JPS5829962B2 - 親水性水不溶性微粒子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規親水性不溶性微粒子の製造方法に関する。

近年医学診断の目的をもって合成高分子化合物ラテック
スがしばしば利用されている。

最もよく用いられているのはポリスチレンラテックスで
ある。

例えばポリスチレン微粒子を白血球に貧食させて白血球
の貧食能を測定することが行なわれる。

またポリスチレン微粒子表面に免疫活性物質を吸着させ
ておき、その凝集反応や細胞への不着反応により、免疫
学的検査を行なうことが多い。

しかしながらポリスチレン微粒子を利用する場合の問題
点は、ポリスチレンが疎水性であるため細胞に非選択的
に付着して生理反応を惹起することである。

またポリスチレン表面に固定すべき抗体などの免疫活性
蛋白質の吸着が強くないために、凝集反応でも限られた
場合にしか満足な結果を得ることができない。

またアガロース、架橋デキストランおよびポリアクリル
アミドなどの親水性ゲルも蛋白質に対する非特異的吸着
が少ないために免疫吸着クロマトグラフの担体としてし
ばしば利用されている。

この場合抗原又は抗体などの免疫活性物質の担体への固
定は共有結合によって行なわれる。

しかし従来知られたこれらクロマトグラフ用ピースの直
径は１０μ以上であって貧食能測定用、細胞付着用マー
カーないし凝集反応用としては適当とはいえない。

貧食能測定のためには平均直径が０．１ないし５μの範
囲で、細胞への非特異的付着がない微粒子がのぞましい
。

さらに染色、螢光または放射能で標識できれば好都合で
ある。

細胞付着用ないし凝集反応用マイクロピースの担体とし
て望ましいのは直径が０．１ないし１０μの範囲で、細
胞への付着や血清蛋白の非特異的吸着がなく、しかも蛋
白質や螢光物質を化学的に結合させるのに必要な官能基
を有することである。

ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ、 ９ 、３２８ （１９
７６）には、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（以
下ＨＥＭＡと略記）を放射線を用いて水中で重合するこ
とにより粒径０．３ないし３μの範囲のＰＨＥＭＡ微粒
子を得、それを細胞標識用マーカーとして応用すること
が提案されている。

このＰＨＥＭＡ微粒子は粒度分布も比較的狭く細胞標識
以外の免疫試験にも利用可能と思われるが、放射線重合
によらなければ製造できないことが大きな制約である。

一方、特公昭５３−１６０３７号公報にはＨＥＭＡおよ
び交さ結合剤を芳香族炭化水素のような不活性希釈剤中
で重合することにより直径１０μ以下のＰＨＥＭＡ微粒
子を得られることが提案されている。

しかしこれらＰＨＥＭＡ微粒子の問題点は生理食塩水、
尿または血清中で自発凝集を起こしやすいことである。

本発明の主要な目的の一つは、表面に免疫活性物質（例
えば抗原）を固定化した微粒子がその固定化した免疫活
性物質と特異的に反応する別の免疫活性物質（例えば抗
体）と接触することにより凝集する現象を利用して免疫
学的検査を行なうために好適に利用される担体微粒子を
提供することにある。

かかる用途への利用に際し、免疫学的反応と無関係に自
発凝集が起こっては目的とする検査が行なえないことは
明らかであろう。

本発明者らは凝集反応、細胞標識および貧食能測定等の
免疫学的ないし細胞学的検査に有用な微粒子を開発すべ
く鋭意研究の結果本発明に到達した。

すなわち本発明は、グリシジルメタクリレートを５０モ
ル％以上、分子内に重合性炭素炭素二重結合を少なくと
も２個含む架橋性単量体を０．１〜３０モル％の範囲で
含有する付加重合性単量体混合物を、該単量体混合物は
溶解するが重合により生成する重合体は沈澱析出するよ
うな有機溶媒中で重合させ、沈澱析出した微粒子状重合
体を加水分解させることを特徴とする なる繰返し単位が全繰返し単位の少なくとも５０モル％
を占める架橋重合体で、２５℃における平衡含水率が１
０ないし９０％の範囲にあり、含水状態における平均直
径がｏ、ｉ〜１０μの範囲内にある親水性水不溶性微粒
子の製造法を提供するものである。

本発明による微粒子はヒトおよび動物の細胞に非特異的
に付着することがなく、また血清から蛋白質を非特異的
に吸着することも、実質上ないといってよい。

また生理食塩水や尿により凝集することがなく、血清に
おいても４倍以上に希釈すれば実質上凝集することはな
い。

またヒドロキシル基やエステル結合を含んでいるためそ
の反応性を利用して抗原・抗体をはじめとして生理活性
物質や免疫活性物質を共有結合によって固定化すること
ができる。

また螢光標識や染色も容易である。本発明の微粒子を構
成する重合体は、２，３−ジヒドロキシプロピルメタク
リレートが繰り返し単位の少なくとも５０モル％を占め
る架橋重合体であり、この場合、５０モル％未満の範囲
で許容される共重合成分としては非架橋性共重合成分と
架橋性共重合成分が包含されるが、非架橋性共重合成分
としては、例えばメタクリル酸メチル、メタクリルアミ
ド、アクリルアミド、２−オキシェチルメククリレート
、メタクリル酸、ジエチルアミノエチルメタクリレート
、ジエチルアミノエチルメタクリレートおよびスチレン
などの炭素炭素−重結合を有する付加重合性化合物があ
る。

これら非架橋性共重合成分の添加は必ずしも必要ではな
いが、非架橋性共重合成分の導入によって粒子の親水性
、含水率および分散安定性などを調節することができる
。

粒子の含水率は架橋度によってもまた調節することがで
きる。

重合体の架橋は必要不可欠の条件である。

何故なら主成分である２゜３−ジヒドロキシプロピルメ
タクリレートの重合体は非架橋の状態では水に溶解して
しまい粒子の形態を保ち得ないからである。

なお非架橋性共重合成分の割合が５０モル％を越えると
、微粒子が本発明の目的とする性能、すなわち血清や尿
と混合しても凝集せずに安定に分散状態を保つこと、細
胞に非特異的に付着しないこと、血清蛋白を非特異的に
吸着しないことなどの特長を持ち得ない。

本発明の微粒子は、その表現から自明のとおり固体状態
を維持するに十分な合子量を有しているが、架橋構造を
有するため、通常の手段でその具体的値を測定すること
は不可能である。

本発明の微粒子は含水率が１０ないし９０％であること
が必要である。

含水率は次式によって定義され、２５℃で測定する。

含水率が１０％未満では粒子が細胞に非特異的に付着し
やすいこと、自発的に凝集しやすいことなどの問題があ
り本発明の目的に適しない。

また含水率が９０％以上になると含水ゲル粒子と水性媒
体との間の屈折率の差が非常に小さくなり、凝集・細胞
付着・貧食などの現象を肉眼的にも顕微鏡的にも観察し
難くなる。

粒子を観察しやすくするために染色することはしばしば
利用される技法であるが、９０％以上の高含水率では濃
色に着色することは困難である。

本発明の微粒子の平均直径は０．１ないし１０μの範囲
内にあることが必要である。

粒径が０．１μ以下では凝集を肉眼により観察すること
も、細胞への付着を光学顕微鏡により観察することも困
難となる。

粒径１０μ以上では粒子の分散安定性が悪くなり、また
細胞に対しても相対的に大きくなるので細胞付着の観察
にも適しない。

なお上記の説明から理解できるように粒径の分布はでき
るだけ狭いことがのぞましい。

具体的には例えば粒径の標準偏差を平均直径（数平均）
で除した値が０．２以下であれば本発明の目的に適して
いるということができる。

上記の特徴を有する本発明の重合体微粒子の製造方法は
グリシジルメタクリレートを単独、若しくは他のエチレ
ン性不胞和単量体と共に架橋剤の共存下に適当な希釈剤
中で重合することにより、グリシジルメタクリレートの
単独重合体又は共重合体の微粒子を析出せしめ、その微
粒子を酸性またはアルカリ性の水溶液で処理することに
より、グリシジルメタクリレート単位中のエポキシ環を
加水分解することよりなる。

ここで適当な希釈剤とはグリシジルメタクリレート単量
体が容易に溶解するが重合により生成するポリグリシジ
ルメタクリレートが溶解せずに沈澱析出するような媒体
のことであり、例えば酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、
酢酸イソプロピル、酢酸ブチル各異性体およびプロピオ
ン酸の上記相当エステルなどのエステル類、メチルｎ−
プロピルケトン、メチルイソプロピルケトンおよびメチ
ルイソブチルケトンなとのケトン類などである。

上記重合媒体は混合使用してもよい。

また四塩化炭素、クロロホルム、ブロモホルムなどのハ
ロゲン化炭化水素と混合また架橋剤としては、例えばエ
チレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコ
ールジメタクリレート、およびＨ（−ＯＣＨ２−ＣＨ２
）、 −０Ｈ（ｎは３以上の整数）で表わされるポリエ
チレングリコールのジメタクリレート、ジビニルベンゼ
ン、またはメチレンビスアクリルアミドなどが好ましく
用いられる。

架橋性単量体の添加量は通常全単量体中の０．１〜３０
モル％である。

０．１モル％以下では、後で重合体中のエポキシ基を加
水分解した時に重合体が水に溶解してしまうのを抑える
ことができない。

また３０モル％以上にすると重合中の粒子の分散状態が
悪くなり凝集傾向が顕著となる。

非架橋性共重合成分を添加する意義および適当な非架橋
性共重合成分の種類についてはすでに述べたが、非架橋
性共重合成分を使用することによるもう１つの大きな効
果は重合体微粒子の粒度の調節である。

共重合性成分の種類によって重合体微粒子の平均直径は
大きく変り得る。

平均粒径に影響するもう一つの大きな因子は重合媒体の
種類である。

すなわち生成する重合体粒子の直径は主として重合媒体
および共重合成分の種類とその添加量によって調節する
。

ただし共重合成分は架橋性および非架橋性を合わせて全
単量体の５０モル％を越えることはできない。

共重合成分が５０モル□以上の範囲ではすでに述べたよ
うに生成する粒子の生理食塩水、尿および血清などに対
する分散安定性や蛋白質の非吸着性などが失われ本発明
の目的にそぐわなくなる。

重合開始剤としては通常のラジカル重合開始剤、例えば
、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２．２′−
アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２
′−アゾビス（２，４−ジメチル４−メトキシバレロニ
トリル）、２．２’−アゾビス（４−メトキシ−４，２
−ジメチルバレロニトリル）などのアブ化合物、過酸化
ベンゾイル、ジラウロイルパーオキサイド、ジーｔｅｒ
ｔブチルパーオキサイドなどの過酸化物を用いることが
できる。

重合温度も通常のラジカル重合の温度範囲でよく２０℃
ないし８０℃がとくに好ましい。

重合開始剤の重合混合液中の濃度は、通常０．００１な
いし０．０３モル／ｌ程度である。

単量体の重合混合液中の濃度は通常５ないし５０重量％
の範囲が好ましい。

単量体濃度が５０重量％を超えると生成する重合体粒子
が凝集する傾向がある。

また単量体濃度が５重量％未満でも本発明は実施可能で
あるが、得られる重合体微粒子が少くなるので生産性が
低くなる。

なお重合は窒素またはアルゴンなどの不活性ガスで置換
して行なうのがのぞましい。

次に上記のようにして製造したグリシジルメタクリレー
トを主成分とする重合体微粒子を加水分解処理する。

この加水分解は通常酸性又はアルカリ性水溶液で重合体
微粒子を処理することにより実施され、重合体中のエポ
キシ基を加水分解してジオールに変換するものである。

その際反応条件が過酷であるとエステル結合まで加水分
解されるのでそれを避けるためにできるだけ緩和な条件
を選ぶことが望ましい。

アルカリはエステルを切断する傾向が強いので一般的に
言えば酸性の条件を使用するのが好ましい。

酸としては例えば硫酸、塩酸、硝酸、リン酸などの無機
酸又はベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸などの
有機酸の希薄水溶液が好ましい。

酸濃度としては０．０１ないし１規定の範囲が好ましい
。

加水分解温度は０℃ないし５０℃の範囲が好ましい。

それより高温では副反応が無視できなくなる。

上記のように反応条件が緩和であるため反応速度が小さ
く、十分な撹拌を行なっても通常反応完結には相当の時
間を要する。

そこで反応系にアセ１〜ン、テトラヒドロフラン、ジオ
キサンなど水に可溶で該重合体を膨潤させる能力のある
有機溶媒を添加すると反応を促進することができる。

これらの溶媒によって重合体が膨潤し酸が重合体粒子内
部に拡散するのを助けられるものと解釈されるが、その
結果加水分解の反応時間を短縮することができる。

加水分解終了後、粒子は通常十分量の水で洗浄される。

さらに炭酸水素ナトリウム水溶液等で洗浄してもよい。

このようにしてほとんど副反応を起こすことなくエポキ
シ基を１，２−ジオールに変換し、２，３−ジオキシプ
ロピルメタクリレートを主成分とする重合体粒子を製造
することができる。

目的とする重合体が生成していることは例えば実施例１
で詳しく述べるように赤外線吸収スペクトルにより確認
することができる。

このようにして製造した２、３−ジオキシプロピルメタ
クリレートを主成分とする重合体微粒子は含水状態にお
ける平均直径が０．１ないし１０μの範囲にあり、粒度
分布も比較的狭い。

また２５℃における平衡含水率は１０〜９０％の範囲に
あり通常水に分散した状態で保存されるが、乾燥して保
存してもよい。

乾燥微粒子は使用時に水を加えて振り混ぜれば容易に再
分散することができる。

実施例 １ グリシジルメタクリレートとトリエチレングリコールジ
メタクリレートとを９５：５のモル比で混合し、この単
量体混合物２３部（重量基準、以下同じ）を７７部のプ
ロピオン酸エチルに溶解し、２．２′−アゾビス（２，
４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）０．１部
を添加して重合させた。

重合開始剤の初濃度は３．６ ｍｍ ｏｌ ／１２であ
る。重合はアルゴン雰囲気下４０℃で１．５時間静置状
態で行なった。

所定時間経過後白濁した重合混合物をアセトンに注ぎ、
１５００Ｘ、９，１０分間で遠心分離し、沈降した粒子
をエタノールで再分散して洗浄、次いで再び遠心分離し
た。

減圧下に乾燥し２０部の微粒子状重合体を得た。

この微粒子状重合体１部をＮ／２０硫酸１００に懸濁さ
せ３０℃で１４日間撹拌し加水分解を行なった。

時間が経過するにつれて懸濁液は不透明度が減少し、ま
た微粒子の分散状態が安定化して撹拌を止めても沈降し
にくくなっていることが観察された。

加水分解終了後微粒子は遠沈・分散を繰り返す事により
水で洗浄した。

分散液の一部を乾燥し、赤外線吸収スペクトルを測定し
た。

別に２，３−ジオキシプロピルメタクリレート単量体と
トリエチレングリコールジメタクリレートとを９５：５
のモル比で混合し、水中で過硫酸アンモニウムを重合開
始剤として常法により重合することによって調製した標
品重合体の赤外吸収スペクトルが上記微粒子状重合体の
赤外吸収スペクトルと一致した。

したがってここで得られた微粒子状重合体は、トリエチ
レングリコールジメタクリレートによって橋かけされた
ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）であ
る。

この重合体微粒子を光学顕微鏡により１０００倍の倍率
で観察すると、粒子の直径は１．６μから３．２μの範
囲にあり、平均２．７μであった。

次に乾燥粒子０．５ｇをブルーデキストラン５ｍｙ／ｍ
ｌ！溶液２ｍｌに加えて分散し、２５℃で１夜放置した
後ブルーデキストラン濃度を再び測定し、乾燥粒子を加
えたことによるブルーデキストランの濃度変化から、粒
子の含水率を計算した結果、含水率は４８％であった。

ブルーデキストランとしてはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａｎ
２０００ （平均分子量２，０００，０００）を使用
し、その溶液中の濃度は６２０ｍ！ｉの吸収により測定
した。

実権例 ２゜ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチルメタクリ
レートおよびエチレングリコールジメタクリレートの３
者を８５．７ ： ９．５ ： ４．８のモル比で混合
し、その単量体混合物２４部、プロピオン酸エチル７６
部および２，２′−アゾビス（２，４−ジメチル−４−
メトキシバレロニトリル）０．１３部（４，７ｍｍｏｌ
／１１ ）の混合物を実施例１と同様にして重合させた
。

ただし重合時間のみ３時間に変＊申更した。

同様にアセトンおよびエタノールで洗浄して乾燥させた
。

微粒子状重合体の収量は４７部であった。

この重合体微粒子１部を水５０部、アセトン５０部およ
び濃硫酸０．２部の混合液に分散し、３０℃で７日間撹
拌して加水分解を行なった。

この重合体粒子を光学顕微鏡により１０００倍の倍率で
観察すると粒子の直径の分布は表１の通りである。

直径の平均は３．５２μ、標準偏差は０．４４７μ、し
たがって標準偏差／平均＝０．１２６である。

実施例１と同様にしてブルーデキストラン法により含水
率を測定すると、２５℃における含水率は４６％であっ
た。

また別法として水で膨潤した粒子と乾燥脱水した粒子の
直径の比から含水率を求めた。

すなわちハイドロゲルの容積についてその構成成分であ
るポリマと水との加成性が成り立つと仮定すれば下式（
１）が導かれる。

ただし、Ｓｗ＝膨潤粒子直径 Ｓｄ−乾燥粒子直径ｄ、
＝ポリマの比重＝１．１５ 本実施例の場合乾燥粒子の直径が平均２．８９μであっ
たので含水率は４５％となり、ブルーデキストラン法と
よく一致した。

実施例 ３゜ グリシジルメタクリレート９．４７部、２−オキシエチ
ルメタクリレート０．９６部およびトリエチレングリコ
ールジメタクリレート０．０６部の混合物（モル比は８
９．９ ： ９．９ ： ０．２７ ）の混合物を３０
部のプロピオン酸エチルに溶解し、２，２’−アゾビス
（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）０
．０３部を添加して窒素雰囲気下４０℃で３時間重合さ
せた。

２，２′−アゾビス（２゜４−ジメチル−４−メトキシ
バレロニトリル）の重合液中の濃度は２．２冗（資）ｌ
／ｌである。

白濁した重合混合液はアセトンに注ぎ、遠沈し、アセト
ンで１回、メタノールで１回さらに石油エーテルで２回
洗浄した後濾過乾燥した。

乾燥重合体微粒子の収量は２．９１部であった。

それをさらに実施例２と同様にして希硫酸で加水分解し
た。

加水分解後の微粒子は顕微鏡で観察した結果、粒子の直
径は平均３．０μ、標準偏差は０．４３μであった。

この微粒子の含水率はブルーデキストラン法によれば６
１％、式（１）によれば５９％であった。

実施例４〜１８゜ 実施例２に順じた操作により、非架橋性共重合成分、架
橋性共重合成分、重合媒体、重合開始剤、重合温度およ
び重合時間などの条件を変更してノへイドロゲル微粒子
を調製した。

重合条件と収率、加水分解後のハイドロゲル微粒子の平
均直径と含水率をまとめて表２に示した。

ＨＥＭＡ： ２−ヒドロキシエチルメククリレート、Ｍ
ＭＡ ：メチルメタクリレート、ＴＥＧＤＭニトリエチ
レングリコールジメタクリレート、ＥＧＤＭ：エチレン
グリコールジメタクリレート、Ｖ−７０：２，２′−ア
ゾビス（４−メトキシ−４，２−ジメ＊＊チルノくレロ
ニト ノル） 実施例 １９゜ 実施例１，２，３および１８によって調製された本発明
によるハイドロゲル微粒子と、リチャード・チメロセツ
クらの方法によって作られたＰＨＥＭＡ微粒子とについ
て生理食塩水での分散安定性を比較した。

チメロセツクらの方法によりトルエン中で重合して得た
ＰＨＥＭＡ微粒子は平均直径約１．５μで蒸留水中では
安定に分散している。

その含水率は３８％であった。上記５種類の微粒子につ
いていずれもポリマー濃度を５重量％に調節して蒸留水
中に分散させた。

次にこの微粒子分散液と同容量の生理食塩水（０，９％
塩化ナトリウム水溶液）とをガラス板上で混合したとこ
ろＰＨＥＭＡ微粒子の場合は強く凝集したが、実施例１
，２，３および１８によって調製された微粒子は凝集し
なかった。

実施例 ２０ 実施例１９の生理食塩水の代りに血清および希釈血清を
用いて同様の比較実験を行なった。

血清としては健康ヒト血清を使用し、希釈は０．０１Ｍ
リン酸塩と０．９％塩化ナトリウムを含むｐ Ｈ７，４
の緩衝生理食塩水溶液を使用した。

その結果は表３の通りである。

実施例 ２１ 実施例１，２．３および１８によって調製されたハイド
ロゲル微粒子と、市販ポリスチレンラテックスおよびホ
ルマリンにより固定された羊赤血球とについて、血清蛋
白の吸着に関する比較実験を行なった。

ポリスチレンラテックスとしてはＰｏ １ｙｓｃ ｉ
ｅｎｃｅｓ社製Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｍｉ ｃｒ
ｏｓｐｈｅｒｅ ＋ｃａｔ−４１＝７７６５（直径０．
６２０μ、標準偏差０．００２１μ）を、また固定羊赤
血球としては富士臓器製薬（株）製造の梅毒ＨＡ抗原キ
ット中の未感作血球（ホルマリン、タンニン酸処理、乾
燥）を使用した。

ポリスチレンラテックスは２．５％の分散液として市販
されている状態のままで、ハイドロゲル微粒子および羊
赤血球は蒸留水に２．５％浮遊させて使用した。

上記各微粒子または血球の浮遊液０．２ ｍｌと健康ヒ
ト血清０．２ ｍｌとを試験管中で混合し、３７℃で１
５分間インキュベートした。

次に微粒子または血球を遠心分離し、リン酸塩でｐＨを
７．２に調節した生理食塩水で２回洗浄した。

洗浄した微粒子又は血球を１％のウシ血清アルブミンを
含み、リン酸塩でｐＨを７．２に調節した生理食塩水０
．２ｒｕｌ！に再分散させた。

ガラス板上でこの再分散浮遊液１滴と抗ヒトＩ、ｙＧ抗
血清（兎、力価２．４ｍ９７ｍ１）のリン酸塩緩衝生理
食塩水（ｐＨ７，２）による１０倍希釈液１滴とを混合
して観察した。

ポリスチレンラテックスおよび羊赤血球の場合は３分以
内に凝集が起こるのが認められたが、実症例１，２．３
および１８により調製されたハイドロゲル微粒子の場合
はいずれも１０分経過しても凝集が認められなかった。

上記実験で明らかなようにポリスチレンラテックスおよ
び固定赤血球は血清から少くとも■ｇＧを吸着するが、
本発明によるハイドロゲル微粒子は吸着しない。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グリシジルメタクリレートを５０モル％以上、分子
   内に重合性炭素炭素二重結合を少なくとも２個含む架橋
   性単量体を０．１〜３０モル％の範囲で含有する付加重
   合性単量体混合物を、該単量体混合物は溶解するが重合
   により生成する重合体は沈澱析出するような有機溶媒中
   で重合させ、沈澱析出した微粒子状重合体を加水分解さ
   せることを特徴とする繰返し単位の少なくとも５０モル
   ％が２゜３−ジオキシプロビルメククリレート単位から
   なる架橋重合体からなり、２５℃における平衡含水率が
   １０〜９０％で、含水状態における平均直径が０．１〜
   １０μの範囲内にある親水性水不溶性微粒子の製造方法
   。