JPS58222025A - 精製無毒化エンドトキシンを含有する抗腫瘍組成物 - Google Patents

精製無毒化エンドトキシンを含有する抗腫瘍組成物

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JPS58222025A
JPS58222025A JP58090857A JP9085783A JPS58222025A JP S58222025 A JPS58222025 A JP S58222025A JP 58090857 A JP58090857 A JP 58090857A JP 9085783 A JP9085783 A JP 9085783A JP S58222025 A JPS58222025 A JP S58222025A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） この発明は、精製無毒化エンドトキシン（ＲＤＥ）、細
胞壁骨格（ＳＷＳ　）　、及びトシ・ハロースノミコレ
−１・（ＴＤＭ）を含んで成る医業組成物に関する。こ
の発明において使用するＲＤＭは、検出不能な量の２−
ケト−３−アオキシオククノエート、約３５０〜４７５
　ｎ％、＋Ｌ／Ａｙの燐及び約１７００〜２０００ｎ七
し７タの脂肪酸を含有することを特徴とする。
この組成物は、温血動物の癌性腫瘍を退化せしめ又は鎮
静化するのに有効でおる。
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｌａｅ　）から得ら
れるエンドトキシン抽出物が知られている。これらの抽
出物は、柚々の免疫原性腫瘍の免疫療法に使用されてき
た〔リビ（Ｒｉｂｌ）等ｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　＊　第７巻、４３
〜５８頁（１９７９年）　＋　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ
こと〕。この記載を引用によシこの明細書に組み入れる
。しかしながら、エンドトキシン抽出物は毒性が強く、
このため癌性腫瘍の治療に使用するには限界があること
が知られている。エンドトキシンの腫瘍退化能を保持し
ながらエンドトキシンを無毒化する努力が行われできた
。リビ（Ｒｉｂｌ　）等によシ示されたように、アジュ
バント活性を保持しながらエンドトキシンを無毒化する
ことが知られている化学的方法、例えばザクシニル化及
びフタＩＪ　ＩＪル化によっては、毒性及び腫瘍退化能
の両者が失われた１、従・て、高い腫瘍退化能を有し　
　　　゛且つ毒性をほとんど又は全くカしないエンドト
キシン製品を得る試みはまだ成功していない。
細胞壁骨格とトレハロースジミコレートとの組合わせは
当業界で知られている〔マイヤー（Ｍｅｙｅｒ）等＋　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ
Ｂｎａｅｒ　Ｉｎ５ｔ１ｔｕｔｅ。
第５２巻、第１号、１９７４年１月、　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｌｙ（Ｒｌｂｉ）等、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ＭｏｎｏｇｒａｐｈＡ
３９．１１５〜１２０頁、１９７２年１０月。
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｗａｌｌ
　　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｔｕｍｏｒ通常
見出される蛋白質及び脂質の多くを含有する細胞壁であ
る。これは、トレハロースジミコレートの残物及び未分
解のンベルクロプロテインを含有する高分子ミコリン酸
アラビノガラクタンムコペクテリウム・ノンテリア（Ｃ
ｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏａｉａ　）　（Ｈ３７ＲＶ株及びＡｙｏｍａ　Ｂ株
）、及びＭ、ｙｘ？ビス（Ｍ、　ｂｏｖｌａ　）　ＢＣ
Ｇ株を含む（これらに限定さ′れない）任意ミコバクテ
リアから得られる。
ルネッテ（−（Ｃｏｘｉｅｌｌａ　ｂｕｒｎａｔｔｉｉ
　）のごとき非ミコバクテリアからも得られる。
細胞壁骨格の調製においては、まず、Ｍ、がビス（Ｍ、
　ｂｏｖｉｓ　）　ＢＣＧ　［バシルス・ガルメツチー
ブエリ７　（ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇａｌｍｅｔｔｅ　−
Ｇｕｅｒｉｎ）　）のどとき１Ｍｍを増殖せしめそして
集菌する。こうして得た全細胞残渣を、細胞を破砕して
原形質から細胞壁を分離する細胞分画機〔リビ・セルフ
ラクショネータ（Ｒｌｂｉ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎａｔｏｒ　）　ｒツルパル（Ｓｏｒｖａｌｌ　）　ｒ
モデルＲＴ　−１）によ多処理する。次に、得られた細
胞壁を一連の溶剤抽出及び酵素処理（例えばチ【コ７ン
及び／又はキモ）　ＩＪグシン処理）にかけて精製細胞
壁骨格を得る。
トレ・・ロースノミコレート（’ｒｏＭ）ｕ、物見（ｒ
ｆ生物から得られる。
め、集菌し、そして熱殺菌する。菌体をいくつかの溶剤
で抽出し、そして活性を有し溶剤に可溶な分画を抽出す
る。この抽出物を、一連の溶剤抽出によりさらに精製し
て粗ＴＤＭを得る〔アズマ等。
ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　（４ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　＋第５２巻、
９５　へ１０１頁（１９７４）　、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｌｙＡｃｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｊａｌ　Ｃｅ１ｌＷａｌｌｓ　
、　１　、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒｎｐ
ｏａｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌＷａｌｌ　　５ｋｅｌ
ｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　　Ｐ　ｓ　＋
を参照のこと工この記載を引用によりこの明細書に組み
入れる。
アズマ等によシ開示されたように、粗ＴＤＤを、微粒シ
リカダル遠心クロマトグラフィーによりさらに精製し、
精製ＴＤＭを得ることができる。
前記のごとくして調製されたＣｗＳ及びＴＤＭは油滴乳
剤として使用して注射に適する抗腫瘍組成物を得ること
ができる〔リビ（Ｒｓｂｔ　）　％　＃　Ａｎｎａｌｓ
　ｏｆｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ
ｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　、第２２７巻２２２８〜２３８頁
、１９７６年９月２０日。
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔａ　）。
従って、この発明の目的は、精製無毒化エンドトキシン
、細胞壁骨格、及びトレハロースジミコレートを含んで
成シ、温血動物及びヒトの癌の治療に効果的な医薬組成
物を提供することである。
又、この発明の他の目的は、前Ｈピの成分を言んで成り
、エンドトキシンが通常有する不都合な副作用を有しな
い医薬組成物を提供することである。
以下余白 （発明の概要） Ａｉｌ記の精製無毒化エンドトキシン（ＲＤＥ）を製造
するだめの出発材料として使用するタイプのエンドトキ
シン抽出物は、親株及び変異株を含む任意のエンテロパ
クテリアソセー（Ｅｎｔａｒａｂａｃｔｅｒｉａｃｉａ
ｅ　）から得られる。例えば、次の属の微生物すなわち
、（５ｅｒｒａｔｉａ　）を使用することができる。
次の独すなわち、Ｓ、ミネソタ（Ｓ　、　ｍ１ｎｎｅａ
ｏｔａ　）　＋８、ティピムリウム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｌ＋ｕｎ　）　＋　　Ｂ　、　＜ルソシス（Ｂ、
　ｐｅｒｔｕｓａｉｇ　）　＋　Ｂ　、アン」υレソス
（Ｂ、　ａｂｏｒｔｕａ　）　。
シダラー７１ｚクシ−？−（８ｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅ
ｘｎｉ　）　＊及び的に使用される。
出発材料として使用するエンドトキシン抽出物は複数の
公知の方法の１つを用いて製造することができる〔例え
ば、（１）ウェブスター（Ｗｅｂａｔａｒ　）Ｍ、Ｅ、
、サギン（Ｓａｇｉｎ　）　Ｊ、　Ｆ、　　、う７　ｆ
　４−（Ｌａｎｄｙ　）　Ｍ、　、及びジａ　／ソｙ　
（Ｊｏｈｎｓｏｎ　）Ａ、　Ｇ、　＋ドパ″ル（Ｗｅｓ
ｔｐｈａｌ　）Ｏ，、ルデリッツ（Ｌｕｄｅｒｌｔｚ　
）００．及びビスター（Ｂｉａｔｏｒ）Ｆ、＋グ（Ｇｅ
ｏｒｇｅ　）Ｆ−スプリンタ−（５ｐｒｉｎｔｅｒ　）
編）。
マヅソン（Ｍａｄｉｓｏｎ　）Ｎ、　Ｊ、マソソンプリ
ンディング社、１９５７年、１１５；（４）ガラノス（
Ｇａ１ａｎｏｓ）Ｃ０，ルアリッツ０．．ウエスト・に
ル０．。
Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　９　、２４５　（１
９６９年）；（５）ケン（Ｃｈｅｎ　）Ｃ−Ｈ，、ノヨ
ンソンｈ、Ｇ、、カサイＮ、。
ケイ（Ｋｅｙ）Ｂ、Ａ、　、レビン（Ｌｅｖｉｎ　）　
Ｊ、　ｒノウオドニー　　（Ｎｏｗｏｔｎｙ）Ａ、、　
　ｔｒ、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　　　Ｄｌａ　　１２８　
　５４３（１９７３年）；（６）ピリＥ、　、　ハスキ
ｙ　ス（Ｈａａｋｉｎｓ　）Ｗ、Ｔ、、ランデ４−Ｍ、
、ミルナー（Ｍｉ　１ｎｅｒ　）Ｋ、　Ｃ，。
Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１１４　６４７（１
９６１年）；（７）レイベ（Ｌｅｉｖｅ　）　Ｌ、　、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒａｇ、　　Ｃｏｎｕｎ、　２１
　２９０　（１９６５年）；及び、（８）リビＥ、、ミ
ルナーに、Ｃ，、ペリネを参照のこと〕。
エンドトキシン抽出物を得る好ましい方法はケン（Ｃｈ
ｅｎ　）　尋によシ開示された方法、すなわちメタノー
ル−クロロホルム沈澱法である。
メタノール−クロロホルム沈＃（ＭＣＰ）を有機酸又は
無機酸と反応せしめ、そして凍結乾燥することにより、
出発エンドトキシン材料と比べて毒性及び発熱性が少な
い加水、、分解粗脂質Ａを得る。次に、この生成物を、
脂肪酸及び他の不純物を溶解するが粗脂質Ａを溶解しな
い溶剤で処理する。精製し、無毒化した脂質Ａの燐含量
は毒性エンドトキシンのそれに比べて約半分であ夛、燐
含量がエンドトキシンの毒作用と関係あることが示唆さ
れる。
ＭＣＰと反応せしめるのに使用される好ましい無機酸は
塩酸、硫酸又は燐酸であシ、そして好ましい有機酸はト
ルエンスルホン酸又はトリクロロ酢酸である。反応は、
約９０℃〜１３ｏ℃において、加水分解を完結するのに
十分な時間、通常は約１５〜６０分間行なう。
粗無毒性エンドトキシンの調製は、クロロホルム、メタ
ノール及びエタノール又はこれらの組合せのごとき有機
溶剤の存在下で、出発材料と酸を反応せしめることによ
って行うことができる。
得られた粗脂質Ａを、脂肪酸及び他の不純物を溶解する
アセトンで処理する。次に溶剤を除去して粗無毒化エン
ドトキシンを得る。
以］・余白 １ 次に粗無毒化エンドトキシンを溶剤に溶解し、そしてモ
レギ、ラーエックスクルーシプク口マトグラフィー力ラ
ムのごとき適当なりロマトグラフィーカラムを通過せし
めることによｆｉ　ＲＤＥ分画を分離し、溶剤を除去し
た後にこれを一緒にする。
一つの態様においては、粗無毒化エンドトキシン溶液を
、クロロホルム、メタノール、アセトン。
ピリジン、エーテルもしくは酢酸、又はこれらの組合わ
せのごとき溶剤の存在下でセファデックスカラムを通過
せしめる。カラムの圧は変えることができるが、典型的
には大気圧〜１００　ｔｂｓ／　ｉｌ　２の範囲であり
、流速は約０１〜ｌｏｍｔＺ分の範囲である。
他の態様においては、粗無毒化エンドトキシン溶液を、
セファデックスカラムについて上記したのト同様の圧力
条件の下で、ＤＥＡＥ−七ルロースカラムを通過せしめ
る。流速は約２〜１５ｍｔ／分に維持する。七ファデッ
クスカラムの場合と同じ溶剤を使用することができる。
但し、いずれの混合物にも約１％以下の濃度で水又はジ
壬チルアミンを加えることができる。
粗無毒化エンドトキシンからＲＤＥを調製するための他
の方法には、溶液を、粒子サイズが約２５〜６３ミクロ
ンであるシリカグル６０の低圧カラムを通過せしめ、そ
して容量比が約５０：２５：４：２のクロロホルム、メ
タカール、水及び水酸化アンモニウムからなる溶剤を使
用する方法が含まれる。
ＲＤＥ　、　ＣＷＳ及びＴＤＭを混合し７て強力な抗腫
瘍活性を有する組成物を形成する。ＲＤＥ　−ＣＷＳ　
−ＴＤＭ組成物により治療することができる癌には、ウ
シ扁平細胞癌、ｉ維肉腫、ウマ類肉腫、ウマ黒色腫。
ウマ扁平細胞癌、イヌ乳癌、イヌ腺腫、及びイヌ黒色腫
のごとき動物の腫瘍、並びに、乳癌、肺癌。
塵−直腸腫瘍、悪性黒色腫、扁平細胞癌及び卵巣癌のご
ときヒトの腫瘍が含まれる。この発明の組成物は、油滴
乳剤のごとき医薬として許容される媒体の形で注射によ
り投与され、そして好ましくは、以下に詳述する方法に
よシ直接腫瘍中に投与する。組成物は、例えば凍結乾燥
により安定化し、そして活性を失うことなく再ｈａする
ことができる。動物を治療する場合、注射におけるＲＤ
Ｅの量は約６２５〜２５０マイクログラム／ｍｔである
。
ＣＷＳの１は約１２５〜７５０マイクログラム／　ｍＡ
であシ、そしてＴＤＭの量は約１２５〜２５０マイクロ
グラム／　ｍｔ　である。
腫瘍に注射する薬剤のｍｌ数は次の表に従って、腫瘍の
大きさにより決定する。
注射蟲たりの最大投与量は、ＲＤＥは約１５００マイク
ログラム、　ＣＷＳは約４５００マイクログラム、そし
てＴＤＭは約１５００マイクログラムである。治療の過
程は、１週間の間隔で５回以下の注射から成る。
油滴乳剤のごとき適当な注射用媒体中のＲＤＥ　−ＣＷ
Ｓ　−ＴＤＭ　ｔ′ｉ、ヒト腫瘍に直接投与することか
できる。１回の注射におけるＲＤＥ及びＣＷＳの１は、
それぞれ約５０〜１０００マイクログラムである。
１回の注射におけるＴＤＭの量は約５０〜３００マイク
ログラムである。ＲＤＥ及びＴＤＭの好ましい１投与レ
ベルは約１２５〜１７５マイクログラムであり、ＣＷＳ
の好ましい１投与レベルは２７５〜３２５マイクログラ
ムである。これらの数値は典型的な７０砺の成人患者に
対するものである。注射は毎週１回行い、合計１５回以
下とする。一般に、注射の場合約５０〜５００マイクロ
グラム／　ｍｔのＲＤＥ。
約５０〜５００マイクログラム／　ｍｌのＣＷＳ　、及
び約５０〜１５０マイクロダラム／　ｍＡのＴＤＭを含
有する組成物が好ましい。
前記のごとく、温孟動物及びヒトの治療に用い　　　　
　　゛する組成物は油滴乳剤の形で使用することができ
る。
油の使用量は組成物の合計容積に対して約０．５〜３．
０容量チとする。約０．７５〜１．５容址チの油を用い
るのが好ましい。このような油の例には、軽鉱油、スク
ワレン、７−ｎ−へキシルオクタデカン。
コノコスーパーオイル（Ｃｏｎｏｃｏ　ｇｕｐｅｒｏｉ
ｌ　）及びドラケオール（Ｄｒａｋｅ’ｏｌ　）　６　
ＵＲ鉱油〔ペンレコ（Ｐｅｎｎｒｅｃｏ　）　ｔＬペン
シルバニア〕が含まれる。
混合物を含有する均質化油を、場合によっては混合に先
立って塩溶液に溶解した洗剤と混合する。
洗剤の墓は、組成物の合計各音に対して約０．０２〜０
．２０谷蓋チ、好ましくは０１１０〜０２０谷蓋チであ
る。トウイーン（Ｔｗｅａｎ　）　−８０、及び　アル
ラセル（Ａｒ１ｏｃｅｌ　）　（アトラス・ケミカル（
Ａｔ１ａａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）社製〕を含む任意の
常用の洗剤を使用することができる。
次に、洗剤の添加によって得られた混合物を均質化し、
顕微鏡観察において高いパーセンテジの油滴がＲＤＥ及
びＣ％ｖＳにより被援キれている懸濁液を形成する。
次に、例によりこの発明をざらに詳細に説明する。但し
これによりこの発明の範囲を限界する本のではない。
（１９７３年）の方法により鉤裂したメタノール−クロ
ロホルム沈澱の試料６５０　ｍｇを、凝稲器が装着され
そして超音波発生機中にＩ！ｌｉ！潰°されたミロ丸底
フラスコ中で、０．Ｉ　ＮＨＣＬ　１５０ｍｌに懸濁し
た。
超音波処理の彼、ｆラス装置を１２０℃に保持された油
浴に入れ、フラスコの内部温度を溶液の沸点に近い温度
又はそれを超える温度とした。「１０１つを通して窒素
ガス源に連結した毛細管をフラスコに装着することによ
シ過熱を最小限にした。
加水分解中窒素を流し続けた。加水分解を３０分間継続
し、この後溶液を水浴中で冷却し、超音波処理すること
により固形物を分散せしめ、そして試料管に分注した。
フラスコを蒸留水で洗浄することにより、フラスコ壁に
＋１６しているすべての固形物を取り出し、洗液を試料
管中の懸濁液に加えた。１２，０００　ｒｐｍにて８０
分間遠心分離を行一つだ。上澄液をデカントし、そして
廃棄した。面体残渣を蒸留水に再懸濁し、懸濁物が十分
に分散するまで超音波処理し、そして再度遠心分離した
。
さらに遠心分離工程を反復した。残渣を蒸留水にとり出
し、凍結し、そして凍結乾燥して３８２　ｍｇの粗脂質
Ａを得た。この１５０　ｍｇを冷アセトン（０℃）で処
理することにより脂肪酸を除去し、超音波処理し、そし
て、５℃において、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　
Ｎｏ　１　　重力濾過器により濾過した。
乾燥後、１００ｍｇの粗無毒化エンドトキシンを得た。
例２　粗無毒化エンドトキンンのｈａ ＭＣＰ（メタノール−クロロホルム沈澱）の試料１２０
ｍｇを１２ｒＪの無水メタノールに懸濁し、超音波処理
により固形物を分散せしめ、そして螺着ビン（ＩＸｌＯ
Ｃｒ／Ｌ）６本に分注した。各ビンに０．２　ＮＨＣｌ
を２ｍｌずつ加え、そしてこうして得た懸濁液を沸騰水
浴中で４５分間インキ−ベートした。加水分解後、ビン
を氷水浴中で冷却し、そして約１０分間２５００ｒｐｍ
Ｔ遠心分離した。上澄液を廃棄し、残渣に２＝１クロロ
ホルム／メタノ一ル混合液５　ｍｌを加え、溶解した。
ビン当たり２ｍ１ｌの水を加え、そして溶液を混合した
。２相溶液を２５００ｒｐｍにて１０分間、再度遠心分
離した。上層の水相を廃棄し、そして各ビンに４：１ク
ロロホルム／メタノ一ル混合液１ｍｄを加え、透明な溶
液を得た。溶液を集め、そしてロータリーエバポレータ
ーによシ溶剤を蒸発せしめた。残渣を高真空下で乾燥し
、そして凍結乾燥して４５ｍｇ　　の粗脂質Ａを得た。
この物の２０　ｍｇを冷却アセトン（０℃）で処理し、
超音波処理し、そして５℃にてワットマンＮｏ１　　重
力濾過器で濾過した。乾燥後、１３ｍｇの粗無毒化エン
ドトキシンを得た。
ＬＨ−２０−１００のファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　）（粒子勺イズ２０〜１００ミクロン）１１０ｇを
クロロホルム／メタノール２　：　１　混合液６００　
ｍｌと混合し、これを３０分分間−た。こうして得たス
ラリーを、加圧装置を装着した２５　Ｘ　１０００　ｍ
ｍ　　　　　　　　’ｉ・のガラス製クロマトグラフィ
ーカラム（ＢＲＬラボラトリーズ製）に入れた。充填し
た後、テフロン製耐圧チー−グにより、このカラムをｌ
５ＣＯモデｋ　ｌ　３２　）ｌｅングに連結した。クロ
ロホルム／メタノール４；１混合紮鵞ｔ３ｍｅ／分の速
度で、ボンダによりカラムを通過せしめた。例１の方法
に従って調製した粗無毒化エンドトキシンｌＱＯｍｇを
クロロホルム／メタノール４　：　１　混合液２．５ｍ
ｌに入れ、これをサンプルル−ゾを通してカラムに適用
した。流速を１ｍ１ｌ１分　に下げ、そして１５０！ｍ
７！の溶離液を集めた後、流出液をフラクションコレク
ターに供給した。４ｍＪずつ分画し、分画全薄層クロマ
トグラフィー分析〔メルク社ｇ０．２５■層厚の薄層板
を使用：溶離液としてクロロホルム／メタノール／Ｈ２
０／ＮＨ４ＯＨ（５０：　２５　：４：２）を使用〕す
ることにより精製無毒化エンドトギシン分画を確認した
。
精製無毒化エンドトキシン分画を一緒にし、溶剤を蒸発
せしめ、３０ｍｇのｙ＃Ｉｍ無毒化エンドトキシンを白
色粉末として得た。
例４　精製無毒化エンドトキシンの調製１）ＥＡＥ−セ
ルロース〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）ＤＥ−３２
）３３ｇを１５０ｒＪの氷酢酸に懸濁し、そして１０分
間ゆっくりと攪拌することによりスラリーを得た。この
混合物を一夜放置した。
スラリーを２５Ｘ４０（Ｈｌｍのカラムに注入し、軽く
たたきながら沈降せしめ、その後過剰の酸を流去せしめ
た。カラムを２０００ｒＪのメタノールで洗浄し、次に
クロロホルム／メタノール４：′１混合液２００　ｍ　
ｌで洗浄した。例１の方法に従って調製した粗無毒化エ
ンドトキシン試料１００ｍｇｋ、クロロホルム／メタノ
ール４：１混合液又はクロロホルム／メタノール／水８
０　：　２０　：　１混合液３ｎＪに入れてカラムに加
えた。カラムを、クロロホルム／メタノール４　：　１
　混合液３５０　ｍｌで溶出し、続いてメタノール／水
９９：１混合液３００ｍｄで溶出した。線形勾配装置を
使用し、１００％メタノールで始、９０．２　Ｍ酢酸を
含有するメタノールで終る２０００ｒＪの溶離液を用い
て線形勾配溶出を行った。溶出速度を６ｍｅ１分とし、
１５　ｍｌずツ分子ｉ　Ｌり。ｉ４　　）　レット（Ｂ
ａｒｔｌｅｔｔ　）（１９５９年）の方法に従って、他
のすべての分画の全燐含１を分析した。分画を集め、ロ
ータＩＪ　−エパホレータ上でほとんど乾燥するまで蒸
発せしめ、そして分液漏斗中のクロロホルム／メタノー
ル２：１混合液１０　ｍｌｌ及び０．００１Ｍ酢酸４０
ｍ１中に溶解した。下層を分離し、ワットマンＮｏ　２
１紙で濾過し、蒸発乾燥し、１９．２ｍｇの精製無毒化
エンドトキシンヲ得り。
例５ 約９朋に増熾した系統−１０腫瘍を有する系統−２モル
モット７匹の腫瘍組織に、ＲＤＥ　、　ＣＷＳ及びＴＤ
Ｍをそれぞれ５０マイクログラム含有する殺菌した注射
用油滴乳剤〔ドラケオール（Ｄｒａｋａｏｌ）６ＵＲｇ
油、ペンシルパニアリフフイニング社、ベンフルバニア
Ｊ　Ｏ，４ｍｌを直接注射した。
３箇月後に動物を検査したところ、すべての礒合におい
て腫場増鵠の完全な退化が認められた。
対照実験として、９〜１２朋の範囲の系統−１０腫瘍を
もする系統−２モルモット６匹ずつからなる２群のそれ
ぞれに、ＲＤＥ’ｉ５０マイクログラム含有する注射液
及びＲＤＥ及びＴＤＭをそれぞれ５０マイクログラム含
有する注射液０．４ｍＪを１回、腫瘍組織に直接注射し
た。
３箇月後に動物を検査した。いずれの対照群においても
、腫瘍組織の退化の徴候を示すモルモットはなかった。
特許出願人 リビ　イミューノチェム　リサーチ。
インコーホレイティド 特許出願代理人 弁理士　官　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　　　積 弁理士　山　口　昭　之

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）　　検出し得る量の２　ケト−３−デオキシ
    オクタノエートを含有せず、３５０〜４７５　ｎ−％４
    の燐及び約１７００〜２００Ｏｎ−＋：）す〜の脂肪酸
    を含有する４＊製無毒化エンドトキシン、 （ｂ）　　細胞壁骨格、 （Ｃ）トレハロースジミコレート、 をそれぞれ医薬として有効な量含有し、そして（ｄ）　
    　医薬として許容される担体、を含んで成る医薬組成物
    。 ２、　　ｎ　ＩＩ　ｍ　Ｉｇ　化エンドトギシン及びト
    レノ・ロースノミコレートの医薬として有効な量が注射
    当たり約１５００マイクロダラム以下であり、そして細
    胞壁骨格の医薬として有効な址が約４５００マイクログ
    ラム以下である特許請求の範囲第１項記載の組成物、っ ３、凍結乾燥の斥又は油滴乳剤の形である特許請求の範
    囲第１項記載の組成物。 ４厖）検出し得る量の２−ヶ）−３−デオキシオクタノ
    エートを含有せず、３５０〜４７５低ル〜の燐及び約１
    ７００〜２００ｏｎ七Ｖ啼の脂肪酸を含有する精製無毒
    化エンドトキシン、 （ｂ）　　細胞壁骨格、 （ｃ）トレハロースジミコレート、 をそれぞれ医薬として有効な量含有し、そして（ｄ）　
    　医薬として許容される担体、を含んで成る医薬組成物
    を温血動物に投与することを特徴とする咳温血動物の癌
    の治療方法。 ５、約６．２５〜２５０マイクログラム／１五ｅの精製
    無毒化エンドトキシン、約１２５手〜７５０−ｒイクロ
    ダラム／ｒＩＬｌの細胞壁骨格、及び約１２５〜２５０
    マ’（クロダラム／ｍｌのトレハロース）　ミコレ−ト
    を含んでなる前記組成物を、少なくとも１週間の間隔で
    の５回以下の注射により、腫瘍組織に直接注射すること
    により前記温血動物に投与することを特徴とする特許請
    求の範囲Ｍ４項記載の方法。 ６、約５０〜１０００マイクログラム、好ましくは１２
    ５〜１７５マイクログラムの精製無毒化エンドトキシン
    、約５０〜１０００マイクログラム、好−ましくけ約２
    ７５〜３２５マイクロダラムの細胞壁骨格、及び約５０
    〜３００マイクログラム、好′ましくは約１２５〜１７
    ５マイクログラムのトレハロースノミコレートを含んで
    成る組成物をヒトに投与することを特徴とするヒトのガ
    ンの治療方法。
JP58090857A 1982-05-26 1983-05-25 精製無毒化エンドトキシンを含有する抗腫瘍組成物 Granted JPS58222025A (ja)

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