JPS5823785A - ヒトｔ細胞ライン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なしトＴ細胞ライン、更に詳しくはしトＴ
細胞交雑（融合）細胞ライン殊にＴ細胞増殖因子を分泌
するしトＴ細胞交雑細胞ライブ、該交雑細胞を得るため
のじトＴ細胞融合特性を有する親細胞ライン、２等細胞
うイシの確立方法並びに上記細胞ラインよりＴ細胞増殖
因子を得る方法に関する。

しトの免疫系に含まれるリンパ球は、Ｔ細胞即ち胸腺由
来細胞と、Ｂ細胞即ち骨髄由来細胞とに大別される。上
記Ｂ細胞は、抗体を分泌することが知られており、従来
細胞融合技術を利用して上記Ｂ細胞の交雑細胞即ち抗体
産生Ｂ細胞と親細胞としての骨髄腫瘍細胞（ミニ０−マ
）との交雑細胞（ハイプリドーマ）を作製し、該ハイプ
リドーマより単一クローシ由来の抗体（′ｆニック０ナ
ル抗体）を生産する技術が確立されている〔「臨床科学
」第１６巻第９号第１１０８−１１１４（１９８０年）
参照〕。

一方Ｔ細胞は免疫応答の調節における中心的役割を果す
ものであり、その特性については尚不明な点が多いが、
抗体産性を抑制する因子、異種細胞の分裂を引起す因子
（イルター０イ＋ンス）等の数多くの液性免疫因子（リ
ンホカイン類）を分泌するものである。しかしながら２
等Ｔ細胞の細胞融合技術の応用による交雑細胞の作成は
、現在わずかマウスＴ細胞につき報告されているにすぎ
ず、しトＴ細胞融合技術は非常に遅れており、未だ成功
した例がない。

本発明者らはかかるしトＴ細胞融合技術を確立すること
を目的として種々研究を重ねた結果、まずしトＴ細胞と
の融合特性を有し且つ融合細胞を選択するための培地に
感受性を有し、しかも永代培養可能な親細胞株を確立し
、該親細胞株を利用してしトＴ細胞交雑細胞の作成に成
功し、ここＧこ本発明を完成するに至った。

即ち本発明はしボ＋サンチンークアニンーホスホリポシ
ル　トランスフエラー１！（ＨＧＰＲＴ）欠損しト白血
病性Ｔ細胞ラインおよびそれから誘導される細胞ライク
並びに２等細胞ラインを確立する方法に係るものである
。

本発明は従来全く知られていない新規な、シトＴ細胞融
合を可能とする親細胞株、該親細胞株とじトＴ細胞との
新規な交雑細胞株および之等の生産方法を提供するもの
である。本発明の親細胞株および交雑細胞株は、いずれ
も継代培養できるものであり、２等細胞株の確立殊に交
雑細胞株の確立によれば、しトＴ細胞が放出する数多く
の液性免疫因子即ち細胞間相互作用をメヂイエートする
可溶性因子の生体外での大量生産が可能となり、従来尚
充分には解明されていない２等可溶性因子の化学的及び
生物学的特性の解析が可能となり、之等の臨床面べの応
用、該臨床面での効果の究明進歩に大きく寄与する。ま
た上記しトＴ細胞交雑細胞ラインの確立は、しトＴ細胞
における細胞膜表面抗原やＴ細胞抗原しセプターの解析
、Ｔ細胞サブセットの検索、Ｔ細胞自体の分化、増殖−
１活性化等の細胞学的及び免疫学的研究にも極めて有力
な手段を提供するものである。

本発明に係る親規な親細胞株は、シト白血病性Ｔ細胞株
より誘導されるものであり、ＨＧＰＲＴを欠損している
点において特徴付けられる。その細胞学的及びその他の
諸性質を示せば次の通りである。

（１）形態学的特徴： 径は正常しト末梢血Ｔ細胞の約２〜３倍であり、はぼ球
形をなす。細胞内における核の占める割合は大で、原形
質が僅かに認められる。原形質内には僅かの顆粒が認め
られる。時として偽足様の突起を出す場合がある。

（２）染色体数： ０゜ｌμｆ／ｍｌ　　濃度のコルしチシ存在下に細胞を
３７°ｄ下３時間培養し、遠沈後０．０７５Ｍ−ＫＣ７
＋で処理し亀メタノール：エタノール＝３＝１の固定液
を用いスライドガラス上に固定後の核染色体数を、１０
００倍の油浸レンズを用いた顕微鏡観察により計数した
結果、１００個の細胞の分裂中期において各細胞の核染
色体数は１下記第１表の通り６９〜８７の間にあり、平
均７８である。

第　　１　　表 （３）Ｔ細胞特異抗原発現性： 各細胞を５ＸＩＯ個濃度に調整し、１００μｌの適当な
濃度のｔツク０ナル抗体（０，１Ｗ１０゜５ｍｌの抗−
Ｌｔｕ７．抗−Ｌｔｕ　２　Ａ及び抗−Ｌｔｕ　３　Ａ
抗体の原液を、夫々１００倍、１０倍及び１０倍に希釈
して１００μｌとして用いた）と、４°Ｃ下３０分間イ
ン士ユベート後、細胞を５％胎児牛血清（ｐｃｓ＞を含
むＭＥＮ培地〔財団法大阪大微宝研〕で洗浄し、Ｆ　Ｉ
　Ｔ　Ｃ（ｆｌｕａｒｔｓｃｔｉｎｉｓ６ｔｈｉａｃｙ
ａｎａｔｔ　）　　−結合−ウサ手抗マウス免疫り０プ
リン〔Ｍｉｌｅｓ　−Ｙｚｄａ　　ＬＴＤ＋、　　ｌ５
ｒａｅｌ　）と反応させ、Ｔ細胞特異抗原発現性を間接
免疫螢光抗体法により測定した。尚各七ノクロナル抗体
はベクトンヂイ士ンソン社（Ｂｔｃｌｏｎ　Ｄ’１ｔｋ
ｉｎｓｏｎＣｏ、、　５ｕｎｎｙｔｐａｌｔ、　Ｃａ　
）　　より得た（　／、　Ｅｘｐ。

Ｍｌｄ、、　１５３．３１０−３２３（１９８＋））。

２００個の細胞について調べた結果抗−Ｌｔｕ　ｌ及び
抗−Ｌｔｕ　３　Ａ抗体に対し９５％以上が陽性であり
、抗−Ｌｚｕ　２　Ａ抗体に対し１％以下が陽性であっ
た。

（４）Ｏｔ！ット形成： 抗体補体感作ヒツジ赤血球（ＥＡＣ）におけるＯｔ！ッ
ト形成を、２００個の細胞につき、４００倍の顕微鏡下
で測定した結果１−以下が陽性である。

（５）Ｂ細胞マーカー発現性： ＦＩＴＣ−結合マウス抗しトー免疫り０プリン（Ｂｔｈ
ｒｉｎｙ　ｗｚｒＡｔ　ＡＧ、　Ｍａｒｂｕｒｇ　）を
用いた直接免疫螢光抗体法により解析した表面′免疫り
０ブリシＣ１ｙ）は、１％以下陽性である。

セック０ナルー抗−ＤＲ抗体（Ｂｚｔｔｏｎ　−Ｄｉｔ
ｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏ、　）を用いた間接免疫螢光抗体法
により解析したしトＨＬＡ、−ＤＲ抗原（ＤＲ）は、１
％以下陽性である。

またじ−Ｂ、　ス（Ｅｐｓｔｔｉｎ　−Ｂａｒｒ　ｖｉ
ｒｕｓ　）　　でトラシスフオームしたしトＢ細胞株（
ＣＥＳＳ、ス０−ン・ケタリング晴研究所のじ〒ターラ
ルフ博士より入手）により免疫されたマウス牌細胞とミ
ニ０　＝　マＰ　３　Ｕ□、　　（Ｅｌｂｔｒｔ　Ｅｉ
ｎｓｔｅｉｎ　ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｔＣｏｌｌｅ　　
より人手）との細胞融合株がら得た（　Ｇ、Ｋｏｈｌｚ
ｒ　ａｎｄ　Ｃ０Ｍ１ｌｓｔｔｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、
　２５６゜４９５．１９７５参照〕ｔツク０ナル抗しト
Ｂ細胞抗体を用い、間接免疫螢光抗体法により解析した
、しトＢ細胞特異抗原（Ｂ抗原）の表現性は、１％以下
が陽性である。尚上記抗体はＢ細胞乃至そのラインとは
反応するが、Ｔ細胞乃至そのラインとは反応しない。

（６）　ＨＬＡ表現型 細胞を抗ＨＬＡ血清（東京医科大学、笹月教授より入手
）と３０分間３７°Ｃで培養後、本発明の親細胞で吸収
した家兎補体（ベリタス）と、６０分間イシ士ユベート
して細胞の生存率を調べた結果、ＨＬＡ表現型はＡ２．
ＡＩ　Ｉ、Ｂ８．Ｂ３７゜Ｂｗ　２’ｌを示す。

（７）増殖性： ８−アザグアニジ（８，ＡＧ％１００μＭ）、１０％胎
児牛血清（ｐｃｓ）、５ＸＩＯＭ２−メルカプトエタノ
ール及び７ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ　１６４０培
地（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）において
良好に増殖する。

（８）増殖条件ニ 一般に３６〜３８°Ｃの温度条件下及び／’Ｈ７，２〜
７．３の条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス及
び９５％空気のイン士ユベーター内での培養が好適であ
る。

（９）　　継代培養： 限界なく継代培養が可能である。

ａｌ　　凍結保存： 液体窒素中で容易に長期間保存できる。

０υ　８−アザグアニン耐性： ８−アザグアニジ（！ｏＯμＭ）に耐性があり、しポ＋
サンチン１アミノプテリン及びチ三ジンを含む培地（Ｈ
ＡＴ培地）で死滅する。このことから本細胞はＨＧＰＲ
Ｔ欠損株であることが判る。

α埠　マイトジェン反応性： ］ンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）１０〜１００／’ｆ／　
ｍｌの添加及び植物性赤血球凝集素、フィトへｔアクル
ケニン（ＰＨＡ　）の１−１０％添加により、分裂増殖
は部分的に抑制される。ポラクライードマイトジェン（
ＰＷＭ）及びづ０テイシＡ　（ＰｒｔｙＡ）は、いかな
る濃度においても本細胞株の分裂増殖に影響を与えない
。

之等のことを添付の第１図乃至第４図に示す。

各図は夫々２×ｌＯ個の本細胞株を、種々の濃度のマイ
トジェン（第１図はＣｏｎＡ、第２図はＰＨＡ、第３図
はＰＷＭ及び第４図はＰｒｏＡを夫々用いたものである
）と共にＲＰＭＩ　１６４０＋ｌＯ％ｐｃｓ内で６０時
間培養し、培養の最後の１２時間に０．２μＣｉの３Ｈ
−チミジン（３Ｈ−ＴｔｉＲ）を加え、培養細胞をクラ
スファイバーストリッ″ｊ（ラボ　サイエンス社）に集
め、３Ｈ−ＴｄＲのデオ＋シリボ核酸分画への取り込み
を液体シンチレーションカウンターでカウントした結果
を、各３度繰返した平均値（Ｓ、Ｄ。は１０％以下）で
づＩ］’Ｊトしたものであり、図中横軸は各マイトジエ
シの濃度及び縦軸は取り込まれた３　Ｈｍ　ＴｄＲのカ
ウント数（Ｃ，２６Ｍ。×ｌＯ）を示す。また各図にお
ける（ト→）は本細胞株を、また（トー）は、後述する
クローン２４Ａ（本発明しトＴ＃ＩＦＩ融合細胞株のひ
とつのり０−ン）における結果を示す。

上記諸性質を有する本発明のＨＧＰＲＴ欠損しト白血病
性Ｔ細胞株は、例えばしト白血病性Ｔ細胞（ＣＣＲＦ、
、ＣＥＭ）　（Ｊ、　ＫＡＰＬＡＮ、　Ｔ、Ｃ０５ＨＯ
ＰＥ　　ａｎｄ　ｒＩ／、Ｄ、　ＰＥＴＥＲ５ＯＮ、　
　Ｊｒ、、　　　／、　Ｅｘｐ。

Ｍｔｄ、１３９．１０７０−１０７６．１９７４参照〕
を起源とし、これを１０％ｐｃｓ含有ＲＰＭＩ３１６今
０培地に８−アザタアニン（８−ＡＧ　）を添加した培
地で培養し、８−ＡＧ添加量を順次増加させていくこと
により収得できる。より具体的には例えばまず２μＭの
８．−、ＡＧを添加した培地で１週間培養し、生存細胞
を次に１６ＭＭの８．−ＡＧを含む培地で１週間培養し
、その後同様に８．ＡＧ濃度を２倍づつ増加させた培地
で順次培養し、最終的に８−．４Ｇ濃度を１００μＭと
した培地に生存する８−ＡＧ耐性細胞株を得る。かくし
て得られる細胞株は、その後１００μＭの８．−ＡＧ含
有培地で強い増殖性を示し、この培地で継代培養できる
。

また本発明のＨＧＰＲＴ欠損ヒト白血病性Ｔ細胞株は、
上記に代え６−チオタアニン（最終濃度６７μＭ）又は
６−メルカづトづリンリボジッド礪終濃度１μＭ）を用
い、上記と同様に培養することによっても収得できる。

かくして本発明のＨＧＰＲＴ欠損細胞ラインを得る。こ
れは上記した諸性質を有し、文献未載の新しいＴ細胞ラ
インであり、永代培養でき、またほぼ永久的に凍結保存
できる。

上記本発明ＨにＰＲＴ欠損細胞ライシう培養は、各種の
栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培地は、゛本質
的には合成培地であるが、血清のような天然から得られ
る成分を含んでいてもよく、該培地としては例えばＲＰ
Ｍ１１６４０培地（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ社）を、ＦＣ５，ウマ血清等の血清補液を用いて改質
した培地、又は血清を含まないイスコづ（ｌ５ｅｏｖｚ
　　）　　改質培地を用いて改質したドルベツコ（Ｄｕ
ｌｂｔｃｃσ）改質培地等が有利に用い得る。上記培地
で増殖される本発明細胞はまた例えばＦＣ５含有イーグ
ル最低必須培地（ＭＥｈｆ）培地等の当該分野で細胞培
養に一般に用いられている各種の培地で短期間の適応で
容易に増殖する。上記各種培地には、特にＦ３．−、Ａ
Ｇの添加を必要としないが、通常好ましくは８−ＡＧを
添加しておくのがよい。また上記各種培地での培養条件
は、通常の細胞培養に利用される条件でよい。一般には
約３６〜３８℃下に３〜５日毎に液交換を行なうことに
より細胞を良好に増殖させることができる。

上記細胞株は、工業技術院微生物工業技術研究所への寄
託が受付けられなかったが、本発明者らにより、常に分
譲可能な状態にて保存されており、また上記細胞株は、
１９８１年７月３０日にアメリカン・タイプ中カルテＰ
′−・コレクション（ＡＴＣＣ）に「ＣＲＬ−８０８１
」として受託されている。

本発明の上記ＨＧ　Ｐ　ＲＴ欠損Ｔ細胞株は、しトＴ細
胞の細胞融合用親細胞株として利用できる。

本発明は上記親細胞株を用いたＴ細胞融合反応及−、び
これにより得られる交雑Ｔ細胞株をも提供するものであ
る。

上記Ｔ細胞融合において利用できるしトＴ細胞は特に制
限はなく、例えば未稍血、骨髄、リンパ節、胛臓、扁桃
腺、胸腺等に由来する各種Ｔ細胞をいずれも例示できる
。２等Ｔ細胞は、通常知られている各種の分離手段例え
ば物理的方法、化学的方法及び表面膜法により単離精製
され、本発明の細胞融合に供し得る。また２等Ｔ細胞は
、細胞融合に先立ち融合効率を高めるために、公知の種
々のマイトジェンで刺激することができる。マイトジェ
ンとしては、Ｔ細胞に感受性を持つ各種のものが利用で
き、この例としては、例えばコシカナバリンＡ（Ｃθｎ
　Ａ　ｚシクマ社）、精製ツベルクリン（ＰＰＤ、阪大
癌研究所、高滓博士）、づ０テインＡ　（Ｐｒｔｒ　Ａ
％ファルマシア社）、フィトへしアタルチニン（ＰＨＡ
％ディフコ社）、ポ′υクウイード　マイト、；１ン（
ＰＷＭ、４づコ社）等挙げることができる。更に之等ｒ
ｍ胞は、リンパ球混合培養法（Ｍｉｘｅｄ　Ｌｙｍ戸ｈ
ｏｔｙｔｔ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）　　を用いて活性化す
ることもできる。上記しトＴ細胞及びマイトジェン刺激
Ｔ細胞の製造の詳細は後述する実施例に示す通りである
。

本発明のＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞と上記しト
Ｔ細胞との融合反応は、基本的には公知の細胞融合方法
と同様であり、融合促進剤の存在下に適当な培地内で行
なわれる。融合促進剤としては例えばｔ：／Ｊイウィル
ス（ＨＶＪ）等のウィルスを用いてもよいが、近年開発
されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるのが
好ましい。

該ＰＥＧとしては平均分子量１０００〜６０００程度の
ものが好ましくｔこれは培地に約３０〜（５Ｑ　Ｗ／Ｖ
％の濃度で存在させるのが適当である。

また培地としては、上記した親細胞株の増殖に用いられ
るよりなＭＥＮ培地、そのドルベツコ改質培地、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地、その他のこの種の細胞培養に利用され
る通常の各種培地を利用できる。また上記細胞融合用培
地には所望により融合効率を高めるための補助剤として
例えばジメチルスルホ＋シト等を添加してもよい。

上記細胞融合に当り用いる本発明親細胞と、しトＴ細胞
との使用量比は、特に制限はないが一般には親細胞数に
対ししトＴ細胞数を約１〜１０倍用いることができる。

好ましい細胞融合は例えば次の如くして行なわれる。即
ち親細胞株とじトＴ細胞との所定量を適当な培地内でよ
く混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７°Ｃに加温した
ＰＥＧ溶液の適当量を加えてまぜ合せる。これにより細
胞融合反応が開始される。以後適当な培地を逐次添加し
、遠沈させ、上清をすてる操作を繰返すことにより所望
の融合細胞の出現が認められる。

所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞を〜通常
の雑種選別用培地で培養することにより行なわれる。こ
の選別用培地は、親細胞は増殖し得す、目的とする交雑
細胞のみが増殖し得る培地（しトＴ細胞は本来増殖し得
ない）であり、その代表例としては例えばしボ＋サンチ
ン、アミノづゾリン及びチミジンを含む培地（ＨＡＴ培
地）を例示できる。該ＨＡＴ培地としては、例えば１０
％ＦＣ５含有ＭＥＮ培地に１ア三ノづゾリン４×拳７ １０　　Ｍ％しポ＋サンチンｌＸｌ０　　＃％チ三リジ
ン１．６ＸＩＯＭ及びクリシン３ＸＩＯＭを添加した培
地が例示できる。該ＨＡＴ培地での細胞の培養は、通常
の限界希釈法に従い目的とする交雑細胞以外の細胞（未
融合細胞等）が死滅するに充分な時間通常約数日〜数週
間程行なわれる。これにより目的とするしトＴ細胞融合
細胞のみが選択的に増殖する。

かくして得られる融合細胞は、核形（核染色体数）細胞
表面の表現型、マイトジェン反応性、リンホカイン産生
能等において、親細胞株、しトＴ細胞とは明らかに異な
る新しい特性を具備している。この融合細胞は、前記と
同様の適当な培地中で増殖推持することができるがＨＡ
Ｔ培地による選別後、しポ士サンチン及びチミジンを含
むＨＴ培地で１〜２週間培養した後、通常の培地に移す
方が好ましい。その特性を後述する実施例により得られ
た融合細胞を例にとり、親細胞株（πＧＰＲ１欠損ヒト
白血病性Ｔ細胞、以下ＣＥＭ−ＡＧＲとする）との対比
において示せば、下記第２表の通りである。

第　　２　　表 尚第２表中鎖度は次式により示されるものである。

細胞融合直後の細胞２×ｌＯ個を接種したウェル敵情た
、染色体数、Ｔ細胞特異抗原発現性、ｏｆワット成及び
Ｂ細胞マーカー発現性は、夫々親細胞につき前述した方
法により測定されたものであり、各項における記号は夫
々次のことを示す。

十十・・・・　９５％以上の細胞が陽性を示す。

−・・・・　１％以下の細胞が陽性を示す。

ＮＤ・・・・　未測定 上記第２表を参考として、本発明のしトＴ細胞交雑細胞
うイシの各種特性を、親細胞株につき上記した各項目（
１）〜（２）と共にその他の特性をまとめれば次の通＃
）ズある。

（１）形態学的特徴； 各融合細胞のり０−シ毎に若干相違するが、本質的には
親細胞株を類似しており、その大きさは親細胞株よシや
、や大きく　（１，２〜１．５倍）、細胞表面上にじゲ
様の突起を多数出しているものが多い。

（２）積形（核染色体数）； 各りＯ−シ毎に異なるが平均染色体数は、８６〜９４の
範囲にある。これは親細胞のそれが７８であるのに対し
明らかに多い。

（３）〜（５）； 大部分のり０−シにおいて親細胞と同一である。

（６）ＨＬＡ表現型； すべてのり０−シにおいて親細胞のそれは発現されてお
シ、各り０−ンは他に該親細胞以外のしトＴ細胞のＨＬ
Ａ表現型の１以上を発現している。

（７）〜ａＯ； すべてのり０−ンにおいて親細胞のそれと略々同一であ
る。

０υ　８−アザタアニン耐性； すべてのり０−シは８−ＡＧ耐性を示さない。

αり　マイトジエシ反応性； ＣｏｎＡとＰＨＡに関しては、親細胞株と同様の又はそ
れ以上の反応性を示す。親細胞株はＰＷＨに全く反応し
ないがＰＷＨに反応するり□−：Ｊがかな９見い出され
る。

α３　Ｔ細胞増殖因子活性； り０−シＡ　２４−　Ａは、後述する実施例に示す方法
において、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）活性を示す。

上記した緒特性より、本発明によれば新規なしトＴ細胞
交雑細胞うイシが確立されることが明らかである。殊に
この交雑細胞ライクの確立は、得られる各り０−ンが親
細胞株と対比して、いずれも８−ＡＧ耐性を示さないこ
と、核染色体数が増加していること、ＨＬＡ表現型にお
いて親細胞株以外の表現型が発現されること等において
確証される。

また上記した如き本発明のしトＴ細胞交雑細胞株は、こ
れを常法に従い通常の培地で増殖させることによシ、り
０−シ化することができ、これにより夫々単一の融合細
胞株に分離することができる。かくして得られる各融合
細胞株は、いずれもしトＴ細胞の少なくとも１つの核染
色体を保有するものであり、また継代培養による増殖が
可能でしかも凍結保存できる所から、これを増殖させる
ことによりしトＴ細胞のより詳細な研究解明が行ない得
る。また之等り０−シには、従来しトＴ細胞より分泌さ
れ免疫応答の調節における重要な役割を演じることの知
られている数多くのリシホカイシ類の産生能を有するも
のが存在しており、従って該クローンの確立により生体
外で容易迅速にしかも多量のりンホカイシ類を収得する
ことが可能である。これは各種の免疫系疾患の診断や治
療に新しい方法を提供し得るものである。

本発明に従い確立単離されたひとつのしトＴ細胞融合細
胞株（り０−シ＆　２４−　’　）につき更に詳述すれ
ば次の通りである。即ちこの細胞融合株り０−シは、後
述する実施例に示す通シ親細胞株と、ヒト末梢血リシパ
球のＴ細胞との細胞融合により得られたひとつの交雑細
胞株であり、これは上記した交雑細胞株に共通する各種
性質を有する。

殊にその核染色体数は７９−９７（平均８９）である。

ＨＬＡ表現型は、Ａ２、ＡＷ２４、ＡＩ　Ｉ、　Ｂ５、
Ｂ８、Ｂ３７及びＢＦ２２　　であり、親細胞株のそれ
ＣＡ２、Ａｌ　ｌ、Ｂ８、Ｂ３７、ＢＦ２２　　＞の他
にしトＴ細胞のそれＣＡ２、ＡＷ２今、Ｂ５、Ｂ４０　
）のうちの８４０　　を除（すべてを発現している。ま
たこのり０−シ細胞株は、第１図乃至第４図に示す各マ
イトジェンに対する反応性を示し、即ち１％のＰＨＡ濃
度で分裂増殖をほぼ完全に抑制され、０．５〜１％のＰ
ＩＮ濃度で分裂増殖が抑制される。

更にとのり０−シ細胞株は、強力なＴＣＧＦ活性を示す
点において特徴付けられる。之等の特性は実施例及び添
付の第５図及び第６図に示す通りである。

このように上記本発明のひとつのり０−シ細胞株は、こ
れを前記した適当な培地中で培養させることによシ、そ
の培養上澄からＴ細胞増殖因子（ｒＣＧＦ　）を回収す
ることができる。従って本発明はこのＴＣＧＦを製造す
る新しい方法をも提供するものである。この方法の詳細
は後記実施例に示す。

本発明者らは、この新しいＴＣＧＦ産生能を有する融合
細胞株についても、前記親細胞株と同様微工研への寄託
が受付けられなかったため、自ら分譲可能な状態に保持
すると共に、ＡＴＣＣｊｆＣ寄託し　「ＨＥＬ　８０８
−２Ｊとして受託されている。

以下本発明を更に詳しく説明するため、親細胞株の製造
例、ｔトｒｉａ胞の単離調製例、之等の各細胞の融合例
及び得られた融合株についての試験例を実施例として詳
述する。

実施例１　ＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞の製造 しト白血病Ｔ細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭは、ＤｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　　社）に培養維持した。

上記ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　　細胞を、まず２μＭの８−Ａ
Ｃを含むＲＰＭｌ　　１６４０＋ｌＯ％ＦＣ５培地に１
×１０６個／　ｗｅの細胞濃度で浮遊させ、培養ボトル
（］−ニング社）にそのＩＯｇ／を取シ、ボトルを横に
した状態で、５％炭酸ガス及び９５％空気の通気条件下
、３７°Ｃでイン士ユベーター内で１週間培養した。そ
の後生存細胞を取シ出し、上記の２濃度度即ち４μＭの
８．−ＡＧ　　を含む同一培地に１×１０６個／　ｍｌ
濃度となる様に浮遊させ、同様にして１週間培養した。

上記のように１週間毎に培地に添加させる８−ＡＣ３度
を約２倍づつ（２→４→８→１６→３２→５０→７５→
１００μＭとした）増加させ、夫々の培地で生存する細
胞を順次培養して、最終的に８−、［ｌＱＱμＭを存在
させた培地で生存する細胞を得た。かくして約８週間を
経て所望の８−ＡＧ耐性株を得た。これを（−ＣＥＭ−
ＡＧとする。この株はその後同濃度（１００μＭ）の８
−．４Ｇを含むＲＰＭｌ　　１６４０＋Ｉｏ％ＦＣ８培
地にて強い増殖を示し、この培地で継代培養により維持
されている。またその細胞学的及びその他の特性は前述
した通シであった。

実施例２　しト細胞の単離調製 （１）末梢血Ｔ＠胞 健康な成人よりへｌ〜リン採血して得た血液５０震ｌを
「フィコール−バック」（ファルマシア・ジＰパン株式
会社）で遠心分離して、末梢血９ンノ＼球５ＸＩ０７を
単離した。該リンパ球からのＴ＠胞の単離は、ノイラ三
ニダーを処理羊赤血球（ＳＲＢＣ）で０ゼツト化するこ
とによシ行なった（　Ｔ。

ＨＩＲＡＮＯ、Ｔ、ＫＵＲＩＴＡＮＩ　、　Ｔ、　ＫＩ
ＳＨＩＭＯＴＯａｎｄＴ、　ＹＡＭＡＭＵＲＡ　、　Ｊ
、Ｉｍｍｕｎｔｙｌ、　、　Ｉ　！　９．　Ｉ　２３５
〜＋２４１（１９７？　））。かくして得られた末ｔｒ
肖血Ｔ細胞を「非刺激ＰＢＬ、、、ＴＪとする。

ｔた上記非刺激ＰＢＬ−ＴのＩ　Ｘ　１０６個／　ｍｅ
に対して、ｌＯμｆ／ｍｌ　　のＣｏｎＡ、２５μｆ／
譚ｌのＰＰＤ及びｌＯμｆ／譚ｌのＰｒｔｙＡ　で夫々
４８時間束１１激させて、刺激Ｔ細胞を調整する。之等
を夫々「ＣｏｎＡ刺激ＰＢＬ−Ｔ」、「ＰＰ′Ｄ刺激Ｐ
ＢＬ−ＴＪ及び「ＰｒｏＡ　刺激ＰＢＬ−ＴＪとする。

（２）口蓋扁桃Ｔ細胞 慢性扁桃炎患者の扁桃切除術で得たしトロ蓋扁桃より採
取した扁桃腺を、ヘパリン１０単位／　ｙｐｒｌ及びア
ンホテリシンＢ（三共株式会社）４μｆ／ｌｌ！Ｉｌを
含むＨＥＭ培地にて細切し、扁桃細胞を取り出した。こ
の細胞を「フィコール−バック」を用い遠心分離し、５
　Ｘ　Ｉ　０８個の扁桃リンパ球を単離した。以後上記
（１）と同様にノイラ三ニダーを処理羊赤血球にてＤセ
ット化して扁桃Ｔ細胞２ＸＩ０８を単離した。この細胞
ｌＸｌ０６個／ＩＩＭＥＭを次いでｌ０ｐｆ／ｌｌｌの
ＣｏｎＡで４８時間刺激し、刺激扁桃Ｔ細胞を得た。こ
れを「ＣｔｒｎＡ刺激Ｔｏｎｓｉｌ　−Ｔ　Ｊとする。

（３）胸膜滲出液Ｔ細胞 肺結核の患者より胸膜滲出液のりシバ様細胞を分離した
。即ち肺結核患者の胸膜滲出液（胸膜）を穿刺法により
Ｉ　Ｏ’Ｏｔｅｌ採取し、これを１５０Ｏｒｐｍ、５分
の遠沈後ヘパリン１０単位／ゴを含有するＭＥＮにて２
回洗浄し、「フィコール−ハイパツク」（ファルマシア
・ジセパシ株式会社）で遠心分離し、胸膜９９４球３　
Ｘ　Ｉ　０８個を単離した。

以後上記（１）と同様にして、胸膜Ｔ細胞を得、そのｌ
Ｘｌ０６個／　ｍｌを２５μｆ　／　ｍｌのＰＰＤで４
８時間刺激した。かくして得られた細胞を「ＰＰ、Ｄ刺
激ＰＦ−ＴＪとする。

実施例３　親細胞−しトＴ細胞融合 親細胞ＣＥＭ−ＡＣ；　　は、融合の３日前より毎日培
地（ＲＰＭＩ　　１６４０＋ＩＯ％ＦＣ５−＋−１００
μＭＳ−ＡＣ）を交換して、増殖が活発な状態に保持し
ておいた。

Ｒ 上記ＣＥＭ−ＡＣの１ＸＩＯ個と、上記実施例２で得た
各しトＴ細胞の夫々２　Ｘ　Ｉ　０７個とを細胞融合に
利用した。即ち上記各細胞を、予め３７°Ｃ加温保持し
たＦｅ２を含まないＭＥＮ培地で３回洗浄し、次いで５
０ｍ１の］ニカルチューブに移しよく混合し、１００Ｏ
ｒ／””で１０分遠沈した。

上清を除去して得られた細胞ペレットを軽く振とうし、
その上に３７°Ｃに加温した４５％ＰＥＧ。

６０００　（コツホライト社）の０．３ｔｇｌを注いだ
。

３０秒間よく振とうした後、５％度酸ガス及び９５％空
気の炭酸ガスイシ士ユベーター内で、３７°Ｃ下に６分
間静置した。これにＦｅ２を含まないＭＥＮ（予め３７
℃に加温）を１分間に２　ｗｒｌの速度で総計１２ｍ１
加えた。更にＭ　Ｅ　Ｍ　２５　ｍｌをすばやく加えた
後８００ｒｆｉｍ、１０分間遠沈し、上清を除去した。

これに２０％ＦＣ５含有ＲＰＭ１１６４０培地（予め３
７゛Ｃに加温）　Ｑ　５０　ｄを静かに加えてＣＥＭ−
ＡＧ　　濃度を２ＸＩＯ個／　ｗｅとし、これをマイク
ロカルチＰ−づレート（９９５０社）の直径２ｔＭの各
ウェル５０個に夫々Ｉ　ｗｅづつ分注した。２４時間後
上清の半分をすてＩｆＡＴ培地（しポ＋サンチン（シグ
マ社）ＩＸＩＯＭ、アミノづテリン（シグマ社）４ＸＩ
ＯＭ及びチ三ジシ（シグマ社、）１．６ＸＩＯＭを含む
ハＰＭ１１６４０＋２０％ＦＣ５培地）Ｉｓｌを各ウェ
ルに加えた。２日毎に同様の操作を繰返し、２〜４週間
週間５酸炭酸ガスイン＋ユベーター内７°Ｃ下に培養し
た。増殖する細胞株を次いでアミノづテリンＣＡ）を含
まないＩｔ　Ｔ培地（ＨＡＴ培地よりＡを除いたもの）
に移し、更に１週間培養後、ＨＡＴを含まないＲＰＭＩ
　　１６４０＋ｌＯ％ＦＣ５培地（正常培地）に移し、
以後常法に従いり０−ニシグ化した。即ち交雑細胞を正
常培地中で５個／　ｚｌとなるように希釈しこれをファ
ルコシマイク０づレートに帆２　ｍｌ　／ウェルづつ分
注し、２〜３日おきに上清を半分すて、予め３７°Ｃに
加温した培地を加え、上記細胞の増殖をつづけた。かく
して交雑細胞株の単一り０−シを得た。得られたり０−
シ中の代表的しトＴ細胞交雑細胞株は、前述した第２表
に示す特性を有していた。

実施例今　しトＴ細胞交雑細胞上清の製造（１）無刺激
で得た上清 上記実施例３で得た交雑細胞り０−シ應２４−Ａの細胞
を、ＲＰＭＩ　　１６４０＋ＩＯ％ｐｃｓ培地を用いて
ｌ　Ｘ　Ｉ　０５個／　ｙｘｌ濃度に調整し、これをマ
イクロカルテセプし一ト（９９５０社）の直径２傷のウ
ェルにて２日間、３７°Ｃ下、５％炭酸カスイン士ユベ
ーター内で培養した。３０００ｒｐｍ１０分遠沈して培
養上清を採取し、これを０．４５μミリボア・フィルタ
ーにて滅菌濾過し、この上清中のりンホカイシ活性の有
無を検討した。

（２）　ＣａｎＡ刺激で得た上清 上記において用いた培地にＣｏｎＡ　１μ９　／　Ｗｌ
を添加する以外は、上記（１）と同様にして、上清を得
、これをリシホカイシ活性測定に供した。

実施例ラ　しトＴ細胞交雑細胞上清のりンホカイン産生
能 上記実施例４で得た各上清のリンホカイン産生能を次の
通り試験した。

＜　Ｔ　ＣＧ　Ｆ活性試験Ｉ〉 生後５〜６週間のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス（静岡実験
動物）から胸腺細胞を取出し、細切して胸腺細胞を得、
これをＭＥＮにて２回洗浄し、１０％ｐｃｓを含むＲＰ
ＭＩ　　１６４０　　培地にてｌ　Ｘ　Ｉ　０６個／　
ｙｘｌ濃度の細胞液を調整した。この胸腺細胞浮遊液０
．１　ｗｌ　（ｌ　ＸＩＯ３個［１１）　Ｋ、上記実ｍ
例４で得た交雑細胞の上清を加えＯ，：２Ｍ／容平底マ
イク０プレート（ファルコン社）内で２μｆｌ　／　ｍ
ｅのＣｏｎＡの刺激下、′３Ｈ−チミジ：、、（’Ｈ−
ＴｄＲ）０．５μ白／ウエルを６時間を要して与え培養
を行′なった。培養３日後の分裂増殖を３Ｈ−ＴａＲの
取り込みによシ調べた。同一試験を親細胞株であるＣＥ
Ｍ−ＡＧ　　の培養上清に、ついても行なった。結果を
第５図に示す。第５図中縦軸は取シ込まれた３Ｉｆ−Ｔ
ｔｔＲカウ、ト数（Ｃ０Ｐ、Ｍ、ｘｌＯ−３）を示す。

また横軸のＣＡ）は、何らの培養上清をも添加しない場
合、（Ｂ）は、実施例今の（１）及びこれと同様にして
得たＣＥＩＩＩ−ＡＧ　　の各上澄を添加した場合（斜
線を入れないものが実施ｆ１１４（＋）で得た上清及び
斜線で示すものがＣＥＭ−ＡＧ　　の上清である。以下
同じ）、（Ｃ）は実施例４の（２）及びこれと同様にし
て得たＯＥＭ−ＡＧ　　上清の場合及び（Ｄ）は培養上
清の替わりにｌμｆｌ／ｘｌのＣｏｎＡのみを用いた場
合を夫々示す。各（Ａ）〜（Ｄ）共結果は３度同一試験
を繰返した平均±Ｓ、Ｄ、で示す。

上記第５図より、りＤ−ンＩＦＬ２４−　’の培養上清
（図中斜線を付していないＣＢ）及び（Ｃ）群）は、Ｃ
ａｎＡで刺激されたマウス胸腺細胞の有意な分裂増殖を
誘発し、殊にこの作用はりＤ−ンＦａ　２４−　’をＣ
ａｎＡで刺激して得た上清（Ｃ）群で著しく強いことが
判る。これに対しＣＥＭ−ＡＧ　　は、シト束１１激上
澄及びＣｏｎＡ刺激上清のいずれにおいても分裂増殖誘
発因子を産生じないこと７５；判る。

＜　Ｔ　ＣＧ　Ｆ活性試験２〉 実施例４の（１）で得た上清５０ｍ１を濃縮後ｔファデ
ックスＧ−１００カラム（ファ」しマシア社）に通し、
分子量約１３０００〜２００００の分画を得、これを「
アミコンＹＭ−５Ｊメンづラシス（Ａｍ１ｔｏｎ　　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　　、　　Ｌｅｚｉｎｙｌｏｎ　
　、　　Ｍａｓｓ　　）　　で５　ｍｌに濃縮して半、
精製上澄を得た。同様にして親細胞株ＣＥＭ−ＡＧＲの
半精製上澄を得た。

一方正常しト末梢血Ｔ細胞とマイトマイシシ処理ｃＥｓ
ｓ（ＥＢ−ウィルスでトランスフオームしたしトＢ細胞
、スＤ−ン・ケタ１ノシジ癌研究所のじ一ターラルフ博
士より入手）とを１ノシ７Ｓ球混合培養（ＭＬＣ）し、
Ｔ”ＣＧＦ（しト扁υＬ１ノシ）ＰＸ球Ｉ　Ｘ　Ｉ　０
６個／　ｍｌを０．１％ＰＨＡの存在下で２日間培養し
、培養上清を粗製ＴＣＧＦとして用いた）によって１６
週間培養、増殖させたＴＣＧＦ依存性しト細胞障害性Ｔ
細胞株を用意した。

上記７（：ＧＦ依存性ヒト細胞障害性Ｔ細胞株の３　Ｘ
　１０３個を、上記で得た半精製上澄の存在下に。

２４時間培養しく３７°Ｃ，ＣＯ２イン＋１ベーター内
、ＲＰＭＩ　　１６４０＋ｌ０９６ＦＣ５培地）し、０
．５μＣｉの３Ｈ−ＴｄＲを５〜８時間を力・けて与え
、上記半精製上澄の連続希釈によって、該３゜ＴｔｔＲ
の取り込み量をカラシトし、ＴＣＧＦ活性を調べた。結
果を第６図に示す。第６図において横軸は希釈上清原液
を１とし、その希釈濃度（希釈倍率）を示し、０はコン
ト０−ルとして上澄を加えない場合を、また斜線を入れ
た値は、上記で得た半精製上清を、斜線を入れない値は
けＣＥＭ−ＡＣの半精製上清を示す。また縦軸は取り込
まれた３Ｈ−ＴｔｔＲのカウント数（Ｃ，ＰｏＭ、　Ｘ
ｌ０−３）を示す。すべての結果は、同一試験を３度繰
返した平均子ＳＤで示すものである。

第６図より本発明のり０−ン＆　２４−　’の培養上清
中の分子量１３０００〜２００００の半精製分画は、Ｔ
ＣＧＦ依存性しト障害性Ｔ細胞株の増殖を維持すること
ができ、その活性は、液性因子の濃度に依存することが
判る。一方親細胞株ＣＥＭ−ＡＧＲから得られる同様や
分子量を持つ分画け、どの濃度においても上記増殖活性
を示さないことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は、本発明親細胞株ＣＥＭ−ＡＧ　　
及び本発明Ｔ細胞融合株り０−ンＡ　２４−　’の夫々
のマイトジェン反応性を示すグラフ並びに第５図及び第
６図は本発明Ｔ細胞融合株り０−ン／ａ　２４−　’の
ＴＣＧＦ活性を示すグラフを夫々示す。 （以　上） 第１図　　　　　第３Ｆ！！１ 第２図　　　　　第４図 ２　　　　　　　　　　　　　２ ’０２　　　　　　　　　　　　″。 ×　　　　　　　　　　　　　　　　　　　こΣ　　　
　　　　　　　　　　　　　ΣＣＬ：　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＬｏ　　　　　　　　　　
　　　　　　０ｎ−−−−−＝＝−− 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　しポ＋”ｊ：Ｊチンータアニンーホスホリボシルト
   ランスフエラー−ｆｐ（ＨＧＰＲＴ）欠損しト白血病性
   Ｔ細胞ラインおよびそれから誘導された細胞ライン。 ■　誘導された細胞ラインがＨＧＰＲＴ欠損しト白血病
   性Ｔ細胞と、正常しトＴ細胞との交雑細胞ラインである
   特許請求の範囲第１項記載の細胞ライン０　′ ■　誘導された細胞ラインがＴ細胞増殖因子産生能を有
   するものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   細胞ライン。 ■　しト白血病性Ｔ細胞を、８−アザクアニン、６−チ
   オタアニンおよび６−メルカづトブリシリボシッドから
   選ばれた少なくとも１種を含有する培地で培養すること
   を特徴とするＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞ライン
   の生産方法。 ■　ＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞と正常しトＴ細
   胞とを融合促進剤を用いて融合させることを特徴とする
   しトＴ交雑細胞うイシの生産方法。 ■　ＨＧＰＲＴ欠損しト白血病性Ｔ細胞と正常しトＴ細
   胞との融合後に、交雑細胞を雑種選別用培地で選択的に
   増殖させる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ■　雑種選別用培地がしポ牛サンチン、アミノづテリン
   及びチ三ジンを含む培地である特許請求の範囲第６項の
   方法。 ■　交雑細胞をりｉ−シ化してＴ細胞増殖因子産生能を
   有する交雑細胞ラインを得る特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 ■　特許請求の範囲第８項記載の交雑細胞ラインを培養
   して、Ｔ細胞増殖因子を得ることを特徴とするＴ細胞増
   殖因子の製造方法。