて、　　２
．０ｍ１１分の割合で０．８９分間溶出させる。

これらの脱着したフラクションは、０．０２Ｍリン酸、
ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム；０．００５％
ゲンタミシン硫酸塩；および０．００３Ｍアジ化ナトリ
ウムを含む溶液で８．０１ｒＬｌ１分の割合で０．４分
間、定量のために固体シンチレーション検出器中に洗い
導く。この洗浄によって、次のサンプルの循環を行うた
めのＯＤＳの準備ができる。ビタミンＢＩ２と葉酸の量
は、サンプルの結合度と、既知の標準曲線の結合度とを
比較することによって決定される。既知量のビタミンＢ
１□と葉酸の量は、サンプルの結合度と、既知の標準曲
線の結合度とを、比較することによって決定される。既
知量のビタミンＢ１２とＰＧＡｋ、７％ヒト血清アルブ
ミンＣＢ１２１ｊ＃酸を含まないもの）、０．００５％
クロラムフェニコール、０．００５％バシトラシ／、０
．００１％ニスタチン、０．９％塩化ナトリウム、０．
０５Ｍホウ酸を含む溶液にｐＨ８，８にて加える。

ビタ之ンＢ１２の典型的な分析結果は、痕跡量で５４．
２％の結合度、１００　ｐｆ／ｒｎｌで５１．８％、２
００　ｐｔ／Ｉｎｌで４４．４％、４００　ｐｙ／ｍｅ
で３７．５％、８００　ｐｇ／ｍｅで２７．５％および
１６００　ｐｆ／ｍ１３で１８．８％となる。

上の曲線を使って、確定した５　９５　ｐｙ／１１２な
いし８４７ｐり／Ｉｎｅの範囲のコントロールの血清は
７１６　ｐｇ／ｌｎｌと分析された。２８４　ｐｇ／ｌ
ｕｅないし３４２　ｐｆ／ｍεの範囲のもう一つのコン
トロールの血清は、２８２　ｐｙ／ｒｎ１３と分析され
た。８７７　ｐｙ／；ｎＥないし５５７　ｐｙ／ｍｌの
範囲の三番目のコントロールの血清は、４８７７）ｆ／
ｍεと分析された。葉酸の典型的な分析結果は、痕跡量
で６１．６％の結合度、１、Ｏｎｆ／ｍ１３で５３．４
％、２、Ｏｎｙ／ｍｅで４４．５％、４．０ｎり／ｍε
で３５．０％、８．０　ｎｙ／ｒｎｌで２４．５％およ
び１６．０　ｎｙ７ｍｌで１８．７％となる。上の曲線
を利用して、確定した６、６　ｎｑ／ｍｅないし８．８
ｎｙ／ｍｅの範囲のコントロールの血清は、７．９ｎｙ
／ｌｎｌと分析された。確定した２、０　ｎｙ／ｍｌな
いし２．８ｎｙ／ｍｌの範囲のもう一つのコントロール
の血清は、２．２ｎｙ／ｍｌと分析された。確定した６
、２　ｎｙ／ｉｎｉないＬ８．６ｎｙ／ｍｌの範囲で、
三番目のコントロールの血清は７．８　ｎｙ／ｍｅと分
析された。

実施例２ ジゴキシン ジゴキシンの分析は、５０μｌの血清あるいは被験サン
プルをポリスチレンのす／プル容器に加えることによっ
て行なわれる。このサンプルに、５５−８０％の程度に
１２１１Ｉ−ジゴキシントレーサー標識が結合している
、ウサギジゴキシンに特異的な抗血清、０．０２Ｍリン
酸、０．０５Ａ／塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナ
トリウム、０．００５％ゲンタ５シン硫酸塩および１．
０％の正常なウサギの血清を含む５０μｊの溶液ｋｐＨ
７，４にて加える。これに、続いて１２５　Ｉで標識さ
れたジゴキシゲン−８−へミサクシニルーチロシンに０
．８４５１１ｃｉ／ｍｌｃ比活性−０，５−２ｍＣｉ／
　ｔｉｔ　）、０．２Ｍす／酸、０．０５Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．００５％ゲン
タミシン硫酸塩および０．２％サリチル酸を含む１００
μｌの溶液をｐＨ７，４で加える。これに次に、０．０
２Ｍリン酸、ｐＨ’？、４．０．０５Ｍ塩化ナトリウム
、０．０２％アジ化ナトリウムおよび０．００５％ゲ／
タミシン硫酸塩を含む２８０ｍ１の溶液を加える。サン
プル全量を、１８分間室温でインキュベーションする。

Ｑ−４ｍ１３　（Ｄ　インキュベーションしたサンプル
全量を、シリカゲル粒子（５５ないし１０５ミクロン）
に共有結合している９５Ｉｎ９のオクタデシルシラン（
ＯＤＥ）を含むテフロンチャンバーに通して流す。

そのチャンバー空孔の白値の寸法は、直径４龍で、長さ
１２朋である。その空孔の底の覆いは、円周０．３イン
チの２５ミクロンメツシュのナイロンである。ＯＤＳを
乾燥したままその空孔に注ぎ、直径４龍で厚さ２闘の円
形のテフロンウールで覆う。

そして空孔の上端は、さらに円周８インチの２５ミクロ
ンメツシュのナイロンで覆う。（空孔内のＯＤＳは直径
４　ｍｍ　ｓ高さ１０朋の円柱状カラムを形成する）す
／プル全量を、　８．０ｔｎｌ１分の割合でＯＤＥに通
して流す。この結果、抗体に結合していないジゴキシン
（標識したものも、標識していないものも含む）はＯＤ
Ｓに吸着され、一方、抗体に結合したフラクションは、
放射能検出フローセル中へ続けて流れ、そこで定量され
る。抗体に結合したフラクションは０．０２Ｍリン酸、
ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００８　
Ｍアジ化ナトリウム、および０．００５％ゲンタミシン
硫酸塩を含む緩衝液で２．４ｍ／分の割合で０．８８分
間定量のために検出器中へ洗い導く。吸着されたフラク
ションは、０．０２５Ｍグリシン、０．０２５％安息香
酸、　　０．０４２５Ｍ’）ン酸および５０％アセトニ
トリルを含む溶液でｐＨ２，０にて、２．４ｍｌ／分の
割合で１．０３分間溶出させる。この脱着したフラクシ
ョンは、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４゜０．０５Ａｆ
塩化ナトリウム、０．０（）８Ａ／アジ化ナトリウムお
よび０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を含む緩衝液で８
．０ｍ／分の割合で０．１５分間、定量するために固体
シンチレーション検出器中へ洗い導く。この洗浄によっ
て次のす／プルの循環を行なうための準備ができる。

ジゴキシンの量は、サンプルの結合度を既知の標準曲線
の結合度と比較することによって決定される。既知量の
ジゴキシンを９９％のジゴキシンを含まない、フレオン
で処理した血漿、１．０％２度蒸留した水、０．００５
％バフトラシンおよび０．００５％クロラムフェニコー
ルを含む溶液に入れる。ジゴキシンについての典型的な
結果は、痕跡量で６５，５％の結合度、０．５　ｎｙ／
ｍｌで５５４％、１、Ｏｎｙ／ｍｌで４５．１％、２．
Ｏｎｙ／ａｔで８２．８％、４、Ｏｎｙ／ｍｌで２１．
２％および８−Ｏｎｙ／ｍｌで１３．８％となる。上の
曲？ｓを用いると、確定した０、８７ｎｙ／ｗｔｌない
し１．１０　ｎｔ／ａｔの範囲の市販の１７トロールは
、１．０ｒＬだ１１と分析された。確定した１、７０　
ｎｙ／ｍｌないし２．１６　ｎｙ／ｍｌの範囲の二番目
の市販のコントロールはり、８ｎｙ／−と分析された。

確定した２、７８　ｎｙ／ｒａｔないし８．５４　ｎｙ
／ｙｎｌの範囲の三番目の市販のコントロールは２．９
　ｎｙ／ｌｅｌと分析された。

実施例ａ Ｔ３の取り込み チロイド結合性グロブリン（ＴＢＧ）Ｋよるトリョード
チロニ／の取り込みの分析は、Ｚ、−）！Ｊヨードチロ
ニンーｌ２ｓＩ、単一放射活性（比活性＝０．５−２　
ｍｃｉ／μｔ　）　ｔ　Ｏ，７μＣｉ／ａｔ、　　Ｏ，
ｏ　ｔ％ウシ血清アルブミン、１．７％プロピレンクリ
コール、０．０５＆塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸
、ｐＨ７，４，０，０２％アジ化ナトリウムおよび０．
００５％ゲンタミシ／硫酸塩を含む０．５２８ｍＪの溶
液で１８μｌの血清または被験サンプルを希釈すること
によって行なわれる。このサンプルを室温で０．１８分
間インキュベーションスル。インキュベーション後、ｏ
、５４ｅ−のサンプル全量を、シリカゲル粒子（５５−
１０５ミクロン）＜Ｃ共有結合、ｆ、ニー　９５．．９
Ｏ，ｔ７　ｆｉｆ　７Ａ−７５７＜０ＤＥ）　ｋｔｔｒ
　　　　’テフロンチャンバーに通して流す。チャ／バ
ーの空孔の内側の寸法は直径４龍で、長さ１２龍ある。

空孔の底の覆いは、円周０．８インチの２５ミクロ　　
　、ンメソンユのナイロンである。０ＤＳｔ乾燥したま
ま空孔に注ぎ、直径４朋厚さ２龍の円形のテフロンウー
ルで榎う。そして、空孔の上端はさらに円周０．３イン
チの２５ミクロンメツシュのナイロンで覆う。（空孔内
のＯＤＳは直径４順高さ１０朋の円柱状カラムを形成す
るンそのす／プル全量に８．０ｍＡ’／分の割合でＯＤ
Ｓに通して流す。この結果、ＴＢＧに結合したＴｓ（標
識したものも、標識していないものも）はＯＤＳに吸着
され、一方、蛋白と結合したフラクショ／は放射能検出
フローセル中へ続けて流れ、そこで定量される。蛋白と
結合したフラクションは、０．０２Ｍリーン酸、ｐＨ７
，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００８Ａ／アジ
化ナトリウムおよび０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を
含む緩衝液によって３．３ｍ／／分の割合で０．６７分
間、定量のために検出器中へ洗い導く。

吸着されたフラクションは０．０２５Ｍグリシン、０．
０２５％安息香酸、０．０４２５Ｍリン酸、そして５０
％アセトニトリルを含む溶液でｐＨ２，０にて８．８０
ｍ１１分の割付で０．５０分間溶出させる。

脱着したフラ多ジョンは、０．０２Ｍす７酸、ｐＨ７，
４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００８　Ｍアジ−
化ナトリウム、および０．００５％ゲンタミシン硫酸塩
を含む溶液で３．８９ｍ／／分の割合で、０．８５分間
定量のために固体シンチレーション検出器中へ洗い導く
。この洗浄によって次のサンプルの循環全行なうための
ＯＤＳの準備ができる。

Ｔ、の取り込みは、サンプルの結合度を、既知の比較標
準物質結合度と比較することにより決定される。その比
較標準物質はフィブリンを除去した血漿、安定化された
Ｔ＋′ｆｔ含まない血清、０．００５％バシトラシン、
および０．００５％クロラムフェニコールを含んでいる
。標準物質は、％結合度が、既知の一次比較標準物質の
１．５％以内になるように調製されている。Ｔ、取り込
みについての典型的な結果は、標準サンプルに対して８
０．４％結合したものおよび標準サンプルに対して８１
．６％結合したものを包含している。Ｔｓ取り込みの範
囲が４２．８−５８．１の既知の血清サンプルは５１．
８と分析された。Ｔｓ取り込み範囲が４４．０−６０．
０の二番目の既知の血清サンプルは５１．２と分析され
た。Ｔ３取り込みの範囲が２＆５−８９．５の三番目の
既知の血清サンプルは２５．５と分析された。

実施倒毛 チロキシン チロキシン（Ｔ４）の分析は、０．０１％ウシ血清アル
ブミ７，０．５Ｍグリシン、５．０％エチルアルコール
、０．０２％アジ化ナトリウムおよび０．０８％８−ア
ニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（アンモニウム塩）
を含む溶液で１１５０に希釈された５０μｌの血清ある
いは被験サンプルｋｐＨ１Ｏ０５にてポリスチレンのサ
ンプル容器に加えることにより行なわれる。このサンプ
ルに、４〇−７０％の程度に１２５　Ｉ−Ｔ４　トレー
ス標識が結合しているウサギチロキシンに特異的な抗血
清、０．００１％ウシ血清アルブミン、０．５Ｍグリシ
ン、５．０％エチルアルコール、０．０２％アジ化ナト
リウム、および０．０８％８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸（アンモニウム塩）１１−含む５０μｊの
溶液′！！−７）Ｈｌｏ、５にて加える。これに続いて
、Ｌ−チロキシン−１２５Ｉ、単一放射活性（比活性−
０，５−２，０ｍＣｉ／ｌｔｔ　）　ｌｒ　Ｏ，２ｔｔ
ｃｉ／ｌｎｌ、　　０．００９　％ウシ血清アルブミン
、０．４５Ａ／グリシン、０．００５　Ｍリン酸、５％
プロピレンクリコール、４．５％エチルアルコール、０
．０１８％アジ化ナトリウム、および０．０２７％８−
アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（アンモニウム塩
）を含む１００μｌの溶液１ｐＨ１０，５にて加える。

そして、これに次いで０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４，
０，０５Ｍ塩化ナトリウム、００２％アジ化ナトリウム
、および０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を含む２８０
μｌの溶液を加える。サンプル全量を室温で６０分間イ
ンキュベーションする。インキュベーション後、０．４
８７ＩＩ１０インキユベーシヨンしたサンプル全量を、
シリカゲル粒子（５５ないし１０５ミクロン）に共有結
合した９５ダのオクタデシルシラン（ＯＤＳ）’に含む
テフロンチャンバーに通して流す。

そのチャンバーの空孔の内側の寸法は、直径４ｍｍで、
長さ１２ｍである。その空孔の底の覆いは円周０．３イ
ンチの２５ミクロンメツシュのナイロンである。ＯＤＳ
を乾燥したままその空孔に注ぎ、直径４ｍｍで厚さ２ｍ
ｍの円形のテフロンウールで覆う。そして空孔の上端は
、さらに円周０．８インチの２５ミクロンメツシュのナ
イロンで榎う。（その空孔内のＯＤＳ￥′ｉ直径４龍高
さ１０酎の円柱状カラムを形成する）サンプル全量’ｔ
８．ｏＩＩＩ７／分の割合でそのＯＤＥに通して流す。

この結果、抗体に結合していないチロキシン（標識した
ものも、標識していないものも含む〕はＯＤＳに吸着さ
れ、−万、抗体に結合したフラクションは放射能検出フ
ローセル中へ続けて流れ、そこで定量される。その抗体
に結合したフラクションは、定量のため、０．０２Ｍリ
ン酸、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
０８Ｖアジ化ナトリウム、および０．００５％ゲンタミ
シン硫酸塩を含む緩衝液で２．４　ｍｌ　７分の割合で
０．８８分間検出器中へ洗い導く。吸着されたフラクシ
ョンは０．０２５Ｍグリシン、０．０２５％安息香酸、
０．０４２５Ａｆリン酸、そして５０％アセトニトリル
を含む溶液で、ｐＨ２，０にて、２．４　ｍｌ　７分の
割合で１，０８分間溶出させる。この脱着したフラクシ
ョンは、定量のためｓ　（Ｌ　Ｏ２Ａ／　’）ン酸、ｐ
Ｈ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、ｏ、ｏｏａＭア
ジ化ナトジナトリウムび０．００５％ゲンタミシン硫酸
塩を含む溶液で８．０ｍ／分の割合で０．１５分間固体
シンチレーション検出器中へ洗い導く。この洗浄によっ
て次のサンプルの循環に対する準備ができる。

チロキシンの量は、サンプルの結合度と、既知の標準曲
線の結合度を比較することにより決定できる。既知量の
サンプルを、９９％チロキシンを含まないフレオンで処
理した血漿、１．０％２度蒸留した水、０．００５％バ
シトラシンおよび０００５％クロラムフェニコールを含
む溶液へ加える。チロキシンに対する典型的な結果は、
痕跡量で４６．４％結合、０．２ｎｙ／ｍで４８．８％
結企、０．４　？１．ｙ／ｍｌで４１．２％結合、０．
８　ｎｙ／ｍｌで３７．７％結合、Ｌ６ｎｙ／ｍで８４
．１結合、８．２ｎｙ／ｓｌで２９．８％結合、６．４
ｎｙ／ｙａｌで２６．１％結合、および１２，８ｎ　ｙ
／ｍｌで２５．０％結合となる。上の曲線を使って、０
．５６−０．８４　ｎｙ／ｌｎｌ　（７）範囲の市販ノ
コントロールは、０．５８　ｎｙ／：ｎｌと分析された
。１．４１−２．１　Ｉｎｆ／ｍｌの範囲の二番目の市
販のコントロールは、１．５１　ｎｙ／ｌｎｌと分析さ
れた。２．４４−３．６７　ｎｙ／ｍｌの範囲の三番目
の市販のコントロールは、２．４８ｎ　ｔ／ｍｌと分析
された。

実施例＆ コルチゾール コルチゾールの分析は、１６μｌの血清あるいは被験サ
ンプルをポリスチレンのサンプル容器に入れることによ
り行なわれる。′２５Ｉで標識されたコルチゾールー力
ルボキシメトキシムーチロシンスｋ　Ｏ−４１１ｃｉ／
　：ｔｌｉ　（比活性＝　０．５−２　ｒｎｃｉ／ｌｔ
ｔ　入０．０２　Ａ／　ＩＪ　ン酸、ｐＨ７，４，０，
０５Ｍ塩化ナトリウム、０．８＃ｌ１ｉｉｌ／Ｘｎ１８
−７＝　！Ｊ　／　−１−す７タレ：ｙスルホン酸（ア
ンモニウム塩）、０．００８Ｍアジ化ナトリウムおよび
０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を含む５０μｌの溶液
をこのサンプルに加える。

これに続いて、５０−８０％の程度に１２５１−コルチ
ゾールトレーサー標識が結合している、ウサギコルチゾ
ールに特異的な抗血清、０．５Ａ／ＩＪン酸、ｐＨ６，
０、Ｏ−００８Ｍ７ジ化ナトリウム、０．００５％ゲン
タミシン硫酸塩、および０．８〜／７ｎ１８−ア−”）
／−１−ナフタレンスルホン酸（アンモニウム塩）ｖｉ
−含む１００μｊの溶液を加える。そして、これに続イ
テ、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、および（ＬＯ
Ｏ５％ゲンタミシン硫酸塩を含む６００μｌの溶液を加
える。サンプル全量を室温で３０分間インキュベーショ
ンする。インキュベーションＬＯ−７２ｍｌのインキュ
ベーションしたサンプル全量を、シリカゲル粒子（５５
ないし１０５ミクロン）に共有結合した９５Ｉｎ９のオ
クタデシルシラン（ＯＤＥ）を含んでいるテフロンチャ
ンバーに通して流す。そのチャンバー空孔の内側の寸法
は直径４朋で、長さ１．２闘である。その空孔の底の覆
いは、円周０．８インチの２５ミクロンメツシュのナイ
ロンである。ＯＤＳを乾燥したままその空孔に注ぎ、直
径４１ｎ１で、厚さ２寵の円形のテフロンウールで覆う
。空孔の上端は、さらに円周０．３インチの２５ミクロ
ンメツシュのナイロンで覆う。

（空孔内のＯＤＥは、直径４闘、高さ１０龍の円柱状カ
ラムを形成する）サンプル全量ｋ、８．９ｍ／／分の割
合でＯＤＳに通して流す。

この結果、抗体に結合していないコルチゾール（標識し
たものも、標識し心ないものも）はＯＤＳに吸着され、
一方、抗体に結合したフラクションは、放射能検出用フ
ローセル中へ続けて流れ、そこで定量される。抗体に結
合したフラクションは、０．０２Ａｉリン駿、ｐＨ７，
４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００８Ａ／アジ化
ナトリウム、および０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を
含む緩衝液で、２．４１ｎｌ／分の割合で、０．３８分
間足量のために検出器中へ洗い導く。吸着されたフラク
ションは、０．０２５Ｍグリシン、０．０２５％安息香
酸、０．０４２５Ｍリン懺、および５０％アセトニトリ
ルを含む溶液で、ｐＨ２，０にて２．４ｍ／／分の割合
で１．０８分間溶出させる。この脱着したフラクション
は、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナ
トリウム、ｏ、ｏｏａＭナトリウムアジドおよび０．０
０５％ゲンタミシン硫酸塩を含む溶液で、８．０ｍ１１
分の割合で、０．１５分間、定量のために固体シンチレ
ーション検出器中へ洗い導く。この洗浄によって、次の
サンプルの循環を行うためのＯＤＳの準備ができる。

コルチゾールの量は、サンプルの結合度を、既知の標準
曲線の結合度と比較することにより決定される。既知量
のコルチゾールを９９％コルチゾールを含まないフレオ
ンで処理した血漿、１．０％二度蒸留した水、０．００
５％バシトラシンおよび０．００５％クロラムフェニコ
ールを含む溶液に加える。コルチゾールについての典型
的な結果は、痕跡量で７０．６％結合、２．Ｏｔｔｆｌ
ｄｉで６Ｚ５％、４．０　μｔ／ｄｉ　Ｔ：　５５．５
％、８．　ＯｌｌＶｄ１で４６．１％、１６、Ｏｔｎｌ
ｄｌｌで８５．６％、８２．Ｏｔｎｌｄｉで２７．。

％、および６４．０μｔ／ｄｌｌで２０．８％となる。

上の曲線を用いて、確定した２、８１μＷ／ｄＪｌ　−
４，２１μｔ／ｄｌｌの範囲の市販のコントロールは８
４．１μＶｄＪと分析された。確定した９、７２μｔ／
ｄｌｌ−１４５８μｔ／ｄｉの範囲の二番目の市販のコ
ントロールは１１．４８μ？／ｄｌｌと分析された。確
定した８Ｌ２６μｔ／ｄｌｌ　−４１，８８μｔ／ｄｌ
の範囲の三番目のコントロールは８２．４２μｆ／ｄｌ
と分析された。

実施例Ｇ インシュリンの分析は、２００μｌの血清あるいは被験
サンプルをポリスチレンのサンプル容器に加えることに
より行なわれる。このサンプルに、５０−８０％の程度
に１２！ｌ　Ｉ−インシュリントレーサー標識が結合し
ている、モルモットインシュリンに特異的な抗血清、０
．０２５ＭＩＪン酸、ｐＨ６，２，０，０２％ウシ血清
アルブミン、０．０２％チメロザールおよび６０　ＫＩ
Ｕ＃！　トラシロールを含む７５μｌの溶液を加える。

これに続いて１９　Ｉで標識されたインスリン’ｉｏ、
０２５μＣｉ／ｄ　（比活性０．８−　ＯＪ　５　ｔｎ
Ｃｉ／μ２）、０．０２５Ｍリン酸、ｐＨ６，２，０，
２％ウシ血清アルブミン、０．０２％チメロザール、お
よび６０　ＫＩＵ／ｌｕｔ　）ラシロールおよび１％ア
セトニトリルを含む１００μｌの溶液を加える。そして
、これに続いて、０．０２Ｍリン酸、０．０５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．２％アジ化ナトリウム、および０．００
５％ゲンタミシン硫酸塩をｐＨ’１．４で加える。サン
プル全量を室温で１．８時間インキュベーションする。

インキュベーション後、６５５μｌのインキュベーショ
ンシタサンミクロン）に共有結合している９５Ｉｎ９の
オクタデシルシラン＜０ＤＥ）を含むテフロンチャンバ
ーに通して流す。そのチャンバー空孔の内側の寸法は、
直径４ｍｍで、長さ１２ｍである。その空孔の底の覆い
は、円周０．８インチの２５ミクロンメツツユのナイロ
ンである。０ＤＳｋ乾燥したままその空孔に注ぎ、直径
４龍で、厚さ２朋の円形のテフロンウールで覆う。そし
て、空孔の上端はさらに円周帆８インチの２５ミクロン
メツシュのナイロンで榎う。（空孔内（ＤＯＤＳは直径
４龍で高さ１０Ｕの円柱状カラムを形成する）サンプル
全量を、８．０１＋Ｉ／／分の割合でＯＤＳに通して流
す。

この結果、抗体に結合していないインシュリン（標識し
たものも、標識していないものも）は、ＯＤＳに吸着さ
れ、−万、抗体に結合したフラクションは放射能検出フ
ローセル中へ続けて流れ、そこで定量される。抗体に結
合したフラクションは、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４
，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００８ｈＬアジ化ナ
トリウム、および０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を含
む緩衝液で２．４ｄ／分の割合で０．３８分間、定量の
ために検出器中へ洗い導く。吸着されたフラクションは
０．０２５Ｍグリシン、０．０２５％安息香酸、０．０
４２５Ａ／リン酸および５０％アセトニトリルを含む溶
液でｐＨ２，０にて２．４ｍ１１分の割合で１．０３分
間溶出させる。この脱着したフラクションは、０．０２
Ｍリン酸、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０
．００８Ａｆアジ化ナトリウム、および０．００５％ゲ
ンタミシン硫酸塩を含む溶液で８．０ｍ１１分の割合で
０．１５分間足量のだめに固体シンチレーション検出器
中へ洗い導く。この洗浄によって、次のサンプルの循環
を行うだめのＯＤＳの準備ができ−る。

インシュリンの量はサンプルの結合度と、既知の標準曲
線の結合度とを比較することにより決定される。既知量
のインスリンを、９９％インス゛リンを含まないヒト血
清を含む溶液に加える。インスリンについての典型的な
結果は、痕跡量で７２．２％結合、８　ｐＵ７／ｄで６
２．４％結合、１６　ｐＵ／　Ｙｎｌで６１．９％結合
、８２μの値で５５．７％結合、６３μｖ／ｓｔｔで５
１．７％の結合、１２５　ｔｔＵ／ｍｌで４４．５％結
合および２５０μＵＡｎｌで３８．２％結合となる。上
の曲線を使って、４．９−１８．８μＵ／−の範囲の市
販のコントロールは、１８．０μＵ／ｙｘｌと分析され
た。２４−５２μＵ／ｍｌの範囲の二番目の市販のコン
トロールは４８．１μＵ、Ａｒｔｌと分析された。

実施例７ Ｔ、ＲＩＡ トリョードチロニンの分析は、７５μｌの血清あるいは
被験サンプルをポリスチレンのサンプル容器に加えるこ
とにより行なわれる。このサンプ／Ｉ／Ｋ、５５−８５
％Ｏ程ＫＫ”Ｉ−Ｔｓ　トレ　”ｊ−標識が結合してい
る、ウサギのトリョードチロニン（Ｔ、）に特異的な抗
血清、０．０２Ｍ！Ｊン酸、０．０５Ａ／塩化ナトリウ
ム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．００５％ゲンタ
ミシン硫醗塩および１．０％の正常なウサギの血清を含
む５０μｌの溶液をｐＨ７，４にて加える。これに続い
て、！２５Ｉで標識されたＺ、−）リョードチロニン−
１２”Ｉ、　単一放射活性（比活性＝　０．５−２にｉ
／μをンを０．１２μＣｉ／ｍＡ’、　　０．０５Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、”０．１　Ｍ
グリシン、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．０４％
アジ化ナトリウム、５．０％無水エタノール（変性した
もの）および０．１％８−アニリノ−１−ナフタレンス
ルホン酸を含む３００μＥの溶液を７）Ｈ８，７にて加
える。そして、これに続いて０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７
，４，０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナ
トリウム、および０．００５％ゲンタミシン微酸塩を含
む７５μノの溶液を加える。サンプル全ｉｔ室温で２５
分間インキュベーションする。インキュベーション後、
０．５ｍｌのインキュベーションしたサンプル全量ヲ、
シリカゲル粒子（５５−１０５ミクロン）に共有結合し
ている９５〜のオクタデシルシランＣ０ＤＳ）を含むテ
フロンチャンバーに流して通す。そのチャンバー空孔の
内側の寸法は、直径４朋で、長さ１２１ｍである。その
空孔の底の覆いは、円周０．３インチの２５ミクロンメ
ツシュのナイロンである。

ＯＤＳを乾燥したままその空孔に注ぎ、直径４朋で厚さ
２ｍｍの円形のテフロンウールで覆う。そして空孔の上
端は、さらに円周０．３インチの２５ミクロンメツシュ
のナイロンで覆う。（空孔内のＯＤＳは、直径４龍で高
さｌ０ＩＩＥＩの円柱状のカラムを形成する）サンプル
全量’ｉ８．０ｄ／分の割合でＯＤＳに通して流す。

この結果、抗体に結合していないＴ３　（標識したもの
も、標識していないものも含む）はＯＤＳに吸着され、
一方、抗体に結合していないフラクションは放射能検出
フローセル中へ続けて流れ、そこでｉｎされる。抗体と
結合したフラクションは、０．０２Ｍす７酸、ｐＨ７，
４，０，０５１／塩化ナトリウム、ｏ、ｏｏａＭアジ化
ナトジナトリウムび０．００５％ゲンタミシン硫酸塩を
含む緩衝液で２．４ｍＡ’／分の割合で０．３８分間定
量のために検出器中へ洗い導く。吸着されたフラクショ
ンは、０．０２５　Ｍグリシン、０．０２５％安息香酸
、０．０４２５Ａ／リン酸および６０％アセトニトリル
を含む溶液でｐＨ２，０にて２．４ｍＡ’／分の割合で
１．０３分間溶出−させる。この脱着したフラクション
は、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．００３Ｍアジ化ナトリウム、および０．
００５％ゲンタミシン硫酸塩を含む溶液で８．０ｍ１１
分の割合で０．１５分間、定量′のために、固体シンチ
レーション検出器中へ洗い導く。この洗浄によって、次
のサンプルの循環を行うだめのＯＤＳの準備ができる。

Ｔ３の量は、サンプルの結合度と、既知の標準曲線の結
合度を比較することにより決定される。

既知量のＴ３ｋ、６７％Ｔ＋に含まないヒト血清、２％
ヒト血清アルブミ：／、０．００５％クロラムフェニコ
ール、０．００５％バシトラシン、および０．００８　
Ｍアジ化ナトリウムを含む溶液に加える。

トリョードチロニンについての典型的な結果は、痕跡量
で７３，４％結合、５０　ｎｙ／ｄｉで６７．９％結合
、１００　ｆＬｔ／ｄｉで６１．８％結合、２００　ｎ
ｙ／ｄｌｌで５２．２％結合、４００　ｎｇ／ｄｉで４
２．９％結合、および８００　ｎｙ／ｄｉで８８．８％
結合となる。上の曲線を使って、確定した７８−９４ｎ
り／ｄｉの範囲の市販のコントロールは、　　８６　ｎ
ｙ／ｄｉと分析された。確定した１４６−１７２ｎｙ／
ｄｉの範囲の二番目の市販のコントロールは１６４　ｎ
ｙ／ｄｉと分析された。確定した８　８５−４１７ｎｔ
ｔ／ｄｉの範囲の三番目の市販のコントロールは８９６
　ｎｙｄｌと分析された。

【図面の簡単な説明】

第１図は自動化放射能測定システムの概要のダイアダラ
ムであり、ビタミンＢ１２および葉酸の競争４的蛋白結
合分析法に対する血清サンプルの調製における種々の段
階を表わしたフローチャートを示している。 第２図から第６図は放射能測定時における自動化放射能
測定システムの種々の段階および位置な示しである。 Ｃ外４．Ａらン 手続補正書 昭和５８年７月ｌ　日 特許庁長官　若杉和夫　　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第　８６５２８　　号２、発明の名称 競争的蛋白結合分析法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 ４、代理人 別紙の通り。 （別紙） （１）特許請求の範囲を下記のように補正する。 「（１）分析試料を標識した分析試料および上記の分析
試料および上記の標識した分析試料による競争的な結合
活性に適した蛋白バインダーの存在下見インキュイード
し、フリーの分析試料、フリーの標識した分析試料、結
合した分析試料およびパ結合した標識した分析試料の混
合物を得て、前もつで測定した量の上記混合物をシリカ
ゲルに結合した有機シランの層を通して流出させること
により、上記の結合した分析試料および上記の結合した
標識した分析試料を上記のフリーの分析試料およびフリ
ーの榛緑した分析試料から実質的に分離し、上記の結合
した分析試料および上記の結合した標識した分析試料を
実質的に含む第１フラクシミンおよび上記のフリーの分
析試料および上記のフリーの標識した分析試料を実質的
に含む第２フラクシヨンとし、 上記の第１および第２のフラクションの少なくとも１つ
の標識した分析試料を分析し、標準サンプルと比較して
上記の分析試料の濃度を決定する、ことから成る競争的
蛋白結合分析の改良法。 （２）上記の有機シランが鎖状の０８ないしＣ２４の有
機部分を有する特許請求の範囲第（１）項に記載の分析
法。 （３）上記の有機シランがオクタデシルシランである特
許請求の箭＠４第（１）項に記載の分析法。 （４）上記のシリカゲルが約２５ないし約２５０ミクロ
ンの粒子の大六さシ有する特許請求の範囲第（１）項に
記載の分析法。 （５）上記混合物な有機シラン−シリカゲル１ｃｃ当り
、１分間に約０．０２ないし約０．２０　ｍｌの速度で
シリカゲルに結合した有機シランの層を通して流出する
特許請求の範囲第（１）項に記載の分析法。 （６）上記混合物を有機シラン−シリカゲルｌｃｃ当り
、１分間に約０．０７ないし約１．０ｍｌの速度でシリ
カゲルに結合した有機シランの層を通して流出する特許
請求の範囲第（１）項に記載の分析法。 （））上記混合物を有機シラン−シリカゲル１ｃｃ当り
、１分間に約０．０２ないし約０．２０　ｍｔの速度で
シリカゲルに結合した有機シランの層を通して流出する
特許請求の範囲第（３）項に記載の分析法。 （８）上記混合物を有機シラン−シリカゲルｉ　ｃｅ当
り、１分間に約０．０７ないし約１．　Ｑ　ｍｅの速度
でシリカゲルに結合した有機シランの層を通して流出す
る特許請求の範囲第（３）項に記載の分析法。 （９）上記分析試料がジゴキシン、Ｔ３取り込み、チロ
キシン、コルチゾール、インシュリン、および葉酸およ
びビタミンＢ１２の両者あるいは一方の測定から選択さ
れる特許請求の範囲第（１）項の記載の分析法。 （１０）上記分析試料がジゴキシン、Ｔ３取り込み、チ
ロキシン、コルチゾール、イソシュリンおよび葉酸およ
びビタミンＢ１２の両者あるいは一方の測定から選択さ
れる特許請求の範囲第（３）項に一記載の分析法。 （１１）上記分析が葉酸およびビタミンＢ１２の同時分
析に用いられる特許請求の範囲第（１）項に記載の分析
法。 （１＃　　上記分析が葉酸およびビタミンＢ１□の同時
分析に用いられる特許請求の範囲第（３）項に記載の分
析法。 （１３）　　シリカゲルに結合した有機シランの上記の
層が自動化分析システムにおいて再使用される特許請求
の範囲第（１）、（２）および（３）項に記載の分析法
。 （１４）　　チェンバー内に配置した流入口および流出
口および分離メディウム（この分離メディウムはシリカ
ゲルに結合した有機シランである）を有するチェンバー
から成る競争的蛋白結合分析用のカートリッジ。 （１５）上記有機シランが鎖状のＣ８ないしＣ２４の有
機部分を有する特許請求の範囲第Ｋ１１）運に記載のカ
ートリッジ。 （国　上記有機シランがオクタデシルシランである特許
請求の範囲第（１３）項に記載のカートリッジ。 同　上記シリカゲルが約２５ないし約２５０ミクロンの
粒子の大きさを有する特許請求の範囲第（１３）項のカ
ートリッジ。」 （２）明細書を下記に補正する。 頁　　　　行　　　　誤　　　　　　　　正１０１０−
１１　　　有機ケイ素　　　　有機シラン１２８〜９　
　　　〃　　　　　　　　〃２５　１５．１６，１９　
　　　＃　　　　　　　　　＃２６９、　　　　　　　
　　。 以　　　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）分析試料を標識した分析試料および上記の分析試
   料および上記の標識した分析試料による競争的な結合活
   性に適した蛋白バイングーの存在下、インキュベートし
   フリーの分析試料、フリーの標識した分析試料、結合し
   た分析試料および結合した標識した分析試料の混合物を
   得て、 前もって測定した量の上記混合物をシリカゲルに結合し
   た有機ケイ素の層を通して流出させることにより、上記
   の結合した分析試料および上記の結合した標識した分析
   試料を上記のフリーの分析試料およびフリーの標識した
   分析試料から実質的に分離し、上記の結合した分析試料
   および上記の結合した標識した分析試料を実質的に含む
   第１フラクシヨンおよび上記のフリーの分析試料および
   上記のフリーの標識した分析試料を実質的に含む第２フ
   ラクシヨンとし、 上記の第１および第２のフラクションの少なくとも１つ
   の標識した分析試料を分析し、標準サンプルと比較して
   上記の分析試料の濃度を決定する、ことから成る競争的
   蛋白結合分析の改良法。 （２）　　上記の有機ケイ素が鎖状のＣ８ないしＣ’２
   ４の有機部分を有する特許請求の範囲第（１）項に記載
   の分析法。 （３）上記の有機ケイ素がオクタデシルシランである特
   許請求の範囲第（１）項に記載の分析法。 （４）上記のシリカゲルが約２５ないし約２５０ミクロ
   ンの粒子の大きさを有する特許請求の範囲第（１）項に
   記載の分析法。 （５）上記混合物を有機ケイ素−シリカゲル１ｃｃ当り
   、１分間に約０．０２ないし約０．２０１Ｆ、Ａの速度
   でシリカゲルに結合した有機ケイ素の層を通して流出す
   る特許請求の範囲第（１）項に記載の分析法。 （６）上記混合物を有機ケイ素−シリカゲル１区当り、
   １分間に約０．０７ないし約１．ＱＦＩｌｇの速度でシ
   リカゲルに結合した有機ケイ素の層を通して流出する特
   許請求の範囲第（１）項に記載の分析法。 （７）上記混合物を有機ケイ素−シリカゲル１ｃｊ１１
   ．当り、１分間に約０．０２ないし約０．２０ｍＡの速
   度でシリカゲルに結合した有機ケイ素の層を通して流出
   する特許請求の範囲第（３）項に記載の分析法。 （８）上記混合物を有機ケイ素−シリカゲル１に当り、
   １分間に約０．０７ないし約１．Ｏｍｌの速度でシリカ
   ゲルに結合した有機ケイ素の層を通して流出する特許請
   求の範囲第（３）項に記載の分析法。 （９）上記分析試料がジゴキシン、Ｉ３取り込み、チロ
   キシン、コルチゾール、インシュリン、オヨび葉酸およ
   びビタミンＢ、２０両者あるいは一方の測定から選択さ
   れる特許請求の範囲第（１）項の記載の分析法。 （１０）上記分析試料がジゴキシン、Ｉ３取り込み、チ
   ロキシン、コルチゾール、インシュリンおよび葉酸およ
   びビタミンＢ１□の両者あるいは一方の測定から選択さ
   れる特許請求の範囲第（３）項に記載の分析法。 （ｌυ上記分析が葉酸およびビタミンＢ、２の同時分析
   に用いられる特許請求の範囲第（１）項に記載の分析法
   。 （１２）上記分析が葉酸およびビタミンＢ、２の同時分
   析に用いられる特許請求の範囲第（３）項に記載の分析
   法。 （１ａ）シリカゲルに結合した有機ケイ素の上記の層が
   自動化分析システムにおいて再使用される特許請求の範
   囲第（１）、（２）および（３）項に記載の分析法。 （１４）チェンバー内に配置した流入口および流出口お
   よび分離メディウム（この分離メディウムはシリカゲル
   に結合した有機ケイ素である）を有するチェンバーから
   成る競争的蛋白結合分析用のカートリッジ。 （］５）上記有機ケイ素が鎖状のｃ８ないしｃ２４の有
   機部分を有する特許請求の範囲第（１３）項に記載のカ
   ートリッジ。 （１６）上記有機ケイ素がオクタデシルシランである特
   許請求の範囲第（１８）項に記載のカートリッジ。 （１：Ｄ上記シリカゲルが約２５ないし約２５０ミクロ
   ンの粒子の大きさを有する特許請求の範囲第（１８）項
   のカートリッジ。