JPS6254774B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） この発明は、微生物由来のピリジン可溶性抽出
物に関し、この抽出物はトレハロースジミコレー
ト（TDM）、及びクロロホルム−メタノールで抽
出されたエンドトキシングリコリピドのアセトン
沈澱副生物（ACP）と組合わせた場合に抗腫瘍
性を有する医薬組成物を供する。 コリネバクテリウム・パルブム （Corynebacterium parvum）のごとき細菌
が、腫瘍増殖の阻害に寄与する成分を分離しそし
て特徴を調べるための実験の対象とされてきた
〔例えば、カントレル（Cantrell）等、Cancer
Research39、3554〜3563頁（1979年９月）、Anti
Tumor Activity and Lymphoreticular
Stimulation Properties of Fractions Isolated
from C.parvumを参照のこと〕。抗腫瘍活性とは
別に、C.パルブム（C.parvum）が脾及び肝の重
量の好ましくない増加を結果するリンパ網状系及
び胚子発生の効果的な刺激剤であることが示され
ている。出願人は、微生物のピリジン可溶性抽出
物が、従来技術の生成物が有する不所望の毒性を
伴わないで効果的な抗腫瘍性を有することを見出
した。 トレハロースジミコレート（TDM）は、例え
ばM.アビウム（M.avium）、M.フレイ、M.ツベ
ルクロシスH37RV株及びAyoma Ｂ株、M.ボビ
スBCG、M.スメグマチス、M.カンサシー、ノカ
ルデイア・ルブラ、M.ボビニス（M.bovinis）及
びコリネバクテリウム・ジフテリアのごとき微生
物が得られる。 M.アビウムのごとき細菌を増殖せしめ、集菌
し、そして熱殺菌する。次に細胞を幾種類かの溶
剤で抽出し、そして活性な溶剤可溶性区分を抽出
する。この抽出物を一連の溶剤抽出によりさらに
純化し粗TDMを得る〔アズマ等、Journal of
the National Cancer Institute、第25巻、95〜
101頁（1974年）Bioloyically active components
from mycobacteria cell walls.i.isolation and
composition of cell wall skeleton and
component P3を参照のこと〕。この記載を引用
によりこの明細書に組み入れる。アズマ等の記載
のごとく、粗TDMを、遠心微粒シリカゲルクロ
マトグラフイーによりさらに精製することにより
精製されたTDMを得ることができる。 クロロホルム−メタノールにより抽出されたエ
ンドトキシングリコリピドのアセトン沈澱副生物
（ACP）は、単独で使用する場合又はトレハロー
スジミコレートと組合わせて使用した場合には腫
瘍退化能を有しない。ACP、その性質及び製造
方法をさらに完全に検討するために、リビ
（Ribi）等、Cancer Immunol、Immuother、第
７巻、43〜58頁（1979年）Peptides as
Reqirement for Immunotherapy of the Guinea
−Pig Line−10 Tumor with Endotoxinsを引用
によりこの明細書に組み入れる。ACPは、次の
属すなわち、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ
（Shigella）、エセリヒア（Escherichia）、ブルセ
ラ（Brucella）、ボルデテラ（Bordetella）、シト
ロバクター（Citrobacter）、シユードモナス
（Pseudomonas）、パスツレラ（Pasturella）、ナ
イゼリア（Neisseria）、プロテウス（Proteus）、
クレブシラ（Klebsiella）、及びセラチア
（Serratia）を含むがこれに限定されない任意の
エンテロバクテリアセ（Enterobacteriaciae）か
ら調製することができる。 典型的には次の種すなわち、S.ミネソタ（S.
minesota）、S.テイピムリウム（S.
typhimurium）、B.パーツシス（B.pertussis）、
B.アボルツス（B.abortus）、S.エンテリチデイス
（S.enteritidis）、E.コリ（E.coli）、S.テイピ（S.
typhi）、S.マルセツセンス（S.marcescens）、S.
テイポサ（S.typhosa）、シゲラ・フレクスニ
（Shigella flexni）及びS.アボルツス・エクイ
（S.abortus equi）を使用する。 従つてこの発明は、微生物由来のピリジン可溶
性抽出物を、トレハロースジミコレート及びクロ
ロホルム−メタノールにより抽出されたエンドト
キシングリコリピドのアセトン沈澱副生物
（ACP）と共に含んでなる医薬組成物を提供する
ことを目的とする。 この発明の他の目的は、微生物のピリジン可溶
性抽出物、TDM及びACPを含んで成る組成物を
使用する温血動物及びヒトの腫瘍の治療方法を提
供することである。 （発明の概要） この発明は、約７〜約20重量％の蛋白質、約10
〜約16重量％の糖及び約35〜約55重量％の脂肪酸
を含んで成る微生物由来のピリジン可溶性抽出物
を、TDM及びACPと共に含んで成る医薬組成物
に関する。この抽出物は、約12重量％ずつの蛋白
質及び糖、並びに約45重量％の脂肪酸を含有する
ことが好ましい。 例えばM.ボビス（M.bovis）BCG、M.フレイ
（M.phlei）、M.スメグマチス（M.smegmatis）、
M.カンサシー（M.kansasii）、ノカルデイア・ル
ブラ（Nocardia rubra）、コリネバクテリウム・
ジフテリア（Corynebacterium diphtheriae）及
びコリネバクテリウム・パルブム
（Corymebacterium Parvum）を含む任意の微生
物を使用してピリジン可溶性抽出物を製造するこ
とができる。コリネバクテリウム・パルブムが特
に好ましい。 微生物の全細胞、好ましくはペースト状のもの
をピリジンと混合する。こうして得た混合物を分
離することによりピリジン可溶性抽出物を含有す
る上澄区分、及びピリジン抽出残渣を得る。場合
によつては、ピリジン残渣を再度上記のようにピ
リジンを使用する分離操作にかけ、追加量の目的
抽出物を分離する。 次に、抽出物からピリジンを除去し、そして乾
燥抽出物を、蒸留水のごとき適当な液に対して透
析する。全細胞又は細胞断片汚染物が存在しない
ことを電子顕微鏡で確認する。こうして得た精製
された抽出物は、次に公知の方法により凍結乾燥
して安定な生成物を得ることができる。 この発明の方法に従つて製造したピリジン可溶
性抽出物をTDM及びACPと組合わせて、脾及び
肝の肥大の誘導を刺激することなく有効な抗腫瘍
活性を有する組成物を製造する。この組成物によ
り治療することができる癌には、動物の腫瘍、例
えばウシ扁平細胞癌、ウシ線維肉腫、ウマ類肉
腫、ウマ黒色腫、ウマ扁平細胞癌、イヌ乳房癌、
イヌ線腫、及びイヌ黒色腫、並びにヒトの腫瘍、
例えば乳癌、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、扁平細
胞癌及び卵巣腫瘍が含まれる。 この組成物は、油滴乳剤のごとき医薬として許
容される媒体中、注射により、後に詳述する条件
下で、腫瘍に直接投与するのが好ましい。 前記の組成物は、例えば凍結乾燥により安定化
せしめ、そして効力を喪失することなく再調製す
ることができる。 動物の治療の場合、１回の注射におけるピリジ
ン可溶性抽出物の量は約375〜約2500マイクログ
ラム／mlである。TDM及びACPの量は375〜1250
マイクログラム／mlである。 腫瘍に注射する生物製剤のミリリツトル数は次
の表に従つて、腫瘍の大きさにより決定する。 【表】 注射当たりの最大投与量は、ピリジン可溶性抽
出物は約40mgであり、TDMは約６mgであり、そ
してACPは約20mgである。治療の過程は約２週
間の間隔における６回以下の注射から成る。 油滴乳剤のごとき適当な注射媒体中のこの発明
の組成物はヒトの腫瘍に直接投与する。１回の注
射におけるピリジン可溶性抽出物の量は約200〜
5000マイクログラム、好ましくは約800〜1200マ
イクログラムであり、TDMの量は約50〜1000マ
イクログラムであり、ACPの量は約150〜1000マ
イクログラムである。TDM及びACPの好ましい
単位投与量はいずれも約475〜525マイクログラム
である。上記の投与レベルはいずれも典型的な70
Kgの成人患者を基礎にしたものである。注射はお
よそ１週間に１回、合計15回以下で行う。 上記のごとく、温血動物及びヒトの治療のため
の組成物は油滴乳剤の形で使用することができ
る。使用する油の量は、組成物の合計容量に対し
て約0.5〜約3.0容量％の範囲である。約0.75〜約
1.5容量％の油を使用するのが好ましい。このよ
うな油の例には、軽鉱油、スクアレン、スクアラ
ン、７−ｎ−ヘキシルオクタデカン、コノコ・ス
ーパーオイル（Conoco superoil）及びドラケオ
ール（Drakeol）6VR鉱油〔ペンレコ
（Penreco）社、バトラー（Butler）、ペンシルバ
ニア製〕が含まれる。 次に、ホモジナイズした油含有混合物を、場合
によつては混合に先立つて塩溶液中に溶解した洗
剤と混合する。洗剤の量は、組成物の合計容量に
対して約0.02〜0.25容量％、好ましくは約0.10〜
0.20容量％とする。トウイーン（Tween）−80、
アルラセル（Arlacel）（アトラス・ケミカル社
製）等の任意の一般の洗剤を使用することができ
る。 次に洗剤の添加によつて得られた混合物をホモ
ジナイズして、顕微鏡観察した場合に活性成分に
より被覆された油滴を高い比率で含む懸濁液を生
成せしめる。 次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明す
る。但しこれによりこの発明の範囲が限定される
ものではない。 例 １ コリネバクテリウム・パルブムからのピリジン
可溶性抽出物の調製 コリネバクテリウム・パルブム〔P.アクネス
（P.acnes）、4182株〕を、NIHチオグリコレート
培地中で48〜72時間、37℃にて増殖せしめ、そし
て集菌して全細胞ペーストを得た。次にこのペー
ストを500mlの蒸留水で洗浄した。90ｇ（湿重
量）の洗浄ペーストを200mlの純ピリジンと混合
し、そして４℃にて１時間1700×ｇにおいて遠心
分離した。ピリジン可溶性抽出物を上澄区分とし
て取り出した。残つた残渣を、前記と同じ条件で
追加のピリジンを用いて抽出した。ワツトマン
（Whatman）No.１紙を用いて過した後のピリ
ジン抽出物を集め、そしてブツチ・ローターベー
パー（Buchi Rotavapor）〔ブリンクマン・イン
ストルメンツ（Brinkman Instrument）ウエス
トバリー、ニユーヨーク製〕中、50℃にて溶剤を
蒸発除去した。乾燥ピリジン抽出物を、蒸留水に
対して十分に透析し、そして凍結乾燥した。得ら
れた、精製されたピリジン抽出物は約12重量％の
蛋白質、約12重量％の糖及び約45重量％の脂肪酸
を含有していた。抽出物を電子顕微鏡で観察し、
全細胞及び細胞壁断片による汚染が存在しないこ
とが見出された。ピリジン可溶性抽出物の収量は
９％（8.1ｇ）であつた。 例 ２ M.ボビスBCG株からのピリジン可溶性抽出物
の調製 M.ボビスBCG株を、サウトンス（Sautons）培
地中、37℃にて３〜４週間増殖せしめ、そして集
菌し、洗浄全細胞ペーストを得た。50ｇ（湿重
量）の洗浄ペーストを、次に例１と同様にして処
理し、７％（3.5ｇ）のピリジン可溶性抽出物を
得た。この抽出物は、15重量％の蛋白質、10重量
％の糖及び約52重量％の脂肪酸を含有していた。 医薬として許容される媒体中でTDM及びACP
と組合わせたピリジン可溶性抽出物は、腫瘍の治
療に有意に効果的であり、ほとんどの場合に腫瘍
を完全に退化せしめた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 約７〜約20重量％の蛋白質、約10〜約16重量
   ％の糖、及び約35〜約55重量％の脂肪酸を含んで
   成る微生物由来のピリジン可溶性抽出物、トレハ
   ロースジミコレート、クロロホルム−メタノール
   により抽出されたエンドトキシングリコリピドの
   アセトン沈澱副生物のそれぞれの医薬として有効
   な量を、医薬として許容される担体と共に含んで
   成る医薬組成物。 ２ 微生物が、M.ボビス（M.bovis）BCG、M.
   フレイ（M.phlei）、M.スメグマチス（M.
   smegmatis）、M.カンサシー（M.kansasii）、ノ
   カルデイア・ルブラ（Nocardia rubra）、コリネ
   バクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium
   diphtheriae）、又はコリネバクテリウム・パルブ
   ム（Corynebacterium parvum）である特許請求
   の範囲第１項記載の組成物。 ３ 抽出物がそれぞれ約12重量％の蛋白質及び
   糖、並びに約45重量％の脂肪酸を含有し、そして
   ピリジン可溶性抽出物の量が約40mg以下であり、
   トレハロースジミコレートの量が約６mg以下であ
   り、アセトン沈澱副生物の量が約20mg以下であ
   り、そして組成物が凍結乾燥の形又は油滴乳剤の
   形である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   組成物。 ４ 油がスクアレン、軽鉱油、スクアラン、７−
   ｎ−ヘキシルオクタデカン、コノコ・スーパーオ
   イル（Conoco superoil）又はドラケオール
   （Drakeol）6VR鉱油であり、そして組成物中に、
   組成物の合計容量に対して約0.5〜3.0容量％存在
   し、そして組成物の合計容量に対して約0.02〜
   0.25容量％の洗剤が存在する特許請求の範囲第３
   項記載の組成物。 ５ 抽出物の量が約200〜5000マイクログラムで
   あり、トレハロースジミコレートの量が約50〜
   1000マイクログラムであり、そしてアセトン沈澱
   副生物の量が約150〜1000マイクログラムである
   特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に
   記載の組成物。 ６ 約７〜約20重量％の蛋白質、約10〜約16重量
   ％の糖及び約35〜約55重量％の脂肪酸を含んで成
   る微生物由来のピリジン可溶性抽出物、トレハロ
   ースジミコレート及びクロロホルム−メタノール
   により抽出されたエンドトキシングリコリピドの
   アセトン沈澱副生物のそれぞれの医薬として有効
   な量を、医薬として許容される担体と共に含んで
   なり、温血動物の腫瘍の直接注射することにより
   温血動物の腫瘍の治療方法に使用するための特許
   請求の範囲第１項に記載の組成物。 ７ 約375〜2500マイクログラム／mlのピリジン
   可溶性抽出物、それぞれ約375〜1250マイクログ
   ラム／mlのトレハロースジミコレート及びアセト
   ン沈澱副生物を含有する特許請求の範囲第６項記
   載の組成物。