JPS60217895A - ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミド - Google Patents
ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミドInfo
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- JPS60217895A JPS60217895A JP60064034A JP6403485A JPS60217895A JP S60217895 A JPS60217895 A JP S60217895A JP 60064034 A JP60064034 A JP 60064034A JP 6403485 A JP6403485 A JP 6403485A JP S60217895 A JPS60217895 A JP S60217895A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はハイブリッドプラスミド特に大腸−（Ｌｃｏｌ
ｉ）プラスミドとストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｔｅ）プラスミドＩ）ＳＧ ２ （ヨーロッパ
特許出願公開番号ｉ６６７０１号）、ｐｓＶＨｉ（ヨー
ロッパ特許出願公開番号第７０５２２号〕ならひにｐＳ
Ｇｓ （ｒストレプトミセス科プラスミドｐｓＧ ５
、その）４！ｌ得法およびその使用」なる名称を有する
同日出願の西ドイツ特許用５ｉｐ３４１２０９２．０号
の目的物であシそして第１図によ！０％徴づけられる）
との融合によ多生成しそしてそれゆえ大腸菌中のみなら
ずストレプトミセス科中においても自律的に複製するい
わゆるシャトルベクターに関する。さらに本発明による
シャトルベクターはマーカー、好ましくはストレプトミ
セス科および／または大腸菌における選択を可能にする
抵抗性遺伝子を包含している。
ｉ）プラスミドとストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｔｅ）プラスミドＩ）ＳＧ ２ （ヨーロッパ
特許出願公開番号ｉ６６７０１号）、ｐｓＶＨｉ（ヨー
ロッパ特許出願公開番号第７０５２２号〕ならひにｐＳ
Ｇｓ （ｒストレプトミセス科プラスミドｐｓＧ ５
、その）４！ｌ得法およびその使用」なる名称を有する
同日出願の西ドイツ特許用５ｉｐ３４１２０９２．０号
の目的物であシそして第１図によ！０％徴づけられる）
との融合によ多生成しそしてそれゆえ大腸菌中のみなら
ずストレプトミセス科中においても自律的に複製するい
わゆるシャトルベクターに関する。さらに本発明による
シャトルベクターはマーカー、好ましくはストレプトミ
セス科および／または大腸菌における選択を可能にする
抵抗性遺伝子を包含している。
これらシャトルベクターにより大腸菌における遺伝子工
学の試験ずみの方法の使用が許容されるので、ストレプ
トミセス科へのパックトランスファーおよび操作された
遺伝子のストレー１／）ミセス科における研究および利
用が許容される。
学の試験ずみの方法の使用が許容されるので、ストレプ
トミセス科へのパックトランスファーおよび操作された
遺伝子のストレー１／）ミセス科における研究および利
用が許容される。
本発明の他の局面および好ましい態様を以下に詳細に説
明する。
明する。
大腸菌部分の出発プラスミドとしては知られた大腸菌プ
ラスミド、好ましくは文献から知られたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２およびｐＢＲ３２５（ポリパール（Ｂｏｌｉｖ
ａｒ ）氏他の「ジーン（Ｇｅｎｅ ）Ｊ第２巻＄９５
頁（１９７７年ンおよび同じくポリバール氏の「ジーン
」第４巻第１２１頁（１９７８年）参照〕そして特にｐ
ＡＣ系列のプラスミドであるｐＡＯＹｏ １７７および
ｐＡＯＹｏ １８４ Ｃシャンガ（ｏｈａｎｇ）氏他の
「ジエーーパクテリオル（Ｊ、Ｅａｃｔｅｒｉｏｌ、１
第１３４巻褐１１４１貞（１９７８年）参埴〕が用いら
れる。これらｐＡｏプ２スミドはそれらの寸法がそれぞ
れ４．０および４．５ｋｂとφさいゆえにストレプトミ
セス科ブ２スミドとの融合に優れて適合する。
ラスミド、好ましくは文献から知られたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２およびｐＢＲ３２５（ポリパール（Ｂｏｌｉｖ
ａｒ ）氏他の「ジーン（Ｇｅｎｅ ）Ｊ第２巻＄９５
頁（１９７７年ンおよび同じくポリバール氏の「ジーン
」第４巻第１２１頁（１９７８年）参照〕そして特にｐ
ＡＣ系列のプラスミドであるｐＡＯＹｏ １７７および
ｐＡＯＹｏ １８４ Ｃシャンガ（ｏｈａｎｇ）氏他の
「ジエーーパクテリオル（Ｊ、Ｅａｃｔｅｒｉｏｌ、１
第１３４巻褐１１４１貞（１９７８年）参埴〕が用いら
れる。これらｐＡｏプ２スミドはそれらの寸法がそれぞ
れ４．０および４．５ｋｂとφさいゆえにストレプトミ
セス科ブ２スミドとの融合に優れて適合する。
本発明によるシャトルベクターにおいては大腸菌ＤＮＡ
配列は未変化で存在するかまたは例えば外米遺伝子また
は調節配列の挿入によシ修飾されることができる。従っ
て、他の大ｗｋ凶の抵抗性遺伝子の挿入、例えばネオマ
イシン／カナマイシン抵抗性についての遺伝子′ｔ″担
持するトランスボッ゛ンＴｎ５からのＨｌｎｄ ｍ断片
〔ヨルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｇｅｎ）氏他のＦモル争
ゲン・ゲネト（Ｍｏ１．ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）Ｊ ７
１＋ １７７巻第６５貞（１９７７年〕参照）ｔｐムＯ
ＹＯ１８４のＨｌｎｄ ｍ切期部位に挿入することによ
ｊ） ｐＡＯＹｏ １８４ Ｎと表示される（第３表参
照）適当な出発プラスミドが得られうる。勿論本発明に
よるシャトルベクターにとって一本来の大Ｍ菌複製シス
テムを保有したままである他の方法で修飾された大腸菌
プラスミドも適当でめる。かかる修飾された大腸菌プラ
スミドにはもう一つの大腸菌レプリコンが挿入されたも
の、例えば前記したｐＡｏ系列のプラスミドが包含され
る。
配列は未変化で存在するかまたは例えば外米遺伝子また
は調節配列の挿入によシ修飾されることができる。従っ
て、他の大ｗｋ凶の抵抗性遺伝子の挿入、例えばネオマ
イシン／カナマイシン抵抗性についての遺伝子′ｔ″担
持するトランスボッ゛ンＴｎ５からのＨｌｎｄ ｍ断片
〔ヨルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｇｅｎ）氏他のＦモル争
ゲン・ゲネト（Ｍｏ１．ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）Ｊ ７
１＋ １７７巻第６５貞（１９７７年〕参照）ｔｐムＯ
ＹＯ１８４のＨｌｎｄ ｍ切期部位に挿入することによ
ｊ） ｐＡＯＹｏ １８４ Ｎと表示される（第３表参
照）適当な出発プラスミドが得られうる。勿論本発明に
よるシャトルベクターにとって一本来の大Ｍ菌複製シス
テムを保有したままである他の方法で修飾された大腸菌
プラスミドも適当でめる。かかる修飾された大腸菌プラ
スミドにはもう一つの大腸菌レプリコンが挿入されたも
の、例えば前記したｐＡｏ系列のプラスミドが包含され
る。
シャトルベクターの構成にはストレプトミセス暑中で操
作できる抵抗８：遺広子茫Ｍする修飾された大腸菌プラ
スミドが好ましい。これらストレプトミセス科抵抗性遺
伝子はまた丁でに修飾された大腸菌プラスミド中にも挿
入されうる例えばプラスミドｐＥＲ３２５ｃｌ （渠１
表参照ン中にストレプトミセス科プ２スミドｐ工Ｊ６〔
トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）氏他の「ネーチャー（
Ｎａｔｕｒ’６ ）Ｊ第２８６巻Ｎ５２５Ａ（１９８０
年）参照〕からのチオストレプトン抵抗性がクローニン
グされうる。かくして本発明によるシャトルベクターの
構成に使用されうるｐｓＬｊｌｉ １４０と呼ばれる修
飾された大１ｄｈ菌が得られる。
作できる抵抗８：遺広子茫Ｍする修飾された大腸菌プラ
スミドが好ましい。これらストレプトミセス科抵抗性遺
伝子はまた丁でに修飾された大腸菌プラスミド中にも挿
入されうる例えばプラスミドｐＥＲ３２５ｃｌ （渠１
表参照ン中にストレプトミセス科プ２スミドｐ工Ｊ６〔
トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）氏他の「ネーチャー（
Ｎａｔｕｒ’６ ）Ｊ第２８６巻Ｎ５２５Ａ（１９８０
年）参照〕からのチオストレプトン抵抗性がクローニン
グされうる。かくして本発明によるシャトルベクターの
構成に使用されうるｐｓＬｊｌｉ １４０と呼ばれる修
飾された大１ｄｈ菌が得られる。
ストレプトミセス科抵抗性遺伝子金用いて大腸菌プラス
ミドを修飾するための他の例としては、ストレプトミセ
ス科プラスミドｐ工、Ｔ ２１１［キーザー（Ｋｉｅｓ
ｅｒ）氏他の「モルーゲン・ゲネ〆ト（Ｍｏ１．ｇｅｎ
、Ｇｏｎｅｔ）Ｊｉ １８５巻Ｍ ２２３ ｊｉｊ（１
９８２年〕参照〕からのネオマイシン抵抗性遺伝子がク
ローニングされたプラスミドｐ＆ＬＪ＋ １１ならびに
ストレプトミセス科プ２スミドｐ工Ｊ６からのチオスト
レプトン抵抗性遺伝子を担持するプラスミドｐＢＬＢ
４０および４０１があげられよう。
ミドを修飾するための他の例としては、ストレプトミセ
ス科プラスミドｐ工、Ｔ ２１１［キーザー（Ｋｉｅｓ
ｅｒ）氏他の「モルーゲン・ゲネ〆ト（Ｍｏ１．ｇｅｎ
、Ｇｏｎｅｔ）Ｊｉ １８５巻Ｍ ２２３ ｊｉｊ（１
９８２年〕参照〕からのネオマイシン抵抗性遺伝子がク
ローニングされたプラスミドｐ＆ＬＪ＋ １１ならびに
ストレプトミセス科プ２スミドｐ工Ｊ６からのチオスト
レプトン抵抗性遺伝子を担持するプラスミドｐＢＬＢ
４０および４０１があげられよう。
下記比１表にはストレプトミセス科ブ２スミドからの抵
抗性遺伝子の挿＾により得らｎそしてシャトルベクター
の構成に使用されうる本発明によシ使用されうるベクタ
ーが示される。
抗性遺伝子の挿＾により得らｎそしてシャトルベクター
の構成に使用されうる本発明によシ使用されうるベクタ
ーが示される。
第１表
断片
Ｂｅ１ｌ−断片
ｐｓＩＪ４０１ ｐＢＲ３２５Ｅｃｌｌ ｐ工、Ｔ６（
Ｔｈｉｏｒ） Ａｐｒ、Ｑｍｒ、４からの１ ＃ １
ｋｂ Ｔａｒ Ｂａｌｌ−ｔｋ片 Ｂｅｌｌ−断片 ＊ ｐＢＲ３２５ｄ：小さなｆ）ｃｏＲＩ／Ｈ１ｎｄＪ
ｉｌ −ｌｒ片が欠失したｐＢ：Ｒ３２５ 下記第２表には本発明による融合プラスミドが示される
。
Ｔｈｉｏｒ） Ａｐｒ、Ｑｍｒ、４からの１ ＃ １
ｋｂ Ｔａｒ Ｂａｌｌ−ｔｋ片 Ｂｅｌｌ−断片 ＊ ｐＢＲ３２５ｄ：小さなｆ）ｃｏＲＩ／Ｈ１ｎｄＪ
ｉｌ −ｌｒ片が欠失したｐＢ：Ｒ３２５ 下記第２表には本発明による融合プラスミドが示される
。
第 ２ 表
ｐＢＲ３２５ｐｓＧ２Ｐｓｔｌ ｐｓＧＫｌ ６ｐｓＧ
Ｉ！ｔ２ ７ ｔｔ ｐＳＶＨＩ ＰｓｔＪ ｐｓＶｆｆｌｌ ８ｐｓ
ＶＫ２ ９ ｐＢＲ３２２ｐｓＶＨｌＰｓｔｌ ｐｓＶＦｉ２１ １
０ｐＢＲ３２５ｐＳＶＨＩ ＢａｍＨｌ ｐｓＶＥｔＮ
ｌ−４１１ｐＡＯＹＯ１７７ｐｓＶＨＩ Ｐｓｔｌ ｐ
ｆｆＶＥ３１ １２ｐＡＯＹＯ１８４ｐＥＩＧ５ ｎａ
ｏＲｌ ｐｓＧ凡５５１にれらプラスミドは一方では大
）ＭＡ ｄからの簡易化された方法でのストレプトミセ
ス科ｊ）ＮＡの取得に役立てられる、何故ならこれらは
大腸菌中で安定でそして大腸菌プラスミドは妬いコピー
数で存在するからでるる。一方ではこれらはシャトルベ
クター構成のための前駆＠賞とじて適轟である。
Ｉ！ｔ２ ７ ｔｔ ｐＳＶＨＩ ＰｓｔＪ ｐｓＶｆｆｌｌ ８ｐｓ
ＶＫ２ ９ ｐＢＲ３２２ｐｓＶＨｌＰｓｔｌ ｐｓＶＦｉ２１ １
０ｐＢＲ３２５ｐＳＶＨＩ ＢａｍＨｌ ｐｓＶＥｔＮ
ｌ−４１１ｐＡＯＹＯ１７７ｐｓＶＨＩ Ｐｓｔｌ ｐ
ｆｆＶＥ３１ １２ｐＡＯＹＯ１８４ｐＥＩＧ５ ｎａ
ｏＲｌ ｐｓＧ凡５５１にれらプラスミドは一方では大
）ＭＡ ｄからの簡易化された方法でのストレプトミセ
ス科ｊ）ＮＡの取得に役立てられる、何故ならこれらは
大腸菌中で安定でそして大腸菌プラスミドは妬いコピー
数で存在するからでるる。一方ではこれらはシャトルベ
クター構成のための前駆＠賞とじて適轟である。
第３表には、修飾された大腸菌プラスミド（第１表参照
）から得られそして大腸菌レプリコンｐＢＲ３２５に基
づく木兄１男によるシャトルベクターがめげられる。
）から得られそして大腸菌レプリコンｐＢＲ３２５に基
づく木兄１男によるシャトルベクターがめげられる。
第３表
ｐ８ＶＨｊ（Ｐｓｔｌ） ｐｓＩＪ４０（Ｐｓｔｌ）
ｐｓＷ２５４（Ｒ９，５ｋｂ） １４ｐ８Ｇ５（ｊｌｉ
ｃｏＲＩ） ｐｓＬ［ｎ１１（ＴｈｏＲＪ）’ｐｌｑ３
１１（２４，３ｋｂ） １５ｐｓＧ２（７１分的Ｐａｔ
ｌ） μｓ田４０（Ｐｓｔｌ） ｐ［１５４ＰＣ２０，
７ｋｂ） １６゜−ｐＥＩＬＩ！！４０部分に関しでは
完結せず、第６図参照それぞれのシャトルベクターにと
って出発プラスミドの種々の融合可能性が存在する。第
１６図には４ｍｍの変種が示される。変種ｐ８Ｗ１５４
Ｐ２−２が用いられるのが好ましい。
ｐｓＷ２５４（Ｒ９，５ｋｂ） １４ｐ８Ｇ５（ｊｌｉ
ｃｏＲＩ） ｐｓＬ［ｎ１１（ＴｈｏＲＪ）’ｐｌｑ３
１１（２４，３ｋｂ） １５ｐｓＧ２（７１分的Ｐａｔ
ｌ） μｓ田４０（Ｐｓｔｌ） ｐ［１５４ＰＣ２０，
７ｋｂ） １６゜−ｐＥＩＬＩ！！４０部分に関しでは
完結せず、第６図参照それぞれのシャトルベクターにと
って出発プラスミドの種々の融合可能性が存在する。第
１６図には４ｍｍの変種が示される。変種ｐ８Ｗ１５４
Ｐ２−２が用いられるのが好ましい。
ｐＢＲ系列の大腸菌レプリカ’ｋＶする本発明によるシ
ャトルベクターは大腸菌中に訃いてあらゆる場合に安定
である。ストレプトミセス科プ２スミド部分中における
欠失は観察されなかった。ストレプトミセス暑中におい
てｐｓｗ ２５４、ｐｓＷ３１１およびＸＪＢＷ １５
４ Ｆはそれぞれの抵抗性（チオストレプトンまたはネ
オマイシンに対する抵抗性）を発現する。これらプラス
ミドはストレプトマイシスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｌｌｖｉｄａｎｅ）に形質転換されうる。こ
のことは複製遺伝子が元来の宿王に特異的でないことを
証明している。レプリコンのコピー数（７ｌｇ１０）お
よび両立性ゆえに相互の２よびｐ工Ｊ１０１およ’ＣＦ
８ＬＰ １１．２ （ＸＬｉ１１％ｔＴ−第４．６６
ｏ、５９７号明ｍ畳参照）とのシャトルベクターは存在
するベクター系を拡大させて複雑な生合成経路をストレ
ゾトライシス中に段階的にクローニング瓶せるのに適す
る。
ャトルベクターは大腸菌中に訃いてあらゆる場合に安定
である。ストレプトミセス科プ２スミド部分中における
欠失は観察されなかった。ストレプトミセス暑中におい
てｐｓｗ ２５４、ｐｓＷ３１１およびＸＪＢＷ １５
４ Ｆはそれぞれの抵抗性（チオストレプトンまたはネ
オマイシンに対する抵抗性）を発現する。これらプラス
ミドはストレプトマイシスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓｌｌｖｉｄａｎｅ）に形質転換されうる。こ
のことは複製遺伝子が元来の宿王に特異的でないことを
証明している。レプリコンのコピー数（７ｌｇ１０）お
よび両立性ゆえに相互の２よびｐ工Ｊ１０１およ’ＣＦ
８ＬＰ １１．２ （ＸＬｉ１１％ｔＴ−第４．６６
ｏ、５９７号明ｍ畳参照）とのシャトルベクターは存在
するベクター系を拡大させて複雑な生合成経路をストレ
ゾトライシス中に段階的にクローニング瓶せるのに適す
る。
第４表にはストレプトミセス暑中における選択用の抵抗
性遺伝子を担持しそしてシャトルベクター構成用の前駆
物質として使用されうるｐム０系列の修飾されたプラス
ミドが示される。
性遺伝子を担持しそしてシャトルベクター構成用の前駆
物質として使用されうるｐム０系列の修飾されたプラス
ミドが示される。
第４表
からの３．３
ｋｂ Ｂａｍ１ニー
断片
ｐＡＯＹＯ１８４ｕ 上と同じ ｐｓＩＪ１６ ０ｍｒ
１８ｐＡＯＹ０１８４ ／／ ｐＩＪ６（Ｔｈｉｏｒ
） ｐｓｘ＆！１ ０ｍｒ １９からの６．９ ｋｂ ＢａｍＨｌ− 断片 Ｂｃｌｉ−１１ｉ片 第４辰にあけられた修飾され７ＣＩ）ＡＯ系列の修飾さ
れたプラスミドを使用してながんず〈第５表にあげられ
るシャトルベクターが構成されうる。
１８ｐＡＯＹ０１８４ ／／ ｐＩＪ６（Ｔｈｉｏｒ
） ｐｓｘ＆！１ ０ｍｒ １９からの６．９ ｋｂ ＢａｍＨｌ− 断片 Ｂｃｌｉ−１１ｉ片 第４辰にあけられた修飾され７ＣＩ）ＡＯ系列の修飾さ
れたプラスミドを使用してながんず〈第５表にあげられ
るシャトルベクターが構成されうる。
第５表
ｐｓＩＪｌｏ ＢａｏＲｌ ｐｓｅ５ ＢｃｏＲＩ 、
ｐ８Ｗ５６１ ２１ｐｓＩＪＬ６ Ｈｌｎｄｌ［ｐｓｅ
２ Ｈｌｎｄｌｌｌ ｐ１３Ｗ１４１ ２２ｐｓＩ＋Ｅ
ｉ２１ｔｔ ｔｔ ｔｔ ｐ１３ｗ１４２２５ｐｓＩＪ
４１ ＢａｍＨＩ ／／ Ｂａ１１部分ｐＢＷ１４４Ｂ
ｏ ２４中ｐｓＬＥｊ４１ ｕ ｕ Ｂｇｌ１１部分ｐ
８１Ｆ１４４Ｊ３Ｇ ２５”ｐｓＬＥ；４１ｔｔ ｔｔ
ＢｇＩＩＩｐｓＷｌ ２６ｐ１３ＩＪ４１ ／ｌ ｐ
ｓＶＨｊ Ｂｇｌｌ［部分 ｐｓＷ２４４ＢＧ ２７”
ｐｓＩＪ４１ ／／ ｕ Ｂｃｌ） ｐ８’１Ｖ２４４
２８ｐ８ＬＰＪ４１ＪＩＩｃｏＲＩ ｐ１９０５１ｃ
ｏＲＩ ｐＢＷ５４４ｎ ２９ｐｓＩＦ！４１ Ｂａｍ
川 ｔｔ Ｂａ１ｌ ｐＢＷ５４４Ｂ ３０＊ ｐ８Ｉ
Ｊ４１一部分に関して完全でない、４２０図参照それぞ
れのシャトルベクターについて出発プラスミドの種々の
融合可能性が存在する。図面においては変異が示される
。
ｐ８Ｗ５６１ ２１ｐｓＩＪＬ６ Ｈｌｎｄｌ［ｐｓｅ
２ Ｈｌｎｄｌｌｌ ｐ１３Ｗ１４１ ２２ｐｓＩ＋Ｅ
ｉ２１ｔｔ ｔｔ ｔｔ ｐ１３ｗ１４２２５ｐｓＩＪ
４１ ＢａｍＨＩ ／／ Ｂａ１１部分ｐＢＷ１４４Ｂ
ｏ ２４中ｐｓＬＥｊ４１ ｕ ｕ Ｂｇｌ１１部分ｐ
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ＢｇＩＩＩｐｓＷｌ ２６ｐ１３ＩＪ４１ ／ｌ ｐ
ｓＶＨｊ Ｂｇｌｌ［部分 ｐｓＷ２４４ＢＧ ２７”
ｐｓＩＪ４１ ／／ ｕ Ｂｃｌ） ｐ８’１Ｖ２４４
２８ｐ８ＬＰＪ４１ＪＩＩｃｏＲＩ ｐ１９０５１ｃ
ｏＲＩ ｐＢＷ５４４ｎ ２９ｐｓＩＦ！４１ Ｂａｍ
川 ｔｔ Ｂａ１ｌ ｐＢＷ５４４Ｂ ３０＊ ｐ８Ｉ
Ｊ４１一部分に関して完全でない、４２０図参照それぞ
れのシャトルベクターについて出発プラスミドの種々の
融合可能性が存在する。図面においては変異が示される
。
特に好ましいシャトルベクターは第２５図および２７図
のプラスミド、す匁わちそれぞれ特に挿入ｐｓＬｇ ４
１が１なる数字で表示された変異物（第２７ａ図）、な
らびに第２６．２８および２９図のプラスミドである。
のプラスミド、す匁わちそれぞれ特に挿入ｐｓＬｇ ４
１が１なる数字で表示された変異物（第２７ａ図）、な
らびに第２６．２８および２９図のプラスミドである。
例えば必須でない領域を離脱させることによシ本発明に
よるベクターのストレプトミセス科−プラスミド部分を
修飾すると・とも勿論可能である。従ってプラスミドｐ
８０５ において複製領域が最大ＢａｍＨ１ｌｆｒ片（
４，４５ｋｂ）中に存在するｔすなわち第１図に相当す
る１〜３ｋｂの範囲中に存在することが見出された。従
ってストレプトミセス暑中で複製するベクターの構成に
はこの「必須領域」で光分である。
よるベクターのストレプトミセス科−プラスミド部分を
修飾すると・とも勿論可能である。従ってプラスミドｐ
８０５ において複製領域が最大ＢａｍＨ１ｌｆｒ片（
４，４５ｋｂ）中に存在するｔすなわち第１図に相当す
る１〜３ｋｂの範囲中に存在することが見出された。従
ってストレプトミセス暑中で複製するベクターの構成に
はこの「必須領域」で光分である。
コノ「ミニマルレプリコン」の構成には例えば前記した
４、４５ｋｂの長さのＢａｍＨＩ Ｗｒ片が適当である
。この断片を環化させると、 Ｂ（！ＩＩ 、８ｐｈｌ
、ＢａｍＨＩ 、Ｊ！ＩＣ０ＲＩおよびＸｈｏ ｌに対
する独特の切断点によシ区別されるプラスミドが得られ
る。最後にめげた４ａ類の切ｍｒ点に対しこれらがクロ
ーニングに用いられうろことが示される。その上、「必
須領域」の外に存在し従ってクローニングまたはさらに
短縮に利用しうるＰｖｕ ｌに対する切断点がこの断片
上にさらに存在する（第１図の１２．６、＆２およびＡ
６ｋｂに）。さらに８ａｔｌに対する切断点（第１図の
０．６，１．８および五６５ｋｌ）に）も見出され、そ
のうち中央のものは恐らく「必須領域」中に存在する。
４、４５ｋｂの長さのＢａｍＨＩ Ｗｒ片が適当である
。この断片を環化させると、 Ｂ（！ＩＩ 、８ｐｈｌ
、ＢａｍＨＩ 、Ｊ！ＩＣ０ＲＩおよびＸｈｏ ｌに対
する独特の切断点によシ区別されるプラスミドが得られ
る。最後にめげた４ａ類の切ｍｒ点に対しこれらがクロ
ーニングに用いられうろことが示される。その上、「必
須領域」の外に存在し従ってクローニングまたはさらに
短縮に利用しうるＰｖｕ ｌに対する切断点がこの断片
上にさらに存在する（第１図の１２．６、＆２およびＡ
６ｋｂに）。さらに８ａｔｌに対する切断点（第１図の
０．６，１．８および五６５ｋｌ）に）も見出され、そ
のうち中央のものは恐らく「必須領域」中に存在する。
その他に少くとも５個のＳａｌ ｌ−切断点が存在する
。
。
例えばプラスミドｐＳＬ、１４１（ＩＡ ２０図参照）
をＢａｍＨｌで開環させそしてｐｓｅ ５０４．４５
ｋｂ ＢａｍＨ１断片と連結させると、ハイブリッドプ
ラスミドｐＧＭ １０１が得られる（第５１図参照、こ
こでレプリコン中３個のＳａｌ ｌ切断点のみが地図に
示される）。このプラスミドはなかんずく必須でない領
域中に［１ｎｄｌｌｌおよびＸｈＯｌの独特の切断点を
有する。選択するにはマーカーとしてクロ２ムフエニコ
ール抵抗性（大腸菌中）およびチオストレプトン抵抗性
（ストレプトマイシス中）が利用できる。分子寸法は２
９ｋｌ）である。
をＢａｍＨｌで開環させそしてｐｓｅ ５０４．４５
ｋｂ ＢａｍＨ１断片と連結させると、ハイブリッドプ
ラスミドｐＧＭ １０１が得られる（第５１図参照、こ
こでレプリコン中３個のＳａｌ ｌ切断点のみが地図に
示される）。このプラスミドはなかんずく必須でない領
域中に［１ｎｄｌｌｌおよびＸｈＯｌの独特の切断点を
有する。選択するにはマーカーとしてクロ２ムフエニコ
ール抵抗性（大腸菌中）およびチオストレプトン抵抗性
（ストレプトマイシス中）が利用できる。分子寸法は２
９ｋｌ）である。
ｐ（）Ｍ １０１から１ｋｌ）のＨｌｎｄｍ−Ｘｈｏｌ
Ｍ片をとシ出しそしてその代ｐにネオマイシンに対す
るａｐｈｌｌ抵抗性遺伝子を担持するＴｎ５からの１．
６ ｋｂ Ｈｌｎｄｌｌｌ−ＸｈｏＮＦｒ片を挿入する
と、ハイブリッドプラスミドｐＧＭ １０２が生成され
る（第６２図参照、ここでレプリコン中には５個のＢａ
１ｌ切断点のみが図示される）。このものは大腸菌中お
よびストレプトマイシスリビダンス中で複製する。大腸
菌における選択にはクロラムフェニコール抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できそしてストレプトマイシ
スリビダンスにおいてはチオストレプトン抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できる。クローニングするに
は大腸菌においては１ｃｏＲＩの独特の切断点（クロラ
ムフェニコール抵抗性の不活性化）およびＢｇｌ…の独
特の切断点（ネオマイシン抵抗性の不宿性化）が役立て
られそしてストレプトミセス科においてはＪｌ！ｃｏＲ
Ｖの切断点（チオストレプトン抵抗性の不活性化）およ
び同じ（Ｂｇｌ…のそれが用いられ、その他にａｌｎａ
ｌｌ［およびＸｈｏ ｌの独特の切断点も用いられる。
Ｍ片をとシ出しそしてその代ｐにネオマイシンに対す
るａｐｈｌｌ抵抗性遺伝子を担持するＴｎ５からの１．
６ ｋｂ Ｈｌｎｄｌｌｌ−ＸｈｏＮＦｒ片を挿入する
と、ハイブリッドプラスミドｐＧＭ １０２が生成され
る（第６２図参照、ここでレプリコン中には５個のＢａ
１ｌ切断点のみが図示される）。このものは大腸菌中お
よびストレプトマイシスリビダンス中で複製する。大腸
菌における選択にはクロラムフェニコール抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できそしてストレプトマイシ
スリビダンスにおいてはチオストレプトン抵抗性および
ネオマイシン抵抗性が利用できる。クローニングするに
は大腸菌においては１ｃｏＲＩの独特の切断点（クロラ
ムフェニコール抵抗性の不活性化）およびＢｇｌ…の独
特の切断点（ネオマイシン抵抗性の不宿性化）が役立て
られそしてストレプトミセス科においてはＪｌ！ｃｏＲ
Ｖの切断点（チオストレプトン抵抗性の不活性化）およ
び同じ（Ｂｇｌ…のそれが用いられ、その他にａｌｎａ
ｌｌ［およびＸｈｏ ｌの独特の切断点も用いられる。
ｐＡｏ−レプリコンｔ−Ｗする本発明によるシャトルベ
クターは大１ｈ１中でめらゆる場合に安定である。スト
レプトミセス科プラスミド部分中における欠失は大腸−
では観察されない。ストレプトマイシス中において充分
に試験されたベクター（特にｐｓＷ ３４４Ｂ％ｐ８Ｗ
１およびｐＳＷ２４４３Ｇ ）は調査された菌株（な
かんずくストレプトマイシスリビダンス、ストレブトマ
イシスゲイシレンジス（Ｓ、ｇｅｙｓｉｒｅｎａ工６）
、ストレプトマイシスガーナエンシス（８，ｇｈａｎａ
ｅｎｓｉｓ）およびストレプトマイシスベネズエラ（ｓ
、 ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ））中において安定でメジ
そしてストレプトミセス科抵抗性遺伝子を発現する。
クターは大１ｈ１中でめらゆる場合に安定である。スト
レプトミセス科プラスミド部分中における欠失は大腸−
では観察されない。ストレプトマイシス中において充分
に試験されたベクター（特にｐｓＷ ３４４Ｂ％ｐ８Ｗ
１およびｐＳＷ２４４３Ｇ ）は調査された菌株（な
かんずくストレプトマイシスリビダンス、ストレブトマ
イシスゲイシレンジス（Ｓ、ｇｅｙｓｉｒｅｎａ工６）
、ストレプトマイシスガーナエンシス（８，ｇｈａｎａ
ｅｎｓｉｓ）およびストレプトマイシスベネズエラ（ｓ
、 ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ））中において安定でメジ
そしてストレプトミセス科抵抗性遺伝子を発現する。
これらベクターの決定的な利点１６げれば次。
Ｏとおりでめる。
（１）宿主範囲にはこれまで知られたベクターによシ形
質転換され得ない一株（例えばストレプトマイシスガー
ナエンシス）も包含される。
質転換され得ない一株（例えばストレプトマイシスガー
ナエンシス）も包含される。
（２コピー数はこれまで知られたベクターによルカバー
されない規模の準位である約１０でるる。他のストレプ
トミセス科プラスミドおよびそれらの誘導体のコピー数
は１１１１１胞当ｊｌ） １（ＳＯＰ２＊、ヨーロッパ
特許／ｆｊ願公開番号第９２３８８号〕、３〜．５ （
ＥＩＬＰ １．２ ）および２０（例えばｐｒＪ １０
１等、キーｆ −（Ｋｉｅｓｅｒ）氏の前記引用文献参
照）である。
されない規模の準位である約１０でるる。他のストレプ
トミセス科プラスミドおよびそれらの誘導体のコピー数
は１１１１１胞当ｊｌ） １（ＳＯＰ２＊、ヨーロッパ
特許／ｆｊ願公開番号第９２３８８号〕、３〜．５ （
ＥＩＬＰ １．２ ）および２０（例えばｐｒＪ １０
１等、キーｆ −（Ｋｉｅｓｅｒ）氏の前記引用文献参
照）である。
（３） プラスミドｐ８ＶＨ１、ｐｓＧ２およびｐｓＧ
５ならびにそれらの誘導体は適合性の種類が異なる。か
つまたこれらはｐ工Ｊ １０ルプリコンおよびＢＬＰｌ
、２レプリコンと適合しうる。従って＃Ｉｌ胞中で種々
のレプリコン中の異なる遺伝子を平行してすなわちそれ
ぞれ選抜されたコピー数において―食することが可能で
ある。
５ならびにそれらの誘導体は適合性の種類が異なる。か
つまたこれらはｐ工Ｊ １０ルプリコンおよびＢＬＰｌ
、２レプリコンと適合しうる。従って＃Ｉｌ胞中で種々
のレプリコン中の異なる遺伝子を平行してすなわちそれ
ぞれ選抜されたコピー数において―食することが可能で
ある。
それらの好ましい性質ゆえに本発明によるシャトルベク
ターは遺伝子の調査およびレプリコンの地図作成（例え
ば大腸菌におけるトランスポゾン突然変異生成）に適す
るのみならずまた遺伝子の修飾およびトランスファーに
も適する。
ターは遺伝子の調査およびレプリコンの地図作成（例え
ば大腸菌におけるトランスポゾン突然変異生成）に適す
るのみならずまた遺伝子の修飾およびトランスファーに
も適する。
操作法は一般に知られてお）そして例えば前記した特許
文書、米国特許第４，５５２，９００号、同第４．３３
ａ４００号、同第４，５４０，６７４号、同第４，５４
５，９０６号、同第４，３６２．’８１６号、同第４，
３６２，８１７号、同第４，３９５，１３７号および同
第４，４０１，７６１号ならびにマニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）氏他の教本である［モレキニラー争クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ）Ｊ 、コ
ールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８２年に６己載されている。
文書、米国特許第４，５５２，９００号、同第４．３３
ａ４００号、同第４，５４０，６７４号、同第４，５４
５，９０６号、同第４，３６２．’８１６号、同第４，
３６２，８１７号、同第４，３９５，１３７号および同
第４，４０１，７６１号ならびにマニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）氏他の教本である［モレキニラー争クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ）Ｊ 、コ
ールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８２年に６己載されている。
従って本発明はストレプトミセス暑中における外米遺伝
子の発現への本発明によるシャトルベクターの使用にも
関する。
子の発現への本発明によるシャトルベクターの使用にも
関する。
以下の実施例によシ本発明をよシ吐則に説明する。
はじめにプラスミドｐｓＧ ５の単離について記載する
。
。
続いて溶解させるためのストレブトマイシスガーテエン
シスＤＳＭ２り３２のｉ株の培養にはＦ記培地が適する
。
シスＤＳＭ２り３２のｉ株の培養にはＦ記培地が適する
。
ｘａ２ＰＯ４２ｓＦ グルコース １０１ＦＨ２０１ｔ
Ｋ２ＨＰＯ４４？ ７．りＯ−Ｘ ５４０？ＭｇＳＯ４
ｏ、ｓｒ グリシン ５ｆ グリシン １０ｆ ＭｇＯ１２・６Ｈ２０１？ａ２ｏ
１ｔＨ２０１ｔ ５００ ｒｎｌのエレンマイヤーフラスコ中で栄養培地
約１００４中に均質化された率−コロニーを接種しそし
て軌道振盪６中（１２０ｒｐｍ ） ５０℃で２〜３日
間保温培養する。
ｏ、ｓｒ グリシン ５ｆ グリシン １０ｆ ＭｇＯ１２・６Ｈ２０１？ａ２ｏ
１ｔＨ２０１ｔ ５００ ｒｎｌのエレンマイヤーフラスコ中で栄養培地
約１００４中に均質化された率−コロニーを接種しそし
て軌道振盪６中（１２０ｒｐｍ ） ５０℃で２〜３日
間保温培養する。
５日令の、均質化された液状培養ｖＩＪ約５０ｍｇをベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） ？ｆＩ却遠心器Ｊ２１０
型のＪＡ−２０管中に収穫しく１０分、１００００ ｒ
ｐｍ 。
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ） ？ｆＩ却遠心器Ｊ２１０
型のＪＡ−２０管中に収穫しく１０分、１００００ ｒ
ｐｍ 。
２５℃）そしてＴＩｅＳｕ（ｉｏ ｍＭ ）リス−Ｈ０
１％ １ｍＭＩＩ）ＴＡ（ｐＨ８）および１０％スクロ
ース）中１回洗浄する。細Ｉ＠２ｔｋ’）ゾテーム溶液
（０，３Ｍスクロース、２５ ｍＭ トリス−ＨｏＬ
（ｐＨ８） 、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８） ｓ ４
’９ ／ ｍｊリゾチーム）５ゴ中に再懸濁しそして
３７℃で軌道憑盪器中（１００ｒｐｍ ）で保温培養す
る。３０〜４５分後ＭＢ胞をプロトプラストに変換する
。溶解混合物（０，３Ｍ ＮａＯＨ，２％ドデシル硫戚
ナトリウム）２．５ｄｋｌ／Ａ加しそして貝ちに強く混
合することにより細胞膜を溶解式せそしてＤＮＡ ｉ変
性させる。１０分間加熱処理（７０Ｃ）して溶解および
変性を完結させる。蛋白質を変性させそしてＤＮＡ ’
ｉ復元させるために室温で酸性７エノール／クロロホル
ム浴液８００μｔｔ加え−る（酸性フェノール／クロロ
ホルム溶液はクロロホルム５００ｄ１２０２００ｍ、フ
ェノール５００ｉおよびヒトＱキシキノリン０．５ ｔ
ｋ混合しそして下相を用いる）。
１％ １ｍＭＩＩ）ＴＡ（ｐＨ８）および１０％スクロ
ース）中１回洗浄する。細Ｉ＠２ｔｋ’）ゾテーム溶液
（０，３Ｍスクロース、２５ ｍＭ トリス−ＨｏＬ
（ｐＨ８） 、２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８） ｓ ４
’９ ／ ｍｊリゾチーム）５ゴ中に再懸濁しそして
３７℃で軌道憑盪器中（１００ｒｐｍ ）で保温培養す
る。３０〜４５分後ＭＢ胞をプロトプラストに変換する
。溶解混合物（０，３Ｍ ＮａＯＨ，２％ドデシル硫戚
ナトリウム）２．５ｄｋｌ／Ａ加しそして貝ちに強く混
合することにより細胞膜を溶解式せそしてＤＮＡ ｉ変
性させる。１０分間加熱処理（７０Ｃ）して溶解および
変性を完結させる。蛋白質を変性させそしてＤＮＡ ’
ｉ復元させるために室温で酸性７エノール／クロロホル
ム浴液８００μｔｔ加え−る（酸性フェノール／クロロ
ホルム溶液はクロロホルム５００ｄ１２０２００ｍ、フ
ェノール５００ｉおよびヒトＱキシキノリン０．５ ｔ
ｋ混合しそして下相を用いる）。
この混合物を振盪器〔ポルテックス（ＶｏｒＴｅ”））
中約２０秒間充分に混合しそして次に冷却遠心６中でペ
レットとなす（５分間、１２００Ｏｒｐｍ。
中約２０秒間充分に混合しそして次に冷却遠心６中でペ
レットとなす（５分間、１２００Ｏｒｐｍ。
４℃）。
プラスミドを含有する上澄み液７−を次に超遠心器中で
さらにａ＃する。０ｔｓＣＪｔ７ｆｓ浴解物７−および
エテジクムプロマイド溶液（３０ｑ／ｍｌ）０．２ｍを
混合しそして超遠心器〔コントｏ ン（ｘｏｎＴｎｏ製
）ＴｅＡ ５０） 中３４０００ ｒｐｍで４８時間遠
心分離する（２０℃）。プラスミドバンドｉＵＶ照射に
よシ螢先による視認可能となしそして注射器でとシ出丁
。この溶液を脱色および透析させるとざらに研究に使用
できる。このものは溶液２０μを当多約１μｔのプラス
ミドＤＮＡ ｆｔ含有する。
さらにａ＃する。０ｔｓＣＪｔ７ｆｓ浴解物７−および
エテジクムプロマイド溶液（３０ｑ／ｍｌ）０．２ｍを
混合しそして超遠心器〔コントｏ ン（ｘｏｎＴｎｏ製
）ＴｅＡ ５０） 中３４０００ ｒｐｍで４８時間遠
心分離する（２０℃）。プラスミドバンドｉＵＶ照射に
よシ螢先による視認可能となしそして注射器でとシ出丁
。この溶液を脱色および透析させるとざらに研究に使用
できる。このものは溶液２０μを当多約１μｔのプラス
ミドＤＮＡ ｆｔ含有する。
実施例 １
プラスミドｐ８ＬＥ４０の調製（ｐＢＲ系列の修飾され
たプラスミドの例として） ｐＢＲ３２５−ＤＮＡはプラスミドを担持する細胞から
知られた方法（マニアテイス氏他）により取得されつる
。プラスミドｐＩＪ６はストレプトマイシスリビダンス
ＴＣ１４から知られたストレプトミセス科技法に従い単
離されつる（ ｐｓＧ２、ｐｓＧ５の単離参照、または
例えばトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ）氏他の［ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ ） Ｊ第２８６巻第５２５頁（
１９８０年）または米国特許第４β６０，５９７号参照
〕。
たプラスミドの例として） ｐＢＲ３２５−ＤＮＡはプラスミドを担持する細胞から
知られた方法（マニアテイス氏他）により取得されつる
。プラスミドｐＩＪ６はストレプトマイシスリビダンス
ＴＣ１４から知られたストレプトミセス科技法に従い単
離されつる（ ｐｓＧ２、ｐｓＧ５の単離参照、または
例えばトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ）氏他の［ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ ） Ｊ第２８６巻第５２５頁（
１９８０年）または米国特許第４β６０，５９７号参照
〕。
クローニングするにはプラスミドｐＢＲ３２５を制限酵
素ＢａｍＨＩを用いて線状となす。ＤＮＡ １μｔを開
裂緩衝液（ｐＨ８，０のトリス−ＨＣＬ ５０ ｍＭ。
素ＢａｍＨＩを用いて線状となす。ＤＮＡ １μｔを開
裂緩衝液（ｐＨ８，０のトリス−ＨＣＬ ５０ ｍＭ。
ＭｇＣｌ２１０ ｍＭ、 ＮａＣ２５０ｍＭ ）中１単
位のＢａｍ Ｈ１（ＢＲＬ製、ノイーアイゼンバーグ（
Ｎｅｕ−Ｉｓｅｎｂｕｒｇ ） ）の存在下３７℃で１
時間保温培養する。フェノール処理（マニアテイス氏他
）により反応を停止させそしてエタノール沈殿によりＤ
ＮＡを精製する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤ
ＮＡ断片を得るには、ｐＩＪ ６− ＤＮＡをＢｃｌ
Ｉで切断する（操作法は前記と同じだが、Ｂａｍ ＨＩ
の代りにＢｅ１ｌ、３７℃の代りに５０℃で培養）。続
いて、ｐＢＲ３２５をアルカリフォスファターゼ（仔牛
の腸からのもの、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
） −マンハイム（Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ ）社製品〕
で処理することによりＤＮＡの５７−ホスペード末端を
除去しそしてｐＢＲ５２５の再連結を阻止する（マニア
テイス氏他）。２種類のＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を
混合しく ｐＢＲ３２５０，１μ？およびｐＩＪ６１μ
？）そしてＨ−橋を開かせるために７０℃に加熱する。
位のＢａｍ Ｈ１（ＢＲＬ製、ノイーアイゼンバーグ（
Ｎｅｕ−Ｉｓｅｎｂｕｒｇ ） ）の存在下３７℃で１
時間保温培養する。フェノール処理（マニアテイス氏他
）により反応を停止させそしてエタノール沈殿によりＤ
ＮＡを精製する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤ
ＮＡ断片を得るには、ｐＩＪ ６− ＤＮＡをＢｃｌ
Ｉで切断する（操作法は前記と同じだが、Ｂａｍ ＨＩ
の代りにＢｅ１ｌ、３７℃の代りに５０℃で培養）。続
いて、ｐＢＲ３２５をアルカリフォスファターゼ（仔牛
の腸からのもの、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
） −マンハイム（Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ ）社製品〕
で処理することによりＤＮＡの５７−ホスペード末端を
除去しそしてｐＢＲ５２５の再連結を阻止する（マニア
テイス氏他）。２種類のＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を
混合しく ｐＢＲ３２５０，１μ？およびｐＩＪ６１μ
？）そしてＨ−橋を開かせるために７０℃に加熱する。
メルカプトエタノール（最終濃度１０ ｍＭ ）および
ＡＴＰ （０，１ｍＭ ）の添加により反応条件を調整
する。このＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時
間保温培養する。
ＡＴＰ （０，１ｍＭ ）の添加により反応条件を調整
する。このＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時
間保温培養する。
このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換させ（マニ
アテイス氏他の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリン感受性およびクロラムフェニコール抵抗性につい
て選択する。
アテイス氏他の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリン感受性およびクロラムフェニコール抵抗性につい
て選択する。
それぞれのコロニーをプラスミド寸法を測定するために
迅速に溶解させる〔ティー・ニックハルト（Ｔ、 Ｅｃ
ｋｈａｒｄｔ ）氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉ６月
第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。チオストレプ
トン抵抗性遺伝子がｐｌＪ６プラスミドの１．１ｋｂの
長さのＢｃｌ Ｉ断片上に局在することは知られており
〔キーザー氏他、［モル・ゲン・ゲネ） （Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、 Ｇｏｎｅｔ ） Ｊ第１８５巻第２２３頁（
１９８２年）参照〕すなわちアガロースゲルにおいて寸
法６．９ｋｂのプラスミド（ｐＢＲ３２５’５．８ｋｂ
＋チオストレプトン抵抗性遺伝子（Ｔｈｉｏｒ） １．
１ｋｂ）を捜す。
迅速に溶解させる〔ティー・ニックハルト（Ｔ、 Ｅｃ
ｋｈａｒｄｔ ）氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉ６月
第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。チオストレプ
トン抵抗性遺伝子がｐｌＪ６プラスミドの１．１ｋｂの
長さのＢｃｌ Ｉ断片上に局在することは知られており
〔キーザー氏他、［モル・ゲン・ゲネ） （Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、 Ｇｏｎｅｔ ） Ｊ第１８５巻第２２３頁（
１９８２年）参照〕すなわちアガロースゲルにおいて寸
法６．９ｋｂのプラスミド（ｐＢＲ３２５’５．８ｋｂ
＋チオストレプトン抵抗性遺伝子（Ｔｈｉｏｒ） １．
１ｋｂ）を捜す。
要求される長さのプラスミドを担持する細胞からＤＮＡ
を単離しく前出）、そして正しいＤＮＡ断片が挿入され
たか否かを制限分析により検べる。
を単離しく前出）、そして正しいＤＮＡ断片が挿入され
たか否かを制限分析により検べる。
その断片の制限切断点は知られている（キーザー氏他）
ので、り四−ニングの成功は証明されつる。
ので、り四−ニングの成功は証明されつる。
実施例 ２
シャトルベクターｐ８Ｗ６１１の調製
プラスミドｐｓＬＥ１１は大腸菌から知られた方法（マ
ニアテイス氏他）により得られつる。プラスミドｐ８Ｇ
５はストレゾトマイシスガーナエンシスから前記のよ
うにして単離される。
ニアテイス氏他）により得られつる。プラスミドｐ８Ｇ
５はストレゾトマイシスガーナエンシスから前記のよ
うにして単離される。
クローニングするには２種類のプラスミドをＨｃｏ Ｒ
夏を用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｔを開裂
緩衝液中１単位のｇｃｏ）ｔｌ （ベーリンガー・マン
ハイム社製品）の存在下に３７℃で１時間保温培養する
。フェノール処理により反応を停止させそしてＤＮＡを
エタノール沈殿により精製する（マニアテイス氏他）。
夏を用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｔを開裂
緩衝液中１単位のｇｃｏ）ｔｌ （ベーリンガー・マン
ハイム社製品）の存在下に３７℃で１時間保温培養する
。フェノール処理により反応を停止させそしてＤＮＡを
エタノール沈殿により精製する（マニアテイス氏他）。
ｐ８ＩＪ １１− ＤＮＡ １１再連結を阻止するため
にアルカリフォスファターゼでさらに処理するのが好都
合である（マニアテイス氏他）。次にＤＮＡ試料（開裂
緩衝液中）を混合しく０，２μＰｐＳＬＨ１１および１
μｒｐｓＧｓ）、７０℃に加熱しそしてメルカプトエタ
ノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ （０，１ｍ
Ｍ ）の添加によりリガーゼ反応条件に調整する。１単
位のＴ４− ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンノ）
イム社製品）の存在下この混合物を４℃で１２時間保温
培養する。続いてこの混合物を大腸菌中に形質転換させ
（マニアテイス氏他）そしてコロニー上アンピシリン抵
抗性およびクロラムフェニコール感受性を用いて選択す
る。適当な抵抗７ξターンな有するコロニーをプラスミ
ドの寸法測定のために迅速溶解させる。要求される長さ
く２４３ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞から
プラスミドＤＮＡを単離しそして所望のシャトルベクタ
ーｐｓＷ３１１が存在するか否か制限分析により解明す
る。
にアルカリフォスファターゼでさらに処理するのが好都
合である（マニアテイス氏他）。次にＤＮＡ試料（開裂
緩衝液中）を混合しく０，２μＰｐＳＬＨ１１および１
μｒｐｓＧｓ）、７０℃に加熱しそしてメルカプトエタ
ノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ （０，１ｍ
Ｍ ）の添加によりリガーゼ反応条件に調整する。１単
位のＴ４− ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンノ）
イム社製品）の存在下この混合物を４℃で１２時間保温
培養する。続いてこの混合物を大腸菌中に形質転換させ
（マニアテイス氏他）そしてコロニー上アンピシリン抵
抗性およびクロラムフェニコール感受性を用いて選択す
る。適当な抵抗７ξターンな有するコロニーをプラスミ
ドの寸法測定のために迅速溶解させる。要求される長さ
く２４３ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞から
プラスミドＤＮＡを単離しそして所望のシャトルベクタ
ーｐｓＷ３１１が存在するか否か制限分析により解明す
る。
類似方法で第３表に示されるノーイブリッドプラスミド
が調製されつる。
が調製されつる。
実施例 ３
シラスξ ドｐｓＬＥ４１の調製（ｐＡＣ系列の修飾さ
れたプラスミドの例として） ｐ８ＬＫ４１の構成 プラスミドを担持する細胞から知られた方法（マニアテ
イス氏他）によりｐＡｃＹｏ １８４− ＤＮＡが取得
されうる。しかしながら野生型大腸菌細胞はＤＮＡを修
飾してＢｃｌ Ｉでの必要な制限が可能で゛な（なるダ
ム（、Ｄａｍ ）−メチラーゼを有している。すなわち
この場合ＤＮＡを単離するには大腸菌のダム−突然変異
体が用いられる。
れたプラスミドの例として） ｐ８ＬＫ４１の構成 プラスミドを担持する細胞から知られた方法（マニアテ
イス氏他）によりｐＡｃＹｏ １８４− ＤＮＡが取得
されうる。しかしながら野生型大腸菌細胞はＤＮＡを修
飾してＢｃｌ Ｉでの必要な制限が可能で゛な（なるダ
ム（、Ｄａｍ ）−メチラーゼを有している。すなわち
この場合ＤＮＡを単離するには大腸菌のダム−突然変異
体が用いられる。
プラスミドｐＩＪ ６はストレプトマイシスリビダンス
ＴＣ１４から知られたストレプトミセス科技法に従い単
離されつる（前記参照）。
ＴＣ１４から知られたストレプトミセス科技法に従い単
離されつる（前記参照）。
り四−ニングするにはプラスミドｐＡＣＹ０１８４を制
限酵素Ｂｃｌ Ｉを用いて線状となす。
限酵素Ｂｃｌ Ｉを用いて線状となす。
ＤＮＡ １μｔを開裂緩衝液中１単位のＢｃｌ Ｉ （
ＢＲＬ製、ノイーアイゼンバーグ（Ｎｅｕ−Ｉｓｅｎｂ
ｕｒｇ ） ）の存在下５０℃で１時間保温培養する。
ＢＲＬ製、ノイーアイゼンバーグ（Ｎｅｕ−Ｉｓｅｎｂ
ｕｒｇ ） ）の存在下５０℃で１時間保温培養する。
フェノール処理により反応を停止させそしてエタノール
沈殿によりＤＮＡを精製する。続いてアルカリフォスフ
ァターゼ〔修生の腸からのもの、ぺ一リンガー・マンハ
イム社製品〕で処理することＫよりＤＮＡの５′−ホス
ペード末端を除去しそしてｐＡ（７Ｙ０１８４の再連結
を阻止する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤＮＡ
断片を得るには、ｐＸＪ６−ＤＮＡをＢｃｌ Ｉで切断
する（操作は前出）。
沈殿によりＤＮＡを精製する。続いてアルカリフォスフ
ァターゼ〔修生の腸からのもの、ぺ一リンガー・マンハ
イム社製品〕で処理することＫよりＤＮＡの５′−ホス
ペード末端を除去しそしてｐＡ（７Ｙ０１８４の再連結
を阻止する。チオストレプトン抵抗性を担持するＤＮＡ
断片を得るには、ｐＸＪ６−ＤＮＡをＢｃｌ Ｉで切断
する（操作は前出）。
２種類のＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を混合しくｐＡｃ
Ｙｃ １８４ ｏ、１μｒ、 ｐＩＪ６１μ？）そｌ、
−［Ｉ（−橋を開かせるために７０℃に加熱する。メル
カプトエタノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ
（０，１ｍＭ）の添加により反応条件を調整する。この
ＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時間保温培養
する。
Ｙｃ １８４ ｏ、１μｒ、 ｐＩＪ６１μ？）そｌ、
−［Ｉ（−橋を開かせるために７０℃に加熱する。メル
カプトエタノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ
（０，１ｍＭ）の添加により反応条件を調整する。この
ＤＮＡをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム社製品）１単位の存在下に４℃で１２時間保温培養
する。
このＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換させ（マニ
アテイス氏他の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリン抵抗性およびクロラムフェニコール抵抗性につい
て選択する。
アテイス氏他の前記方法参照）そして細胞をテトラサイ
クリン抵抗性およびクロラムフェニコール抵抗性につい
て選択する。
それぞれのコロニーをプラスミド寸法を測定するために
迅速に溶解させる。アガロースゲル中で寸法５．４ｋｂ
のプラスミド（ｐＡＣＹＣ１８ｉ４４．５ｋｂ＋チオ抵
抗性１．１ｋｂ）をさがす。要求される長さを有するプ
ラスミドを担持する細胞からＤＮＡを単離（前出）しそ
して正しいＤＮＡ断片が挿入されたか否かを制限分析に
より解明する。その断片の制限切断点は知られている（
キーザー氏他）ので、クローニングの成功は証明されう
る。
迅速に溶解させる。アガロースゲル中で寸法５．４ｋｂ
のプラスミド（ｐＡＣＹＣ１８ｉ４４．５ｋｂ＋チオ抵
抗性１．１ｋｂ）をさがす。要求される長さを有するプ
ラスミドを担持する細胞からＤＮＡを単離（前出）しそ
して正しいＤＮＡ断片が挿入されたか否かを制限分析に
より解明する。その断片の制限切断点は知られている（
キーザー氏他）ので、クローニングの成功は証明されう
る。
実施例 ４
プラスミドｐｓＷ ３４４ Ｅの調製
プラスミドｐｓＬＥ ４１は大腸菌から知られた方法（
マニアテイス氏他）により得られうる。プラスミドｐｓ
Ｇ ５はストレプトマイシスガーナエンシス２９３２か
ら前記のようにして単離される。
マニアテイス氏他）により得られうる。プラスミドｐｓ
Ｇ ５はストレプトマイシスガーナエンシス２９３２か
ら前記のようにして単離される。
クローニングするには２種類のプラスミドをＦｉｃｏＲ
Ｉを用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｔを開裂
緩衝液中１単位のＫｃｏＲＩ （ベーリンガー・マンハ
イム社製品）の存在下に３７℃で１時間保温培養する。
Ｉを用いて平行して線状となす。ＤＮＡ １μｔを開裂
緩衝液中１単位のＫｃｏＲＩ （ベーリンガー・マンハ
イム社製品）の存在下に３７℃で１時間保温培養する。
フェノール処理により反応を停止させそしてＤＮＡをエ
タノール沈殿により精製する。１１）ＳＩＪ ４１−
ＤＮＡは再連結を阻止するために、′フルカリフォスフ
ァターゼでさらに処理するのが好都合である。次にＤＮ
Ａ試料（開裂緩衝液中）を混合しく０．２μｆ ｐｓＬ
Ｋ ４１および１μｒｐｓｏ５）、７０℃に加熱しそし
てメルカプトエタノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡ
ＴＰ （０，１ｍＭ ）の添加によりリガーゼ反応条件
に調整する。１単位のＴ４−ＤＮＡリガー七（ベーリン
ガー・マンノ−イム社製品）の存在下にこの混合物を４
℃で１２時間保温培養する。続いてこの混合物を大腸菌
中に形質転換させ（マニアテイス氏他）そしてテトラサ
イクリン抵抗性およびクロラムフェニコール感受性を有
するコロニーを選択する。
タノール沈殿により精製する。１１）ＳＩＪ ４１−
ＤＮＡは再連結を阻止するために、′フルカリフォスフ
ァターゼでさらに処理するのが好都合である。次にＤＮ
Ａ試料（開裂緩衝液中）を混合しく０．２μｆ ｐｓＬ
Ｋ ４１および１μｒｐｓｏ５）、７０℃に加熱しそし
てメルカプトエタノール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡ
ＴＰ （０，１ｍＭ ）の添加によりリガーゼ反応条件
に調整する。１単位のＴ４−ＤＮＡリガー七（ベーリン
ガー・マンノ−イム社製品）の存在下にこの混合物を４
℃で１２時間保温培養する。続いてこの混合物を大腸菌
中に形質転換させ（マニアテイス氏他）そしてテトラサ
イクリン抵抗性およびクロラムフェニコール感受性を有
するコロニーを選択する。
適当な抵抗パターンを有するコロニーをプラスミド寸法
測定のために迅速溶解させる。要求される長さく１ｓ、
１ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞からＤＮＡ
を単離しそしてＤＮＡがｐＳＩＪ４１およびｐ８Ｇ ５
の連結が起った場合に必要な適当な制限パターンを生成
しているか否か制限分析により解明する。
測定のために迅速溶解させる。要求される長さく１ｓ、
１ｋｂ）を有するプラスミドを含有する細胞からＤＮＡ
を単離しそしてＤＮＡがｐＳＩＪ４１およびｐ８Ｇ ５
の連結が起った場合に必要な適当な制限パターンを生成
しているか否か制限分析により解明する。
類似方法で第５表に示されるハイブリッドプラスミドが
ｌＩＩ製されうる。
ｌＩＩ製されうる。
実施例 ５
実施例４に従い操作するが、しかし下記のＢａｍ Ｈｌ
を用いて直線状としたｐ８Ｇ５０［ミニマルレプリコン
」をＢａｍ ＨＩで切断したｐ８ＬＥ４１と連結させる
とシャトルベクターｐＧＭ１０１が得られる。
を用いて直線状としたｐ８Ｇ５０［ミニマルレプリコン
」をＢａｍ ＨＩで切断したｐ８ＬＥ４１と連結させる
とシャトルベクターｐＧＭ１０１が得られる。
ｐｓＧ ５からのミニマルレプリコンの構成前記のよう
にしてストレプトマイシスガーナエンシスＤＡＭ ２９
５２からプラスミドｐｓａ ｓを単離する。プラスミド
ｐ８ＩＪ４０およびｐｓＬＥ４１は知られた方法（マニ
アテイス氏他）により大腸菌から得られうる。
にしてストレプトマイシスガーナエンシスＤＡＭ ２９
５２からプラスミドｐｓａ ｓを単離する。プラスミド
ｐ８ＩＪ４０およびｐｓＬＥ４１は知られた方法（マニ
アテイス氏他）により大腸菌から得られうる。
ｐ８ＬＥ ４０ ｔたはｐｓＩＪ４１中にｐｓＧ ５の
断片がクローニングされる。すなわちＳｐｈ Ｉ、 Ｂ
ａｍＨｌおよびＢｇｌ…の断片がｐｓＩＪ４１の８ｐｈ
ｌ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌ ｍ切断点に連結されそし
てＰｓｔｌ断片がｐＢＬＢ４０のＰｓｔＩ切断点に連結
される。クローニングするには２種類のプラスミド（ｐ
ｓＩ！プラスミドおよびｐｓＧ ５ ）を上記した酵素
を用いて平行して線状となす。フェノール処理により反
応を停止させそしてエタノール沈殿によりＤＮＡを精製
する（マニアテイス氏他の前記方法参照）。
断片がクローニングされる。すなわちＳｐｈ Ｉ、 Ｂ
ａｍＨｌおよびＢｇｌ…の断片がｐｓＩＪ４１の８ｐｈ
ｌ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌ ｍ切断点に連結されそし
てＰｓｔｌ断片がｐＢＬＢ４０のＰｓｔＩ切断点に連結
される。クローニングするには２種類のプラスミド（ｐ
ｓＩ！プラスミドおよびｐｓＧ ５ ）を上記した酵素
を用いて平行して線状となす。フェノール処理により反
応を停止させそしてエタノール沈殿によりＤＮＡを精製
する（マニアテイス氏他の前記方法参照）。
再連結を阻止するためにｐｓｉ、ｇ ４０およびｐ８１
Ｊ４１− ＤＮＡをさらにアルカリフォスファターゼで
処理するのが好都合である（マニアテイス氏他の前記方
法参照）。
Ｊ４１− ＤＮＡをさらにアルカリフォスファターゼで
処理するのが好都合である（マニアテイス氏他の前記方
法参照）。
次にＤＮＡ試料（開裂緩衝液中）を混合しく０．２μｔ
ｐｓＩＪ ４０またはｐ８１Ｊ４１および１μｔ ｐ
８Ｇ ５ ）、７０℃に加熱しそしてメルカプトエタノ
ール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ（０，１ｍＭ）
の添加によリリガーゼ反応条件に調整する。１単位のＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製品
）の存在下にこの混合物を４℃で１２時間保厘培養する
。続いてこの混合物を大腸菌中に形質転換させ（マニア
ティス氏他の前記方法参照）そしてｐ８ＬＫ４１を使用
する場合はクロラムフェニコール抵抗性およびテトラサ
イクリン感受性を有するコロニーを選択する。ｐＳＬＥ
４０ハイブリッドはクロラムフェニコール抵抗性および
アンド、シリン感受性を用いて選択する。適当な抵抗パ
ターンを有するコロニーをプラスミド寸法測定のために
迅速溶解させる〔ティー・ニックハルト氏の「プラスミ
ド」第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。必要な長
さのプラスミドを含有する細胞からＤＮＡを単離しそし
て予期された融合シラスミドが生成したか否か制限分析
により解明する。
ｐｓＩＪ ４０またはｐ８１Ｊ４１および１μｔ ｐ
８Ｇ ５ ）、７０℃に加熱しそしてメルカプトエタノ
ール（最終濃度１０ｍＭ）およびＡＴＰ（０，１ｍＭ）
の添加によリリガーゼ反応条件に調整する。１単位のＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製品
）の存在下にこの混合物を４℃で１２時間保厘培養する
。続いてこの混合物を大腸菌中に形質転換させ（マニア
ティス氏他の前記方法参照）そしてｐ８ＬＫ４１を使用
する場合はクロラムフェニコール抵抗性およびテトラサ
イクリン感受性を有するコロニーを選択する。ｐＳＬＥ
４０ハイブリッドはクロラムフェニコール抵抗性および
アンド、シリン感受性を用いて選択する。適当な抵抗パ
ターンを有するコロニーをプラスミド寸法測定のために
迅速溶解させる〔ティー・ニックハルト氏の「プラスミ
ド」第１巻第５８４頁（１９７８年）参照〕。必要な長
さのプラスミドを含有する細胞からＤＮＡを単離しそし
て予期された融合シラスミドが生成したか否か制限分析
により解明する。
これらプラスミドを慣用の方法に従いストレプトマイシ
スリビダンスＴＫ ２３に形質転換させ〔ケー・エフ・
シャーチル（Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒ ）、ディー・
ニー・ホップウッド（Ｄ、 Ａ、 Ｈｏｐｖｒｏｏｄ
）、ティー・キーザーおよびシー・ジェー・トンプソン
氏、ｆ） 「シーン・クローニング・イン・ストレプト
マイシス、カレント・トピックス・イン・ミクロビオル
・アンド・イミュノル（Ｇｅｎｅ Ｃ１ｏｎ−ｉｎｇ
ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、 ） Ｊ第９６巻第６９〜９５頁（１９
８２年）参照〕そしてチオストレプトン抵抗性について
選択する。チオストレプトン抵抗性のストレフトマイシ
スリビダンスコロニーから標準的操作〔ティー・キーザ
ー氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）Ｊ第１２巻第
１９ Ｂ （１９８４年）、ストレプトマイシスリビダ
ンスおよび大腸菌からのｃｃｃＤＮＡの単離に影響する
因子、参照〕を用いてプラスミドＤＮＡを単離しそして
その組成について検査する。
スリビダンスＴＫ ２３に形質転換させ〔ケー・エフ・
シャーチル（Ｋ、 Ｆ、 Ｃｈａｔｅｒ ）、ディー・
ニー・ホップウッド（Ｄ、 Ａ、 Ｈｏｐｖｒｏｏｄ
）、ティー・キーザーおよびシー・ジェー・トンプソン
氏、ｆ） 「シーン・クローニング・イン・ストレプト
マイシス、カレント・トピックス・イン・ミクロビオル
・アンド・イミュノル（Ｇｅｎｅ Ｃ１ｏｎ−ｉｎｇ
ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、 ） Ｊ第９６巻第６９〜９５頁（１９
８２年）参照〕そしてチオストレプトン抵抗性について
選択する。チオストレプトン抵抗性のストレフトマイシ
スリビダンスコロニーから標準的操作〔ティー・キーザ
ー氏の「プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ ）Ｊ第１２巻第
１９ Ｂ （１９８４年）、ストレプトマイシスリビダ
ンスおよび大腸菌からのｃｃｃＤＮＡの単離に影響する
因子、参照〕を用いてプラスミドＤＮＡを単離しそして
その組成について検査する。
チオストレプトン抵抗性のコロニーから得られるすべて
のプラスミドは複製に必要なｐｓＧ ５プラスミドの遺
伝子を担持している。従って総合した結果から合目的々
な［ミニマルレプリコン」 （ここでは４．４５ｋｂの
Ｂａｎｄ）断片）が確認され、このものは他のクローニ
ング実験および比較によるオーバーラッピングクローニ
ングによりさらにξニマム化されうる。
のプラスミドは複製に必要なｐｓＧ ５プラスミドの遺
伝子を担持している。従って総合した結果から合目的々
な［ミニマルレプリコン」 （ここでは４．４５ｋｂの
Ｂａｎｄ）断片）が確認され、このものは他のクローニ
ング実験および比較によるオーバーラッピングクローニ
ングによりさらにξニマム化されうる。
第１〜５図は本発明により使用されつるプラスミドの制
限地図を示す。 第６〜１６図は本発明によるシャトルベクターの構造を
示す。 第１７〜２０図はシャトルベクターの構成に使用されう
るｐＡＣ系列の修飾され次プラスミドの構造を示す。 第２１１〜３０図は第１７〜２０図記載のプラスミドを
使用して調製されたシャトルベクターの構造を示す。 第３１および６２図は本発明により調製されるハイブリ
ッドプラスミドの構造を示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト第３
図 第２ｂ図 ■聞１１１％！＋ 范５図 晃８図 第９図 児１３図
限地図を示す。 第６〜１６図は本発明によるシャトルベクターの構造を
示す。 第１７〜２０図はシャトルベクターの構成に使用されう
るｐＡＣ系列の修飾され次プラスミドの構造を示す。 第２１１〜３０図は第１７〜２０図記載のプラスミドを
使用して調製されたシャトルベクターの構造を示す。 第３１および６２図は本発明により調製されるハイブリ
ッドプラスミドの構造を示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト第３
図 第２ｂ図 ■聞１１１％！＋ 范５図 晃８図 第９図 児１３図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）プラスミドｐ８Ｇ ２ ｓ Ｐ” ５またはｐ８Ｖ
Ｈ１に由来するストレプトミセス科レプリコン、および
大腸菌（Ｊ！ｉ、ａｏｌｉ）レプリコンを含Ｍするハイ
ブリッドプラスミド。 ２）大腸菌レプリコンがｐＢＲ３２２％ ｐＢＲ３２５
，１）ＡＯＹＯ１７７ｔたはｐＡＯＹｏ １８４からな
る系列のプラスミドに由来する前記！ｆｆＩｆＩ求の範
囲第１項記載のプラスミド。 ３）大腸劇中、およびストレプトマイシスリビダンス（
８ｔｒｅｐｔｏｍｙｏｅａ １ｉｖｌａｎｓ）、ストレ
プトマイシスリビダンス（８，ｇｅｙｓｉｒｅｎｓｉａ
）、ストレプトマイシスガーナエンシス（８、ｇｈａｎ
ａ−・ｅｎａｉａ）およびストレプトマイシスベネズエ
ラ（８，ｖｅｎｅｇｕｅｌａｅ）からなる群から選択さ
れるストレプトマイシス種中において複製される前記特
許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ４）大腸菌中、およびストレプトマイシスリビダンスー
ストレプトマイシスゲイシレンシス、ストレプトマイシ
スガーナエンシスおよびストレプトマイシスベネズエラ
からなる群から選択されるストレプトマイシス棟中に３
いて複製される前記特許請求の範囲第２項記載のプラス
ミド。 ５）第１６図に示されるｐｓＷ １５４ Ｆなる表示を
Ｍする前記特許請求の範囲Ｗ！、２項記載のプラスミド
。 ６）第２５図に示されるｐｓＷ１４４ＢＧなる表示を有
する前ｍｌ脣許請求の範−第２項記載のプラスミド。 ７）第２６図に示されるｐｓＷ １なる表示ｔ−有する
前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミド。 ８）第２７図に示されるｐ８Ｗ ２４４ＥＧなる表示を
有する前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミド。 ９）第２８図に示されるｐｓｉ ２４４なる表示を有す
る前記特許請求の範囲第２項記載のプラスき ド。 １０）第２９図に示されるｐｓＷ ３４４ Ｆ！なる表
示を有する前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミド
。 １１）第１５図に示されるｐｓＷ３１１なる表示を有す
る前記特許請求の範囲第１項記載のプラスミ ド。 １２〕 第３１図に示されるｐＧＭ １０１なる表示を
有する前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミ ド。 １３）！３２図に示されるｐＧＭ １０２なる表示ｔ−
有する前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミ ド。 １４） ｐｓＧ ２．、ｐｓＶＨｌおよびｐｓＧ ５か
らなる群から選択されたプラスミドのレプリコンを貧有
するＤＮＡｔ大ｉ菌レプリコンを含有するＤＮＡと連結
させることからなる前記特許請求の範囲第１項記載のハ
イブリッドプラスミドの製法。 １５）大腸菌レプリコンがｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５
、ｐＡＯＹｏ １７７およびｐＡＯＹｏ １８４のレプ
リコンから選択されることからなる前記特許請求の範囲
第１４４項記載方法。 １６）前記特許請求の軛Ｆ！Ｉｉ第１１項記載のプラス
ミドをストレプトマイシス宿主中に形質転換させること
からなるストレプトマイシス遺伝子の発現法。 １７）前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミドをス
トレプトマイシス宿主中に形質転換させることからなる
ストレプトマイシス遺伝子の発現法。 １８）前記特許請求の範囲第１項記戦のプラスミドをス
トレプトマイシスリビダンス、ストレプトマイシスゲイ
シレンシス、ストレプトマイシスガーナエンシスおよび
ストレプトマイシスベネズエラからなる群から選択され
たストレプトマイシス宿主中に形質転換させることから
なるストレプトマイシス遺伝子の発現法。 １９）前記特許請求の範囲第２項記載のプラスミド全ス
トレプトマイシスリビダンス、ストレプトマイシスゲイ
シレンシス、ストレプトマイシスガーナエンシスおよび
ストレプトマイシスベネズエラからなる群から選択さｎ
たストレプトマイシス宿主中に形質転換させることから
なるストレプトマイシス、ｉｔ云子の発現法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3412093.9 | 1984-03-31 | ||
| DE19843412093 DE3412093A1 (de) | 1984-03-31 | 1984-03-31 | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60217895A true JPS60217895A (ja) | 1985-10-31 |
| JP2619855B2 JP2619855B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=6232265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60064034A Expired - Lifetime JP2619855B2 (ja) | 1984-03-31 | 1985-03-29 | ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミド |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4992371A (ja) |
| EP (1) | EP0158201B1 (ja) |
| JP (1) | JP2619855B2 (ja) |
| AT (1) | ATE55152T1 (ja) |
| AU (1) | AU4060085A (ja) |
| CA (1) | CA1246474A (ja) |
| DE (2) | DE3412093A1 (ja) |
| DK (1) | DK144985A (ja) |
| ES (1) | ES8603573A1 (ja) |
| GR (1) | GR850798B (ja) |
| PT (1) | PT80189B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60256384A (ja) * | 1984-03-31 | 1985-12-18 | ヘキスト アクチエンゲゼルシヤフト | ストレプトミセスプラスミドｐｓｇ５ |
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|---|---|---|---|---|
| US4680265A (en) * | 1984-09-25 | 1987-07-14 | Eli Lilly And Company | Method of selecting recombinant DNA-containing streptomyces |
| DE3737729A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Degussa | Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen |
| DE3809692A1 (de) * | 1988-03-23 | 1989-10-12 | Hoechst Ag | Verwendung von psg5 als temperatursensitives plasmid |
| US5589385A (en) * | 1990-07-26 | 1996-12-31 | American Cyanamid Company | Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein |
| EP0618297A1 (en) * | 1993-03-18 | 1994-10-05 | Pfizer Inc. | Novel bacterial plasmid shuttle vectors for streptomycetes and escherichia coli |
| KR101662807B1 (ko) | 2014-10-27 | 2016-10-06 | 한국과학기술연구원 | 코리네박테리움 및 이콜라이 셔틀 벡터 |
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| JPS5877897A (ja) * | 1981-10-15 | 1983-05-11 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | ストレプトマイセス属およびその類縁菌に使用するクロ−ニング・ベクタ− |
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