JPH0361420B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は酵素の固定化に関する。 固定化酵素は産業界において重要性が増しつつ
あり、特にいわゆる「バイオテクノロジー」と呼
ばれる方面への急激な関心の増大と共に、その重
要性が高くなつてきている。事実、経済的な連続
操作の達成にはいくつかの実用上の問題点が存在
するが、固定化酵素は酵素触媒反応の効率的な方
法であると長い間いわれてきている。 たとえばブドウ糖シロツプの生産において、で
んぷんのバツチ式加水分解および希釈用に長年酵
素が溶液中で用いられてきた。該加水分解酵素を
固定化し連続操作を可能ならしめる多くの方法が
提案されているが、どれひとつとして無条件で受
け入れられる方法はない。 酵素自身の固定化は別にして、酵素を単離せず
に固定化する多くの方法が提案されている。特に
微生物の細胞全体を固定化すれば、その細胞を酵
素の担体として使用できて、その細胞より酵素を
抽出する必要がなくなる。 われわれが試みた細胞の固定化方法のなかで
は、ゲル（特にアルギン酸塩ゲル）中の捕捉によ
る固定化が、ゲル中に比較的大きなすき間を有す
る相互に結合した不活性の三次元構造の高分子網
の中に細胞が捕捉されることによる種々の利点が
あることがわかつている。もつと一般的にいう
と、他の研究者たちは固定化方法としてのゲル捕
捉（特にアルギン酸塩ゲルによる捕捉）の有用性
について報告してきている。 ゲル固定化細胞のひとつの問題は、保存期間あ
るいは輸送中などのように使用していない時期
に、活性が著しく低下し易いことである。使用し
ていない期間に付随するもうひとつの問題は、雑
菌が汚染繁殖し易いことである。一般的には、ゲ
ル固定化細胞の調製は使用直前になされることが
多いが、使用していないときはゲル固定化細胞の
活性は比較的急速に低下し易い。このゲルは高い
水分活性を有するため、カビや細菌などの汚染菌
の増殖に適した環境を提供するものと思われる。
活性低下の程度をみる場合には、操作時の安定性
と保存時の安定性が重要な指標となる。 ゲル固定化細胞を用いたある変換工程の操作中
に、ふつうは使用にともなつて若干の酵素系の活
性低下が起きる。この活性低下の速度は遅く、特
に微生物の増殖維持に不充分な栄養欠乏培地中で
細胞が働いている場合にゆつくりしている。放射
能崩壊と同じように、活性低下は半減期として評
価される。たとえば、ゲル固定化細胞の活性は、
たとえば2000時間の使用で半減したということに
なる。 同様にして、ゲル固定化細胞を使用していない
ときの活性低下を追跡することができる。保存前
後あるいは別の使用していない時期の前後の活性
を測定すれば、活性低下がわかり、このようにし
て求められた半減期は保存半減期と呼ばれる。一
般的に、この保存半減期は操作時半減期よりも小
さい。 したがつて、操作安定性の高いゲル固定化細胞
を調製後ただちに使用しないでおくと、最終的に
使用したときに操作安定性が大きく低下している
ことがよくある。ゲル固定化細胞を低温で保存す
る場合は、プラスチツク製の包装用フイルムでお
おつたびんの中に入れて保存するだけで充分なこ
ともあるが、もつと高い温度（周囲の温度）で保
存する場合は、菌類の胞子が増殖し易いのでふつ
うこの方法では不充分であり、微生物の増殖（主
にカビの増殖）が特徴的に観察される。従つて固
定化細胞は気密な管の中で保存し、使用直前にの
み開くようにしなければならない。たとえこの保
存方法がうまくゆくとしても、大規模な工業的使
用には適さないことが察せられるであろう。 われわれは、特に固定化酵素系の取扱いと輸送
が簡単になるような方法の開発をめざして、固定
化細胞の保存方法を検討してきた。食品工業にお
ける生物学的物質保存の通常法としては、放射線
照射、脱水、冷却、極端に高い（あるいは低い）
PHや浸透圧の使用などがある。しかしながら極端
な温度、PH、浸透圧などや、これらの操作を組み
合わせた極端な条件に過度にさらすことは避けた
方が望ましい。特に、高い保存安定性が要求され
る場合はなおさらである。 具体的な例をひとつあげると、凍結乾燥法はし
ばしば大きな活性低下を起こし操作半減期および
保存半減期を短くする。 要約すると、新たに調製したゲル固定化細胞の
操作安定性はしばしば高いものが得られるが、同
時に保存安定性の高いものを得る必要がある。こ
れに加えて機械的強度が高いことも必要である。 固定化細胞含有ゲルを特殊な脱水剤と接触さ
せ、長期間に渡つて酵素活性を維持し、同時に予
想外の利点を得ることが可能であることを、われ
われは見い出した。 ゲルの基本成分はその95％までを占める水ある
いは他の冷媒系であることが理解されるであろ
う。該溶媒はゲルにその特徴的な物理的性質、特
に酵素変換工程中に分子が拡散できる高いゲル内
容量を供する。 本発明に従い、固定化酵素系の調製方法をここ
に示す。すなわち、酵素含有細胞をゲルの中に固
定化させ、しかる後にグリセロールと接触させ
る。グリセロールの存在により、悪影響なしに固
定化細胞に高い保存安定性が与えられる。 該固定化細胞の保存安定性の増加を示すものと
して、われわれは該固定化細胞の保存および輸送
方法を示す。ここでは該固定化細胞はグリセロー
ルの存在下で保存および／あるいは輸送される。 グリセロールの類似化合物を用いても同様の効
果が得られないため、グリセロールの効果を説明
することはむずかしい。さらにこの効果は単に固
定化系の水分活性を変えるだけのものではない。 本発明のゲルの調製にあたつては、酵素系はゲ
ル中に捕捉せしめることにより固定化される。該
酵素系は単一のあるいは一連の酵素を含むもので
あり、酵母や細菌などの細胞全体という形をと
る。 可能なゲル固定化方法の中で、本発明の方法に
ついてはアルギン酸塩ゲル中への捕捉を選ぶ。し
かしながら他に適した材料としては、ポリアクリ
ルアミド、寒天、キサンタンガム／ロカストビー
ンガム、カツパーカラジーナンあるいはカツパー
カラジーナン／ロカストビーンガムなどがある。
アルギン酸塩ゲルについていえば、アルギン酸カ
ルシウムで最も良好な結果が得られる。他の第
族金属と構成されるような他のアルギン酸塩ゲル
を使用することもできる。アルギン酸塩中の酵素
系の固定には、われわれはまず全酵素系を可溶性
アルギン酸塩（たとえばアルギン酸ナトリウム）
の水溶液と混合せしめる。混合液中の該酵素濃度
は本法の成否には決して決定的に重要なものでは
なく、ある特別な系については種々の濃度で試験
することにより、容易に最適濃度を見出だすこと
ができる。同様に可溶性アルギン酸塩濃度も決定
的に重要ではない。 ここで得られる酵素系／アルギン酸塩混合物
を、該可溶性アルギン酸塩とともにゲルを形成す
る金属塩の溶液中に計量しながら加える。望まし
いアルギン酸カルシウムのゲルについては、適切
な塩としては塩化カルシウムがあり、特にモル濃
度が0.01から1Mの塩化カルシウム溶液が良い。 該スラリーを計量しながら不連続に滴下するこ
とにより、該細胞を捕捉しているゲルの球形ペレ
ツトを容易に作ることができる。ペレツトの大き
さはいろいろあるが、直径が約３mmから５mmのも
のを作ることが望ましい。しかし大きさと形はそ
れ程重要ではなく、塊になつたゲル中にもあるい
は糸状になつたゲル中にも、該細胞は簡単に固定
化が可能である。 他のゲルを用いた系でも同様の方法で細胞を固
定することができる。ゲル下生成物の調製方法は
文献に記載されており、それらの方法は簡単に本
目的に適応せしめることができる。 もし必要ならば、細胞を他の物質、特に（しか
しこれに限られるわけではないが）不活性な物質
と共同固定をすることもできる。好ましくは用い
る不活性物質は、250ミクから1500ミクロンの大
きさの粒子から成るのがよい。生成物を流動床反
応槽中で用いる場合は、最大の大きさが150ミク
ロンより小さいものは好ましくない。 使用される不活性物質の例としては、天然に存
在する物質あるいは製造物質の多孔質粒子があ
る。 骨炭は本発明には特に適した不活性物質であ
り、他の物質には見られないいくつかの利点を有
する。 骨炭は天然に存在する原料から経済的にみあう
コストで得られる。骨炭は主にヒドロキシアパタ
イト構造から成り、その上を薄く均一に分散した
活性炭が覆つている。その粒子の形は不規則で外
部沈澱物が付着するのに適した「あな」を提供し
ている。さらに骨炭は長年砂糖精製用に世界中で
使用されており、食品工業において使用してもま
つたく無害であることがよく知られている。骨炭
は充分な熱安定性を有し、弱酸性条件下で使用し
たときでさえ問題を引き起こすような人工添加物
はふつう含有しない。 骨炭粒子の大きさは固定化の成否に決定的に重
要ではない。粒子の最小の大きさは好ましくは２
mm未満、さらに好ましくは１mm未満がよく、最大
の大きさは６mm未満、さらに好ましくは２mm未満
がよい。 固定化酵素の調製後ゲルを乾燥させてもよい。
乾燥方法が決定的に重要ではないが、室温あるい
は室温に近い温度において空気の流れを利用する
単純な空気乾燥法により、最もよい結果が得られ
るようである。該ゲルを初期体積の70％未満（た
とえば40％未満）にまで乾燥することが特に適し
ている。できればゲルに会合している水分のみを
乾燥させ、細胞に会合している水分は残すのがよ
い。 乾燥により水分が消失するにもかかわらず、乾
燥された酵素含有ゲルは酵素活性を保持してい
る。一定量のゲルにより単位時間に変換される基
質量により活性を表せば、乾燥によりゲルの活性
は減少している。一方ゲル体積が減少するという
ことは、ふつう乾燥後単位体積当りの活性が増加
していることを意味する。本発明の乾燥ゲルを水
溶液中の酵素触媒反応に用いた場合ある程度の水
の摂取が起きるが、ふつうある程度のゲル体積の
減少は維持される。したがつてふつうは単位体積
あたりの活性の増加は維持される。 酵素活性の維持とは別に、本発明の乾燥ゲルは
他の有用な性質を有している。たとえば機械的強
度に優れ、圧縮や摩滅に強く、取扱いや輸送が容
易である。 空気乾燥は20℃から50℃で10時間から200時間
の条件で行なえるが、30℃から35℃で50時間から
150時間行なうのが好ましい。乾燥中ゲルをゆつ
くり転倒させることや水分含量の低い空気を使用
することも有効である。 乾燥ゲルの体積は非乾燥ゲルの70％未満である
ことが好ましく、重さも非乾燥ゲルの70％未満で
あることが好ましい。 該ゲルが溶質あるいは基質を含んでいる場合
は、乾燥後酵素活性の保持能力が上昇することが
ある。かかる添加物は該乾燥ゲルの安定性を変更
させるのに使用されることもあり、該ゲルの調製
時に添加できる。一例をあげると、アルギン酸塩
ゲルの調製時にシヨ糖が溶質として、金属塩溶液
（ふつうはカルシウム塩）に有効に添加される。 該ゲルの調製後、そして乾燥を行なつた場合は
乾燥後、該固定化細胞をグリセロールと接触せし
める。グリセロール１当りの細胞のキログラム
数で表示した場合、５：１から１：30の比率でグ
リセロールを使用するのが好ましい。アルギン酸
塩ゲルで実施する場合われわれは２：１から１：
５（ふつうは約１：１）の比率を好んで用いる。
簡単にいえば、固定化細胞を覆うのに充分なグリ
セロールを加えた方がよいことが多い。しかる後
に該細胞はグリセロール環境中での保存、取扱い
に適したものとなる。周囲の温度以下で保存すれ
ば、該細胞の安定性はさらによくなる。 グリセロールに非常によく似た化合物では同様
の効果が得られないようであるから、固定化細胞
をグリセロール中に浸漬するかあるいは別の方法
でグリセロールに接触させた場合の保存安定性の
増加は驚くべきものである。 使用に際しては、該ゲル固定化酵素を基質溶液
と接触させて、所期の酵素反応を行なわせる。必
要ならば該接触段階の前に、グリセロールをデカ
ントするかあるいは別の方法により除去できる。
基質溶液との接触は、たとえば該酵素含有ゲルの
ペレツトを充填したカラム中に基質溶液を通すと
いうような連続操作の一環として行なうことが好
ましい。変換された溶液はかかる後通常法により
回収され処理される。 本発明は次の限定されない実施例によつて示さ
れる。また比較例も示す。 エルヴイ＝アラポンテイシ（Erwinia
rhapontici）の細胞を用いる例では、シヨ糖をイ
ソ麦芽糖に変換させる標準法により活性を評価し
た。連続操作のひとつの標準法では、固定化酵素
系を包被したカラム（長さ30cm、直径５cm）に充
填した。脱イオン水を用いてシヨ糖55％（ｗ／
ｖ）溶液を調製し、1.0M NaOHでPH7.0に調製
した。該シヨ糖溶液をポンプでカラムにのせ、30
℃に維持した。シヨ糖の流速を約0.1カラム空体
積／時間（ecv／ｈ）にすると、シヨ糖のイソマ
ルチユロースへの変換は平衡に近づいた。しかる
後に生成物の流速を分析して固定化酵素系の活性
を求めた。この活性はふつう１時間当り、湿細胞
のグラム当りの生成物のグラム数（ｇ／ｇｃ／
ｈ）で考えるかあるいは、１時間当り、ペレツト
のグラム当りの生成物のグラム数（ｇ／ｇｐ／
ｈ）で考える。バツチ式操作や小規模の実験に適
した標準法としては、ペレツトを基質溶液中で30
℃で約15時間撹拌し、反応後の溶液を分析すると
いう簡単な操作で活性を測定した。この測定法で
は簡単に活性が求められる。 比較例 １ 固定化酵素系の調製 エルヴイ＝アラポンテイシ（Erwinia
rhapontici）NCPBB1578をアルギン酸ナトリウ
ム脱イオン水溶液（５％乾燥重量／ｖ）に浮遊さ
せて20％湿重量／ｖの細胞浮遊液を作つた。しか
る後に該細胞浮遊液を、30℃に保ち撹拌している
塩化カルシウム溶液（0.1M）中へ、10cmの高さ
から滴下した。生成するペレツトを１時間撹拌し
た後過した。 このようにして新たに調製したペレツトを連続
操作で測定すると、基質から生成物への変換率が
100％のとき0.4ｇ／ｇｃ／ｈの活性を有してい
た。カラムを連続的に流してペレツトを連続使用
すると、活性は約8500時間で半分に減少してい
た。したがつて調製直後に使用した該ペレツトの
半減期は約8500時間であつた。 この固定化酵素試料を調製直後に55％シヨ糖溶
液の連続反応に使用したときの半減期は約8500時
間であつたが、該ペレツトを保存しようと試みた
ところ割合急速に活性が低下した。 該ペレツト試料を使用してないときはその時間
の長さに関係なく（たとえば数日であつてもある
いはそれ以上であつても）、一般的に活性が大き
く低下し、雑菌による汚染があつた。該ペレツト
を新たに調製したときの水分活性（a_w）は1.00で
あつたが、この条件が雑菌の繁殖に適しているの
であろう。該ペレツトを18℃で保存したときは、
プラスチツク製の包装用フイルムで被つたびんの
中に入れて保存するだけでよいことが多かつた
が、周囲温度がもつと高いときは菌類胞子が増殖
し易いためかこの方法では不充分であつた。微生
物の増殖（主にカビ）は約200時間以内にペレツ
トの表面に観察された。 したがつて該ペレツトは気密な管の中で保存
し、使用直前にのみ開くようにしなければならな
かつた。かかる保存方法が大規模な工業的使用に
は非実用的であることは容易に察せられるであろ
う。さらに、遠心分離したペレツトをこのような
条件で保存した場合の半減期は、わずか124時間
であつた。同様に、細胞をアルギン酸塩スラリー
として保存した場合の半減期も、わずか101時間
であつた。 われわれは、特に該固定化酵素系の取扱いと輸
送が簡単になるようなペレツトの保存方法の開発
をめざして多くの実験を行なつた。 詳細に述べると、該ペレツトをその２倍の容量
の55％シヨ糖溶液中で20℃で500時間保存し、再
び活性を測定した。55％シヨ糖溶液中でのこの期
間の活性低下の保存半減期はわずか120時間であ
つた。さらに、飽和塩化ナトリウム溶液中での保
存安定性は、わずか250時間であつた。 シヨ糖溶液中での保存後活性を測定してから、
ペレツトを過し再び重さを測つた。液体の摂取
のためにペレツトの重さは216％増加していた。 さらに該ペレツトを凍結乾燥したところ、活性
は大きく低下し半減期はわずか125時間という短
いものになつた。したがつて、凍結乾燥により該
ペレツトの活性は約５日で半分低下することにな
つた。活性がこれだけ低下することは、該ペレツ
トの保存、取扱い、輸送には明らかに適さない。 要約すると、新たに調製したペレツトの操作安
定性は高いが、保存安定性も同様に高くする必要
がある。 例 １ グリセロールとの接触 比較例１の新たに調製したペレツトを約50ｇビ
ーカーに入れ、該ペレツトに対し約２倍容量のア
ナラー（商標）グリセロールを注いだ。しかる後
に該ペレツトをグリセロール中で約20℃で500時
間、あるいはそれ以上の期間保存した。しかる後
に活性を測定したところ、グリセロール中での保
存の半減期は約1100時間であつた。 グリセロール中での保存後活性を測定してか
ら、該ペレツトを過し再び重さを測つたとこ
ろ、該ペレツトの重さは増えていなかつた。グリ
セロール中での保存後60時間使用しても重さは増
えていなかつた。 例 ２ 乾燥とグリセロールとの接触 比較例１の新たに調製されたペレツトを約50ｇ
とり、30℃で充分通気された環境でたえず撹拌し
ながら、単一層として乾燥せしめた。該ペレツト
が初期体積の44％になるまで乾燥を続けた。 しかる後、該乾燥ペレツトは例１と同様にグリ
セロール中で保存し活性を測定すると、グリセロ
ール中での保存中の半減期は約850時間であつた。
しかし重さを基準にして比較すると、保存後のペ
レツトは例１のペレツトを同じ期間保存したもの
より高い活性を有していた。すなわち、該ペレツ
トの保存後の活性は、例１の保存ペレツトの活性
よりも、ｇ／ｇｃ／ｈでは低く、ｇ／ｇｃ／ｈで
は高かつた。 該ペレツトを55％シヨ糖溶液に接触させた時の
液体とりこみ量を求めるために、重さを測定し
た。例１と同様に、該ペレツトの重さの増加はな
く、60時間使用しても重さは増加しなかつた。 さらにいくつかの実験を行ない、乾燥条件をい
ろいろ変化させた。該ペレツトが最大活性に到達
するまで乾燥すべき程度は細胞を加える量に反比
例していた。これはおそらく担体に会合した水分
よりも、細胞に会合した水分を除去すると活性が
低下するためと思われる。したがつて、20％
（ww／ｖ）の細胞を含有したペレツトは、初期
体積の35％まで乾燥後最大の活性を示した。ペレ
ツトの乾燥には次のような効果もあつた。すなわ
ち乾燥によりペレツトは強度が増加し、充填カラ
ム中での圧縮や撹拌反応槽における摩滅にも強く
なり、輸送や取扱いが容易になつた。該ペレツト
は例１のペレツトよりもかさばらなく、また流れ
が均一であつた。 乾燥工程を含めることのもうひとつの利点は、
乾燥ペレツトは非乾燥ペレツトに比較して密度が
少し高いため、例２のペレツトの流動床反応槽で
使用するのにさらに適していた。 例 ３ 種々の比率のグリセロールとの接触 例１と例２において過したグリセロールの水
分活性（a_w）を測定した。例１ではa_wは0.78で、 例２では0.73であつた。したがつてグリセロー
ルはペレツトから水を抽出していた。 微生物の増殖を防ぐには、一般的には約0.6以
下の水分活性が必要であると考えられている。し
たがつて保存した該固定化酵素系の長期安定性が
得られるまで水分活性が低下することを期待し
て、グリセロールの使用量を増やしていつた。 例１と同様に、比較例１の新たに調製したペレ
ツト（活性0.39ｇ／ｇｃ／ｈ）を約50ｇとり、そ
れぞれビーカーに入れ次表に示した量のグリセロ
ールを注ぎこんだ。しかる後該ペレツトをグリセ
ロール中で20℃で約500時間保存し、活性を測定
して次のような結果を得た。

【表】 原因は不明であるがグリセロールの相対量が
１：５にあがると、予想に反して相対活性と保存
安定性が低下した。その後比率を１：10に変える
と、相対活性と保存安定性は上昇した。 比較例 ２ 種々のグリセロール化合物との接触 例１と例３の結果の後、特に実施例の予期せぬ
結果の後その他の化合物についても、比較例１の
方法に従い調製した固定化酵素系の保存安定性を
増加させる能力について調べてみた。グリセロー
ルの類似化合物を選び１：１の比率で用いた。そ
れ以外の点では例１と同じであり、保存前の初期
活性が表に示した値の新たに調製したペレツトを
使用した。次表に示す結果が得られた。

【表】 これらの類似化合物からは悪い結果しか得られ
ないことが分る。これは、特に該化合物のいくつ
かが保存剤としての性質を有していることを考え
ると、驚くべきことである。例３と同様に、グリ
セロールの効果は簡単に合理的な説明がつかな
い。 例 ４ グリセロールおよび静菌剤との接触 比較例１の方法により新たに調製したペレツト
を得た。ただしアルギン酸塩溶液、塩化カルシウ
ム溶液、グリセロールに静菌剤を次表に示す濃度
で添加した。該静菌剤は市販されており、それら
は（）商標ニパ（Nipa）のついた物質で安息
香酸誘導体のエステル、（）ペニシリンＧ、そ
して（）クロラムフエニコールである。該ペレ
ツトは実施例１と同様の方法で、グリセロール中
（１：１ｇ：mlの比率）で保存した。結果を次表
に示す。

【表】 ル

【表】 ムフエニコール
すべての例において固定化酵素系の保存安定性
は高かつた。例２にような初期体積の約45％まで
の乾燥を含めて同様の実験を行なつたが、再び非
常に高い保存安定性が得られた。 例 ５ 乾燥とグリセロールおよび静菌剤との接触 例２の乾燥工程を含めて例４の操作を繰返し
た。さらにグリセロール濃度も変化させた。各条
件と結果を次表に示すが、次表は２部にわかれて
いる。新たに調製したペレツトの初期活性は0.57
ｇ／ｇｃ／ｈであり、乾燥ペレツトの初期活性は
0.25ｇ／ｇｃ／ｈであつた。

【表】 下のみられなかつたことを意味する

【表】 一般的に、低水分率のもので高い保存安定性が
得られることがわかる。 例 ６ 他の菌株の使用 他の菌株を用いて例１の方法を繰返し、次表に
示す結果が得られた。

【表】 通常の連続的使用法では、該ATCC株の活性は
調製後急速に低下するので、該菌株の保存安定性
が最も予想外であつた。 さらに一般的にいうと、他の微生物を用いた実
験から本発明は広く適用できるものであるがわか
つた。たとえば、セラチアマルセサンス
（Serratia marcescens）NCIB8285、セラチアプ
リムチカ（Serratia plymuthica）ATCC15928、
およびプロタミノバクタールーバー
（Protaminobacter ruber）NCIB2879は、比較
例１の方法で固定し、シヨ糖を変換させる通常法
で使用されるまで、グリセロール中で安定に保存
された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素を含有する細胞をゲルの中に固定化し、
   しかる後にグリセロールと接触させることを特徴
   とする、固定化酵素の製造法。 ２ グリセロールに接触させる前にゲルを乾燥さ
   せることより成る請求項１記載の方法。 ３ 室温あるいは室温に近い温度で、空気の流れ
   を利用して乾燥させることより成る、請求項２記
   載の方法。 ４ ゲルを初期体積の70％未満まで乾燥させるこ
   とより成る、請求項２又は３記載の方法。 ５ グリセロール１当りの細胞のキログラム数
   で表わした場合、グリセロールを５：１から１：
   30までの比率で使用することより成る、請求項１
   から４のいずれか１項に記載の方法。 ６ ゲルがアルギン酸塩ゲルであり、比率が２：
   １から１：５までの範囲である、請求項５記載の
   方法。 ７ グリセロールに接触後、ゲル固定化細胞を周
   辺の温度以下の温度で保存することより成る、請
   求項１から６のいずれか１項に記載の方法。