JPS5831991A

JPS5831991A - 菌体のアルギン酸塩による固定化法

Info

Publication number: JPS5831991A
Application number: JP13169281A
Authority: JP
Inventors: Tatsu Fukushima; 福島　達
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1981-08-21
Filing date: 1981-08-21
Publication date: 1983-02-24
Also published as: JPS599154B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は菌体の固定化法、さらに１；子細には菌体の懸
濁するアルギン酸塩を含む液をアルミニウム塩含有架橋
液で、あるいはアルギン酸す１−リウム、カリウム又は
アンモニウト塩水溶液を菌体の懸濁するアルミニウＪ、
塩含有架橋ｎｋで処理し、菌体をアルギン酸アルミニウ
ノ、で固定化する方法に関する。

菌体の固定化法に関し従来技ｉボ１についてｊホベると
、最近開発されたに一カラギーナンのカリウム塩により
固定化された包括菌体は、機械的衝撃に弱く、菌体の包
括体外への４１洩が多い。従ってこの固定化菌体包括体
を用いるアルコール醗酵法は、従来法である生酵母を用
いる方法と大差がガいと云っても過言ではなく、しかも
その醗酵は完全Ｊ？〜地又はそれに近い環境で行う必要
がある。

又、本発明者の出願に係る特願昭５５−１４１８２０号
記１１戊Ｏ７ルギン酸アルミニウム・カルシラノ・固シ
ｉノ化菌体包括体は、菌体を二段法、即ちまずアルギン
酸カルシウム固定化包括体を作シ、次にイオン交換によ
りカルシウムイオンヲ一部７　）Ｖミニラムイオンに置
きかえるととにより得られたものであり、菌体懸濁アル
ギン酸塩溶液を直接アルミニウム塩で処理するとｐＴ−
Ｉ低下のために菌体の活性が低下すること、および一方
ｐＨ低下を少々ぐするために、アルミニウム塩の濃度を
、　　小さくすると菌体の活性はあるが機械的強度が不
十分になることの欠点を解決したものでろムこのように
して？１）だアルギン酸アルミニウＪ・・カルシラノ、
固′、ｉｙ化苗体包ｉ１”ｉ　ｆ、Ｉ＜を月１いると、
Ｉ）１１２．８〜３０という、醗酵’ｌ：　１＋ｉ’の
条１′１とすれば到底ぢえられない悪環境といえる１氏
］）１１下においても活発にアルコール醗酵が出Ｎ′る
１、　（′１°Ｊ願５Ｇ−４３６３９）。かかる効用あ
る固定化’＋−’ｉ則体を作製するＵてあたってし１１
、できる／ζけ固５１乏化の素１４の使用ｉｉ１が少な
く１．ぞのプ１１中ノ、がｉ’＋ｉ’ｉ中であることが
望−Ｊしい。ととろで十記アルーＶン酸塩包括体はその
ブ１１士スが７看・つと々つているため−それだけ煩ｉ
”１（であるから、如何にすＪｌ、ば一段のプロセスで
」：り沼Ｉ中、に、１．かもｉ占性があり（曵械的強Ｊ
（の人なる包括１イ・を短１１．１：間で、しかも１”
業的規模で作製しうるかｒ’Ｎ　、ｆ“（、（ｉｌ（究
の結１７４．木定明を完成しまたものである。

即ち本定明とらば、菌ｆ４・％　７’ｉｉｉアル、Ｖン
酸塩溶Ｙｆｋをアルミニウドでなく、アルミニウド含そのｐｒｌさえ制用１１〜、」ず１ｄｌ　３．　１〜４
．５の了・ｆ′Ｉ−１・で、次いでｐＨ　２．　４〜３
．０のγ：（’ｌＩで＋！ｂ１甲すれば、活性でしかも
機械的強度の犬なる固定化菌体包括体が得られるととを
見出したものである。

々お本定明を実施する場合、アルミニウム塩の濃度をた
とえばＡ．］−　２（ＳＯ　４　）　ｇを例にとると０
０１ｑ　ｒｎｒ）−１　（ヅを稈度にうすくし、即ち初
発ｐＦＴ　３．　１にしてＩＩ周間程度のに時間その１
−１放菅してゲル化寸°）１，げ、ｐＴ１条件を三段に
分けずとも固定化酵ｆＪは？１（Ｃっれるが、菌体の失
活化が起とりやすく、’Ｒ　ＪＣ時間を要し、その−１
１機械的強度も弱い。このような方法はＴ業的規模でア
ルコール生産を７１うだめの固定化菌体の製υぐとして
は、あ寸り（曲ｆｉ白のないものである。

Ａ・閉門に，１，−ける架橋液口］アルミニウム塩とし
てＶＪ冒ｉ＋ｆｅ　酸アルミニウドウＪ・、硫酸アルミニウド・・アンモニウム、硝酸アル
ミニラＪ・、塩化アルミニウム、乳酸アルミニラＪ．な
ど水に可溶の無機又ｄ：有機化合物ならびにこれらの混
合物を任意に用いることができるが、伺コ酸アルミニウ
ノ−、ｌｉｆｔ酸アルミニウム・アンモニウム、Ｍｉ：
酸アルミニウム・カリウムハ安ｆ曲でＩＩ”／：　ｌ及
いべ・すい。ぞのｌ！！　１％にアルミニウノ、噸：お
」＝び菌１本のＩ’小．ｒ：Ｉ’ｉによつ−（　、１，
１，！、なる３，／ｒとえば、１（Δｌ　（：；（１・
Ｉ）２　　溶（ｆンは０．０５す［１１０レヅｌのｌ＋
：’ａ　ｔ（ｙにＪ？いてｐＩ＋８．２である。

この中にり゛ツカ１Ｊミセス・１ニルビン工１テ１ｆ４
＼！四劇、）シ。

のアルギン酸す１−リウノ・ｒｆｋ　’？ｔ：人涯ると
、１４Ｃに７■：。

すすトす１ントとアルミニウノ、とのイ」−ンベンー１
１ｉ！！反応が進みゲル化し、ン夜中のアルミ：−ウＪ
．．　、（−４ンの濃度が低１・する結眼、ｒｌに中の
１）［１が一１＋ｆ１する。

アルギン酸すトリウノ、１′命を１′白１１・の：（Ｉ
り　濁−Ｊ−るＩ〈Δｌ（ＳＯＩ）２　　溶（伐に入れ
る現今イ、同じ（）ｔな・１１が１、・こる。

８　（Ｃｅｌｌ’，’０６Ｎａ）、、　　ｌ　ｒｌ（△
ｌ　　（、’：（’）−＋）２→（’　（（：６　１１
７０６）３　Δ］）ｎ　Ｉ−攪　ｌ＜２１：（）１　Ｉ
　（−Ｆ１ト１１１．２　：：０４固定化菌住包括体ゲ
ル表面近（帝からゲ／Ｉ／ｆＩコが進み、さらに次第に
この包１．Ｉｉ　Ｉ（・ゲルの内部もイオン交換される
。表面近傍がり′ル化し／１−状態となれば、液本体の
［）１１を２８しこしても、１）１１を３２にしてず１
つだ包括＋Ｗ　（４−と比べて７　）１／　：Ｉ　−　
／ｌ／　／ｌ　１１？１’ｌ＋は変りなく、面木ｆ１・
のｐＨ’ｆｉ；　２．　５　Ｖこ］−てもなＪ，・アル
コール生産を行い、かつ固定化包括体内で増殖する。本
発明に」：り作った固定化包括体中に固定化される菌ｆ
４，−１１は、包括体１６当り約２００〜３６０Ｑ（乾
量゛）であり、に−カラギーナンやポリアクリルアミド
で固５１ｉＺ化する場合」＝りはるかりて大なる菌体保
持ｊ’ｉｉ，をもだせることが出来、又物理的強度も大
でアルコール醗酵生産力が大きく、かつ低［、、ｌ■ｒ
とはいえ増殖力がある。

固５；！化される菌体量はアルギン酸ナトリウム、カリ
ウノ・、アルミニウド・又はこれ等の混合物の溶液の２
１Ｊ　ｌ’２及び１［１と、これに懸濁させる菌体の比
ににつて／１↓めることかできる。

たとえばザッカ「１ミセヌ属を例にとると湿潤菌体（ｌ
ｋ分７５％）１００９、１．５％（重量）のアルギン酸
すトリウノ・水溶ｉ（１　１　５　０　ｇを用いると約
１００ｍｌのアルギン酸アルミニウム固定化包括体が４
７１られ、固定化菌体ｐ１−　（乾量）は固定化包括体
１１当り２５０ｑである。

菌ｆ（・が懸濁するアルギン酸すｌ・リウム、カリウＪ
・、アンモニラＪ・およびこれらの混合物の濃度は任（
′う、でよいが１〜１．５　’ｙ’ｏ　（中１１１）水
Ｉｎ　（＜’ｅ力；　ｉｙ　Ｊｉｌいやすい。

アルコールｆ１．１シ酵を行う際、（Ｊ、：川するアル
ギン酸アルミニウｊ・固定化包括１４・の物理的１・Ｊ
：びｆ［；学的性質の安う１ゴ１′、け供給ｔｌ！ｉ　
Ｙ＋’Ｑ中にアルミ＝・ンノ・イオンを添加することに
よりｔｊわれる。県ｌ（のうち温州みかんジコ、−ヌ超
、放置すると次”ｒｓに沈１５ｎ・物質が：’？＋　［
ｌｌ　シ、パイプの閉四′ｌ・シソ゛ルを：ｌ、・こ１
″が、弔糖として１．５Ｍを含イ１するジュースを例に
とる々、これに硫酸アルミニ１７）、を１〜２ｑ／ｌ添
加干るとすげやく沈降し、閉塞Ｉ・ノズルが解決できる
。その十余剰の硫酸アルミニ１′）ノ・がアルギン酸ア
ルミニウム固定化包括体の１．２期間安定化に役立って
いる。

使用する菌体には特別の制限はなく、−１トフカロミセ
ス属の全て、例エハリ゛ツカ＋Ｉミ土ヌ・カールスバー
ゲンシス、シゾリーツカ１１ミー１こス属の全て、倒木
ばシゾリツ力［Ｉミ士ニス・ボンベ、カンデイダ属の全
て、例えばカンデ・イダ・ン：１〜−トド（］ピカルス
、クルイベｌ’ｌミセスｌハスの全て、例リース属の全
て、例えばザイモモナス・モビルス、クルコノバクター
属の全て、例えばグルコノバクタ−・ザプオギシダンス
、アセ１−バクター属の全て、例えばアセトバクター・
アセティ、シュート゛モナス属の全て、例ｔハン−ｙ−
−）”そり−ｙ・オバリス等が使用できる。

−Ｆ記に実施例および参考例をあげて、アルギン酸アル
ミニウム固定化酵母菌体包括体粒子ゲルのｉｌｉ’ｊ法
およびそれを使用したアルコール醗酵法を説明する。

実施例１菌体トｌ、てツイン酸ｒ１（ザツカロミセヌ・セルビシ
工０Ｃ２−２）を用い、Ｙｌφ　槁地中振とり培養しプ
こものを遠心分１ｉ１１１１することにより得られた水
分７５％（重ｉ７１：　）を含む湿ｆｆｉ’］酵ｆ’９
２４ｇヲ１．５　（重量）６るのアルギン酸す１−リウ
ム水溶ｆｆ８６ｔｉ中に懸濁させた。この１傅濁液をノ
ズルを通して、架橋液であるｏ、ｏ　１ｇ＋１０］−０
７１（＝　２．６　ｑ／ｌ）のＫＡ　１−　（Ｓ　０４
　）　２溶１（（８００ｍ　ｌ　（ｐＴＩ８．６）中に
滴下すると、表面近傍のみイオン化されたアルギン酸ア
ルミニウノ・固定化ｔ１￥１′、工菌体包１占１４（石
ｆ−ｒゲルができる。次にｐＬ＋３．１４に制御しなが
らこの拉１′ゲルを含む溶液中に０．１　ｇｍａｌ−０
／ｌ　のＫＡｌ、、　（ＳＯ４）２１　Ｂ、　６　ｍ、
ｌを加え、さらに１　ｇ＋１１０１０／ｌのＫＡｌ、　
（３０４）２１５　ｍ、ｌをｐＨ２，６，５℃に制御し
ながら滴下し、５°Ｃで１時間Ｍ装置する。その結果ｆ
Ｙ２ＲＲの固′、ｉ２化酵１″、１菌体包括体粒子ゲル
２２ｔｉをＴ−５）だ。粒子中の酵り迂＋Ｗ　（４；濃
度は、約２ｓｏｑ　（乾ｉｉＱ　）／６であった。

参考例１ｐＴＴＬ２のミカンジュースに、Ｆノ１８りのΔ１２（
Ｓ　０４）！１を入れてｐＴ’＋　２．８としブこミカ
ンジュース（中１１．１ｉとしテ］、、　６　ｇｍａｌ
、０／ｌ）　８００　ｍ、ｔと生理食塩ノ１（で洗１條
した包括外粒子０．５ｑ　とを正角フラスコに入れ振と
う下アルコール醗酵を３０°０で行った。

２４　ｈｒ後８４ｑ／ｌ、７２ｔｌ工＝後１２ｏｑ／ｌ
の７　）ｖ　コー／ｌ’ａ度となった。固定化包括体外
への抛１７曳１′！（数はｉ’ｊ１者で７．８　Ｘ　１
０５／ｍ、　ｔ　、後とは１．９　Ｘ　１　ｏ’／ｍ、
１となった。ｐＴ１３．２では２４ｈｒ’後に７８　ｑ
／ｌ、　７２　ｌ′＋ｒ後に１２（１／ｌのアｌレニ１
−ル＝ｔ＋：Ｉｓ　ＩＢ：’であり、また山）洩菌数は
それぞれ１．９　Ｘ　１０５／ｎｂｌ、　２．　ＯＸ　
１０８／ｍｌであった。すなわち、■）■１２．８で行
った本願方法の結果はｐＶ■３．２で行った時と比較し
てもアルコール生産性、菌体生産性において、いずれも
大差が々い。しかもｐＨ２，８における漏洩菌体の９０
％Ｌ＝Ｊ、−１−が生菌体であった。

実施例２ｉ７．１体トしてワイン酸／”Ｊ（ザツカロミセス・セ
ルビシエＱＣ−２）を用い、￥１φ培地で振とう培養し
、遠心分１螺することによりえもれた水分７５％（ＦＴ
ｌｒｌ−ｉ：　）　ヲ含む湿潤酵ｆ’１２４ｑ’ｉ１．
５％（重量）アルギン酸すトリウム水溶ｉ＆８６ｑ中に
懸濁させ、この懸濁液をノズルを通し、架橋液である０
、ＯＩＱｍＯ］−、ｃ〕／ｌ　（−＝　８．４２　ｑ／
ｌ）のＡ工２（ＳＯ４）３水溶液（ｐＴ（る。次にこの
ゲル粒子を硬くするだめｐＴＩ２．８に制省１１シなが
ら１．０　ｔｉ　ｍｏ］−ｅ／ｌのＡ　ＩＱ　（Ｓ　０
４　）　３２０　ｍ　ｌを加え、そのｉｔ−夜５°Ｃに
放置する。

Ｉ’Ｂｌｕ＋のゲ）Ｖれ“ｆ予約２２９を得だ。

参考例２」二　ｉｌ！　　ｆイ　１１１１１　　　ゲ　ル　才）
”ｌ　了　　０５　リｋ　１１．Ｊ甲　食　Ｉブ、＋１
　水　で　よ　　く　ン５１゜滌した後、約１８９のＡ
　１２　（’、、”、、（１、＋　）３を加えてｐＴ’
ｆ　２．８にさげたミカンジュース（中ＩＪｌｉとして
１．ｒｉ　＆ｒｌｌ（’）−，１，（４／ｌ）の中に入
れ、ＩＢ（とう丁アルコール酊オ酵を（−１つだ。（３
０°Ｃ）２４１１ｒ　　後　　　ア　ル　コ　−　ルｌ農　Ｊ負
　３０ｔｉ／１山１１曵菌数　り９Ｘ］０５７２１１ｒ後　−ｆ　／Ｌ／　コ−／ｌ／　７１３度１
２０ｑ／１ＩＡ１”＋代菌数３．ｌＸ１０８一方丁）Ｈ８，２では７２ｂｒ　　後　　　７　　）し　＝１−　　）しｌ農
ＪＱｒ：　　　１　２　０　　ｑ／ｌハｊＨ曵菌数　１
．　’Ｉ　Ｘ　１０８であり、すなわちＴ）ＩＴ２．８
と３．２でＶまア／Ｖ二１−　Ｉ＋／生産性は大差がな
い。

ｐＩ−Ｉ２．５においても下記に示すように、アルコー
ル生産、増殖が行われる。

５０ｈｒ後　　　ア　ル　コ　−　ルｌ農度　　５２ｔ
ｉ／ｌ漏洩菌数　８Ｘ１０７実施例３（１１）一１〕記の例とことなり、１００メツシユ不銹鋼製金網
を骨組とし、径９礪、厚み３朋の円盤型のザツカ「Ｉミ
セス・セルビシエＷ　−３ＷＥ、　丹菌体ヲ包括固定化
し、アルコール醗酵を行った例を示す。

酵１ｉＪ菌体はＹｌφ」７″τ地でタンク培養し、集菌
した湿潤ｆｌ’Ｆ　ｆ号１０ｇ（水分８０％）を１．５
％（重＠）のアルギン酸ソーダと寸ぜ、径９．５　ｃｍ
　１深さ５砿の成形容２ｇに入れる。これに１００メツ
シユ金網を骨組とした枠を入れる。次に成型容器外を氷
水で冷却しながら、２００ｍ１の０．０５９ｍｏ］−ｅ
／ｌＫ　Ａ　Ｅ−（、’、Ｅ　Ｏ４）　！２腋を静かに
注ぐ、２時間裏返してさらに２時間放置する。この円盤
型アルギン酸アルミニウム固定化酵母菌体包括体を液よ
り取出し、その表面に０．Ｉ　ＱＴｎＯＪ−ｅ／ｌ（Ｄ
　ＫＡＩ　（ＳＯ４）２水溶液をスプレーする。又さら
に０．５９　ｍｏＥ−ｅ／ｌのに’、Ａｌ　（ＳＯ４）
２水溶液ｆ、（ｙ−ｙ”　ｖ　−ｔ　ル。

参考例３かくしてえられた円盤１５枚を水平軸にとりつ（１２）土が液に浸されないようにし、糖蜜（弔糖として１．５
Ｍ）に硫酸と１す／Ｚの硫酸アルミニウムを加えｐＴ’
ｆ２゜８の液を供給６にとし、円盤回転数１１００ｒｐ
、３０°Ｃ，バイオリアククー土部にはｌＶ＋　２ガス
を、下部には供給液を流１７だ本連続操作にＪ、１ｔ月
以上１−ラブルなしに運転でき、↑ノ１出液中には１０
０〜１１０ｑ／ｌ　　のアルコールが含有された。

実施例４糖蜜培地で振とり培養したアルコール酸ｆＪ　１２　Ｑ
（乾ｉ１３ｉ（準）を懸濁する腋１１に、攪拌下１７１
りＫＡＩ　（ＳＯ４）　２　を除々に加える。このｐＴ
ｌ　８．２の懸濁液に１．５（重量）％のアルギン酸ア
ンモニウム１６０ｑをノズルを通し滴下する。

精製したゲル粒子をさらに固くするためにＴ）ＴＩ２．
９に制御しなからＩｇｍｏ］−ｅ／１（−＝８４１／ｌ
）　（Ｄ硫酸アンモニウム、ｏ、５ｔをさらに加え、１
夜５°Ｃに放置する。得られた約２１１Ｒ径のアルギン
酸アルミニウム包括固定化酵ｆＪ　ｒ）“２丁−ゲルを
とり出し、１．５９ｍＯ′ｌｅ／ｌの硫酸アルミニウム
を含む冷たい生理食塩水でよく洗滌することにより、固
定化酵母粒子９０ｇを１１）だ。粒子中の菌体濃度は２
０〜１００ｇ（乾−１７Ｉ）／７であった。

参考例４この粒子９０ｇを内容積４８０ｍ、ｌの３段」二下円錐
型バイオリアクターに充填し、バイオリアクター下部よ
りＮ２ガフ　０．０８　Ｖ／Ｖ／ｍ、と硫酸にてｐＨ２
，９とした糖含有１８％の糖蜜を４８ｍ、　ｌ　／　Ａ
　そう入する。反応は３０°Ｃで行われ、ガス及び液は
連続的にバイオリアクター」一部より送出される。

この連続アルコール醗酵操作において、定常運転では送
出液は７．２〜８．０　（ｗ／ｖ）％のアルコールを含
有する。

出　願　人　　賓酒造株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

菌体の懸濁するアルギン酸す）・リウノ１、カリウム又
はアンモニウム塩を含むＩｆ（をアルミニウノ・塩含有
架橋液で、あるいｄ−アルギン酸す−１−ＩＪウム、カ
リウム又はアンモニラＪ、塩水溶ｌｒ夕を菌体の懸濁す
るアルミニウム塩含有架橋液で寸ず１）Ｈ３，１〜４．
５の条件下において、次いでｐ　Ｔ７２．４〜３．０の
条件下において処理し、菌ｆ４・を固定化する方法。