JPS5826317B2 - ヒト甲状腺刺激ホルモンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈｕｍａｎＴｈｙ
ｒｏｉｄ −ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ
、以下ｈＴｓＨと略称する。

）の製法に関する。ｈＴＳＨは、下垂体前葉の好塩基性
細胞が産生ずるホルモンで、甲状腺重量の増加作用、無
機ヨウ素の有機化促進作用およびＡＴＰａｓｅの活性化
作用などを有する。

そして、ｈＴＳＨを大量に安価に製造する方法は未だ知
られていない。

本発明者は、ｈＴｓＨの大量供給を目ざして鋭意研究を
続けたところ、意外にも、ｈＴｓＨ産生能を有するヒト
由来のリンパ芽球細胞が、その増殖速度が大きく、細胞
当りのｈＴＳＨ産生量も犬でｈＴｓＨ産生細胞として好
適であることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ｈＴＳＨ産生能を有するヒト由来
のリンパ芽球細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、
または、その温血動物の体液の供給を受けながら増殖さ
せた細胞からｈＴＳＨを産生せしめることを特徴とする
ｈＴｓＨの製造方法に関するものである。

本発明の方法は、インビトロで培養させる場合とは違っ
て、ｈＴＳＨの産生量が犬であるだけでなく、高価な血
清などを含む栄養培地が不要、または大幅に節約でき、
更に細胞増殖中の維持管理も極めて容易である。

すなわち、ｈＴｓＨ産生能を有するヒト由来のリンパ芽
球細胞をヒト以外の温血動物体内に移植し、またはその
動物の体液の供給を受けることのできるチャンバーに収
容し、通常の飼育をすれば、温血動物体から供給される
栄養物を含有する体液を利用してその細胞が容易に増殖
しうるのである。

更にインビトロで培養させる場合と比較して、この細胞
の増殖が安定していること、その増殖速度の大きいこと
、得られる細胞量の大きいこと、更には細胞当りのｈＴ
ＳＨ産生量の大きいことが特徴である。

本発明で使用するヒト由来のリンパ芽球細胞は、ｈＴＳ
Ｈ産生能を有し、かつヒト以外の温血動物の体内に移植
して容易に増殖するものであればよい。

例えば、下垂体前葉の好塩基性細胞、下垂体腫瘍細胞、
下垂体色素嫌性腺腫細胞などの本来ｈＴＳＨ産生能を有
する細胞及び肺癌細胞などの異所性ｈＴＳＨ産生能を有
する細胞からｈＴｓＨ産生遺伝子を、ポリエチレングリ
コールやセンダイウィルスなどを利用する細胞融合の手
段や、ＤＮＡＩＪガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、
ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組換え
の手段などによって導入したヒト由来のリンパ芽球細胞
または異所性ｈＴＳＨ産生能を有するヒト由来のリンパ
芽球細胞などが好適である。

これらリンパ芽球細胞の利用は、ヒト以外の温血動物に
移植する時、その宿主動物の細胞と混りにくい軟腫瘤を
形威しやすく、摘出後の分散も容易なので、生きたヒト
リンパ芽球様細胞の採取に極めて有利である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腫由来の細胞株が適しそおり、例え
ばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ ）細胞、ＢＡＬＬ−１細
胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞
などの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しうる。

本発明におけるｈＴＳＨの製造方法に使用する温血動物
は、ｈＴＳＨ産生能を有するヒト由来のリンパ芽球細胞
が増殖しうるものであればよく、例えば、ニワトリ、ハ
トなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、
ウマ ウサギ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハ
ムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類など
が使用できる。

これらの動物にヒト由来のリンパ芽球細胞を移植すると
好ましくない免疫反応を起すおそれがあるので、その反
応をできるだけおさえるために、使用する動物はできる
だけ幼若な状態、すなわち卵、胚、胎児、新生期、幼少
期のものの方が好ましい。

また、これら動物に、例えば約２００〜６００レムのエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処置をほど
こして、免疫反応を極めて移植してもよい。

使用する動物がヌードマウスやヌードラットなどの免疫
不全動物の場合には、成長じたものであっても免疫反応
が弱いので、これら前処置を必要とすることなく、培養
株化されたヒト由来のリンパ芽球細胞が移植でき、急速
に増殖するので、特に好都合である。

また、ヒト由来のリンパ芽球細胞を、例えば先ずハムス
ターに移植し、増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の温血動物間で
移植してヒト由来のリンパ芽球細胞の増殖をより安定化
したり、更にそれらから産生されるｈＴｓＨ量を増加さ
せることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同線間、同門
間移植であってもよい。

更に、ヒト由来のリンパ芽球細胞を移植する動物体内の
部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であればよく、
例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる。

また、直接動物体内にヒト由来のリンパ芽球細胞を移植
することなく、動物細胞の通過を阻止しうる多孔性の濾
過膜、例えば孔径約１０−７〜１０−５ｍを有するメン
ブランフィルタ−１限外濾過膜、またはホローファイバ
ーなどを設けた公知の各種形状、大きさの拡散チャンバ
ーを動物体内、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの
栄養物を含む体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内
で培養株化されたヒト由来のリンパ芽球細胞を増殖させ
ることができる。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続して潅流させるように
した拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散
チャンバー内のヒト由来のリンパ芽球細胞の増殖状態を
透視できるようにすることも、また、この拡散チャンバ
一部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せず
に寿命一杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産
量を更に高めることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
リンパ芽球細胞が動物の細胞と直接接触しないので、ヒ
ト由来のリンパ芽球細胞のみが容易に採取できるだけで
なく、好ましくない免疫反応を起す心配も少ないので、
免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各種温血動物
を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としない。

ヒト由来のリンパ芽球細胞を増殖させるための期間は１
〜２０週、通常１〜５週で目的を達することができる。

このようにして得られるヒト由来のリンパ芽球様細胞数
は、動物個体当り約１０７〜１０１２、またはそれ以上
に達することも見いだした。

換言すれば、本発明で使用するｈＴＳＨの製造方法によ
り増殖させたヒト由来のリンパ芽細胞数は、動物個体当
り移植した細胞数の約１０２〜１０７倍、またはそれ以
上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増殖させる場
合の約１０”〜１０６倍、またはそれ以上にも達して、
ｈＴｓＨの製造のためにはきわめて好都合である。

このようにして増殖させたヒト由来のリンパ芽球細胞か
ら、ｈＴｓＨを産生させる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来のリ
ンパ芽球細胞を採取し、または、皮下で増殖した腫瘤を
摘出し、分散させた後採取し、この細胞を約２０〜４０
℃に保った栄養培地に細胞濃度が約１０’〜１（）８／
ｍｌになるように浮遊させ、約１〜１００時間保つこと
によって、ｈＴｓＨを産生させればよい。

この際、産生量をより高めるために、例えば、グリシン
、ロイシン、リジン、アルギニン、システィンなどのア
ミノ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、硫酸マグネシウムなどの塩類、甲状腺刺激ホルモン
放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓ
ｉｎｇ ｈｏ−ｒｍｏｎｅ）などのホルモンなどの一種
または二種以上の物質を共存させることも好都合である
。

なお、本発明によって、ｈＴＳＨの産生と同時に他のホ
ルモン、例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、
以下ＨＣＧと略称する。

）、ヒト卵胞刺激ホルモン（Ｈｕｍａｎ Ｆｏｌ １１
ｃｌｅ −ｓｔ ｉｍｕｌａｔ ｉｎｇ Ｈｏｒ−ｍｏ
ｎｅ、以下ｈＦＳＨと略称する。

）などを産生せしめることも自由である。

このようにして産生されたｈＴＳＨは、公知の精製分離
法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、凍結
乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し、採取
することができる。

更に高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオン
交換体への吸着・脱着、ゲル濾過、アフイニテイクロマ
トグラフイー、等電点分画、電気泳動などの公知の方法
を更に組み合せれば、最高純度のｈＴＳＨを採取するこ
とも可能である。

このようにして得たｈＴＳＨは、単一物質で、またはこ
れに他の一種若しくは二種以上の物質を含有せしめ、例
えば、注射薬、外用薬、内服薬、診断薬などとしてヒト
の疾患の予防、治療に有利に利用できる。

ｈＴＳＨの産生量は、Ｓ、Ｗ、Ｍａｎｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ、。

Ｊ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、Ｖｏｌ、６１ 、４１９
−４３６（１９７４）に報告されているラジオレセプタ
ーアッセイ法に準じて測定し、英国ＮａｔｉｏｎａｌＳ
ｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒ
ｅｈより入手される標準ｈＴｓＨの国際単位（ＩＵ）で
表示した。

なお、ＨＣＧの産生量は、Ａ 、 Ｒ、Ｍｉｄｇｌｅｙ
。

Ｊｒ、 、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ 、７
９ 、１Ｏ−１８（１９６６）に報告されているラジオ
イムノアッセイ法に準じて測定し国際単位（ＩＵ）で表
示した。

ｈＦＴＨの産生量は、Ｃ１Ｆａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ−
。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、、
Ｖｏｌ、２７゜４４４−４４７（１９６７）に報告され
ているラジオイムノアッセイ法に準じて測定し、国際単
位（ＩＵ）で示した。

以下、２〜３の実施例を述べる。

実施例 １ 下垂体前葉好塩基性細胞腺腫の患者から摘出、細切、分
散させて得たヒト腫瘍性好塩基性細胞とリンパ芽球様ナ
マルバ細胞（Ｎａｍａｌｖａｃｅｌｌ ）とを１４０
ｍＭ ＮａＣ１、５４ｍＭＫＣＩ。

１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有
する塩類溶液にそれぞれ約１０４／ｍｌになるようフラ
スコに浮遊させ、これに予め紫外線で不活化したセンダ
イウィルスを含有する前記塩類溶液を水冷下で混合し、
約５分後に３７℃恒温水槽に移して、約３０分間攪拌し
つつ細胞触合を起させ、リンパ芽球様ナマルバ細胞にｈ
ＴｓＨ産生能を導入した。

このリンパ芽球ナマルバ細胞を成長したヌードマウスの
腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。

生じた腫瘤約ＩＥＩを摘出し、細切した後、トリプシン
含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散させた。

この細胞を牛胎児血清１０ｖ／ｖ％を補足したＥａｒｌ
ｅ培地１９９（ｐＨ７，２）で洗浄した後、Ｌ−アルギ
ニンを３０ｍＭ存在せしめた同培地に細胞濃度約ＩＱ”
／ｍｌになるように浮遊させ、３７℃で３５時間保って
ｈＴｓＨを産生させた。

その後、細胞を超音波処理し、得られる上清を用いてｈ
ＴＳＨ量を測定したところ、浮遊液ａ当り約１８０ｍＩ
Ｕであった。

なお、この上清には、ｈＦｓＨの活性も認められ、その
量は浮遊液Ｍ当り約５００ｍＩＵであった。

対照として、腫瘍性好塩基性細胞を牛胎児血清１０ｖ／
ｖ％を補足したＥａｒｌｅ培地１９９（ｐＨ７，２）に
３７℃でインビトロで培養させ、得られる細胞を同様に
処理してｈＴＳＨを産生させたところ、浮遊液ｍｌ当り
わずかに０．３ｍＩＵであった。

実施例 ２ 下垂体色素嫌性細胞腺腫患者から摘出、細切、分散させ
て得たヒト色素嫌性腺腫細胞とリンパ芽球様ＪＢＬ細胞
とを実施例１の方法に準じて細胞融合させ、リンパ芽球
様ＪＢＬ細胞にｈＴＳＨ産生能を導入した。

この細胞を、ウサギから公知の方法で調製した抗血清を
予め注射し免疫反応を弱めた新生児ハムスターの皮下に
移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫瘤的１０ｇを摘出し、細切した後、コラ
ゲナーゼ含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散させた
。

この細胞をヒト血清５ｖ／ｖ％を補足したＥａｇｌｅの
最少基本培地（ｐＨ７，４）で洗浄した後、Ｌ−リジン
を２０ｍＭ、硫酸マグネシウム１０ｍＭおよび甲状腺刺
激ホルモン放出ホルモンをｒｕｌ当り１０ｎ９存在せし
めた同培地に細胞濃度約１０６Ａｌｌになるように浮遊
させ、３７°Ｃに２０時間保ってｈＴｓＨを産生させた
。

その産生量を測定したところ、浮遊液−当り約２２０
ｍ Ｉ Ｕであった。

なお、この浮遊液にはＨＣＧの活性も認められ、その量
は浮遊液Ｍ当り約４３０ＩＵであった。

対照として、ｈＴＳＨ産生能を導入したリンパ芽球様Ｊ
ＢＬ細胞を用いて、実施例１と同様にインビトロで培養
し、ｈＴＳＨを産生させたところ、浮遊液ａ当り約８
ｍ Ｉ Ｕであった。

実施例 ３ 新生児ラットの静脈内へ、実施例１の方法に準じてヒト
腫瘍性好塩基性細胞からｈＴＳＨ産生能を導入したリン
パ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植して後、通常の方法で
４週間飼育した。

生じた腫瘤的３０ｇを摘出し、実施例１と同様に細切し
、分散させ処理してｈＴ ＳＨを産生させた。

その産生量は、浮遊液ｍｌ当り約１６０ｍＩＵであった
。

なお、この浮遊液にはｈＦＳＨ（７）活性も認められ、
その量は浮遊液−当り約９９０ｍＩＵであった。

対照として、ｈＴｓＨ産生能を導入したリンパ芽球様Ｂ
ＡＬＬ−１細胞をインビトロで培養し、ｈＴＳＨを実施
例１と同様に産生させたところ浮遊液ａ当り約５ ｒｒ
ｉ Ｉ Ｕにすぎなかった。

実施例 ４ 成長した普通マウスに約４００レムのエックス線を照射
してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮下に実施例１
の方法に従ってヒト色素嫌性腺腫細胞からｈＴＳＨ産生
能を導入したリンパ芽球様ＮＡＬＬ−１細胞を移植し、
通常の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫瘤的１５ｇを摘出し、実施例２と同様に
処理してｈＴＳＨを産生させた。

その産生量は、浮遊液Ｍ当り約２１０ｍＩＵであった。

なお、この浮遊液にはＨＣＧも認められ、その産生量は
、浮遊液ａ当り約４８０ＩＵであった。

対照として、ｈＴｓＨ産生能を導入したリンパ芽球ｍＮ
ＡＬＬ−１細胞をインビトロで培養し、ｈＴｓＨを実施
例２と同様に産生させたところ、浮遊液−当り約７ ｍ
Ｉ Ｕであった。

実施例 ５ 孔径約０．５ミクロンのメンブランフィルタ−を設けた
内容量的１０ＴＬｌのプラスチック製円筒型拡散チャン
バー内に、実施例１の方法に準じてヒト腫瘍性好塩基性
細胞からｈＴＳＨ産生能を導入したリンパ芽球ＴＡＬＬ
−１細胞を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラッ
トの腹腔内に埋設した。

このラットを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チャンバーを取り出した。

これにより得られたＴＡＬＬ−１細胞の濃度は約７Ｘ１
０９／ｍｊ！であって、インビトロでの炭酸ガスインキ
ュベーター中で培養する場合の約１０２倍以上にも達す
ることがわかった。

この細胞を実施例２と同様に処理してｈＴｓＨを産生さ
せた。

その産生量は、浮遊液ａ当り約１７０ｍＩ’［Ｊであっ
た。

この浮遊液にはＨＣＧも認められ、その産生量は、浮遊
液−当り約７２０ＩＵであった。

対照として、ヒト腫瘍性好塩基性細胞を同様に拡散チャ
ンバー内に収容し、ラット腹腔内に埋設して４週間飼育
し、細胞濃度約８Ｘ１０／ｍｌを得、この細胞を用いて
同様にｈＴＳＨを産生させたところ、浮遊液縦当り約０
．１ ｍ Ｉ Ｕに過ぎなかった。

実施例 ６ ３７℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、実施例１の
方法に準じてヒト肺癌細胞からｈＴＳＨ産生能を導入し
たリンパ芽球様ＪＢＬ細胞を移植した後、３７℃で１週
間保った。

この卵を割卵した後、増殖細胞を採取し、実施例１と同
様に処理してｈＴＳＨを産生させた。

その産生量は、浮遊液ａ当り約１４０ｍＩＵであった。

対照として、ヒト肺癌細胞を同様にニワトリの受精卵に
移植したが増殖は見られなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ヒト甲状腺刺激ホルモン産生能を有するヒト由来の
   リンパ芽球様細胞をヒト以外の温血動物に移植し、また
   はその温血動物の体液の供給を受けながら増殖させた細
   胞からヒト甲状腺刺激ホルモンを産生せしめることを特
   徴とするヒト甲状腺刺激ホルモンの製造方法。