JPS5828285A - 固定化酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の固定化に関する。

固定化酵素は産業界において重要性が増しつつあり、特
にいわゆる「バイオテクノロジー」と呼ばれる方面への
急激な関心の増大と共に、その重要性が高くなってきて
いる。事実、経済的な連続操作の達成にはいくつかの実
用上の問題点が存在するが、固定化酵素は酵素触媒反応
の効率的な方法であると長い問いわれてきている。

たとえばブドウ糖シロップの生産において、でんぷんの
バッチ式加水分解および希釈用に長年酵素が溶液中で用
いられてきた。該加水分解酵素を固定化し連続操作を可
能ならしめる多くの方法が提案されているが、どれひと
つとして無条件で受は入れられる方法はない。

酵素自身の固定化は別にして、酵素を単離せずに固定化
する多くの方法が提案されている。特に微生物の細胞全
体を固定化すれば、その細胞を酵素の担体として使用で
きて、その細胞より酵素を抽出する必要がなくなる。

われわれが試みた細胞の固定化方法のなかでは、ゲル（
特にアルギン酸塩ゲル）中の捕捉による固定化が、ゲル
中に比較的大きなすき間を有する相互に結合した不活性
の三次元構造の高分子網の中に細胞が捕捉されることに
よる種々の利点があることがわかっている。もつと一般
的にいうと、他の研究者たちは固定化方法としてのゲル
捕捉（特にアルギン酸＃１ｒルによる捕捉）の有用性に
ついて報告してきている。

ゲル固定化細胞のひとつの問題は、保存期間あるいは輸
送中などのように使用していない時期に、活性が著しく
低下し易いことである。使用していない期間に付随する
もうひとつの問題は、雑菌が汚染繁殖し易いことである
。一般的には、ゲル固定化細胞の調製は使用直前になさ
れることが多いが、使用していないときはゲル固定化細
胞の活性は比較的急速に低下し易い。このデルは高い水
分活性を有するため、カビや細菌などの汚染菌の増殖に
適した環境を提供するものと思われる。活性低下の程度
をみる場合には、操作時の安定性と保存時の安定性が重
要な指標となる。

ゲル固定化細胞を用いたある変換工程の操作中に、ふつ
うは使用にともなって若干の酵素系の活性低下が起きる
。この活性低下の速度は遅く、特に微生物の増殖維持に
不充分な栄養欠乏培地中で細胞が働いている場合にゆっ
くりしている。放射能崩壊と同じように、活性低下は半
減期として評価される。たとえば、ゲル固定化細胞の活
性は、たとえば２０００時間の使用で半減したというこ
とになる。

同様にして、デル固定化細胞を使用していないときの活
性低下を追跡することができる。保存前後あるいは別の
使用してない時期の前後の活性を測定すれば、活性低下
がわかり、このようにして求められた半減期は保存半減
期と呼ばれる。一般的に、この保存半減期は操作時半減
期よりも小さい。

したがって、操作安定性の高いゲル固定化細胞を調製後
ただちに使用しないでおくと、最終的に使用したときに
操作安定性が大きく低下していることがよくある。ゲル
固定化細胞を低温で保存する場合は、プラスチック族の
包装用フィルムでおおったびんの中に入れて保存するだ
けで充分なこともあるが、もつと高い温度（周囲の温度
）で保存する場合は、ｍ＠の胞子が増殖し易いのでふつ
うこの方法では不充分であり、微生物の増殖（主にカビ
の増殖）が特徴的に観察される。従って固定化・細胞は
気密な管の中で保存し、使用直前にのみ開くようにしな
ければならない。たとえこの保存方法がうまくゆくとし
ても、大規模な工業的使用には適さないことが察せられ
るであろう。

われわれは、特に固定化酵素系の取扱いと輸送が簡単に
なるような方法の開発をめざして、固定化細胞の保存方
法を検討してきた。食品工業における生物学的物質保存
の通常法としては、放射線照射、脱水、冷却、極端に高
い（あるいは低い）−や浸透圧の使用などがある。しか
しながら極端な湿度、−１浸透圧などや、これらの操作
を組み合わせた極端な条件に過度にさらすことは避けた
方が望ましい、特に、高い保存安定性が要求される場合
はなおさらである。

具体的な例をひとつあげると、凍結乾燥法はしばしば大
きな活性低下を起こし操作半減期および保存半減期を短
くする。

要約すると、新たに調製したゲル固定化細胞の操作安定
性はしばしば高いものが得られるが、同時に保存安定性
の高いものを得る必要がある。これに加えて機械的強度
が高いことも必要である。

固定化細胞含有ゲルを特殊な脱水剤と接触させ。

長期間に渡って酵素活性を維持し、同時に予想外の利点
を得ることが可能であることを、われわれは見い出した
。

ゲルの基本成分はその９５％までを占める水あるいは他
の溶媒系であることが理解されるであろう。該溶媒はゲ
ルにその特徴的な物理的性質、特に酵素変換工程中に分
子が拡散できる高いゲル内容量を供する。

本発明に従い、固定化酵素系の調製方法をここに示す、
すなわち、酵素含有細胞をデルの中に固定化させ、しか
る後にグリセロールと接触させる。、グリセロールの存
在により、悪影響なしに固定化細胞に高い保存安定性が
与えられる。

該固定化細胞の保存安定性の増加を示すものとして、わ
れわれは該固定化細胞の保存および輸送方法を示す。こ
こでは該固定化細胞はグリセロールの存在下で保存およ
び／あるいは輸送される。

グリセロールの類似化合物を用いても同様の効果が得ら
れないため、グリ七四−ルの効果を説明することはむず
かしい。さらにこの効果は単に固定化系の水分活性を変
えるだけのものではない。

本発明のデルの調製にあたっては、酵素系はゲル中に捕
捉せしめることにより固定化される。該酵素系は単一の
あるいは一連の酵素を含むものであり、酵母や細菌など
の細胞全体という形をとる。

可能なゲル固定化方法の中で、本発明の方法については
アルギン酸塩ゲル中への捕捉を選ぶ。しかしながら他に
適した材料としては、ポリアクリルアミド、寒天、キサ
ンタンガム／ロカストビーンガム、カツパー力ラジーナ
ンあるいはカツパーカラジーナン／ロカストビーンガム
などがある。

アルギン酸塩ゲルについていえば、アルギン酸カルシウ
ムで最も良好な結果が得られる。他の第１族金属と構成
されるような他のアルギン酸塩ゲルを使用することもで
きる。アルギン酸塩中の酵素系の固定には、われわれは
まず全酵素系を可溶性アルギン酸塩（たとえばアルギン
酸ナトリウム）の水溶液と混合せしめる。混合液中の該
酵素濃度は本法の成否には決して決定的に重要なもので
Ｇまなく、ある特別な系については種々の濃度で試験す
ることにより、容易に最適濃度を見出だすことができる
。同様に可溶性アルギン酸塩濃度も決定的に重要ではな
い。

ここで得られる酵素系／アルギン酸塩混合物を、該可溶
性アルギン酸塩とともにゲルを形成する金属塩の溶液中
に計量しながら加える。望ましし１アルギン酸カルシウ
ムのゲルにつし１ては、適切な塩としては塩化カルシウ
ムがあり、特にモル濃度が０．０１から１Ｍの塩化カル
シウム溶液が良しＡ。

該スラリーを計量しながら不連続に滴下することにより
、該細胞を捕捉しているデルの球形ペレットを容易に作
ることができる。ペレットの大きさはいろいろあるが、
直径が約６静め１ら５ｍのものを作ることが望ましい。

しかし大きさと形番まそれ程重要ではなく、塊になった
ゲル中にもあるいは糸状になったデル中にも、該細胞は
簡単に固定化が可能である。

他のゲルを用いた系でも同様の方法で細胞を固定するこ
とができる。ゲル化生成物の調製方法は文献に記載され
ており、それらの方法は簡単に本目的に適応せしめるこ
とができる。

もし必要ならば、細胞を他の物質、特に（しかしこれに
限られるわけではないが）不活性な物質と共同固定をす
ることもできる。好ましくは用いる不活性物質は、２５
０ミクから１５００ミク四ンの大きさの粒子から成るの
がよい。生成物を流動床反応槽中で用いる場合は、最大
の大きさが１５０ミク四ンより小さいものは好ましくな
い。

使用される不活性物質の例としては、天然に存在する物
質あるいは製造物質の多孔質粒子がある。

骨炭は本発明には特に適した不活性物質であり、他の物
質には見られないいくつかの利点を有する。

骨炭は天然に存在する原料から経済的にみあうコストで
得られる。骨炭は主にヒトａキシアパタイト構造から成
り、その上を薄く均一に分散した活性炭が欄っている。

その粒子の形は不規則で外部沈澱物が付着するのに適し
た「あな」を提供している。ざらに骨炭は長年砂糖精製
用に世界中で使用されており、食品工業において使用し
てもまったく無害であることことがよく知られている。

骨炭は充分な熱安定性を有し、弱酸性条件下で使用した
ときでさえ問題を引き起こすような人工添加物はふつう
含有しない。

骨炭粒子の大きさは固定化の成否に決定的に重要ではな
い。粒子の最小の大きさは好ましくは２■未満、さらに
好ましくは１錦未満がよく、最大の大きさは６■未満、
さらに好ましくは２簡未満がよい。

固定化酵素の調製後ゲルを乾燥させてもよい。

乾燥方法が決定的に重要ではないが、室温あるいは室温
に近い温度において空気の流れを利用する単純な空気乾
燥法により、最もよい結果が得られるようである。該デ
ルを初期体積の７０％未満（たとえば４０％未満）にま
で乾燥することが特に適している。できればゲルに会合
している水分のみを乾燥させ、細胞に会合している水分
は残すのがよい。

乾燥−より水分が消失するにもがかわらず、乾燥された
酵素含有ゲルは酵素活性を保持している。

一定量のデルにより単位時間に変換される基質量により
活性を表せば、乾燥によりゲルの活性は減少している。

一方デル体積が減少するということは、ふつう乾燥後単
位体積当りの活性が増加していることを意味する。本発
明の乾燥ゲルを水溶液中の酵素触媒反応に用いた場合あ
る程度の水の摂取が起きるが、ふつうある程度のゲル体
積の減少は維持される。したがってふつうは単位体積あ
たりの活性の増加は維持される。

酵素活性の維持とは別に、本発明の乾燥ゲルは他の有用
な性質を有している。たとえば機械的強度に優れ、圧縮
や摩滅に強く、取扱いや輸送が容易である。

空気乾燥は２０℃から５０　’Ｃで１ｏ時間から２００
時間の条件で行なえるが、３０００がら６５℃で５０時
間から１５０時間行なうのが好ましい。

乾燥中デルをゆっくり転倒させることや水分含量の低い
空気を使用することも有効である。

乾燥デルの体積は非乾燥ゲルの７０％未満であることが
好ましく、重さも非乾燥デルの７０％未満であることが
好ましい。

該ゲルが溶質あるいは基質を含んでいる場合は、乾燥後
酵素活性の保持能力が上昇することがある。

かかる添加物は該乾燥ゲルの安定性を変更させるのに使
用１れることもあり、該ゲルの調製時に添加できる。−
例をあげると、アルギン酸塩ゲルの調製時にショ糖が溶
質として、金属塩溶液（ふつうはカルシウム塩）に有効
に添加される。

該ゲルの調製後、そして乾燥を行なった場合は乾燥後、
該固定化細胞をグリセロールと接触せしめる。グリセル
ール１を当りの細胞のキログラム数で表示した場合、５
：１から１：６０の比率でグリセロールを使用するのが
好ましい。アルギン酸塩デルで実施する場合われわれは
２：１から１：５（ふつうは約１：１）の比率を好んで
用いる。簡単にいえば、固定化細胞を覆うのに充分なグ
リセロールを加えた方がよいことが多い。しかる後に該
細胞はグリセロール環境中での保存、取扱いに適したも
のとなる。周囲の温度以下で保存すれば、該細胞の安定
性はさらによくなる。

グリセルールに非常によく似た化合物では同様の効果が
得られないようであるから、固定化細胞をグリセロール
中に浸漬するかあるいは別の方法でグリセロールに接触
させた場合の保存安定性の増加は驚くべきものである。

使用に際しては、該デル固定化酵素を基質溶液と接触さ
せて、所期の酵素反応を行なわせる。必要ならば該接触
段階の前に、グリセロールをデカントするかあるいは別
の方法により除去できる。

基質溶液との接触は、たとえば該酵素含有ゲルのペレッ
トを充填したカラム中に基質溶液を通すというような連
続操作の一環として行なうことが好ましい。変換された
溶液はかかる後通常法により回収され処理される。

本発明は次の限定されない実施例によって示される。ま
た比較例も示す。

エルグイニアラポンティシ（Ｅｒｙｉｎｉａ　ｒｈ、ａ
ｐｏｎｔｉｃｉ　）の細胞を用いる例では、ショ糖をイ
ソ麦芽糖に変換させる標準法により活性を＃価した。連
続操作のひとつの標準法では、固定化酵素系を包被しだ
カラム（長さ３０Ｃ−、直径５ｃｍ）に充填した。脱イ
オン水を用いてショ糖５５％（”／ｖ）溶液を調製シ、
ｉ、Ｑ　Ｍ　ＮａＯＨテ…乙０に調製した。該ショ糖溶
液をポンプでカラムにのせ、６０℃に維持した。

ショ糖の流速を約０．１力ラム空体檀／時間（ｅ　ｃｖ
Ａ）にすると、ショ糖のイソ麦芽糖への変換は平衡に近
づいた。しかる後に生成物の流速を分析して固定化酵素
系の活性を求めた。この活性はふつう１時間当り、湿細
胞のダラム当りの生成物のグラム数（ｇ／りｃ／ｈ）で
考えるがあるいは、１時間当り、ペレットのダラム当り
の生成物のグラム数（９／ｇｐ／ｈ）で考える。バッチ
式操作や小規模の実験に適した標準法としては、ペレッ
トを基質溶液中で５０℃で約１５時間攪拌し、反応後の
溶液を分析するという簡単な操作で活性を測定した。こ
の測定法では簡単に活性が求められる。

比較例１ 固定化酵素系の調製 エルヴイニアラポンティシ（Ｂｒｗｉｎｉａ　ｒｈａｐ
ｏｎｔｉｃｉ）ＮＣＰＢ８１５７８をアルギン酸ナトリ
ウム脱イオン水溶液（５％乾燥重量／ｖ）に浮遊させて
２０％湿重量／Ｖの細胞浮遊液を作った。しがる後に該
細胞浮遊液を、３０’Ｃに保ち攪拌している塩化カルシ
ウム溶液（０，１Ｍ　）中へ、１０Ｃ１１の高さがら滴
下した。生成するペレットを１時間攪拌した後瀝過した
。

このようにして新たに調製したペレットを連続操作で測
定すると、基質がら生成物への変換率が１００％のとき
０．４　ｇ／９Ｃ／ｈの活性を有していた。

カラムを連続的に流してペレットを連続使用すると、活
性は約８５００時間で半分に減少していた。

したがって調製直後に使用した該ペレットの半減期は約
８５００時間であった。

この固定化酵素試料を調製直後に５５％ショ糖溶液の連
続反応に使用したときの半減期は約８５００時間であっ
たが、該ペレットを保存しようと試みたところ割合急速
に活性が低下した。

該ペレット試料を使用してないときはその時間の長さに
関係なく（たとえば数日であってもあるいはそれ以上で
あっても）、一般的に活性が大きく低下し、雑菌による
汚染があった。該ペレットを新たに調製したときの水分
活性（ａ　　）は１．００であったが、この条件が雑菌
の繁殖に適しているのであろう。該ペレットを１８℃で
保存したときは、プラスチック製の包装用フィルムで被
ったびんの中に入れて保存するだけでよいことが多かっ
たが、周Ｆ！ｌｉ湿変がもっと高いときは菌類胞子が増
殖し易いためかこの方法では不充分であった。微生物の
増殖（主にカビ）は約２００時間以内にペレットの表面
に観察された。

したがって該ペレットは気密な管の中で保存し、使用直
前にのみ開くようにしなければならなかった。かかる保
存方法が大規模な工業的使用には非実用的であることは
賽易に察せられるであろう。

さらに、遠心分離したペレットをこのような条件で保存
した場合の半減期は、わずか１２４時間であった。同様
に、細胞をアルギン酸塩スラリーとして保存した場合の
半減期も、わずか１０１時間であった。

われわれは、特に該固定化酵素系の取扱いと輸送が簡単
になるようなペレットの保存方法の開発をめざして多く
の実験を行なった。

詳細に述べると、該ペレットをその２倍の容量の５５％
ショ糖溶液中で２０℃で５００時間保存し、再び活性を
測定した。５５％シミ糖溶液中でのこの期間の活性低下
の保存半減期はわずか１２０時間であった。さらに、飽
和塩化ナトリウム溶液中での保存安定性は、わずか２５
０時間、であった。

ショ糖溶液中での保存後活性を測定してから、ペレット
を一過し再び重さを測った。液体の摂取のためにペレッ
トの重さは２１６％増加していた。−さらに該ペレット
を凍結乾燥したところ、活性は大きく低下し半減期はわ
ずか１２５時間という短いものになった。したがって、
凍結乾燥により該ペレットの活性は約５日で半分低下す
ることになった。活性がこれだけ低下することは、該ペ
レットの保存、取扱い、輸送には明らかに適さない。

要約すると、新たに調製したペレットの操作安定性は高
いが、保存安定性も同様に高くする必要がある。

例１ グリセ四−ルとの接触 比較例１の新たに調製したペレットを約５０ｇビーカー
に入れ、該ペレットに対し約２倍溶量のアナラ−（商標
）グリ七ｐ−ルを注いだ。しかる後に該ペレットをグリ
セロール中で約２０℃で５００時間、あるいはそれ以上
の期間保存した。

しかる後に活性を測定したところ、グリセロール中での
保存の半減期は約１１００時間であった。

グリセロール中での保存後活性を測定してから、該ペレ
ットを一過し再び重さを測ったところ、該ペレットの重
さは増えていなかった。グリ七〇　−ル中での保存後６
０時間使用しても重さは増えていなかった。

例２ 乾燥とグリセロールとの接触 比較例１の新たに調製されたペレットを約５０７とり、
６０°０で充分通気された環境でたえず攪拌しながら、
単一層として乾燥せしめた。該ペレットが初期体積の４
４％になるまで乾燥を続けた。

しかる後、該乾燥ペレットは例１と同様にグリセロール
中で保存し活性を測定すると、グリセロール中での保存
中の半減期は約８５０時間で□あった。しかし重さを基
準にして比較すると、保存後のペレットは例１のペレッ
トを同じ期間保存したものより高い活性を有していた。

すなわち、該ペレットの保存後の活性は、例１の保存ペ
レットの活性よりも、り／りｃ　／ｈでは低く、’！／
９ｐ／ｈでは高かった。

該ペレットを５５％ショ糖溶液に接触させた時の液体と
りこみ量を求めるために、重さを測定した。例１と同様
に、該ペレットの重さの増加はなく、６０時間使用して
も重さは増加しなかった。

さらにいくつかの実験を行ない、乾燥条件をいろいろ変
化させた。該ペレットが最大活性に到達するまで乾燥す
べき程度は細胞を加える量に反比例していた。これはお
そらく担体に会合した水分よりも、細胞に会合した水分
を除去すると活性が低下するためと思われる。したがっ
て、２０％（ｖＦ′１′／）の細胞を含有したペレット
は、初期体積の５５％まで乾燥後最大の活性を示した。

ペレ゛ントの乾燥には次のような効果もあった。すなわ
ち乾燥によりペレットは強度が増加し、充填カラム中で
の圧縮や攪拌反応槽における摩滅にも強くなり、輸送や
取扱いが容易になった。該ペレットは例１のペレットよ
りもかさばらなく、また流れが均一であった。

乾燥工程を含めることのもうひとつの利点は、乾燥ペレ
ットは非乾燥ペレットに比較して密度が少し高いため、
例２のペレットは流動床反応槽で使用するのにさらに適
していた。

例６ 種々の比率のグリセロールとの接触 例１と例２において一過したグリセロールの水分活性（
ａｌ）を測定した。例１ではａＷは０．７８で、例２で
は０．７６であった。したがってグリセロールはペレッ
トから水を抽出してし翫た。

微生物の増殖を防ぐには、一般的にＧｌ約０．６以下の
水分活性が必要であると考えられてし鳥る。したがって
保存した該固定化酵素系の長期安定性が得られるまで水
分活性が低下することを期待して、グリセロールの使用
量を増やしていった。

例１と同様に、比較例１の新たに調製したペレット（活
性０．６９り／９ｃ／ｈ　）を約５０２とり、それぞれ
ビーカーに入れ次表に示した量のグリセ冒−ルを注ぎこ
んだ。しかる後膣ペレットをグリセロール中で２０℃で
約５００時間保存し、活性を測定して次のような結果を
得た。

種々の比率のグリセロールとの接触 グリセルール：ペレット保存後の活性　相対活性保存安
定性の比率　　　　　　　　　　　（保存前の％＜９　
ｒ−１）　　　（９／９ｅ／ｈ）　　　　として）（ｔ
ｈ）１：１　　　　０．４　　　　　１０２　　　無限
大１：２　　　　　０，３５　　　　　９０　　２５０
０１：３　　　　　０．２５　　　　　６４　　　７０
０１＝５　　　　　０．１５　　　　　３８　　　４１
０１：１０　　　　０．２７　　　　　６９　　　８２
０原因は不明であるがグリセロールの相対量が１：５に
あがると、予想に反して相対活性と保存安定性が低下し
た。その後比率を１８１０に変えると、相対活性と保存
安定性は上昇した。

比較例２ 種々のグリセロール化合物との接触 例１と例６の結果の後、特に実施例の予期せぬ結果の後
その他の化合物についても、比較例１の方法に従い調製
した固定化酵素系の保存安定性を増加させる能力につい
て調べてみた。グリセロールの類似化合物を選び１：１
の比率で用いた。それ以外の点では例１と同じであり、
保存前の初期活性が表に示した値の新たに調製したペレ
ットを使用した。次表に示す結果が得られた。

表 種々のグリセロール類似化合物との接触グリセルールの
　　　　ペレット活性（９部ｇｃ／ｈ）　　相対活性類
似化合物　　　　保存前　保存後　　（％）エチレング
リコール　　　　０．８７　　　０．０９　　　　１０
プタンゾオール　　　　　　０，８７　　　　　０　　
　　　　０ヘキシレングリコール　　１，０９　　　０
．０９　　　　　８１．３．プロパンジオール　　　０
．７８　　　　０．１１　　　　　１４ポリエチレング
リコール ｍｖｌｏｏ　　　　　　　　　０．３７　　　　０　　
　　　　０＋ｎｗ２００　　　　　　　　０．３７　　
　　０　　　　　　０これらの類似化合物からは悪い結
果しか得られないことが分る。これは、特に該化合物の
いくつかが保存剤としての性質、を有していることを考
えると、驚くべきことである。例３と同様に、グリセロ
ールの効果は簡単に合理的な説明がつかない。

例４ グリセロールおよび静菌剤との接触 比較例１の方法により新たに調製したペレットを得た。

ただしアルギン酸塩溶液、塩化カルシウム溶液、グリセ
ロールに静菌剤を次表に示す濃度で添加した。該静菌剤
は市販されており、それらは（１）商標二パ（Ｎｉｐａ
　）のついた物質で安息香酸誘導体のエステル、　（＋
＋）ペニシリンＧ、そして（１１１）クロラムフェニコ
ールである。該ペレットは実施例１と同様の方法で、グ
リセロール中（１：１９：ｄの比率）で保存した。結果
を次表に示す。

グリセロールおよび静菌剤との接触 静菌剤　　　　　　　　ペレット活性（９部ｇＣ／′ｈ
）相対活性保存前　保存後　（％） ０．０６％ニアも七シトナトリウム　　　　　　　１．
００　　　０．６５　　　　５５０．０１％ニパコンピ
ンＡ　　　　　　　　１．００　　　０．６０　　　６
００．０１２５％二パへメチル　　　　　　　１．００
　　　０．８４　　　８４１．７６ｆｉり／−ベニシリ
＞Ｇ　　　　　　　Ｏ，５６０，６７１２０１，７６ｆ
ｎｓ９／ｖＬｔり四ラムフェニコール　　　０．５６　
　　０．５４　　　９６すべての例において固定化酵素
系の保存安定性は高かった。例２のような初期体積の約
４５％までの乾燥を含めて同様の実験を行なったが、再
び非常に高い保存安定性が得られた。　　　　　　　−
例５　　゛ 乾燥とグリセロールおよび静菌剤との接触例２の乾燥工
程を含めて例４の操作を繰返し゛た。

さらにグリセロール濃度も変化させた。各条件と結果を
次表に示すが、次表は２部にわかれている。

新たに調製したペレットの初期活性は０５７９／９ＣＡ
であり、乾燥ペレットの初期活性は０．２５９７９　Ｃ
Ａであった。

表（第１部） 乾燥とグリセロールおよび静菌剤との接触静　菌　剤　
　　　ペレット：グリ　保存後の　保存安定性セｐ−ル
比　　活性　　（半減期） （９ニー１＞　　（Ｖ９Ｃ／ｈ）　　（ｈ）な　　し　
　　　　　　　　１：１　　　０．３２　　　無限大１
な　　し　　　　　　　　　１＋３　　　０．２６　　
　無限大ＯＤ６％二ノぐセゾトナトリウム　　　　１＋
１　　　　　０．１５．８１００ｊ］６％ニア社ブトナ
トリウム　　　１１　　　　０．３１　　　　無限大０
Ｌ０１％ニパコンビ？／Ａ　　　　　１：１　　　　０
．１２　　６２００ｒＪ１％ニパコンビンＡ　　　　１
：３　　　０．２５　　　無限大０４１１２５％ニパヘ
プチル　　　　１：１　　　　０．２３　４０５００Ω
１２５％ニパヘゾチル　　　　１：３　　　０．２５　
　　無限大９無限大とは、保存試験期間中活性低下のみ
られなかったことを意味する 表（第２部） 乾燥とグリセロールおよび静菌剤との接触ペレット：グ
リセ　　　　　　乾燥後　　保存後　保存およびロール
　　　　　　　　　グリセロール前（５０５ｈ）　　使
用＆な　し、１：１　　　　　　　４３．１　　　２９
．０　　　２７，７な　し、１：３　　　　　　　　　
４３，１　　　　２９．４　　　２５．８二ノ♀セプト
ナトリウム、１：１　　　４５，２　　　　３８．５　
　　　５７．５ニア皐セプトナトリウム、１：３　　４
５，２　　　　３５，０　　　３７．にＡ？コ＞ヒンＡ
、’　１　：　１　　　４７．８　　　４４．０　　　
４２．５ニパコ＞ヒンＡ、　１　：３　　　４７．８　
　　４０．５　　　４２．２二パヘゾチル、１：１　　
　　４３．２　　　５６．５　　　３４．８二パヘゾチ
ル、１：３　　　　４３．２　　　３２，８　　　３４
．０一般的に、低水分率のもので高い保存安定性が得ら
れることがわかる。

例６ 他の菌株の使用 他の菌株を用いて例１の方法を繰返し、次表に示す結果
が得られた。

他の菌株の使用 寄託菌株　　　　　　　　ペレット活性（ｇ／ｇＣＡ　
）保存前　保存後　相対値 ＮＣＰＰＢ１７５９　　　０．７８　　０，６　　　７
７ＮＣＰＰＢ　　１５９　　　０，７１　　０．５９　
　８３ＡＴＣＣ２９２Ｂ４　　　０，８８　　０．９３
　　１０６通常の連続的使用法では、該ＡＴＣＣ株の活
性は調製後急速に低下するので、該菌株の保存安定性が
最も予想外であった。

さらに一般的にいうと、他の微生物を用いた実験から本
発明は広く適用できるものであることがわかった。たと
えば、セラチアマル七すンス（Ｂｅｒｒａｔｉａ　ｍａ
ｒｃｅｓｃｅｎａ）　ＮＣＩＢ　８２８５　、セラチア
ノリムチ力（８ｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ
）　ＡＴＣＣ１５９２Ｂ　。

およびプロタミノバクタ−ルーバー （Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｓｒ）　Ｎ
ＣＩＢ　２８７９は、比較例１の方法で固定し、ショ糖
を変換させる通常法で使用されるまで、グリセロール中
で安定に保存された。

代理人　浅　村　　　皓 昭和５７年６月−と日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７　年特許願第　７９０９１　　　号３、補正を
する者 事ｆ’ｌとの関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和　　年　　月　　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）酵素を含有する細胞をゲルの中で固定化し、しか
   る後にグリセロール・と接触させることを特徴とする。 固定化酵素の製造法。 （ｚ）デルに固定化された酵素活性を有する細胞を、グ
   リセロールに接触させたまま保存および／あるいは輸送
   する。かかる細胞の保存および輸送方法。 （８）グリセロールに接触させる前にゲルを乾燥させる
   ことより成る、特許請求の範囲第１項あるいは第２項に
   記載の方法。 （４）室温あるいは室温に近い温度で、空気の流れを利
   用して乾燥させることより成る、特許請求の範囲第３項
   に記載の方法。 （６）ゲルを初期体積の７０％未満まで乾燥させること
   より成る、特許請求の範囲第６項あるいは第４項に記載
   の方法。 （６）グリセロール１を当りの細胞のキログラム数で表
   わした場合、グリセロールを５：１から１＝３０までの
   比率で使用することより成る、特許請求の範囲第１項か
   ら第５項までのいずれか１項に記載の方法。 （７）ゲルがアルギン酸塩デルであり、比率が２：１か
   ら１：５までの範囲である。特許請求の範囲第６項に記
   載の方法。 （８）グリセロールに接触後、デル固定化細胞を周辺の
   温度以下の温度で保存することより成る、特許請求の範
   囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の方法。 （９）デル固定化細胞を脱水剤であるグリセロールを接
   触せしめることより成る、酵素系を含有するゲル固定化
   細胞の保存安定性を高める方法。 （ハ）ｒ　Ａ／Ｂ定化細化細胞グリセロール存在下にお
   いて保存および／あるいは輸送された細胞である。 ゲル固定化細胞を使用する基質の酵素的変換方法。