JPS58201723A - イムノグロブリンの製造方法 - Google Patents
イムノグロブリンの製造方法Info
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- JPS58201723A JPS58201723A JP58051753A JP5175383A JPS58201723A JP S58201723 A JPS58201723 A JP S58201723A JP 58051753 A JP58051753 A JP 58051753A JP 5175383 A JP5175383 A JP 5175383A JP S58201723 A JPS58201723 A JP S58201723A
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- Japan
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- immunoglobulin
- cell
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
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- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
コーラ−とミルスタインのハイプリドーマ技術（４）
は、免疫学および多くの他の分野へのその応用について
大変革ｔも九らし７ｔＱマウスおよびラットにおいて産
生したきわめて特異的なモノクローナル抗体は、実質的
に無制限に多ｔｖｃ得られる。最近、ヒトモノクローナ
ル抗体の産生の報告がある。
大変革ｔも九らし７ｔＱマウスおよびラットにおいて産
生したきわめて特異的なモノクローナル抗体は、実質的
に無制限に多ｔｖｃ得られる。最近、ヒトモノクローナ
ル抗体の産生の報告がある。
ヒトモノクローナル抗体、は、特にイン・ビボの診断お
よび治療において、鼠科ｔ７ｔｒｉう・ント系で発生し
之モノクローナル抗体より、すぐれている。
よび治療において、鼠科ｔ７ｔｒｉう・ント系で発生し
之モノクローナル抗体より、すぐれている。
更に鮮しくは、イン・ビボ治療に関しており、外来（異
物）抗血清による感作（増感）の危険によるＯ
・ ・ 更にヒト免疫応答のスペクトルは、非常に制限されて２
９ 、・したがってＨＬＡ特異性のような細胞界面（表
面）マーカーに対してモノクローナル抗体の生成のため
に有用である。しかも自動（自己）免疫モノクローナル
抗体の分離および、抗原としてのそれらの使用は、自動
（自己）抗原への応答ｔｆＡ節するヒトモノクローナ、
ル抗−イデイオタイプ治療ｔもたらすか、組織抗原を移
植する。
物）抗血清による感作（増感）の危険によるＯ
・ ・ 更にヒト免疫応答のスペクトルは、非常に制限されて２
９ 、・したがってＨＬＡ特異性のような細胞界面（表
面）マーカーに対してモノクローナル抗体の生成のため
に有用である。しかも自動（自己）免疫モノクローナル
抗体の分離および、抗原としてのそれらの使用は、自動
（自己）抗原への応答ｔｆＡ節するヒトモノクローナ、
ル抗−イデイオタイプ治療ｔもたらすか、組織抗原を移
植する。
結局、伝染病動固への液◆素性応答は、有用な診断モノ
クローナル抗体全作り出し開発することができる。この
誘発性の有利性にもかかわらず、ヒトモノクローナル抗
体を製造するためのハイブリドーマ技術一般的な応用は
限られている。
クローナル抗体全作り出し開発することができる。この
誘発性の有利性にもかかわらず、ヒトモノクローナル抗
体を製造するためのハイブリドーマ技術一般的な応用は
限られている。
ＥＢＶｔ含む上澄みを、前もってヒ）Ｂ細胞をＮＮＰハ
プテン、〔スタインニッッら、 ＊ Ｎａｔｕｒｅ（１
９７９）２６７巻、５２ページ〕、・ＴＰＮハプテン〔
コズボルら、＊ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９７
７）１０巻、１８１ベージ）、Ｒｈ抗原〔コスキミース
、 ＋ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９−７９） １
０巻、３７１ぺ−・ジ、ボイルストンら、 、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ−（１９８０）１２巻、２５５ページ〕
、連鎖球菌Ａ多糖類〔スタイン＝ツツら、 、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｈｉｏｌｏｇｙ （１９７９）１５６巻、４１ペ
ージ〕、破傷風毒素〔ツラウスキイら、、Ｓ１１！１ｅ
ｎｃｅ（１９７Ｂ）１９９巻、 １４３９）。
プテン、〔スタインニッッら、 ＊ Ｎａｔｕｒｅ（１
９７９）２６７巻、５２ページ〕、・ＴＰＮハプテン〔
コズボルら、＊ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９７
７）１０巻、１８１ベージ）、Ｒｈ抗原〔コスキミース
、 ＋ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９−７９） １
０巻、３７１ぺ−・ジ、ボイルストンら、 、 Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ−（１９８０）１２巻、２５５ページ〕
、連鎖球菌Ａ多糖類〔スタイン＝ツツら、 、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｈｉｏｌｏｇｙ （１９７９）１５６巻、４１ペ
ージ〕、破傷風毒素〔ツラウスキイら、、Ｓ１１！１ｅ
ｎｃｅ（１９７Ｂ）１９９巻、 １４３９）。
ＩｇＧに関連し九すウマイトド〔スタインニツツラ、。
Ｎａｔｕｒｅ（１９８０） ２８７巻４４３ページ〕お
よびホスホリルコリン〔ヨシエおよびオノ。
よびホスホリルコリン〔ヨシエおよびオノ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８０） 、に対してポリクロー
ナルもしくはモノクローナル抗体産生ずる細胞系に形質
転換するために用いる。更にハイプリドーマからモノク
ローナル抗体および細胞融合を用いるヒトハイプリドー
マの生成に関する文献として、クローセら−，（Ｎａｔ
ｕｒｅ （１９８０）２８８巻。
ナルもしくはモノクローナル抗体産生ずる細胞系に形質
転換するために用いる。更にハイプリドーマからモノク
ローナル抗体および細胞融合を用いるヒトハイプリドー
マの生成に関する文献として、クローセら−，（Ｎａｔ
ｕｒｅ （１９８０）２８８巻。
４８８ページ〕オールソンおよびカブラン（ＰＮＡＳＵ
ＳＡ（１９８０）７７’巻、５４２９ページ〕によって
報告さ几た論文が挙げられる。パートら（Ｊ。
ＳＡ（１９８０）７７’巻、５４２９ページ〕によって
報告さ几た論文が挙げられる。パートら（Ｊ。
Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 （１９８１） １５４巻 ８３２
ベージ：ヒトＢリンパ球のＥＢＶ活性化〕コズボールお
よびロダー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’ （１９８１）
１２７巻。
ベージ：ヒトＢリンパ球のＥＢＶ活性化〕コズボールお
よびロダー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’ （１９８１）
１２７巻。
１２７５ページ：破傷風毒素に対するモノクローナル抗
体の確立の之めＫＥＢＶの使用〕によって報告されてい
る０ ′ 霊長類モノクローナル抗体の安定な産生の準備のために
、方法、細胞および成分が提供される。
体の確立の之めＫＥＢＶの使用〕によって報告されてい
る０ ′ 霊長類モノクローナル抗体の安定な産生の準備のために
、方法、細胞および成分が提供される。
エプスタイン−バルーウィルス（”ＥＢＶ”） −りＥ
ｌｋ。
ｌｋ。
移取次（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ＞］と
して細胞（通常リンパ球）盆形質転換する方法を用いる
。この細胞は、以後伝達（転移）細胞として記載する。
して細胞（通常リンパ球）盆形質転換する方法を用いる
。この細胞は、以後伝達（転移）細胞として記載する。
この伝達（転移）ａ胞は、非融合条件下にイムノブ（７
） ロブリン（通常Ｂ −ＩＪンパ球）會形成できる細胞と
接触させるかまたに共−培養’（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａ
ｔｅ）する。イムノグロブリンＣ”Ｉｇ”） ｋ形成で
きる細胞は、伝達（転移）細胞との共−培養によって形
質転換され、不滅化され（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ
） 、 Ｉ ｇ形成にかかり合う。共−培養によって形
質転換され、イムノグロブリン形成できる細胞は、受容
細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ ＞ と記載す
る０転＃（伝達）および受容細胞を選択的条件下に共−
培養し、それによって形質転換した受容細胞を不滅化し
、じ不滅化Ｉｇ産生細胞１“ハ伝達（転移９細胞と無関
係に増殖できる。これらの不滅化したＩｇ形成細胞は、
望ましいリガンド特異性に対してイムノグロブリン産生
細胞の選択のためにスクリーン化され、望ましいクラス
（、ｃｌａａｓ ） およびアイソタイプ（、ｉｓ、
ｏｔ７ｐｊ ）の安定に、モノクローナルＩｇ生成する
細胞系を確立するために、実質的にクローン化する。
） ロブリン（通常Ｂ −ＩＪンパ球）會形成できる細胞と
接触させるかまたに共−培養’（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａ
ｔｅ）する。イムノグロブリンＣ”Ｉｇ”） ｋ形成で
きる細胞は、伝達（転移）細胞との共−培養によって形
質転換され、不滅化され（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ
） 、 Ｉ ｇ形成にかかり合う。共−培養によって形
質転換され、イムノグロブリン形成できる細胞は、受容
細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ ＞ と記載す
る０転＃（伝達）および受容細胞を選択的条件下に共−
培養し、それによって形質転換した受容細胞を不滅化し
、じ不滅化Ｉｇ産生細胞１“ハ伝達（転移９細胞と無関
係に増殖できる。これらの不滅化したＩｇ形成細胞は、
望ましいリガンド特異性に対してイムノグロブリン産生
細胞の選択のためにスクリーン化され、望ましいクラス
（、ｃｌａａｓ ） およびアイソタイプ（、ｉｓ、
ｏｔ７ｐｊ ）の安定に、モノクローナルＩｇ生成する
細胞系を確立するために、実質的にクローン化する。
本発明に係る万云は、糧々の１■鎖（ｈｅａｖｙ ｃｂ
ａｉｎ）アイソタイプ（例 ＩｇＧ１−４）４を含み、
Ｉ ｇＡ 。
ａｉｎ）アイソタイプ（例 ＩｇＧ１−４）４を含み、
Ｉ ｇＡ 。
（８）
ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのようなイムノグ
ロブリンクラスのどのモノクロナール抗体の産生にも用
いられる。モノクローナル抗体を分離し、Ｆａｂ ｌ
Ｆ （ａｂ’）２１ Ｆｖ ｌＦｄ ｌＦｅ 、にお、
よびスＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ）のような特異
フラグメントを生成するために酵素および／または酸分
解（消化）のような種々の方法で変異させる。
ロブリンクラスのどのモノクロナール抗体の産生にも用
いられる。モノクローナル抗体を分離し、Ｆａｂ ｌ
Ｆ （ａｂ’）２１ Ｆｖ ｌＦｄ ｌＦｅ 、にお、
よびスＬ鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ）のような特異
フラグメントを生成するために酵素および／または酸分
解（消化）のような種々の方法で変異させる。
伝達（転移）細胞は、ＥＢＶに対するホストであるどの
ような細胞でもあり得、受容細胞の形質転換および不滅
化後、選択的に除去できるように選択されうる。好まし
くは、伝達（転移）細胞および受容細胞の共−培養は、
伝達（転移）細胞に対する選択的な細胞毒素条件下に行
なう一１ＥＢｖ伝達（転移）細胞系會選択する場合、考
慮すべきことは伝Ｓ（転移）細胞は、入手可能であり、
感受性のない受容細胞に細胞毒素に感受性ｔもつように
突然変異させることができるか・：ＥＢＶに対してのホ
ストであり、伝達（転移）細胞として作用することがで
き、受容細胞とともに媒質への導入は、受容細胞を形質
転換でき、不滅化できる。
ような細胞でもあり得、受容細胞の形質転換および不滅
化後、選択的に除去できるように選択されうる。好まし
くは、伝達（転移）細胞および受容細胞の共−培養は、
伝達（転移）細胞に対する選択的な細胞毒素条件下に行
なう一１ＥＢｖ伝達（転移）細胞系會選択する場合、考
慮すべきことは伝Ｓ（転移）細胞は、入手可能であり、
感受性のない受容細胞に細胞毒素に感受性ｔもつように
突然変異させることができるか・：ＥＢＶに対してのホ
ストであり、伝達（転移）細胞として作用することがで
き、受容細胞とともに媒質への導入は、受容細胞を形質
転換でき、不滅化できる。
ＥＢＶＫ対してホストである細胞としては、特にヒト、
チンパンジー、モンキー、きぬざるなどｔ含む霊長動物
を挙げることができる。これらの細胞は、常法によって
、容易にＥＢＶＫよって形質転換できる。いろいろの細
胞系、ヒトリンパ芽球ＧＭ４６７２、きぬざる系Ｂ９５
−８などのようなＥＢＶｔ−含むものが有効である。
チンパンジー、モンキー、きぬざるなどｔ含む霊長動物
を挙げることができる。これらの細胞は、常法によって
、容易にＥＢＶＫよって形質転換できる。いろいろの細
胞系、ヒトリンパ芽球ＧＭ４６７２、きぬざる系Ｂ９５
−８などのようなＥＢＶｔ−含むものが有効である。
いろいろの方法（手段）が、実質的に完全な伝達（転移
）細胞の不在化に不滅化Ｉｇｆ生細胞全選択的に分離す
るために用いられる。この方法（手段）は、部分的に伝
達（転移）細胞および受容細胞との相違による。いくつ
かの例において細胞は分離され、それらの浮力密度によ
って区別される。いろいろの媒質（例、パーコール）が
遠心分離の間、異なった密度の領域會提供するために用
いられる。細胞の二つのグループが界面抗原。
）細胞の不在化に不滅化Ｉｇｆ生細胞全選択的に分離す
るために用いられる。この方法（手段）は、部分的に伝
達（転移）細胞および受容細胞との相違による。いくつ
かの例において細胞は分離され、それらの浮力密度によ
って区別される。いろいろの媒質（例、パーコール）が
遠心分離の間、異なった密度の領域會提供するために用
いられる。細胞の二つのグループが界面抗原。
抗体、伝達（転移）細胞に対する選択性、補体もしくは
溶解毒素との関連によって区別されることは、有用であ
る。
溶解毒素との関連によって区別されることは、有用であ
る。
大部分の選択細胞毒素剤が有効ｆあることが見い出され
た。伝達（転移）細胞が、抵抗性のある受容細胞対する
細胞毒素剤に感受性があるか、または感受性ＶＣさせう
るかの場合に、選択的細胞毒素剤は使用される。感受性
は、一般に、伝達（転移）細胞上突然変異誘発剤と接触
せしめることによって、次いで、選択的細胞毒素剤に対
して感受性のある細胞を選択することによって得られる
。
た。伝達（転移）細胞が、抵抗性のある受容細胞対する
細胞毒素剤に感受性があるか、または感受性ＶＣさせう
るかの場合に、選択的細胞毒素剤は使用される。感受性
は、一般に、伝達（転移）細胞上突然変異誘発剤と接触
せしめることによって、次いで、選択的細胞毒素剤に対
して感受性のある細胞を選択することによって得られる
。
いろいろの選択的細胞毒素が存在し、しかし、常法で、
一般的に社、ＨＡ・Ｔ（ヒボキサンチンアミノプテリン
、チミジン）感受性であるように、ＨＧＰＲＴ（ヒボキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
）欠損である細胞を形成するために、伝達（転移）細胞
を突然変異させる。いろいろの突然変異誘発剤ｄＨＧＰ
ＲＴ−細胞の誘導体を促進するたりＶＣ用いられ、ＨＡ
ＴＫ感受性がある。一般的にエチルメタンスルフォネ
ート賜しくはＮ−ニトロソグアニジンが用いられる（Ｎ
ａｔｕｒｅ （１９７５）１５６巻：＋９ｓ 〜４９７
ページ参照〕。
一般的に社、ＨＡ・Ｔ（ヒボキサンチンアミノプテリン
、チミジン）感受性であるように、ＨＧＰＲＴ（ヒボキ
サンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
）欠損である細胞を形成するために、伝達（転移）細胞
を突然変異させる。いろいろの突然変異誘発剤ｄＨＧＰ
ＲＴ−細胞の誘導体を促進するたりＶＣ用いられ、ＨＡ
ＴＫ感受性がある。一般的にエチルメタンスルフォネ
ート賜しくはＮ−ニトロソグアニジンが用いられる（Ｎ
ａｔｕｒｅ （１９７５）１５６巻：＋９ｓ 〜４９７
ページ参照〕。
受答細胞、通常は活性化もしくは非活性化Ｂ−（１１）
リンパ球は広範囲の材料および不滅化Ｉｇ産生細胞にな
ることができるホスト由来である。これは、細胞が通常
ＥＢＶのホスト範囲内にあることｔ意味する。Ｂ −Ｉ
Ｊンバ球は、末梢血液、扁桃、バイエル集線、牌、およ
びリンパ牌由来である。特に選択は、形質転換の目的に
依存して変更する。一般Ｋに、選択は、興味の決定基と
なる望ましいイムノグロブリン？生成できるＢ−リンパ
球の有効性に依存する。他の状況において％ Ｂ −’
Ｊンバ球の特別のセットが目的となる。
ることができるホスト由来である。これは、細胞が通常
ＥＢＶのホスト範囲内にあることｔ意味する。Ｂ −Ｉ
Ｊンバ球は、末梢血液、扁桃、バイエル集線、牌、およ
びリンパ牌由来である。特に選択は、形質転換の目的に
依存して変更する。一般Ｋに、選択は、興味の決定基と
なる望ましいイムノグロブリン？生成できるＢ−リンパ
球の有効性に依存する。他の状況において％ Ｂ −’
Ｊンバ球の特別のセットが目的となる。
受容細胞は望ましい免疫原、ハプテンまたは抗原のどち
らかによってイン・ビボまたはイン・ビトロで免役化さ
れる。興味ある決定基の位置は、単純な単量体有機化合
物で、自然に生ずるかもしくに合成されたものであるポ
リペプチドおよびタンパク、多糖類、核酸または類似物
またにそれらの組み合わせ内に存在する。化合物は試薬
、汚染物、殺虫剤、夾雑物、細胞構成物、たとえば表面
膜タンパク、細胞質タンパク、核タンパクなど、酵素、
ホルモン、抗生物質などに存在する。余生（１２） 物体、ま友は細胞として、９イルス、バクテリア。
らかによってイン・ビボまたはイン・ビトロで免役化さ
れる。興味ある決定基の位置は、単純な単量体有機化合
物で、自然に生ずるかもしくに合成されたものであるポ
リペプチドおよびタンパク、多糖類、核酸または類似物
またにそれらの組み合わせ内に存在する。化合物は試薬
、汚染物、殺虫剤、夾雑物、細胞構成物、たとえば表面
膜タンパク、細胞質タンパク、核タンパクなど、酵素、
ホルモン、抗生物質などに存在する。余生（１２） 物体、ま友は細胞として、９イルス、バクテリア。
カビ、原生動物、は乳類の細胞などまｆｒｔそれらの一
部分（例、核）のようなものが用いられる。
部分（例、核）のようなものが用いられる。
Ｂ−リンパ球は、イン・ビボもしくはイン嗜ビトロで、
免疫原によって活性化され、興味あるリガンドに対して
抗体が産生ずる０扁桃切除、または牌切除會うけたホス
トに、特別な器官に対する材料として提供されうる。Ｂ
−リンパ球用ホスト源は、先に示したように霊長類であ
る〇一般に、イン・ビボ免疫化には、ホスト社、少なく
ても一回および、器官の除去前、約二週関数回免疫化す
る。赤血球および顆粒球の組織の単一細胞懸濁液を遊離
後、生育可能な単核細胞を適当な栄養培地に懸濁し、非
癒潰細胞ｔ−ｉ着細胞から分離する。
。
免疫原によって活性化され、興味あるリガンドに対して
抗体が産生ずる０扁桃切除、または牌切除會うけたホス
トに、特別な器官に対する材料として提供されうる。Ｂ
−リンパ球用ホスト源は、先に示したように霊長類であ
る〇一般に、イン・ビボ免疫化には、ホスト社、少なく
ても一回および、器官の除去前、約二週関数回免疫化す
る。赤血球および顆粒球の組織の単一細胞懸濁液を遊離
後、生育可能な単核細胞を適当な栄養培地に懸濁し、非
癒潰細胞ｔ−ｉ着細胞から分離する。
。
イン−ビトロの免疫には、受容細胞源として、たとえば
末梢性血液白血球（ＰＢＬ）ｔ−分離し、活性化せしめ
るに十分な濃度で適当な抗原を栄養培地に含むマクロフ
ァージに実生させる。感作のために十分な時間後、一般
的に約２〜４日間後、生育可能な細胞は、死細胞から分
離し、受容細胞として用いる。この方法（手段）の説明
に関しては、たとえば１９８１年６月１６日出願したヨ
ーロッパ特許出願番号４４，７２２に開示されており、
参照できるる 受容細胞の形質転換は通常は、機能のある生育可能なＴ
−細胞の実質的な不存在下に行なう０形質転俟へのＴ−
細胞妨害の除去ｄ、Ｔ−細胞の実質的な除去もしくｒｔ
’ｒ−細胞の不活性化によって達成できる。
末梢性血液白血球（ＰＢＬ）ｔ−分離し、活性化せしめ
るに十分な濃度で適当な抗原を栄養培地に含むマクロフ
ァージに実生させる。感作のために十分な時間後、一般
的に約２〜４日間後、生育可能な細胞は、死細胞から分
離し、受容細胞として用いる。この方法（手段）の説明
に関しては、たとえば１９８１年６月１６日出願したヨ
ーロッパ特許出願番号４４，７２２に開示されており、
参照できるる 受容細胞の形質転換は通常は、機能のある生育可能なＴ
−細胞の実質的な不存在下に行なう０形質転俟へのＴ−
細胞妨害の除去ｄ、Ｔ−細胞の実質的な除去もしくｒｔ
’ｒ−細胞の不活性化によって達成できる。
機能Ｔ−細胞の減少、は、Ｂ −ＩＪンバ球受容細、胞
の生育性を維持する常法の手段によって達成することが
できる０好都合に、Ｔ−細胞は、羊−赤血球とのＥ−ロ
ゼ、ットの形成によって除去でき、Ｅ−゛ロゼツトを媒
質（培地）から分離する。任意に、Ｔ−細胞を除去する
よりもむしろ、Ｔ−細胞ｔ、たとえばサイクセスポリン
Ａもしくは他のＴ−細胞不活性剤匹よって不活性化する
。仁のように、用いられるＢ−リンパ球懸濁から生育可
能な機能Ｔ−細胞會減少することができる◇ 活性Ｔ−細胞の減少しそして適当な栄養培地に懸濁とし
て提供され九受容細胞は、受容細胞群の形質転換のｔめ
に伝達（転移）細胞と共−培養する。ａ胞二つタイプは
、適当な媒質（培地）中で、たとえばＲＰＭ１１６４０
、実質的にフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）の不存在に、一
般的に、受容細胞と伝達（転移戸細胞との割合を約０．
２−５：１で、通＃Ｔは１−３：１で接触させる。二つ
の細胞群は共−培養する。所望ならば、細胞ｔ−細胞に
損傷を与えないように密着して接触せしめるに十分な遠
心法のような便利な方法よって、緊密ｒｃ接触せしめる
ことが可能である。
の生育性を維持する常法の手段によって達成することが
できる０好都合に、Ｔ−細胞は、羊−赤血球とのＥ−ロ
ゼ、ットの形成によって除去でき、Ｅ−゛ロゼツトを媒
質（培地）から分離する。任意に、Ｔ−細胞を除去する
よりもむしろ、Ｔ−細胞ｔ、たとえばサイクセスポリン
Ａもしくは他のＴ−細胞不活性剤匹よって不活性化する
。仁のように、用いられるＢ−リンパ球懸濁から生育可
能な機能Ｔ−細胞會減少することができる◇ 活性Ｔ−細胞の減少しそして適当な栄養培地に懸濁とし
て提供され九受容細胞は、受容細胞群の形質転換のｔめ
に伝達（転移）細胞と共−培養する。ａ胞二つタイプは
、適当な媒質（培地）中で、たとえばＲＰＭ１１６４０
、実質的にフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）の不存在に、一
般的に、受容細胞と伝達（転移戸細胞との割合を約０．
２−５：１で、通＃Ｔは１−３：１で接触させる。二つ
の細胞群は共−培養する。所望ならば、細胞ｔ−細胞に
損傷を与えないように密着して接触せしめるに十分な遠
心法のような便利な方法よって、緊密ｒｃ接触せしめる
ことが可能である。
遠心に１００−２００Ｘａｌｔで室温の−ｆ？、１Ｚ−
１−６０分間行なう仁とで通常は十分であるが、好まし
くは少なくて４約５分間行なう。
１−６０分間行なう仁とで通常は十分であるが、好まし
くは少なくて４約５分間行なう。
細胞は、共−培養され、不滅化Ｉｆ産生細胞は、機械的
もしくは化学的手段によって伝達（転移〕細胞から遊離
して得られる０大抵の化学的手段は選択的にＡａ胞毒嵩
を用いることである。九とえばＨＡＴ培地を用い７を場
合、各々の成分の＊［範囲は、約１０−’−１０−’Ｍ
である。伝達（転移ン訃よ（１５） び受答細胞の各々に対する細胞濃度は、約１０４−１０
５細胞／ｎｌであるり＠度範囲は、一般的ＩＩＣは約１
５−４０℃である〇 選択的抗体を用いｔ場合、結合位置に基づく抗体に、少
なくても十分量の補体と実質的な細胞の過剰量にある。
もしくは化学的手段によって伝達（転移〕細胞から遊離
して得られる０大抵の化学的手段は選択的にＡａ胞毒嵩
を用いることである。九とえばＨＡＴ培地を用い７を場
合、各々の成分の＊［範囲は、約１０−’−１０−’Ｍ
である。伝達（転移ン訃よ（１５） び受答細胞の各々に対する細胞濃度は、約１０４−１０
５細胞／ｎｌであるり＠度範囲は、一般的ＩＩＣは約１
５−４０℃である〇 選択的抗体を用いｔ場合、結合位置に基づく抗体に、少
なくても十分量の補体と実質的な細胞の過剰量にある。
毒素ｔとえばジフテリア毒素またはりチン４素を毒素の
非−特異性結合部分、すなわちＢ−ペプチドのない抗体
と会合させる。
非−特異性結合部分、すなわちＢ−ペプチドのない抗体
と会合させる。
伝達（転移）および受容細胞と接触させｔのち、すぐに
細胞懸濁液ｔマイクロティター拳ウェルにプレートする
細胞を成長条件下、ｔとえば３７℃、６％ＣＯ８ふん囲
気中で培養し、選択的条件下に維持する。）Ｆ（ＧＰＲ
Ｔ−伝達（＠８）＋［ｌ胞とともに、ＨＡＴ’に栄養培
地で保持する０不滅化Ｉｇ産生細胞の出現が見られ、７
−１４日間増殖させる。各各のウェルにおける細胞の上
澄み金スクリーンし、陽性ウェルにおける一ＩＩｌｌ胞
を限られ＝ｔ４釈条件下にクローン化する。
細胞懸濁液ｔマイクロティター拳ウェルにプレートする
細胞を成長条件下、ｔとえば３７℃、６％ＣＯ８ふん囲
気中で培養し、選択的条件下に維持する。）Ｆ（ＧＰＲ
Ｔ−伝達（＠８）＋［ｌ胞とともに、ＨＡＴ’に栄養培
地で保持する０不滅化Ｉｇ産生細胞の出現が見られ、７
−１４日間増殖させる。各各のウェルにおける細胞の上
澄み金スクリーンし、陽性ウェルにおける一ＩＩｌｌ胞
を限られ＝ｔ４釈条件下にクローン化する。
各々の培養マイクロウェルの上澄み液を、たりえば適当
なイムノアッセイ（例 １２６Ｉ固体相ラジ（１６） オイムノアッセイ）Ｋおけるぶどう球菌タンノくりＡｔ
−用いて、イムノグロブリン産生のテストをする０この
方法は、他のイムノグロブリンの検出が、特別のイムノ
グロブリンに対するＦｃの代゛９の抗体を用いることに
よって達成されるために、いくつかのイムノグロブリン
の診断となりうる０望ましいイムノグロブリンを産生ず
る培養ｌは、適当な栄養培地にクローン化する０ クローンの成長は、条件化培地との組み合わせ栄養培地
、フィーダー・レイヤーまたは類似物栄養培地のような
、いろいろ培地でなされる。フィーダー・レイヤーＶＣ
は、ヒトミ皮線維芽細胞フィーダー細胞、照射したヒト
胎児線維芽細胞、リンパ球、自然に存在するもしくは異
質遺伝的ヒトＰＢＬ、マウスリンバネ等細胞または類似
物を含む０望ましい抗体を産生ずるクローンが確立され
た後、不滅化、１ｇ産生細胞を常法での補助剤とともに
適当な培地を含む培養フラスコで成長（増殖）させ、抗
体は上澄みまたは細胞から採取抗体ｔ−５ａｔ−拒絶し
ないホスト、たとえば適当な霊長類または免疫系の不十
分なホストたとえばヌード・マウスの腹膜に注入し、腹
水金集めるかまたは血液中のイムノグロブリン會採取す
る。細胞上十分に成長させ、イムノグロブリンの生成を
生じせしめる都合の良い方法が用いられる。
なイムノアッセイ（例 １２６Ｉ固体相ラジ（１６） オイムノアッセイ）Ｋおけるぶどう球菌タンノくりＡｔ
−用いて、イムノグロブリン産生のテストをする０この
方法は、他のイムノグロブリンの検出が、特別のイムノ
グロブリンに対するＦｃの代゛９の抗体を用いることに
よって達成されるために、いくつかのイムノグロブリン
の診断となりうる０望ましいイムノグロブリンを産生ず
る培養ｌは、適当な栄養培地にクローン化する０ クローンの成長は、条件化培地との組み合わせ栄養培地
、フィーダー・レイヤーまたは類似物栄養培地のような
、いろいろ培地でなされる。フィーダー・レイヤーＶＣ
は、ヒトミ皮線維芽細胞フィーダー細胞、照射したヒト
胎児線維芽細胞、リンパ球、自然に存在するもしくは異
質遺伝的ヒトＰＢＬ、マウスリンバネ等細胞または類似
物を含む０望ましい抗体を産生ずるクローンが確立され
た後、不滅化、１ｇ産生細胞を常法での補助剤とともに
適当な培地を含む培養フラスコで成長（増殖）させ、抗
体は上澄みまたは細胞から採取抗体ｔ−５ａｔ−拒絶し
ないホスト、たとえば適当な霊長類または免疫系の不十
分なホストたとえばヌード・マウスの腹膜に注入し、腹
水金集めるかまたは血液中のイムノグロブリン會採取す
る。細胞上十分に成長させ、イムノグロブリンの生成を
生じせしめる都合の良い方法が用いられる。
いくつかの場合において、既知のリガンドに対する抗体
の生成に興味あるのみでなく、診断および／または治療
の目的のためにホスト生成する抗体を決定丁石ことであ
る。多くの場合、ホストによって生成された抗体は、興
味かあＶ、特に、癌、たとえば白血病およびリンパ騰、
自己免疫疾患、感染病および類似の疾患のような疾患を
有するホスト上挙げることができる。明らかに疾患にか
かっている期間、回復期、および回復後、患者の血液も
しくは血清をスクリーンする。Ｂ−リンパ球の源はホス
トおよび不滅化Ｉｇ産生細胞を生成用に、本発明に基づ
いて形質転換された細胞から得られる。細胞によって生
成し几Ｉｇｓは適当な抗原を用いてスクリーン化されう
る。いくつかの例において、記憶細胞を形質転換するこ
とが望ましい０不滅Ｉｇ産生細胞は、望ましい決定基位
置に対する抗体の直接生成よりも他のいろいろの目的の
ために用いられる。細胞は、決定基位置に対して特異的
であり、イムノグロブリンの鎖のためにコード化するｍ
ＲＮ Ａの多量を生成する。ｍＲＮＡはオリコンｄＴ
カラムを用いて他のＲＮＡと分別可能である。望ましい
ｍ ＲＮ Ａの存在は、 卵母細胞との好都合な方法に
おいて確立される。
の生成に興味あるのみでなく、診断および／または治療
の目的のためにホスト生成する抗体を決定丁石ことであ
る。多くの場合、ホストによって生成された抗体は、興
味かあＶ、特に、癌、たとえば白血病およびリンパ騰、
自己免疫疾患、感染病および類似の疾患のような疾患を
有するホスト上挙げることができる。明らかに疾患にか
かっている期間、回復期、および回復後、患者の血液も
しくは血清をスクリーンする。Ｂ−リンパ球の源はホス
トおよび不滅化Ｉｇ産生細胞を生成用に、本発明に基づ
いて形質転換された細胞から得られる。細胞によって生
成し几Ｉｇｓは適当な抗原を用いてスクリーン化されう
る。いくつかの例において、記憶細胞を形質転換するこ
とが望ましい０不滅Ｉｇ産生細胞は、望ましい決定基位
置に対する抗体の直接生成よりも他のいろいろの目的の
ために用いられる。細胞は、決定基位置に対して特異的
であり、イムノグロブリンの鎖のためにコード化するｍ
ＲＮ Ａの多量を生成する。ｍＲＮＡはオリコンｄＴ
カラムを用いて他のＲＮＡと分別可能である。望ましい
ｍ ＲＮ Ａの存在は、 卵母細胞との好都合な方法に
おいて確立される。
ｍ ＲＮ Ａは、５ａｃＤＮＡに対する鋳型として用い
られ、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼによってｄ
ｓＤＮＡｋ提供する。ｄｓ ｅＤＮＡの混合物は適当彦
ベクターにおけるクーロン化によって拡大し、拡大した
ｄｓ ｃＤＮＡは、ＲＮ、 Ａ １およびＤＮＡ検体を
用いてＨ鎖もしく＃：ＬＬ鎖のどちらかのＦｃ部分のコ
ード化する配列の存在のためにスクリーン化し、サウザ
ン法に従って、厳しい条件下に雑種化させる。
られ、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼによってｄ
ｓＤＮＡｋ提供する。ｄｓ ｅＤＮＡの混合物は適当彦
ベクターにおけるクーロン化によって拡大し、拡大した
ｄｓ ｃＤＮＡは、ＲＮ、 Ａ １およびＤＮＡ検体を
用いてＨ鎖もしく＃：ＬＬ鎖のどちらかのＦｃ部分のコ
ード化する配列の存在のためにスクリーン化し、サウザ
ン法に従って、厳しい条件下に雑種化させる。
望ましいＩｇ鎖ｔコード化するｄａ ｃＤＮＡは切断シ
、適当なエンドスフレアーゼを用いての制限１ライマー
修復ま九は発現ベクターに挿入できる（１９） ｄｓｃＤＮＡ全提供するｔめのイン・ビトロでの突然変
異誘発によって変えることができ、単細胞ホストにおい
て望ましいアミノ酸配列全生成できるＯＬおよびＨ鎖會
グリコシジル置換基全も九ないかまｔはもつＩｇｋ産生
する変性（再往）条件下（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏ
ｎｄｉｔｉｏｎ ） Ｋ接触せしめる０不滅化Ｉｇ産生
細胞は、イムノグロブリン會暗号化する遺伝子ｔもつク
ロモシームの源としても用いられる。細胞は、望ましい
イムノグロブリンを産生できるハイブリドーマを生成す
るためにメラノーマ細胞と融合させうる。好都合にも、
フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ ） は、望ましい抗体全
生成する異種細胞であり、より低いを椎動物、霊長動物
よりほかのを椎動物に導入できる。
、適当なエンドスフレアーゼを用いての制限１ライマー
修復ま九は発現ベクターに挿入できる（１９） ｄｓｃＤＮＡ全提供するｔめのイン・ビトロでの突然変
異誘発によって変えることができ、単細胞ホストにおい
て望ましいアミノ酸配列全生成できるＯＬおよびＨ鎖會
グリコシジル置換基全も九ないかまｔはもつＩｇｋ産生
する変性（再往）条件下（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏ
ｎｄｉｔｉｏｎ ） Ｋ接触せしめる０不滅化Ｉｇ産生
細胞は、イムノグロブリン會暗号化する遺伝子ｔもつク
ロモシームの源としても用いられる。細胞は、望ましい
イムノグロブリンを産生できるハイブリドーマを生成す
るためにメラノーマ細胞と融合させうる。好都合にも、
フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ ） は、望ましい抗体全
生成する異種細胞であり、より低いを椎動物、霊長動物
よりほかのを椎動物に導入できる。
抗体は、イン・ビボおよびイン・ビトロで組織学、細胞
学、イムノアッセイ、診断、治療および類似物に・おい
て、多様な方法で用いられる０多くの目的のために、抗
体を共有的または非共有的に標識、特にシグナル、粒子
ｐよび細胞會提供する標識のような広範囲の物質に接合
させる。
学、イムノアッセイ、診断、治療および類似物に・おい
て、多様な方法で用いられる０多くの目的のために、抗
体を共有的または非共有的に標識、特にシグナル、粒子
ｐよび細胞會提供する標識のような広範囲の物質に接合
させる。
（２０）
標識ＶＣは放射性核種９色素、螢光体、化学ルミネッセ
ンス体、酵素、基質、補因子、天然に存在する受容体訃
よびリガンド、および類似物が含まれる。粒子には、磁
気粒子、螢光粒子、有孔ラテックス粒子および類似物が
含まれる。細胞には、羊赤血球、Ｓ、アウレウス（ａｕ
ｒｅｕｓ ）細胞または特別な性質または機能をもつ他
の細胞系統を含む。
ンス体、酵素、基質、補因子、天然に存在する受容体訃
よびリガンド、および類似物が含まれる。粒子には、磁
気粒子、螢光粒子、有孔ラテックス粒子および類似物が
含まれる。細胞には、羊赤血球、Ｓ、アウレウス（ａｕ
ｒｅｕｓ ）細胞または特別な性質または機能をもつ他
の細胞系統を含む。
Ｂ−リンパ球の直接形質輯換に用いられるＥＢＶの従来
の実験に比して、形質転換のより高い効率が、細胞−ド
ライブＥＢＶ形質転換の目的のために転移細胞を用いて
達成され、従来観察されるよりも形質転換された細胞の
より高い部分が、ＩｇＭに対照をなして、ＩｇＧｔ＝産
生ずる。
の実験に比して、形質転換のより高い効率が、細胞−ド
ライブＥＢＶ形質転換の目的のために転移細胞を用いて
達成され、従来観察されるよりも形質転換された細胞の
より高い部分が、ＩｇＭに対照をなして、ＩｇＧｔ＝産
生ずる。
次に実施例は、本発明上例示しており、本発明を制限す
るものではない。
るものではない。
実施例
ＡＣＤ抗−凝固剤（アデニン−シトレート−デキストロ
ース）を含む採血した新鮮なヒト末梢血液上滅菌等張食
塩水１：１の割合で室温のもとで希釈する。希釈血液（
２５ｒｐｔｌ）ｋ滅菌管でリンパ球分離媒質（１０ｍ１
）（ＬＳＭ、 リツトン ピオネテックス）のクッショ
ン上に重層させる。管全室温のもとで、４００）ｌで２
５分間遠心分離する。細胞のリンパ球／単核細胞画分を
界面＋１ＬＳＭ答積から集める。集めた細胞は無血清Ｒ
ＰＭ１１６４０で３倍に希釈し、室温のもとて２００Ｘ
、９で１０分間遠心分離する。得られた細胞ペレットは
無血清ＲＰＭ１１６４０で３回洗浄し、洗浄した細胞は
、血球計算盤およびトリパンブルー生体色素の方法でカ
ウントする。
ース）を含む採血した新鮮なヒト末梢血液上滅菌等張食
塩水１：１の割合で室温のもとで希釈する。希釈血液（
２５ｒｐｔｌ）ｋ滅菌管でリンパ球分離媒質（１０ｍ１
）（ＬＳＭ、 リツトン ピオネテックス）のクッショ
ン上に重層させる。管全室温のもとで、４００）ｌで２
５分間遠心分離する。細胞のリンパ球／単核細胞画分を
界面＋１ＬＳＭ答積から集める。集めた細胞は無血清Ｒ
ＰＭ１１６４０で３倍に希釈し、室温のもとて２００Ｘ
、９で１０分間遠心分離する。得られた細胞ペレットは
無血清ＲＰＭ１１６４０で３回洗浄し、洗浄した細胞は
、血球計算盤およびトリパンブルー生体色素の方法でカ
ウントする。
ＡＥＴ−８ＲＢＣ（アミノエチルイソチオウロニウムブ
ロマイドー羊赤血球）ｈ、Ｅ−ｏゼット化によるＴ−細
胞沈澱における使用のために準備する。１．２５ Ｘ
７會含む洗浄したＰＢＬ（２ｔ／）、ＡＥＴ−８ＲＢＣ
（１０％懸濁）５０：１の割合（０，２５ｍ１）、およ
びＲＰＭ１１６４０−１５チ胎内牛血清（Ｆｅ２ ）（
２，２５ｍ１）の混合物を準備し、４℃のもとで、２０
０Ｘ、１７で５分間遠心分７離する。４℃のもとて２時
間培養した後、ベレット會穏やかに再懸濁し、４℃のも
とて管につき約２ｍｌＬＳＭで下層にし、４℃のもとで
４００ Ｘ ９で２０分間超６分離する。得られ之Ｔ−
細胞−除去Ｐ Ｂ Ｌ （Ｅ−Ｐ ＢＬ）全界面で集め
る。Ｅ−ＰＢＬ全室温で無血清ＲＰＭ１１６４０で３回
洗浄し、細胞は血球計算盤およびトリパンブルー生体色
素音用いてカウントする。
ロマイドー羊赤血球）ｈ、Ｅ−ｏゼット化によるＴ−細
胞沈澱における使用のために準備する。１．２５ Ｘ
７會含む洗浄したＰＢＬ（２ｔ／）、ＡＥＴ−８ＲＢＣ
（１０％懸濁）５０：１の割合（０，２５ｍ１）、およ
びＲＰＭ１１６４０−１５チ胎内牛血清（Ｆｅ２ ）（
２，２５ｍ１）の混合物を準備し、４℃のもとで、２０
０Ｘ、１７で５分間遠心分７離する。４℃のもとて２時
間培養した後、ベレット會穏やかに再懸濁し、４℃のも
とて管につき約２ｍｌＬＳＭで下層にし、４℃のもとで
４００ Ｘ ９で２０分間超６分離する。得られ之Ｔ−
細胞−除去Ｐ Ｂ Ｌ （Ｅ−Ｐ ＢＬ）全界面で集め
る。Ｅ−ＰＢＬ全室温で無血清ＲＰＭ１１６４０で３回
洗浄し、細胞は血球計算盤およびトリパンブルー生体色
素音用いてカウントする。
ヒトリンパ芽球細胞（１７ｍ１）ｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ
ｃｅｌｌ）系ＧＭ１５００（ヒト遺伝突然変異細胞貯
蔵所。
ｃｅｌｌ）系ＧＭ１５００（ヒト遺伝突然変異細胞貯
蔵所。
キャンデン、二ニーシャーシー）？エチルメタンスルフ
ォネート（シグマ、３００μｆｉ／ｒｔｔｌ）全台す培
地で２４時間培養する。エチルメタンスルフォネートに
よる突然変異誘発後、生き残りの細胞を、プリン同族体
、６−チオグアニン（６ＴＧ）の増加した濃度中に副次
培養する。数カ月後、生長刀のある増殖した突然変異細
胞系を確立することができ、ＨＡＴ補足培地では死滅し
、ＩＡ２と名づける。クローン化細胞系Ｉ Ａ２ｒ！、
１９８２年３月２６日、ＡＴＣＣに（登録番号ＣＲＬ−
８１１９）保存されて贋る１、
□ＩＡ２細胞全対数期培養から採取し、無血
清（２３） ＲＰＭ１１６４０で一回洗浄する。Ｅ−Ｐ Ｂ Ｌおよ
びＩＡ２細胞全２：１の割合で混合し、室温の龜とで１
６０Ｘ＃で５分間遠心分離する。細胞ペレットｋＲＰＭ
Ｉ １ ｆｉ４０−１５４ＦＣ８，１ｍＭピルビン酸ナ
トリウム、２ｍＭＬ−グルタミンお！びＨＡＴ （Ｈ−
Ｉ Ｘ １０−’Ｍ： Ａ−ｌＸｌ０−’Ｍ；Ｔ −４
Ｘ １０−’ Ｍ ）の混合物で３７℃のもとて再懸濁
する０酸終的凌二次濃度（５ｕｈｃｏｎｃｅｎｔｔａｔ
ｉｏｎ）は、Ｅ−ＰＢＬＫ対シテ、４×１０１′細胞／
ｒｉｇそシテＩＡ２に対して２Ｘ１０’細胞／ｒｔｔｅ
である。９６ウエルマイクロタイトプレートのウェルに
、２００μｊ入れ、３７℃、６チ炭酸ガスのもとで培養
し、上記載のように隔日に、ＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ
培地を供給する。１０−１４日後、細胞系にあられれ、
増殖する。
ォネート（シグマ、３００μｆｉ／ｒｔｔｌ）全台す培
地で２４時間培養する。エチルメタンスルフォネートに
よる突然変異誘発後、生き残りの細胞を、プリン同族体
、６−チオグアニン（６ＴＧ）の増加した濃度中に副次
培養する。数カ月後、生長刀のある増殖した突然変異細
胞系を確立することができ、ＨＡＴ補足培地では死滅し
、ＩＡ２と名づける。クローン化細胞系Ｉ Ａ２ｒ！、
１９８２年３月２６日、ＡＴＣＣに（登録番号ＣＲＬ−
８１１９）保存されて贋る１、
□ＩＡ２細胞全対数期培養から採取し、無血
清（２３） ＲＰＭ１１６４０で一回洗浄する。Ｅ−Ｐ Ｂ Ｌおよ
びＩＡ２細胞全２：１の割合で混合し、室温の龜とで１
６０Ｘ＃で５分間遠心分離する。細胞ペレットｋＲＰＭ
Ｉ １ ｆｉ４０−１５４ＦＣ８，１ｍＭピルビン酸ナ
トリウム、２ｍＭＬ−グルタミンお！びＨＡＴ （Ｈ−
Ｉ Ｘ １０−’Ｍ： Ａ−ｌＸｌ０−’Ｍ；Ｔ −４
Ｘ １０−’ Ｍ ）の混合物で３７℃のもとて再懸濁
する０酸終的凌二次濃度（５ｕｈｃｏｎｃｅｎｔｔａｔ
ｉｏｎ）は、Ｅ−ＰＢＬＫ対シテ、４×１０１′細胞／
ｒｉｇそシテＩＡ２に対して２Ｘ１０’細胞／ｒｔｔｅ
である。９６ウエルマイクロタイトプレートのウェルに
、２００μｊ入れ、３７℃、６チ炭酸ガスのもとで培養
し、上記載のように隔日に、ＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ
培地を供給する。１０−１４日後、細胞系にあられれ、
増殖する。
クローナル系は、正常ジブロイドナンバー、４６クロモ
ゾーム會誉むことが見いだされた。細胞は、免疫螢光、
フルオレセイン−接合Ｆ （ａｂ”）、 抗−ヒトＩｇ
ｋ用いて検出されたように、ヒト界面イムノグロブリン
？有する。細胞は、ＩＡ２細胞系の（２４） 場合のように、エプスタイン−バール核抗原を含むこと
が見い出される。
ゾーム會誉むことが見いだされた。細胞は、免疫螢光、
フルオレセイン−接合Ｆ （ａｂ”）、 抗−ヒトＩｇ
ｋ用いて検出されたように、ヒト界面イムノグロブリン
？有する。細胞は、ＩＡ２細胞系の（２４） 場合のように、エプスタイン−バール核抗原を含むこと
が見い出される。
無差別に選択したウェルからの形質転換したＢ−細胞培
養地の上澄みを沈澱およびドデシルスノトフェートポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
によってイム、ノグロプリンの存在の数値を求める。テ
ストしたすべての上置みは、１つもしくにそれ以上のヒ
トモノクロナールイムノグロブリンを含む。ＩｇＧおよ
びＩｇＭの生１！憾注目すべきである。繰り返しの実験
において、異なったＰＢＬｋ用いて、この結果は再現さ
れる。ＩｇＧ生成は、無差別にテストしたウェルの大部
分から検出される。クローン化Ｂ−細胞系由来の上澄み
の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各々一つのモノクロナール
イムノグロブリン會産生することを示めす。
養地の上澄みを沈澱およびドデシルスノトフェートポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
によってイム、ノグロプリンの存在の数値を求める。テ
ストしたすべての上置みは、１つもしくにそれ以上のヒ
トモノクロナールイムノグロブリンを含む。ＩｇＧおよ
びＩｇＭの生１！憾注目すべきである。繰り返しの実験
において、異なったＰＢＬｋ用いて、この結果は再現さ
れる。ＩｇＧ生成は、無差別にテストしたウェルの大部
分から検出される。クローン化Ｂ−細胞系由来の上澄み
の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、各々一つのモノクロナール
イムノグロブリン會産生することを示めす。
ウェルにつき８Ｘ １０’ Ｅ−ＰＢＬがプレートされ
、共−培養に対する形質転換体の収率（ｙｉｅｌｄ）に
、再現できるとして、８０，０ＯＯＫつき１以上である
（得られた結果は収率が１０，０００につき１またはそ
れより良い）０一方すべての上澄みはモノクロナールイ
ムノグロブリンを含み、イムノグロブリンの量は、単一
の最初のウェル由来の嵌クローン間で一様ではない。
、共−培養に対する形質転換体の収率（ｙｉｅｌｄ）に
、再現できるとして、８０，０ＯＯＫつき１以上である
（得られた結果は収率が１０，０００につき１またはそ
れより良い）０一方すべての上澄みはモノクロナールイ
ムノグロブリンを含み、イムノグロブリンの量は、単一
の最初のウェル由来の嵌クローン間で一様ではない。
ヒトｒ鎖に対する特異的ラジオイムノアッセイは、４８
時間対数基培地および４日目にクロ−ナル系のより高い
培地・ｍ度からの上澄み液のＩｇＧ量の測定するために
用いられる。４８時間で５０ ３’５０ ｎｇ’ｒｎｌ
！ ＩｇＧが産生され、一方、同じ細胞のより高い培地
密度Ｌｒ１８μｇ／１ｔｌＶｃまでなる。
時間対数基培地および４日目にクロ−ナル系のより高い
培地・ｍ度からの上澄み液のＩｇＧ量の測定するために
用いられる。４８時間で５０ ３’５０ ｎｇ’ｒｎｌ
！ ＩｇＧが産生され、一方、同じ細胞のより高い培地
密度Ｌｒ１８μｇ／１ｔｌＶｃまでなる。
４力月以上の培養後、再検査で、クローン化した形質転
換体は、イムノグロブリンの質ま九は分類においていか
なる変化もない。
換体は、イムノグロブリンの質ま九は分類においていか
なる変化もない。
ヒトＢ−細胞の上澄み−イニシエーターＥＢＶ形質転換
の特性に比較した場合、細胞−ドライブ工程の技術は、
いくつかの明らかな有利な点を有する。第一に形質転換
体の出現速度がはやい７゜ＩＡ２細胞系および１２の異
なる正常ＰＢＬ供与体を用いての１２の独立し７Ｉ！：
実験によって、各々の場合、新しく生成した形質転換体
ｒｉＩＯ−１４日間に７５％集合体（ｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｃｙ ）に増殖する。
の特性に比較した場合、細胞−ドライブ工程の技術は、
いくつかの明らかな有利な点を有する。第一に形質転換
体の出現速度がはやい７゜ＩＡ２細胞系および１２の異
なる正常ＰＢＬ供与体を用いての１２の独立し７Ｉ！：
実験によって、各々の場合、新しく生成した形質転換体
ｒｉＩＯ−１４日間に７５％集合体（ｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｃｙ ）に増殖する。
更に、観察さｎた細胞−ドライプ形質転換の効率は実質
的！／ｃｒｉより高い。５Ｏ８−ＰＡＧＥ−分析および
得られるクローン化研究から、２００形質転換された系
の平均が、８ｘｌＯ’Ｅ−ＰＢＬＫつき、たとえば４０
．Ｏｏ ＯＥ−ＰＢＬＣツｌ Ｉ Ｂ細胞系でで産生さ
れることが計算できる０単核細胞が除去されるので、こ
れらの１！験における効率は、より高−０更に、ＥＢＶ
形質転換のＩＡ２細胞−ト°ライプ方法を用いて、クロ
ーンの平均６０憾がモノクロナールＩｇＧ′ｔ−生成す
る。ブラウンおよびミラー（Ｊ、ｌｍｍ１２８巻、２４
ページ（１９８２））は、正常成熟ＰＢＬの形質転換の
ために１００倍ＫＩＩ１１縮したＥＢＶ−含有上澄みを
用いた場合、三回の試験において、再生し几クローンの
１６１が１１ｒＧｔ−産生することｔ報告している０上
記の結果からも明らかなように、効果のある新しい方法
が先決（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ）リガンドまた
は決定基位置に対するモノクロナール抗体の安定な源を
生成するために提供されうる０本発明に係る方法は、当
該分野における従来の（，２７） 方法よりいくつかの有利な点を挙げることができる。Ｅ
ＢＶによる形質＠換によって、安定な不滅細胞が得られ
る。得られた不滅Ｉｇ産生細胞は、興味あるイムノグロ
ブリン全コード化する遺伝子を退行（回４Ｉ）または脱
落しない。目的とした不滅化Ｉｇ産生細胞が、各々親由
来の鎖ｔもつイムノグロブリンを生成する可能性ま友は
ハイプリドーマで実験し友ように、ミエローマ親由来の
鎖で汚染されている可能性ｒ！ない。本発明に係るａ胞
は、望ましいイムノグロブリンを長朋閲産生する。
的！／ｃｒｉより高い。５Ｏ８−ＰＡＧＥ−分析および
得られるクローン化研究から、２００形質転換された系
の平均が、８ｘｌＯ’Ｅ−ＰＢＬＫつき、たとえば４０
．Ｏｏ ＯＥ−ＰＢＬＣツｌ Ｉ Ｂ細胞系でで産生さ
れることが計算できる０単核細胞が除去されるので、こ
れらの１！験における効率は、より高−０更に、ＥＢＶ
形質転換のＩＡ２細胞−ト°ライプ方法を用いて、クロ
ーンの平均６０憾がモノクロナールＩｇＧ′ｔ−生成す
る。ブラウンおよびミラー（Ｊ、ｌｍｍ１２８巻、２４
ページ（１９８２））は、正常成熟ＰＢＬの形質転換の
ために１００倍ＫＩＩ１１縮したＥＢＶ−含有上澄みを
用いた場合、三回の試験において、再生し几クローンの
１６１が１１ｒＧｔ−産生することｔ報告している０上
記の結果からも明らかなように、効果のある新しい方法
が先決（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ）リガンドまた
は決定基位置に対するモノクロナール抗体の安定な源を
生成するために提供されうる０本発明に係る方法は、当
該分野における従来の（，２７） 方法よりいくつかの有利な点を挙げることができる。Ｅ
ＢＶによる形質＠換によって、安定な不滅細胞が得られ
る。得られた不滅Ｉｇ産生細胞は、興味あるイムノグロ
ブリン全コード化する遺伝子を退行（回４Ｉ）または脱
落しない。目的とした不滅化Ｉｇ産生細胞が、各々親由
来の鎖ｔもつイムノグロブリンを生成する可能性ま友は
ハイプリドーマで実験し友ように、ミエローマ親由来の
鎖で汚染されている可能性ｒ！ない。本発明に係るａ胞
は、望ましいイムノグロブリンを長朋閲産生する。
形質転換のｔめにＥＢＶの使用と比すると本発明に係る
方法は、形質転換される受容細胞の数に訃いてもっと効
率が良い。従って、本発明に係る方法は、患者のＢ −
ＩＪンバ球フレパートリのスクリーンとして、特に免疫
系が腫瘍もしくは病原体の存在ま９たは自己免疫疾患に
よるもので作動した場合、用いることを可能である。Ｅ
ＢＶ形′Ｘ転換による従来の結果と比較して、不滅化Ｉ
ｇ産生細胞の高率がＩｇＭよりむしろＩｇＧｋ産生する
。ＩｇＭは一般的にＩｇＧより同族リンガントに対して
低い’（２８） 親和力をもち多くの目的には、ＩｇＭは有用ではないＯ 本発明に係る方法は、簡単であり、再現性が良く、安全
であり、および効率が良く、ならびにＥＢＶＫ対するホ
ストＩｇｔ生成できるいかなる細胞でも使用すゐことが
できる０ 前記のように本発明を実施例および例示に従って具体的
に説明したけれども本発明の範囲はこれらの実施例およ
び例示に限定する５ものではない０％軒出願人 ジェネティック システムズ コーポレイシ１ン 特許出願代理人 弁理士 實 木 朗 弁理士 西 舘 和 之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之 手続補正書（自発） 昭和５８年５月２７日 特許庁長官 着杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５８年 特許願 第Ｏり１７５３号２、発明の名
称 真核生物における細胞−ドライブウィルス性伝達（転移
） ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ジェネティック システムズ コーボレイシ曹
ン４、代理人 （外 ３ 名） ５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 明細書第２２頁第１４行目 ｒｌ、２５Ｘ７Ｊをｒ １．２５ Ｘ １０’Ｊに補正
する。
方法は、形質転換される受容細胞の数に訃いてもっと効
率が良い。従って、本発明に係る方法は、患者のＢ −
ＩＪンバ球フレパートリのスクリーンとして、特に免疫
系が腫瘍もしくは病原体の存在ま９たは自己免疫疾患に
よるもので作動した場合、用いることを可能である。Ｅ
ＢＶ形′Ｘ転換による従来の結果と比較して、不滅化Ｉ
ｇ産生細胞の高率がＩｇＭよりむしろＩｇＧｋ産生する
。ＩｇＭは一般的にＩｇＧより同族リンガントに対して
低い’（２８） 親和力をもち多くの目的には、ＩｇＭは有用ではないＯ 本発明に係る方法は、簡単であり、再現性が良く、安全
であり、および効率が良く、ならびにＥＢＶＫ対するホ
ストＩｇｔ生成できるいかなる細胞でも使用すゐことが
できる０ 前記のように本発明を実施例および例示に従って具体的
に説明したけれども本発明の範囲はこれらの実施例およ
び例示に限定する５ものではない０％軒出願人 ジェネティック システムズ コーポレイシ１ン 特許出願代理人 弁理士 實 木 朗 弁理士 西 舘 和 之 弁理士 石 １） 敬 弁理士 山 口 昭 之 手続補正書（自発） 昭和５８年５月２７日 特許庁長官 着杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５８年 特許願 第Ｏり１７５３号２、発明の名
称 真核生物における細胞−ドライブウィルス性伝達（転移
） ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ジェネティック システムズ コーボレイシ曹
ン４、代理人 （外 ３ 名） ５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 明細書第２２頁第１４行目 ｒｌ、２５Ｘ７Ｊをｒ １．２５ Ｘ １０’Ｊに補正
する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｌ 伝達細胞として、ＥＢＶ形質転換細ｌ１ｉＩヲ用い
て受容イムノグロブリン産生細胞を不滅化する方法にお
いて、該方法が、該伝達および該受容細胞を機能Ｔ−細
胞の実質的な不在下′に共−培養し、該受容細胞を不滅
化Ｉｇ産生細胞にすること、および該伝達細胞の仮想不
在に該不滅化Ｉｇ産生細ｍｔ−クローン化することｔ含
んでなる方法ワ２、該共−培養およびり一ローン化の少
なくても一方が該伝達細胞に対する選択的細胞毒素の存
在下にある特許請求の範囲第１項、記歳の方法。 ３、該伝達細胞が、ＨＡＴ感受性であり、該選択的細胞
毒素がＨＡＴである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ＝４．該受容細胞が、該共培養ＩＷＶｃリガンドで処理
される特許請求の範囲第１項記載の方法〇５、該受容細
胞が、疾病ホスト由来である特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ６、先決決定基位置に対する特異イムノグロブリン（”
Ｉｇ”）を産生する方法において、細胞毒素選択的条件
下に、伝達細胞として、該選択的条件に鋭敏なＥＢＶ形
質転換細胞および受容細胞として、該決定基位置を含６
免疫原にょらて活性化されたＢ −１３ンパ球を接触せ
しめること：該受容細胞の形質転換にお１て不滅化Ｉｇ
産生細胞の産生および該鋭敏な細胞の死滅せしめるとと
；得られた不滅化Ｉｇ産生細胞を各々のウェルにおける
適当な栄養培地で増殖させ、得られたクローンから望ま
しいイムノグロブリンの生成用の選択をすること：およ
び望ましいクローンからの上澄みから望ましいイムノグ
ロブリンを採取することｔ含んでなる方法。
・ ７、該選択的条件がＨＡＴ培地である特許請求の範囲！
６項記載の方法。 ・８、該望ましい
イムノグロブリンを生成する該夛ローンｔ、゛抗体を含
む腹水液を産壺する九めに該クローンを受容できるホス
トの腹膜に注入し、該腹水液全採取する特許請求の範囲
第６項または第７項記載め方法。 、 １ ゝ 。 ９、該望まし艷イムノグロブリン會産生する該クローン
を該クローン會受容できるホストに注入し、該ホストの
血液から該イ、ムイグロプリン全抽出する付加的な工程
を含む特許請求の範囲第６項または第７項記載の方法。 １０、該イムノグロブリンがＩｇＧである特許請求の範
囲第６項ま九は第７項記載の方法０１ｔ 該イムノグ
ロブリンがＩｇＭである特許請求の範囲第６項または第
７項記載の方法。 １２、該イムノグロブリンがＩｇＡである特許請求の範
囲第６項またＦ１１！７項記載の方法０１３、該イムノ
グロブリンがＩｇＥである特許請求の範囲＄６項または
第７項記載の方法。 １４、該イムノグロブリンがＩｇＤである特許請求の範
囲＄６項または第７項記載の方法０１５、先決決定基位
置に対する特異イムノグロブリンじＩｇ”） ｋ産生ず
る方法において、細胞毒素（３） 、ＨＡＴ選択的条件下に、伝達細胞としてＨＧＰＲＴ恣
失ＥＢＶ形質転換細胞および受答細胞として該決定基位
置を含む免疫原によって活性化されたＢ−リンパ球と密
智させて接触せしめること：該受容細胞全不滅化Ｉｇ産
生細胞に形質転換させ、該ＨＧＰＲＴ欠失細胞全死滅せ
しめること：限界希釈条件下ＫＨＡＴ培地に生育した細
胞會増殖させ、該決定基位ｔｌｔＫ対する特異グロブリ
ンを産生ずるクローンを選択すること；および選択した
クローンを増殖させ、該クローンによって産生された該
イムノグロブリンを分離することを含んでなる方法。 １６、該伝達細胞がＩＡ２である特許請求の範囲第１５
項記載の方法。 １７、該イムノグロブリンがＩｇＧである特許請求の範
囲第１５項記載の方法。 １８．１１２と名づけらルたヒ）ＥＢＶ形質転換した細
胞０
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/365,218 US4464465A (en) | 1982-04-05 | 1982-04-05 | Cell-driven viral transfer in eukaryotes |
| US365218 | 1982-04-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201723A true JPS58201723A (ja) | 1983-11-24 |
| JPH0255040B2 JPH0255040B2 (ja) | 1990-11-26 |
Family
ID=23437966
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58051753A Granted JPS58201723A (ja) | 1982-04-05 | 1983-03-29 | イムノグロブリンの製造方法 |
| JP62270483A Granted JPS63126484A (ja) | 1982-04-05 | 1987-10-28 | 真核生物細胞の形質転換方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62270483A Granted JPS63126484A (ja) | 1982-04-05 | 1987-10-28 | 真核生物細胞の形質転換方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4464465A (ja) |
| EP (1) | EP0090898B1 (ja) |
| JP (2) | JPS58201723A (ja) |
| CA (1) | CA1187010A (ja) |
| DE (1) | DE3276706D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS6169796A (ja) * | 1984-05-25 | 1986-04-10 | ジエネテイク システムズ コ−ポレイシヨン | ヒトモノクロ−ナル抗体 |
| JPS63500035A (ja) * | 1985-06-06 | 1988-01-07 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレイシヨン | プソイドモナス アエルギノサ 外毒素ａに対する保護用ヒトモノクロ−ナル抗体 |
| JPS6467199A (en) * | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Agency Ind Science Techn | Human igg1 type monoclonal antibody, production thereof and hybridoma capable of producing said antibody |
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- 1982-04-05 US US06/365,218 patent/US4464465A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-11-25 CA CA000416400A patent/CA1187010A/en not_active Expired
- 1982-12-14 DE DE8282306667T patent/DE3276706D1/de not_active Expired
- 1982-12-14 EP EP82306667A patent/EP0090898B1/en not_active Expired
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1983
- 1983-03-29 JP JP58051753A patent/JPS58201723A/ja active Granted
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1987
- 1987-10-28 JP JP62270483A patent/JPS63126484A/ja active Granted
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|---|---|
| EP0090898A3 (en) | 1984-03-28 |
| US4464465A (en) | 1984-08-07 |
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| DE3276706D1 (en) | 1987-08-13 |
| JPH0563154B2 (ja) | 1993-09-09 |
| EP0090898A2 (en) | 1983-10-12 |
| JPS63126484A (ja) | 1988-05-30 |
| CA1187010A (en) | 1985-05-14 |
| EP0090898B1 (en) | 1987-07-08 |
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