JPH0361143B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はラテツクスの製法、および遊離アミノ
基を有する低分子量または高分子量の生物学的に
活性な物質をラテツクス粒子表面上においてアル
デヒド官能基から導かれた反応性の基に共有カツ
プリングさせることによる生物学的に活性なラテ
ツクス粒子の製法に関する。これら生物学的に活
性なラテツクスコンジユゲートは血清学的または
免疫学的測定操作に特に適する。 適当な免疫学適試薬を負荷された指示薬または
担体小粒子を使用することによりかかる測定法の
感度を高めることは知られている。赤血球または
細胞培養物の細胞のような生物学的担体物質と並
んで、直径0.03〜5μｍを有するラテツスス粒子が
主として使用されている。その広い用途にも拘ら
ず、従来ラテツクス試験操作は負荷されたラテツ
クス粒子が非特異的に相互に反応するか、免疫学
的試薬がラテツクス粒子の表面と接触することに
よりそれらの生物学的活性が失われるか、または
それらが粒子から脱着される可能性があるという
特別な欠点を有していた。 担体への免疫学的試薬の化学結合はこれまで使
用されてきた物理的な表面吸着より優れているこ
とが示された。 従来、担体および免疫学的に活性な物質を結合
させるためには蛋白質の反応性基を担体粒子のそ
れと結合させる二官能性カツプリング剤が必要と
されていた。この方法の欠点は、使用された免疫
学的に活性な物質の望ましからぬ交叉結合が副反
応として起りうること、そしてそれによりこれら
が不活性化されるかまたは担体とのカツプリング
にもはや使用しえないということである。 さらに、結合が重合中に導入されうる表面エポ
キシド基またはジアゾ化しうる芳香族アミノ化合
物によつて遂行される方法も知られている。一般
にこの方法はラテツクスのこれら反応性の基が免
疫学的に活性な物質の多数の官能基と反応しうる
という欠点を有する。それにより、免疫学的に活
性な物質の反応性を立体的作用によりまたは配座
変更により破壊する望ましからぬ結合が生成され
うる。さらにもう一つの欠点は、エポキシドは例
えば加水分解により分解されるのでこれら結合の
できる基は不安定であつて、従つてかかる活性な
ラテツクス粒子は比較的長時間貯蔵され得ない。 すなわち、簡単に調製できそして感度の高い免
疫学的に活性な物質とさえも穏和な条件下に結合
して診断上使用しうる試薬を形成しうる担体が要
求されていた。結合された物質の反応性は長時間
保持されねばならない。試薬は特異的かつ感度良
く反応しなければならない。 今や驚くべきことに、水性媒体中で予め調製さ
れたラテツクス核を、酸アミド基を介して結合さ
れたアセタール官能分を含有するビニル単量体を
用いて膨潤させ、そして当然充分に水不溶性であ
る筈のこのビニル単量体を本性上親水性またはイ
オン性でありうる他の単量体と共重合させるなら
ば前記目的に適した担体が得られることが見ださ
れた。油溶性および水溶性ラジカル生成性物質の
いずれもラジカル鎖重合の開始剤として使用され
うる。特に有用な親水性コモノマーはメタクリル
酸またはアクリル酸あるいはメタクリルアミドま
たはアクリルアミド誘導体である。 親水性単量体を使用しうることは結合された免
疫学的活性物質の安定性にとつて特別に重要であ
る。何故なら感じ安い蛋白質は例えば疏水性表面
によりその配座が変化されそして不活性化されう
るからである。それゆえ親水性表面を有する粒子
も好ましい。その理由はそれらは非特異的な交代
作用を相互にあまり行わないからである。これら
は誤つた試験結果を生ずる重大な原因である。 さらに本発明は結合されるべき物質のアミノ基
をラテツクス粒子表面上のアルデヒト基と還元的
アミノ化の原理により結合させることからなる、
生物学的に活性なラテツクスコンジユゲートは製
法にも関する。これらのアルデヒド基はアセター
ル基から簡単に酸性化することにより得られう
る。これはアルデヒド基を担持するラテツクス粒
子が安定なアセタールの形態で負荷されずに貯蔵
できそしてカツプリング剤なしで結合的に活性な
形態に変換されうるという長所を有する。さら
に、還元的アミノ化は生物学的に活性な物質が非
常に穏和な条件下に結合するのを可能にする。と
いうのは例えば蛋白質中においては多数に得られ
そしてこの結合法においてその本来の負荷形態が
保持されるアミノ基のみが選択的に結合されるか
らである。他の方法と比較すると、この方法はま
た特別に穏やかである。何故なら化学結合が速か
にそして生理学的PH−値において遂行されるから
である。 それゆえ本発明は式 （式中ｎは１〜６であり、R₁はＨであり、R₂は
ＨまたはCH₃でありそしてR₃およびR₄はC₂〜C₆
−アルキルであるかまたはアリールである）の末
端アセタールを有する基を含有する共重合物の表
面層で被覆された新規なラテツクスに関する。 かかるラテツクスは例えばドイツ特許出願公開
第2907794号明細書に記載されるように、既知方
法により単量体のホモポリマーまたは共重合体と
して得られうるようなラテツクス粒子上にグラフ
ト共重合させることにより調製されうる。 ラテツクス粒子上に表面層を調製するためのグ
ラフト共重合にとつて好ましい単量体は核の調製
に使用される１種類またはそれ以上の単量体およ
び末端アセタール基を有する共重合しうるエチレ
ン状不飽和化合物からなる混合物である。これら
は式のメタクリル酸の誘導体でありうるが、し
かし他のアセタール基を含有する単量体もそれら
が充分に水不溶性である限り適当である。もし充
分に水不溶性でないとポリスチレンラテツクス上
へのグラフト生成の代りに水相中における重合が
起る。 もう一つの添加剤として親水性単量体が使用さ
れうる（例えばヒドロキシエチルアクリルアミド
およびその他のヒドロキシル基含有単量体）。特
に好ましいのは少量のイオン性コモノマー例えば
陰イオン性単量体としてのアクリル酸、メタクリ
ル酸またはアクリルアミドプロパンスルホン酸、
または陽イオン性単量体としての４−ビニルピリ
ジンあるいはメタクリルアミドプロピルトリメチ
ルアンモニウムクロライドの使用である。これら
はラテツクスの安定化に多大の貢献をする。 グラフトされる予定の単量体の混合比を単に変
えることによりグラフト層はかかる場合に使用さ
れる免疫学的に活性な物質の至適結合および安定
性を得るための条件に明確に適合せしめうる。 グラフト層の形成および担体−試薬結合の持続
性のためには重合するビニル基が分子の各官能性
末端と酸アミド結合により結合することが極めて
重要である。すなわち前記されたタイプのグラフ
ト化は、酸アミド結合の代りにエステル結合を有
する単量体、例えば（メタ）アクリル酸エチルエ
ステルジ−ｎ−ペンチルアセタールまたはヒドロ
キシエチル（メタ）アクリレートを用いても実施
されうる。しかしながらエステル基はラテツクス
の活性化、カツプリングまたは貯蔵に際して起り
うるようなPH７より小さいかまたは大きいすべて
のPH値において、相当するアクリルアミドまたは
メタクリルアミド誘導体よりかなり容易に加水分
解的に分解されうる。 本発明により変性されたポリスチレンラテツク
スを調製するには一般に任意の粒子直径をした予
め生成されたポリスチレンラテツクスにその表面
の最大被覆に必要である乳化剤量の約40〜70％を
加え、続いてグラフト単量体の混合物を加え、ラ
テツクスを膨潤させてそして重合せしめる。 本発明によるラテツクスコンジユゲートを調製
するには、前記グラフト重合されたラテツクス粒
子の懸濁液を酸の添加によりPH２以下に調整し、
培養し、そして中和後に適当な還元剤の存在下
に、結合される予定の免疫学的に活性な物質と培
養する。還元には中性緩衝液中の水素化硼素シア
ノナトリウム溶液を使用するのが好ましい。 結合反応後に、好ましくは緩衝液中において遊
離アミノ基を有する化合物を添加することにより
過剰のアルデヒド基を「封鎖（シール）する」の
が好都合でありうる。 多くの用途にとつて場合により結合しなかつた
免疫学的に活性な物質またはその他の不純物を遠
心分離によるかまたは適当な膜上で洗浄すること
により反応混合物から分離するのが適切である。 ラテツクスコンジユゲートは種々の診断操作、
例えばガラス担体上における例えばラテツクス凝
集試験による物質の定性的および半定量的測定に
おいて、または直接的あるいは競争的凝集試験に
おける痕跡量蛋白質の比濁測定的または混濁測定
的測定のために、あるいはラテツクス−ハプテン
抑制試験において使用されうる。 例 １ メタクリルアミド−アセトアルデヒドジ−ｎ−
ペンチルアセタール(1)の調製 アミノアセトアルデヒドジ−ｎ−ペンチルアセ
タールをJuretおよびChin両氏の「J.Am.Chem.
Soc.」第83巻第1560頁（1961年）記載の一般的操
作に従いアミノアセトアルデヒドジメチルアアセ
タールをペンタノールを用いてアセタール交換す
ることにより調製する。 単量体(1)はメタクリル酸クロライドを無水溶液
中においてアミノアセトアルデヒドジ−ｎ−ペン
チルアセタールと反応させることにより調製され
る。 この目的のためにはアミノアセトアルデヒドジ
−ｎ−ペンチルアセタール7.2ｇ（3.3×10^-2モル）
およびK₂CO₃9.1ｇ（6.6×10^-2モル）を窒素気流
下に無水クロロホルム20ml中に加えそして０℃に
冷却する。これにクロロホルム20ml中に溶解した
メタクリル酸クロライド3.4ｇ（3.3×10^-2モル）
を撹拌下に30分間以内で滴下する。合計90分後に
ゆつくりと室温まで温度上昇せしめる。 この反応混合物に水を加え、クロロホルム相を
分離し、乾燥しそして室温で真空下に生成物１か
ら溶媒を除去する。帯黄色の粘稠な油状物6.0ｇ
（収率64％）が得られ、このものは高められた温
度で速かに重合するので蒸留できない。 例 ２ (a) 水不溶性のラジカル生成剤を用いるポリスチ
レンラテツクス上への(1)のグラフト共重合 平均粒子直径196nｍを有する洗浄不含のポリ
スチレンラテツクス47ml（固体物質４ｇに相当）
をドデシル硫酸ナトリウム0.0486ｇ、水33ml、メ
タクリルアミドアセトアルデヒドジ−ｎ−ペンチ
ルアセタール0.66ｇ、メタクリル酸0.33ｇおよび
アゾビスイソブチロニトリル0.01ｇと共に反応容
器に加える。この混合物を注意深く数回真空排気
しそして窒素で換気する。この混合物を撹拌下に
室温で１時間乳化させそして次に70℃で５時間重
合させる。 冷却したラテツクスを限外過により精製す
る。カルボキシル基含量（電位差滴定による）は
重合体１ｇ当りCOOH0.23ミリ当量でありそして
アルデヒド基含量（アセタールの酸分解およびヒ
ドロキシルアミンを用いる滴定後）は重合体１ｇ
当りアルデヒド0.13ミリ当量である。 (b) 水溶性のラジカル生成剤を用いるポリスチレ
ンラテツクス上への(1)のグラフト共重合 平均粒子直径196nｍを有する洗浄不含のポリ
スチレンラテツクス47ml（固体物質４ｇに相当）
をドデシル硫酸ナトリウム0.0486ｇ、水32ml、メ
タクリルアミドアセトアルデヒドジ−ｎ−ペンチ
ルアセタール0.4ｇ、スチレン0.4ｇおよびメタク
リル酸0.2ｇと共に反応容器に加える。この混合
物を数回注意深く数回真空排気しそして窒素で換
気する。この混合物を室温で１時間乳化させ、次
に70℃に加温し、さらに15分間撹拌後に水１ml中
に溶解されたペルオキソジ硫酸カリウム0.016ｇ
の注入により共重合を開始させる。重合は70℃で
５時間進行する。冷却したラテツクスを限外過
により精製する。カルボキシル基含量は0.1ミリ
当量／ｇであり、アルデヒド基含量は同じく0.1
ミリ当量／ｇであり、新しい平均粒子直径は
207nｍである。 例 ３ βSP1−糖蛋白質証明のための競争的レーザー
比濁試験 (a) βSP1−ラテツクスコンジユゲートの調製 ラテツクスを活性化させるために例2bで得ら
れた５％ラテツクス懸濁液３mlを1n HCl 300μ
および20％ツイーン（Tween）20溶液300mlと室
温で１時間培養する。次に1n NaOH 250μお
よび飽和燐酸水素ジナトリウム溶液の添加により
PHを6.5に調整する。これと共に生理食塩水溶液
（PBS）中の１mg／mlβSP1−糖蛋白および１mg／
mlヒト血清アルブミンを含有する溶液1.5mlなら
びに燐酸塩緩衝された食塩溶液中の0.5％水素化
硼素シアノナトリウム溶液1.5mlを＋４℃で一夜
培養する。過剰のアルデヒド基を封鎖（シール）
するために0.5モル濃度のエタノールアミン塩酸
塩溶液（PH8.5）1.2mlおよび2.5％水素化硼素ナト
リウム溶液0.3mlを加えそしてこの混合物を＋４
℃で１時間培養する。次にβSP1−ラテツクスコ
ンジユゲートを遠心分離して沈澱させそしてこの
沈澱をツイーン20を0.2％含有するPBS3ml中にと
る。 (b) 試験操作 血清試料を1.7％のツイーン20を含有するPBS
中に１：５で予め希釈する。標準物として、1.7
％のツイーン20を含有するPBS中に１：５で希
釈されたβSP1−糖蛋白質（ベーリング・ウエル
ケ社製品）ならびに男性供与者からの20％ヒト血
清が使用される。測定には希釈された試料または
標準物100μ、ヒトβSP1−糖蛋白質に対する家
兎の抗血清（１％のNaClを含有するPH8.2の0.1モ
ル濃度グリシン緩衝液中に１：3200で希釈）
100μおよび1.7％のツイーン20を含有するPBS
中に１：100で希釈されたラテツクス試薬200μ
をキユベツト中で混合する。このこ混合物を室温
で３時間培養しそして次にレーザー比濁計（ベー
リング・ウエルケ社製品）中で測定する。未知試
料について測定された散乱光シグナルを標準希釈
物を用いて用意された参考曲線に基いて評価す
る。測定範囲はβSP1−糖蛋白質１ml当り約2.5μ
ｇ〜50nｇまでに達する。 例 ４ 破傷風トキソイドに特異的な抗体の直接的比濁
測定 破傷風トキソイド−ラテツクスコンジユゲート
の調製は例３と同様にして５％ラテツクス懸濁液
３mlおよび約3000Lf／mlを有する破傷風トキソ
イド溶液1.5mlから出発して実施される。この方
法で破傷風トキソイド−ラテツクスコンジユゲー
ト３mlが得られる。標準物として約20IE／mlの
破傷風トキソイド特異的抗体活性を有するヒトの
ガンマグロブリンプール（160mg／ml）
（Beriglobin 、ベーリング・ウエルケ社製品）
を１％の食塩に含有するPH8.2の0.1モル濃度グリ
シン緩衝液中に１：80〜１：5120で希釈して使用
した。 測定に先立ち患者の血清を１％のNaClを含有
するPH8.2の0.1モル濃度グリシン緩衝液中に１：
100または１：20で希釈する。試験混合物に対し
て希釈された試料または標準物100μを0.2％の
ツイーン20を含有するPBS中に１：25で希釈さ
れたラテツクスコンジユゲート懸濁液200ml中に
キユベツト中で混合する。２時間後、散乱光シグ
ナルをレーザー測光計にて測定しそして標準希釈
物について調製された参考曲線に基いて評価がな
される。 例 ５ ラテツクス凝集抑制によるハプテンの証明 エプシロン−ジニトロフエニル−Ｌ−リジン−
ラテツクスコンジユゲートの調製は、５％ラテツ
クス懸濁液３mlおよびエプシロン−ジニトロフエ
ニル−Ｌ−リジン（DNP−Lys）（SERVA社製
品）の0.66％溶液1.5mlから出発して例３と同様
にして実施される。過剰のアルデヒド基を封鎖し
た後ハプテン−ラテツクスコンジユゲート
（DNP−ラテツクス）を遠心分離して沈澱させ、
0.2のツイーン20を含有するPBS10ml中に再懸濁
させそして新たに遠心分離したのち0.2％のツイ
ーン20を含有するPBS3ml中にとる。 DNP−ラテツクス懸濁液をジニトロフエニル
基に対してヤギで得られる抗血清（Paesal社製
品）とベーリングウエルケ社製のラテツクス試験
プレートの反応区分上で混合しそして適当な希釈
度において凝集物を生成させる。その反応強度は
慣用の標準により可視的に＋４として判定されう
る。第１表に示されるように、凝集反応はハプテ
ン（DNP）の添加により抑制されうる。これは
試料溶液中のハプテンの検出に使用されうる。

【表】 凝集反 ４＋ ２〜３＋ １〜２＋ ０ ０
応強度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ラテツクスの核、および１種類またはそれ以
   上のエチレン状不飽和単量体および式 （式中ｎは１〜６であり、R₁はＨであり、R₂は
   ＨまたはCH₃でありそしてR₃およびR₄はC₂〜C₆
   −アルキルであるかまたはアリールである）を有
   する単量体からなる共重合体の殻からなる抗原、
   抗体またはハプテンの検出試薬用ラテツクス。 ２ 核がポリスチレンからなりそして殻がメタク
   リルアミドアセトアルデヒドジ−ｎ−ペンチルア
   セタール、メタクリル酸および所望ならばさらに
   エチレン状不飽和単量体からなる共重合体からな
   る、前記特許請求の範囲第１項記載のラテツク
   ス。 ３ 式 （式中ｎは１〜６であり、R₁はＨであり、R₂は
   ＨまたはCH₃でありそしてR₃およびR₄はC₂〜C₆
   −アルキルであるかまたはアリールである）を有
   する単量体および１種類またはそれ以上のエチレ
   ン状不飽和単量体および洗浄剤をラテツクスの核
   と混合し、そして重合をラジカル生成物質の添加
   により開始することからなる抗原、抗体またはハ
   プテンの検出試薬用ラテツクスの製法。 ４ 生物学的に活性な物質が、ラテツクスの核、
   および１種類またはそれ以上のエチレン状不飽和
   単量体および式 （式中ｎは１〜６であり、R₁はＨであり、R₂は
   ＨまたはCH₃でありそしてR₃およびR₄はC₂〜C₆
   −アルキルであるかまたはアリールである）を有
   する単量体からなる共重合体の殻からなるラテツ
   クスに共有結合しているラテツクスコンジユゲー
   トよりなる抗原、抗体またはハプテンの検出試
   薬。