JPS5822192B2 - 新菌種スポロトリクム・セルロフイルム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスポロトリクム属の新菌種スポロトリクム・セ
ルロフイルムに関する。

セルラーゼは従来から糸状菌、担子菌、放線菌及び細菌
によって生産されることが知られているが、一般にセル
ラーゼの培養液中への蓄積が低くセルラーゼを産業上利
用する場合、大きな障害となっている。

そこで本発明者らは広く自然界よりセルラーゼ生産菌の
検索を行った結果、セルラーゼを著量蓄積する能力を有
する新種スポロトリクム・セルロフイルムに属する糸状
菌を得ることができた。

このスポロトリクム・セルロフイルムに属する糸状菌は
セルラーゼ生成能が強〈従来のセルラーゼ生産菌として
著名であるトリコデルマ・ビリデとほぼ同等であり、更
にこのスポロトリクム属の糸状菌は４５〜５０℃の高温
で培養できるため、生育が速く、２〜４日間で培養する
ことができる利点を有している。

本発明者等はこのスポロトリクム属糸状菌のセルラーゼ
生産増大せしめる方法について更に研究ヲ行ツタ結果、
グルコースアナログに耐性を有する変異株の中に親株に
比べ、セルラーゼを著量生成する能力を有する変異株を
見い出し本発明を完成するに至った。

本発明の糸状菌は新菌種スポロトリクム・セルロフイル
ムに属するセルラーゼ生産能を有する糸状菌で例として
はスポロトリクム・セルロフイルム ＡＪ ６９８６
ＦＢＲＭ−Ｐ ３５１４及びＡＪ ６９８６を
親株として得られたグルコースアナログに耐性を有する
ＡＪ ６９８７Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ ３６９６がある
。

以下にＡＪ ６９８６の菌学的性質を示す。

（１） 各培地における生育状態： ■ イーストペプトン・可溶性澱粉、寒天上での生育状
態 イースト・ペプトン・可溶性澱粉・寒天培地上でのコロ
ニーは生育が早く、４５℃、３白目で６６〜６８朋の直
径に達する。

これらコロニーの性状は羊毛状から多少綿状で胞子を多
数形成し、柔組織状で、無色透明の水滴を全面に形成す
る。

コロニーは初め白色で後ベール・イエロインシュ・ブラ
ウンからベール・イエロー・オレンジになる。

コロニーの裏面は初めイエローイ゛ノシュグレイで後に
ベール・イエローになる。

菌糸は無色、平滑、分岐性で、隔壁を有し。

横巾は１．５〜５μｍである。

アルリオスポアは単独、または末端に群生し、さらに菌
糸状にも側生じ、あるいは短いアルリオフオーレまたは
種子上にも生ずる。

これらアルリオスポアは平滑、■細胞性で、細胞壁の厚
さが０．２〜０．５μｍと厚く、無色で、卵形から洋梨
形（４〜５Ｘ２．５〜３μｍで、しばしば欄内形（（４
，５〜）５〜８×２．５〜４μｍ）の大きさ、そして各
胞子はしばしば巾広く、狭い出芽跡を残し、その横巾は
１〜１．５μｍである。

■ ポテート・デキストロース・寒天上での生育状態： ポテート・デキストロース・寒天上でのコロニーは生育
が非常に早く、４５℃、３白目で６３〜６５ｍｍの直径
に達する。

これらコロニーは羊毛状から多少綿状で豊富に胞子を形
成し、全面に無色透明の水滴を作る。

コロニーの色はベール、イエロウ−・オレンジになる。

コロニーの裏面は初め無色で後にベール・ブラウンから
ベール・イエローになる。

（２）生理的性質： ■ 生育の範囲（前記ポテト・デキストロース培地使用
） ｐＨ：３〜８ 温度：２５〜５０℃ ■ 最適生育条件（前記ポテト・デキストロース・寒天
培地使用） ｐＨ：４〜７ 温度３５℃〜４５℃ 以上の菌学的性質より本菌株は、スポロトリクム属に属
する。

スポロトリクム属公知菌種中、高温菌に属する菌種とし
ては、スポロトリクム・サーモファイル（Ｓｐｏｒｏｔ
ｒｉｃｈｕｍｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ ）が知られてい
る。

本菌株は胞子の色調が無色で生育温度範囲が２５℃〜５
０℃であるに対し、スポロトリクム・サーモファイルは
胞子の色調がブラウン系を呈し、生育温度範囲が２５°
Ｃ〜５５℃である。

このように糸状菌の分類で重要な菌学的性質としてとり
上げられている胞子の色調、および生育温度において本
菌株はスポロトリクム・サーモファイルと明確に異って
いる。

従って、本発明者らは本菌株をスポロトリクム属に属す
る新菌種と認め、本菌株をスポロトリクム・セルロフイ
ルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｐ
ｈｉｌｕｍＳｐ、ｎｏｖ、 ）と命名した。

スポロトリクム・セルロフイルムＡＪ ６９８７の菌
学的性質は上記ＡＪ ６９８６と殆んど比しく、親株
ＡＪ ６９８６が０．１％グルコースアナロクの存在
で生育が阻害されるのに対し、０．１％グルコースアナ
ログ存在下で生育しかつ親株の２〜４倍のセルラーゼ生
産能を有している点で異っている。

本発明でいうグルコースアナログとはスポロトリクム属
糸状菌の生育を阻止し、その生育阻害がグルコースの添
加によって解除されるグルコース類似化合物を言い１例
えば２−デオキシグルコース、３−０−メチルグルコー
スなどである。

本発明のグルコースアナログ耐性株の誘導方法は紫外線
照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンあるいは亜硝酸処理等の通常の変異誘導方法に従え
ば良い。

以下にグルコースアナログ耐性株であるＡＪ ６９８
７の具体的な採取方法を示す。

実施例 スポロトリクム・セルロフイルムＡＪ ６９８６ＦＥ
ＲＭ−Ｐ ３５１４をポテトデキストロース寒天斜面
培地上で４５℃ ５日間培養し胞子を十分形成せしめた
。

この胞子をＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンを１００ｒ／ｍ含有するｐＨ７，１、０，０５Ｍ
ＩＪン酸緩衝液に懸濁しく１０９／１１１１）、４５℃
で６０分間保持した。

次いで遠心分離して胞子を集め、前記リン酸緩衝液で十
分洗浄した。

この胞子を適当数０．１％２−デオキシグルコースを含
有するポテトデキストロース寒天培地（ｐＨ６，６）に
途布し、４５℃で５日間培養し、生育して来たコロニー
３００株を釣菌した。

このようにして分離した菌株を第１表に示す液体培地（
５，０ｍｌ／３０ｍ試験管）に接種し、４５℃で４日間
振盪培養した（１１５ ０ｓ ｉ ｌ！／ｍｉ ｎ 、 ） 次に、２−デオキシグルコース耐性株の内生前が良好な
ものを５株選び、培養液中のセルラーゼ活性を調べたと
ころ、いずれの耐性株も親株の２〜４倍のセルラーゼ活
性を示した。

この内から最も活性の強いスポロトリクム・セルロフイ
ルムＡＪ ６９８６を採取した。

一方、グルコースアナログ丑して３−０−メチルグルコ
ース０．１％含有プレートを用いて全く同様の操作によ
り、親株の２〜４倍のセルラーゼ活性を有する３−０−
メチルグルコース耐性株３株が得られた。

このようにして得られた２−デオキシグルコース耐性株
は、同濃度の３−〇−メチルーグルコースにも耐性を示
し、逆に３−０−メチルグルコース耐性株は２−デオキ
シグルコース耐性を示すことが確認された。

これらグルコースアナログ耐性株は、親株が培地中のグ
ルコースの存在でセルラーゼ生産が著しく阻害されるの
に対し、グルコースが０．５〜２．０％培地中に存在し
ていてもセルラーゼ生産能力を有し、この為にセルラー
ゼ生産力が２〜４倍に増大したものと考えられる。

本発明のスポロトリクム属の糸状菌は培養液中にセルラ
ーゼを著量生成する能力を有するものでセルラーゼの生
産に適している。

その他セルロースを炭素源として良く生育するので、こ
の性質を利用して公害処理あるいは微生物菌体の製造に
利用できるものである。

セルラーゼを生産する場合には通常セルラーゼ生産に用
いられる培地で３０〜５０℃望ましくは４５〜５０℃、
ｐＨ４〜９で固体培養又は液体培養すれば良く、２〜４
日で著量のセルラーゼが菌体外に蓄積される。

この場合セルラーゼの生産に用いられる培地の炭素源と
しては、濾紙、一般紙類、オガクヅ、大豆粕、コーヒー
粕等の植物繊維質およびその含有物が用いられる。

又、グルコースアナログ耐性株を使用する場合には親株
と異り、澱粉（その分解物）、シュークロース、クルコ
ース、ケーンモラセス等の併用も可能である。

窒素源としては、硫安等の無機アンモニューム塩、尿素
、アミノ酸、肉エキス５ポリペプトン蛋白分解物等の有
機窒素源が使用される。

その他、ＫＨ２ＰＯ４゜ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２ 、Ｃ
ｏＣｌ２．ＦｅＳＯ４゜ＭｎＳＯ４，Ｚｎ８０４等の無
機塩類さらに必要に応じて有機微量栄養源を含有する栄
養培地が使用される。

このような方法で培養して得られた培養液はそのまま酵
素源として使用できるが、得られた培養液から分離した
菌体および培養濾液はいずれも粗酵素として使用するこ
ともできる。

また菌体を除去した培養液から、塩析法、有機溶剤によ
る沈澱法等公知の方法を用いることにより、強力な活性
を有する粗酵素剤を得ることができる。

実施例 １ スポロトリクム・セルロフイルムＡＪ ６９８６ＦＥ
ＲＭ−Ｐ ３５１４及びＡＪ ６９８７ＦＥＲＭ−
Ｐ ３６９６をポテトデキストロース寒天培地上（ｐ
Ｈ６，０）で４５℃ ５日間培養し。

そのスラント上に生育した菌体を一白金耳とり、第１表
の組成の培地５０ｒＩＬｌ（５００ｄ容フラスコ使用）
に接種し、４８℃で４日間振盪培養した（振巾７．０ｃ
ｍ、１１５０ｓｉｌ 、／ｍｉｎ、）。

培養液を濾過して得られた培養液のワ゛ノドマン／ｉ６
１濾紙に対するセルラーゼ活性を測定したところ、親株
ＡＪ ６９８６のセルラーゼ活性は１．３×１０４υ
／ＴＬｌであるのに対し、グルコースアナログ耐性変異
株ＡＪ ６９８７は５．２Ｘ１０４υ／罰であり、親
株の約４倍の活性を示した。

尚、上記セルラーゼ活性は次のような方法に従って測定
したものである。

濾紙（ワンドマンＡ Ｉ ：ｌ：５０即を基質とし、こ
れに酵素液０．５罰とクエン酸緩衝液（ｐＦ１６．０
、０．０５Ｍ） １０ｄを加え、６０℃で１．０時間酵
素反応を行った後、１００℃で５．０分間加熱し酵素反
応を停止させ、これにジニトロサルチル酸試薬３０ｒＩ
Ｌｌを加え、１００℃で５．０分間加熱し発色させる。

これに水１６属を加え５５０ ｎｍの波長で比色定量し
、還元力を求めた。

酵素単位は、６０℃、１０時間の反応で１μｙのグルコ
ースに相当する還元力を生成する酵素活性を１単位とし
た。

実施例 ２ 市販おから（粗蛋白質３２％、全糖２８％、粗繊維質１
２％含有）１．０％、ＫＨ２ＰＯ４０，２％。

（ＮＨ４）２ＳＯ４０，１５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，０３％、ＣａＣｌ２０．０３％の組成の培地（ｐＨ
６，０）３００ｒｆＬｌを１．Ｏ１容ガラスジャーに注
入シ、１２０℃で１５分間殺菌した。

スポロトリクム・セルフィルムＡＪ ６９８６及びＡ
Ｊ ６９８７を実施例１と同様の方法でスラント培養
し、スラント上に生育した全菌体量を上記培地に夫々接
種し、温度４７℃、攪拌数１０００ｒｌ）ｆｆｌ、内圧
０．５ｋｇ／ｃｒｔｔで２日間培養した。

培養液を濾過して培養濾液２８０ｒｒＬｌを得た。

この粗酵素液のワンドマン／１６１濾紙に対するセルラ
ーゼ活性を測定したところ、親株ＡＪ ６９８６が２
．５Ｘ１０４υ／ＴＬｌであるのに対し、変異株ＡＪ
６９８７では７．６×１０４υ／１１Ｌｌと約３倍の
活性を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 胞子の色調が無色で生育温度範囲が２５〜５０℃で
   ある菌学的性質を有する新菌種スポロトリクム・セルロ
   フイルム。 ２ グルコースアナログに耐性を有する特許請求範囲第
   １項記載のスポロトリクム・セルロフイルム。