JPS5824594A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミドｐｌＶＨ１　、およびストレプトマ
イ竜テスのＤＮＡを他Ｏ黴生物、ｑ＃κストレプトマイ
セテス（　８ｔｒ＠ｐｔｏｍｙｃ＠ｔｅｓ　）の別０’
ｌＭＫ伝達しうる雑種（ハイプリド）ベクターＯ調製ヘ
のその使用に関する。

ドイツ特許出願公開第へｏｏ翫２２６号明細書の記載か
ら、ストレプトマイセス・エスビノズス（８ｔｒ＠ｐｔ
ｏｍｙｃｅａ　ｅｓｐｉｎｏａｕｇ＋　）の培養物から
プラスミドｐＵＣ６が取得されうろことは知られている
。

さらＫ　ＰＣＴ％許出願第７９１０１１６９号明細書に
よれば、数種のストレプトマイセスｋ　ＤＮＡを導入す
るためのベクターとして適当であると考えられるプラス
ンドがストレプトマイセス・リビダンス（ａｔ、Ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ　）から取得されうることも知られ【いる。

これらの事実から、抗生物質形成性ストレプトマイセス
種への遺伝子技術方法の適用には特別な意味があること
が認識できる。しかしながら、大抵の従来既知のプラス
ミドは実際上の使用にはあまり重要視されなかった。何
故ならばこれらは比較的大量には容易に調製されなかっ
たからである。他方、１細胞当り多数のコピーにて存在
するプラスミド（マルチ；ピープラスンド）そクローン
化された遺伝子の増幅のためのベクターとして適度に使
用される場合には、そのプラスミドを入手し５ることは
遺伝子技術操作にとって非常に重要である。

抗生物質の調製に使用されるストレプトマイセス株を抗
生物質の形成量を増大させる目的で遺伝的に改良するこ
とは重要゛な課題である。しかしながら、相互に関連し
ない種でしばしば観察されるように、宿主細胞としズ用
いられているストレプトマイセス種から再び即座に脱離
されないプラスンドが入手できる場合にのみ遺伝子技術
方法を用いて効果的に解決される。

従って、ストレプトマイセス株を遺伝的に改良する。た
めのベクターとして適当な容易に単陣でき且つ細胞中で
安定に存在するマルチコビープ２スＺドを見出すという
課題があった。この課題は他のストレプトマイセス種中
において適当なプラスンドを同定できる場合に最も容易
に解決できることは明白である。

今やストレプトマイセス・ベネズエラ（８ｔ。

ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）　Ｄ８Ｍ４０７５５の培養物か
ら取得される分子量＆４メガダルトン、外形長さ４．１
　μｍを有しそして１２．６キロ塩基対合（＝ｃｂ　）
からなるプラスミドｐ８ＶＥ１によりこの課題が解決さ
れることが示された。

これに使用されるストレプトマイセス・ベネズエラの菌
株はＬＪｔｔｌｉｎｇｅｒ氏等の１Ａｒｃｈ、Ｍｌｌｃ
ｒｏｔｎｏｌＪ第３１巻館３２６〜６第３買 頁以降に詳細に記載されている．更に詳細はＲ０Ｈｕ＠
ｔｔｅｒ氏著［８ｙｓｔｅｍａｔｉｋ　ｄｅｒ　８ｔｒ
＠ｐｔｏｍｙａｅｔｅｎ　Ｊ（　Ｋａｒｇ＠ｒ出版１９
６７年発行）第６０頁に見出される。

ストレプトマイセス・ベネズエラＤＡＭ　４０７５５は
まず第一にプラスミドの優れた供給体とみなされる。何
故ならば、これにはその８，４メガダルトンなる低い分
子量のゆえに遺伝子技術操作の実施に特に良好に適する
２０個よりはるかに多数のプラスミドが各細胞中に存在
するからである。

ストレプトマイセス・ベネズエラＤＡＭ　４０７５５か
らのプラスミドの単離はそれ自体既知の方法により遂行
される。はじめに菌株をグリシンを含有する追歯な培地
中で培養する．菌糸体を収穫し、洗滌しそして均質化し
た後、細胞壁をリゾチームを用いてとり除く。細胞をプ
ロテイナーゼにおよびドブクル硫酸ナトリウムで処理し
た後に細胞が溶解し，従って細胞残分および染色体ＤＮ
Ａが遠心分離により分−されうる。次にプラスミドをポ
リエチレングリコールで沈殿させそしてＨ，Ｃ，Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍおよびＪ、Ｄｏｌｙ両氏のｐ。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄａ　Ｒａｇ、Ｊ第７巻第１５１５〜
１５２５　　頁（１９７５年）記載の方法による迅速調
査のためＫｖｋ処理する。かくして濃縮されたプラスオ
ドｐｓｖＨ１は直ちに分析調査に使用できそして制限エ
ンドヌクレアーゼでの処理に付されうる。純粋な調製は
２回連続するセシウムクｒｙ９イド密度勾配遠心分離に
より達成され５る。

かくして得られたプラスミドｐ８ＶＥ　１はアガロース
ケル上で制限酵素を用いてエンドヌクレアーゼ的に解裂
させるととにより特性化されうる。

この方法によりそれぞれのｐ８ＶＨ１７ラグメントの数
および寸法が識別されうる。このプラスミドｐ８Ｖ′Ｈ
ｉにとって特−徹的なことは、それが制限エンドヌクレ
アーゼＩＥｃｏ　Ｒ７％Ｈ１ｎｄ　ｍ、Ｘｂａ　１およ
びＨｐａ　１に対して何ら切断部位を有せず、制限エン
ドヌクレアーゼＰａｔ　ＩおよびＢａｔＩ　ｋよって１
個所のみ切断され、ｘｈｏｘ＜よって長さｚ６および４
．９ｋｂを有する２個のフラグメントに切断され、　Ｃ
ＬａＩによつ【長さ１ｔ８およびα８　ｋｂを有する２
個の７ラグメントに切断され、Ｂｇｊ　ＩＩ　Ｋ　Ｊ：
　ツテ長す７．５．２．１１ｒ、［Ｆ２．４ｋｂを有す
る３個のフラグメントに切断され、そしてＢａＪ２１Ｈ
Ｉ　ＪＣよって長さｚ７、ｚＯ１ｔ８および１２ｋｌ）
を有する４個の７ラグメントに切断されることである。

さらに、これら酵素のいくつかの切断部位は環状形のプ
ラスミド分子上で相互に測定された（添付図面参照）。

加えて、Ｐｖｕ　ＩＩおよびＫｐｎ　Ｉを用いるエンド
ヌクレアーゼ的解裂により４個の７ラグメント、Ｎｒｕ
　Ｉ、Ｐｖｕ　Ｉおよび８ａｃ　Ｉを用いて５個の７ツ
グメント、８εｔｎおよび８ａｃ　ｎを用いて７個のフ
ラグメン）　、８ｓｔ■を用いて８個の７ラグメント、
そして５ａｔ１を用いて１０個よりはるかに多数のフラ
グメントが生ずる。

多数のプラスミドについての外形測定で寸法４．１μｍ
およびそれから導かれる分子量８６２３メガダルトンが
得られた。この値はゲル電気泳動により分離した後の制
限７ラグメント重量を加算して計算された分子量（＝　
８．４メガ〆ルトン）とよく一致する。同じかまたは類
似のプラスミドはこれまで何ら他のストレプトマイセス
・ベネズエラ純型において見出されなかった（Ｖ、Ｓ。

Ｍａ　１１　ｋおよびＦ、Ｒ＠ｕｓｅｒ　両氏「Ｐｌａ
ｓｍｉｄ　Ｊ第２巻第６２７〜３１頁（１９７９年）参
照〕。

プラスミドｐ８ＶＨ１はベクターＱ南軟いくっかの理由
で非常に適している。まず第一に１細胞当り２０よりは
るかに多いプラスオドなる極度に高いコピー数およびそ
の安定性は遺伝子技術上の操作にｐ　５Ｖｌ（１を使用
するための非？Ｆｆｋ重要な要件である。従来、ストレ
プ）−ｒイセス・ベネズエラＤ８Ｍ４０７５５でプラス
きドのない菌株は広範囲の研究にもかかわらず観察゛さ
れなかった。プラスミドの単離に際してはストレプトマ
イセスの原初培養液１７６りで計算して２００μｇ以上
の収量が常に収穫される。

プラスミドｐ８ＶＨ１はなかんずく他のストレプトマイ
セスに導入されうる雑種ベクターの形成に適する。これ
は従来知られているすべてのプラスきドが比較的小数の
宿主細胞においてしか確立され得ないことが見出されて
いるからである。従って例えばグラム陽性細菌とグシム
隙性細菌との間には外来ＤＮＡの増殖に対する障壁が存
在することが知られる（　Ｐ、Ｃｏｕｒｖａｌｉｎおよ
びＭ、Ｆｉａｎｄｔ両氏「Ｇｏｎｅ　Ｊ＃Ｉ　９巻＄２
４７〜２６９頁（１９８０年）参照〕、クローニングが
成功する最大の機会は雑種ベクターが密！１に関連した
宿主細胞中に導入される場合ＫｔＫ存在する。これまで
発表されたストレプトマイセテスのプラスオドおよび７
アージに関するすべてのデータは、これらが非常に＠定
された数の他のストレフ’）マイセテス中にのみ安定に
導入されうろことを示しさえする。ストレプト！イセテ
ス中におけるストレプトマイセテスＤＮＡのりｐ−ユン
グは、例えば抗生物質の合成に関与する１個または少数
のみでなく非常に多数の遺伝子がクローニングされるぺ
伊場合に常に必要である。

全代部径路についての遺伝子のりｐ−ユングは全ストレ
プトマイセテスゲノムにわたって遺伝子が分配されると
とＫよりたとえそれが実際上解決できない問題とはなら
ないｋしても少くとも膨大な作業である。ストレプト！
イセテスのクローニングシステムにおいてはここでは例
廠ば代謝隘路が存在する。場合、実負上より高い収量を
達成するｋは事情によっては１個の遺伝子の増幅で充分
でありうる。密接に関連した代謝径路を組み合わせるこ
と、例えば抗生物質を変性させる酵素を挿入することに
より、考えられ各るような雑種抗生物質の創成において
も、同じ理由からストレフ）−ｒイセテス宿主ベクター
システムのみが成功の見込みがある。プラスオドｐ８Ｖ
Ｈ１はこれらの理由から抗生物質収量の増大を可能にす
るための雑種ベクターの調製に顕著に適している。

雑種ベクターを調製するｋは大腸菌プラスオドにおいて
すでに用いられそしてストレブトマイセテスでもＭ、Ｂ
ｉｔ）ｂ成環の「Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ第２８４巻第５２６
〜５３１頁（１９８０年）、およびＣ、Ｊ　、　’Ｉｈ
ａｎｐａｏｎ氏等のｒＮａｔｕｒｅ　Ｊ第２８６９第５
２５〜５２７頁（１９８０年）ｋより使用されているの
と同じ遺伝子技術方法が用いられる。

これら既知方法によりプラスオドｐ８ＶＨ１・中に上記
制限エンドヌクレアーゼを用いて得られた切断個所のい
くつかに、抗生物質抵抗性を有する遺伝子が挿入されう
るのみならず、抗生物質。

産生の増大をひき起す遺伝子も挿入されうる。

かくして得られた雑種プラスオドは従来存在するすべて
の観察によればストレプトマイセス細胞中で出発プラス
オドと同様に生存でき且つ増殖しうる。

本発明を以下の例によりさらに説明する。−は別に断わ
りなければ重量によるものとする。

例 ｔ　ストレフ）−ｒイセスーハネズエ？　Ｄ８Ｍ４０７
５５の培養およびプロトプラスト形成 培養は適轟な容器例えば３００−のエレンマイヤーフラ
スコ中で、５０ＷＩｔの培地例えばルリア（Ｌｕｒｉａ
　）肉汁または２Ｙ’Ｉ’　（、Ｔ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ
氏！ｆｋｐｅｒｉｍｅｎｔａｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｇｅｎ＠ｔｉｃｓ　Ｊ　（Ｃｅ１ｌ　８ｐｒｉｎｇｉ
ｉａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９７２年発行参
照〕中でかまたは有効な窒素源および炭素源を有するそ
の他の培地中で遂行される。すべての培地は付加的に０
．５ｚｉｐのグリシンを含有する。胞子懸濁液または胞
子を充たした白金耳を用いて接種する。培養は振盪ロウ
３２℃において振幅４ｅｐｎ、２２０７で早期定常相と
なるまで２〜３日間遂行する。

続いて＜５ＯＯＯｆおよび４℃で１０分間遠心分離する
ことにより細胞を収穫する０Ｍ、＜プラスオドを用いる
転換のためのプロトプラスト形成のためにはこの工程お
よび以後の工程は滅菌条件下にとり行われた。菌糸体イ
レットを１回水洗しそして次Ｋ例えば蔗糖２５チエチレ
ンジア２ンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ　）　５０　ｍＭ濃度
およびトリス（ヒドロキシメチルアンノ）メタン（Ｔｒ
ｉａ　）５　Ｑ　ｍＭ濃度の適幽な高張緩衝液５−中Ｋ
　１）Ｈ８でとる。次にガラスホモジナイザー中で２〜
４スト四−りするととｋより菌糸体を破壊する。これｋ
よりリゾチームがその作用部位に接近するめが容易にな
る。リゾチーム１　ｍ　（ｐＨ８で５０ｍＭＴｒｉｓ中
）ＣＩ０１１Ｆ／−含有）を添加した後、実際上完全な
ブードプラストの形成を達成するｋは室温で６０分間の
消化で充分である。

２、細胞の溶解 プラスミドＤＮＡを調製するためにプＥｌ）プラストを
さらに５０分間室温１プロテイナーゼＸ（ｐＨ８で５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｍ中ｉ’ｃ　１　ｍ１Ｆ／−含有）１ｓ
ｄと処理する。続いて細胞懸濁液にドデシル硫酸ナトリ
ウムを最終濃度（Ｌｌ−となるまで加えそして、次にさ
らに５０分間室温で培養する。続いてｇＤＴＡ　２ｍＭ
　１１度、塩化ナトリウム２Ｍ濃度、升細５０　ｍＭ濃
度の溶液７−をｐＨ８で加えそして高度に結構な混合物
を少くとも１時間氷上で培養する。次に細胞残留物およ
び染色体ＤＮＡの主豐量を２００００　Ｆおよび４℃で
１時間遠心分離するととにより分離し、そして分析的プ
ラスミド単離が意図されるかまたは調製−的プラスミド
単離が意図されるかの如何に従って異なる条件下に処理
される。

３、ａ）分析的プラスミド単離 遠心分離の上澄み液を注意深く注ぎそしてポリエチレン
グリコール６０００を最終濃度１〇−となるまで添加す
ることＫよりプラスミドＤＮＡを沈殿させる。氷上で１
時間培養後、沈殿を２０００Ｏｆおよび４℃で２０、分
間遠心分離するととＫより集め、このｄレットをα２　
Ｎ　Ｎａ０ＦＩ５００μＬ中にとりそして３０分間０℃
で培養する。続いてアルカリ性の懸濁液をｐＨ４，８の
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液５７５μＬの添加により中和す
る。それｋよりアルカリ処理によって部亦的に１本のス
トランドに変性された染色体ＤＮＡが部分的に相同の領
域において再び二重ストランドＤＮＡ　Ｋ変換され、そ
して染色体ＤＮＡ　７ラグメントの交叉結合により分子
量の巨大な生成物が生じ、これは１５０００　ｆおよび
４℃で５分関連心分離するととｋより容易に除去されう
るｌ’ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｊ第７巻第１５１５〜２！５Ｎ（１９７９年）参照３０
次に上澄み液に２．５倍量のエタノールを加えそして一
１８℃で４時間培養後沈殿したプラスミドＤＮＡを遠心
分離（１５０００９，４℃、２０分間）により集めそし
て７８９６エタノールで１回洗う。次に濃縮されたプラ
スぐド匝をαｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｍ中にｐｌ、８でとりそして制限酵素を用いるプラ
スンドの迅速分析に使用する。

ｂ）調製的プラスミド単離 分析的プラスミド単離において既に記載のポリエチレン
グリコール沈殿後、２００００ｔおよび４℃で２０分間
遠心分離するととＫより集めたプラスミドＤＮＡを１０
直ＫＤ’ｌ’Ａおよび５０ｍＭ’ｒｒｉａの溶液６−中
Ｋ　ｐＨ８でとる。生じた懸濁液量をピはットで測定（
そし″Ｃ＠濁液１−尚り塩化セシウム１ｔを添加する。

続いてエチジウムブロマイド（１０１１／ｓｇ）２００
μｔを加えそし【この懸濁液を超遠心ロウで８００００
　ｆおよび１５℃で６００時間遠心離する。密度の比較
的淡い帯域を紫外光線により可視的となし、注射針で側
面から穿刺してとり出しそし【新たに１０ｍＭＥＤＴＡ
、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍからなる付加的にさらに塩化
セシウム５ｔを含有する溶液５１ｍ１！をｐＨ８で加え
る。超遠心ロウにおける再遠心分離は続く帯域の単離と
同じ条件下に遂行される。集められたＤＮＡな次にエチ
ジウムブロマイドを除去するために塩化セシウムを飽和
したｎ−ブタノールを用い【数回抽出しそして水相を１
０　ｍＭ　ＥＤ’Ｉ’Ａ５０ｍＭ’Ｉ’ｒｉｇでｐＨｓ
で少くとも６時間透析する。続いて透析物に２倍半量の
エタノールを加えそして一１８℃で４時間後には析出し
たプラスギド鳳は１５０００Ｆおよび４℃で２０分間遠
心分離するととＫよりベレット化される。次に沈殿を７
８チエタノールで１回洗いそして０．１　ｍＭ　ＥＤＴ
人、２０吐Ｔｒｉｓ中ｐＨ８および４℃で保存する。

４、　プラスオドＤＮＡの特性化 電子顯微鏡による調査は標準的方法により遂行された〔
Ａ、に、Ｋｌｅｉｎａｃｈｍｉｄｔ氏７ｍｎｏｌａｙｅ
ｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ　ＥｌｅｅｔｒＯｎ　Ｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ｏｆ　ｋｃｌｅＬｒ”ｋＭＹｋｓ
ｌｍｄｕｌｅｔｓＪＳ　、Ｐ、Ｃｏｌｏｖｔｃｋ氏勢編
「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｊ第
２５巻第３６１〜３７７頁（１９６８年）参照〕、それ
Ｋより外形長さは４．１μｍと測定された。プラスミド
の外形長さから分子量８．４メガダルトンが測定できた
。プラスきドｐ　ＳＶＨ１の特−性化は種々の制限酵素
を用いて実施された。次に消化され？、：　ＤＮＡ　ヲ
０．７　Ｌｓ水平アガロースゲル（２ｍＭ　ＥＤｒｚ４
０ｍＭ酢讃ナトリウム、８０　ｍＭ　Ｔｒｉ８、ｐＨ８
，５）上で電圧勾配５Ｖ／ａｍで４時間電気泳動するこ
とにより分離した。さらに、同時に電気泳動にかけられ
た既知寸法の標識フラグメントに基いて電場での移動距
離を比較することにより未知フラグメントの分子量が測
定されうる。６個の制限酵素の切断点は環状のｐ８Ｖｉ
ｉｌ−分子上で正確に相互に測定された（添付図面参照
）。

プラスミド上の唯Ｉ１１のＰａｔ　Ｉ切断個所膠ここで
任意ＶＣＯ点として設定した。他の制限エンドヌクレア
ーゼとの処理により生ずるようなプラグメント上の酵素
例えばＢａｎ　Ｈ！の切断点の位置は２回連続する消化
により測定された。酵素Ｂ＆ｍ　ＨＩを用いる制限後に
１部分は直接ゲル上に適用され、他の部分はｐ曲の１０
０　ｍＭ　Ｔｒｉ８緩衝液を飽和したフェノールで２回
抽出し、そしてフェノールを除去するために水相をエー
テルで３回抽出した。続いてＤＮＡを２倍半量のエタノ
ールで沈殿させそして第２の酵素の作用にさらされる消
化緩衝液中に懸濁される。二重に消化されたＤＮＡは第
２の酵素のみで処理されたプラスミド試料と共にここで
ゲル上に適用される。この方法でｔＩｇ２の酵素が制限
個所を有するフラグメントが御ｊ定されうる。

１細胞当り実質上２０個以上のコピーを肩するｐ　８Ｖ
Ｈ１のコピー数は以下の方法で測定された。

細胞中において染色体およびプラスミドＤＮＡ中にＮ程
度にとりこまれる炭素−１４標識付けられたチミジン分
子が振盪培養においてストレプトマイセス・ベネズエラ
Ｄ８Ｍ　４０７５５の細胞中に利用された。細胞の溶解
、およびエチジウムブロマイドの存在下での塩化セシウ
ム密度勾配を用いて染色体ＤＮＡを予め分離することな
く粗溶解質を分離した後、次に勾配を約５０フラクシヨ
ンに分割しそして個々のフラクションの放射能を測定す
る。密度の高いプラスミド帯域と薄い染色体帯域との活
性度の比率からプラスミドの分子量の知識および染色体
の推定分子量の知識により１細胞当りのプラスオドのコ
ピー数が計算されうる（　Ｒ，Ｒａｄｉｏｆｆ氏等［Ｐ
ｒｏｃ　、Ｎａｔ　、Ａｃａｄ　。

８ｃｉ、Ｕ、８．Ｊ第５７巻第１５１４〜１５２０頁（
１９６７年）参照〕。

５、　プラスミ゛ドｐ８ＶＨ１を用いるストレプトマイ
セスの転換 Ｈｏｐｗｏｏｄ氏等によって開発された転換システムが
用いられた「Ｎａｔｕｒｅ　Ｊ第２７４巻第３９８〜４
００頁（１９７８年）参照〕。プロトプラストは前記１
のようにして調製しそして遠心分離（６０００ｆ。

４℃、５分間）しそしてプロトプラスト培地（スクロー
ス２５嗟、Ｋ２ＳＯ３１５ｍＭ、　Ｍｇｃｔ２１０　ｍ
Ｍ。

ＫＨ２ＰＯ４Ｑ、　５６　ｍＭ、　Ｃａｏｊ２２５　ｍ
Ｍ、　ＮａＣｊ　２５　ｍＭ、Ｔｒｉｍ　２５　ｍＭ、
　ｐＨ７，２）中にとる。

４℃で３０分間培養後、プ四ドブ２ストを新た化ペレッ
トとなしそしてこのはレットを注意深くピペットで−吸
い出しそしてピペットから排出するととｋより新鮮なプ
四ドプラスト培地１―中＃／Ｃ勅濁させる。続いてプラ
スミドｐ８ＶＨ１を加えそしてこの懸濁液？ＩＣ５０％
ポリエチレングリコール１０００を５−の量で加え、混
合しモしてさらに４分間Ｄ℃で培養する。次＜７１′ａ
　）プラスト培地８−を加えそして得られた懸濁液をも
う一度遠心分離する。ベレットを変性された再生培地（
ス１Ｏ−ｘ２５Ｔｏ、グにコース３Ｑ％。

［２８０４１５ｍＭ％Ｍｇｅｔ２１０　ｍＭ、カザ建）
酸０．１チ、酵母抽出物ａ、５−１ｘａ２ｐｏ４α５６
　ｍＭ、ＣＩＬＣ１２２０ｍＭ、Ｌ−プロリン　α３ｍ
Ｍ、ＮａＣｊ２５　ｍＭ、升１ｇ２５　ｍＭ、ｐＨ７，
２）で被覆しそして振盪している水浴中５７℃で２時間
培養する。生じた細胞懸濁液を個々のコ四ニーを単離す
るために適轟な選択的培地を含有する痺天板上に塗布し
そして転換物は前記５に）の迅速溶第法を用いて分析し
そしてその中に含有されるプラスミドＤＮＡを制限酵素
を用いて特性化する。

在　外来ＤＮＡのプラスミドｐ８■１中におけるり四−
ユング プラスミドｐ８ＶＥ１を制限酵素を用いて開環さ′せる
。同時に、プラスミド中に組み込まれる予定の染色体Ｄ
ＮＡを、同じ末端すなわち相互に連結しうる末端を有す
る切断点が生ずるよ５に切断する。３分間７０℃に加熱
した後両方の調製物を混合し、フェノールで抽出しそし
て前記４のようｋしてエタノールで沈殿させる。続いて
ＤＮＡを・リガーゼ緩衝液中にとり、Ｔ４−ＤＮＡ−リ
ガーゼを加えそして１６℃で１時間そして次第に４℃ま
で冷却しつつ一夜培養する。かくして連結されたプラミ
ドドを次に前記５のようにして適尚なスト、レプトマイ
竜テス中に導入スル。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明のプラスイドｐ８ＶＨ１の構造および
制限酵素切断点を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ストレプトライセス・ベネズエラ（８ｔｒｅｐｔｏ
   ｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　）　ＤＡＭ　４０７
   ５５の培養物から得られ、分子量８．４メガダルトン、
   外形長さ４．１μｍおよび分子寸法１２．６キロ塩基対
   合（ｋｂ）を有することを％徴とする、プラスミドｐ８
   ＶＨ１゜２）制限工ンドヌクレプーゼＥｃｏＲ”　■、
   　Ｈｌｎｄ　ＴＩＮ、Ｈｐａ　ＩおよびＸｂａ　Ｉ　Ｖ
   Ｃよっては全く切断されず、Ｐａｔ　ＩおよびＢａｔＩ
   　Ｋよって１個所だけ切断され、ＸｈＯＩＫよって長さ
   ７．６　ｋｂおよび４９ｋｂを有する２個のフラグメン
   トに切断され、Ｃム゛ＩＫよって長さ１’Ｌ８ｋｂおよ
   びα８ｋｂを有する２個の７ラグメントに切断され、Ｂ
   ｇｔＴＩＷｃヨッテ長す７．５％２．８ｔｄよび２．４
   ｋｂを有する３個のフラグメントに切断されそして１１
   ａｍ　ＨＩ　Ｋよって長さ７．７．２．０、ｔ８および
   Ｌ　２　ｋｔｌを有する４個のフラグメントに切断され
   ることを特徴とする特許 １項記載のプラス２ドｐｓｖｎ１　。 ５）プラスｉ　ｙ　ｐｓｉｖＨｌを使用するζとからな
   る適当な宿主生物中ＫＴｈけるベクターの構成法および
   外来ＤＮＡのクローエンダ法。 ４）プラスミドｐ８ＶＨ１が解裂され、外来ＤＮＡ物質
   と組み合わされてペタターを形成しこれが次にストレプ
   ト▼イ七テス（８ｔｒｅｐｔｏｍｙａｅｔａｓ　）株中
   和転換されることからなる前記特許請求の範８第ミ項記
   載の方法。