JPS5833863B2 - サケ・カルシトニンの合成 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本明細書の記載を抄録すれば次のようである。

即ちサケ・カルシトニンの製造に有用な樹脂ペプチド及
びその製法が述べられている。

本発明はまた、その樹脂部分が分解されサケ・カルシト
ニンの合成のために有用なペプチド類ならびに該分解ペ
プチドの製法をも含む。

一般にその方法は固相合成方法を包含する。

本発明はサケ・カルシトニンに類似のアミノ酸鎖をもつ
新規化合物、ならびに該化合物の環構造を閉じてカルシ
トニンを製造する方法に関するものである。

本発明はホルモンたるカルシトニンに関腰 またカルシ
トニン類似の生物活性をもつ物質に関し、またそのよう
な生物活性物質に変え得る物質に関するものである。

この発明はまたそれらの物質の製法にも関する。

本発明の背景を述べれば次のようである。

陸上の及び水中の動物の腺から、天然の生理物質が得ら
れること及びそのような物質が人及び他の動物のホルモ
ン欠亡症の治療に用いられ得ることは公知である。

そのような物質の中には、ホルや☆モンたるカルシトニ
ンがある。

このホルモンはベージェット病の治療に特に有用である
ことが見出されている。

セミナールズ・イン・ドラッグ・トリートメント第２巻
第１号（１９７２年夏号）中のド・ローズほかに依る「
カルシトニンを用いるベージェット病の治療」と題する
論文参照。

カルシトニン類はウシ、ブタ及び人間から得られ、これ
らを動物や人間に投与すればホルモン作用を示すことが
見出されている。

カルシトニン類のうち最も活性なのはサケ魚類から得ら
れたものある。

Ｄ、 Ｈ，コツプ、Ｃ１０，パーク、及びＲ，Ｋ。ドー
ル：フイーデラループロシーデイング２８／２．４１３
（１９６９）参照。

サケから得たカルシトニンエキスを精製しく ＨｏＴ、
キュートマンほか：ジャーナル・オフ・バイオロジカル
・ケミストリー２４５．１４９１−６〔１９７０〕）そ
の構造が解明された（ Ｈ，Ｄ、ナイアルほか：フロシ
ーデイング・オフ・ナチュラル・アカデミ−・オフ−サ
イエンス６４．７７１−８１：１９６８．ｌ））。

このものは１位及び７位のシスティン部分の間にジスル
フィド橋をもつところの３２コのアミノ酸のカルボキシ
ル末端アミド・ペプチドであることがわかった。

アミノ酸残基を表わすのにＣｙｓ ％ Ｓ ｅｒ、Ａｓ
ｎ等のような略語を用いれば、サケ・カルシトニンの式
は次のように書くことができる。

カルシトニンを採取するサケの小さな末端えら腺ｕｌｔ
ｉｍｏｂｒａｎｃｈｉａｌ ｇｌａｎｄをきまって集め
ること、得られる活性抽出物の収率が低いこと及びサケ
魚獲高が少くそして急激に減少して行くことは、サケ・
カルシトニンの実用的合成法の要望とか、又はカルシト
ニンホルモン活性をもつ物質に変換可能な新規物質の合
成の要望といったような問題を生起させる。

こ工に本発明者等はそのような方法や物質を見出すべ（
研究した。

古典的ペプチド合成法によってサケ・カルシト二ンを合
成することは既に報告されている（Ｓ。

グツトマンほか：ヘルベチカ・キミカ・アクタ５２．１
７８９−９５１：１９６（Ｊ））。

しかしもつと大規模な工業的生産のために更に実用的な
方法は、業界が探究し続けている。

アミノ酸を単に付加することによりある種のペフチド類
を合成する方法は知られている（Ｒ，Ｂ、ノリフィール
ド：ジャーナル・オフ・アメリカン・ケミカル・ソサイ
エテイ８５．２１４９−５４（１９６３）及びＰ、Ｓ、
ビニツタ、Ｇ、Ｒ，マーシャル：ケミカル・コミュニケ
ーション６５０Ｃ１９７０））けれども、そのような付
加反応によるサケ・カルシトニンの合成は未だ報告され
ていない。

さて以下に本発明の詳細な説明しよう。

一般に本発明では固相合成法を用い、そしてベンズヒド
リルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）と呼ばれる樹脂で反応を
開始する。

この樹脂はスチレンとジビニルベンゼンの共重合で製造
されるところの交叉結合ポリスチレン粒状樹脂に由来す
る。

このタイプの樹脂は公知でありその製造はＰ、 Ｓ、ビ
ニツタほか（ケミカル・ユミュニケーション６５０（１
９７０１）によって更に研究されている。

この交叉結合ポリスチレンＢＨＡ樹脂は入手可能である
。

本発明ではこのＢＨＡ樹脂を（こΣに■は樹脂のポリス
チレン部分である）という記号で表わす。

樹脂ペプチドの合成 この合成法では、樹脂に全ペプチド連鎖が形成されるま
で、アミノ酸が一度に１コずつ、不溶性樹脂に付加され
る。

アミノ酸の官能基は保護基で保護される。

アミノ酸のα−アミノ基は第３級ブチルオキシカルボニ
ル基やその均等基で保護される。

このα−第３級ブチルオキシカルボニル基をＢＯＣと表
わすことにする。

セリンとスレオニンのヒドロキシ官能基はベンジル基や
ベンジル誘導体基（たとえば４−メトキシベンジル：４
−メチルヘンシル：３・４−ジメチルベンジル：４−ク
ロロベンジル：２・６−ジクロロベンジル；４−ニトロ
ベンジル：ベンズヒドリル又はそれらの均等基）で保護
される。

ベンジル及びベンジル誘導体基を表わすのにＢｚという
記号を用いることにする。

チロシンのヒドロキシ官能基は保護してなくとも良いし
、上にＢｚで表わされるベンジル基やベンジル誘導体基
で保護しても良いし、又はベンジルオキシカルボニル基
くはベンジルオキシカルボニル誘導体（たとえば２−ク
ロロベンジルオキシカルボニル、２−ブロモベンジルオ
キシカルボニルあるいはそれらの均等基）で保護されて
いても良い。

これらの無保護基、Ｂｚ基、ベンジルオキシカルボニル
基又はベンジルオキシカルボニル誘導体基を記号Ｗで表
わすこと二する。

システィンのチオール官能基は、上にＢｚで表わされて
いるところのベンジル基若くはベンジル誘導体基で保護
されていても良いし又はノルマルアルキルチオ基たとえ
ばメチルチオ、エチルチオ、ノルマルプロピルチオ、ノ
ルマルブチルチオ、若くはそれらの均等基で保護されて
いても良い。

システィンにおけるこれらのノルマルアルキルチオ基又
はＢｚ基をＲで表わすとと又する。

アルギニンのグアニジノ官能基はニトロ基、トシル基又
はそれらの均等基で保護されていて良い。

これらのニトロ又はトシル基を表わすのに記号Ｔを用い
ること工する。

リジンのε−アミノ官能基はベンジルオキシカルボニル
基又はベンジルオキシカルボニル誘導体基たとえば２−
クロロベンジルオキシカルボニル：２−ブロモベンジル
オキシカルボニル：３・４−ジメチルベンジルオキシカ
ルボニル：もしくはそれらの均等基で保護されていても
良い。

このベンジルオキシカルボニル基又はベンジルオキシカ
ルボニル誘導体基を記号Ｖで表わすことＳする。

ヒスチジンのイミダゾール窒素の保護基は、前記リジン
のところでＶで表わされたようなベンジルオキシカルボ
ニル基及びベンジルオキシカルボニル誘導体基である。

グルタミン酸のγ−カルボン酸基は、セリン及びスレオ
ニンのヒドロキシ官能基の保護のところで述べたような
ベンジル又はベンジル誘導体基で保護される。

これらの保護基は記号Ｂｚで表わされる。

前記サケ・カルシトニンの式かられかるように３２コの
アミノ酸が含まれており、そしてその式においては一般
に承認されている方法に従って、鎖の一方の端のＣｙｓ
を１位とし他方の端の３２位のＰｒｏで終るように位置
が番号づゆられる。

記述を明確にするため合成のサイクルの際にも同様の番
号づげに従うとと〜する。

アミノ酸の組み立ては、プロリンのカップリングより戒
るサイクル３２で始ます、続いてスレオニンのカップリ
ングより成るところのサイクル３１、等々というように
行われる。

３２サイクルの合成の各々に用いられる好ましいアミノ
酸反応体を次の第１表に示す。

第１表におけるアミノ酸誘導体はサイクル７で用いられ
るものをたぶん除けばすべて市場で購入できる。

サイクル７で用いられる物質は文献記載の方法（Ｕ、ウ
ェーバ−及びＰ、ハルター二ホツペ・ザイラース・ツア
イトシュリフト・フユア・フイジオロギツシエ・ヘミ−
３５１，１３８４−８（１９７０））によって製造する
ことができる。

サイクル３２ プロリンのＢＨＡ樹脂へのカップリング 樹脂ペプチド合成のすべての工程で使用する反応容器は
ガラス製のものであって、その上部には材料添加のため
の導入口を具え、また底部には焼結ガラス円板を具えこ
れで濾過することによって、可溶性の反応混合物や洗滌
溶媒を除去する。

濾過は減圧下で又は窒素圧を用いて行うことができる。

容器の内容物は、容器全体を振とうするか、又は機械的
なかくはん機に依って動揺させることができる。

サイクル３２においてはＢＨＡ樹脂を反応容器に入れ、
メチレンクロリド、クロロホルム、ジメチルホルムアミ
ド、ベンゼン又はその均等物のような溶媒に、樹脂１ｉ
に対し溶媒３−１２ｍ１の割合でげんだくする。

これに、使用ＢＨＡアミンの１遊離アミン等量に対し１
〜６等量のＢＯＣ−Ｌ−プロリンを加える。

５−１０分まぜた后、ジシクロへキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ） のようなカップリング試薬（ＣＡ）を加
える。

他のジイミド・カップリング剤を用いても良い。

このジイミド・カップリング剤はＢＯＣ−Ｌ−プロリン
１当量に対し０．５−２．０当量を用いる。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリンは、もしその活性エステル誘導体
たとえばアジド誘導体、対称的無水物誘導体又は適切に
選ばれた混合無水物を用いるときはカップリング試薬な
しにカップリングさせても良い。

用いても良い活性エステル誘導体は２−ニトロフェニル
エステル、４−ニトロフェニルエステル、ベルタフルオ
ロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステ
ル又はその均等物である。

これら活性エステル体はＢＨＡ樹脂の遊離アミン１等量
に対し１−１０当量で用いられる。

ＢＨＡ樹脂、溶媒、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン及び☆・カッ
プリング試薬又はＢＯＣ−Ｌ−プロリン活性エステルよ
り成る反応混合物は、テストサンプルのニンヒドリン試
験（Ｅ、 カイザーほか：アナリチカル・バイオケミ
ストリー３４．５９５−８（１９７０））でしらべて反
応が完結する迄、機械的にかきまぜ又はかくはんする。

カップリング反応の完結后、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂
はメチレンクロリド、クロロホルム、メチルアルコール
、ベンゼン、ジメチルホルムアミド、又は酢酸のような
溶媒で洗う。

当初に用いられたＢＨＡ樹脂１ｒに対して、２−２−２
Ｏの洗浄用溶媒を用いるのが適当である。

完結前にカップリング反応を終えることを望むならば、
゛洗滌操作を行ないそして、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂
の残余遊離アミノ基を、過剰のアセチル化剤でアセチル
化して、両肩の反応から保護する。

このアセチル化はＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂をアセチル
化剤溶液と０．５−１２時間かくはんすることにより行
われる。

Ｎ−アセチルイミダゾールのメチレンクロリド溶液又は
無水酢酸とトリエチルアミンの混合物のクロロホルム溶
液の如きアセチル化剤が用い得る。

該アセチル化剤は、出発物質のＢＨＡ樹脂の遊離アミン
力価１等量に対し０．５−５．０等量を用いる。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂を生成するカップリング反応
は次の式で表わされる。

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂の保護基脱離 上述のようにして生成されたＢＯＣ−Ｌ−プロリン樹脂
は、既述のような溶媒で洗い、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ） と溶媒（たとえばメチレンクロリド、クロロホ
ルム、ベンゼン又はそれらの均等物）の混合物の如きも
のとかくはんすることによって脱保護する。

溶媒中のＴＦＡＯ量は該混合物の１０−１００％にわた
り変化できる。

ＴＦＡと溶媒の混合物の量は、当初に用いられたＢＨＡ
樹脂１ｒに対し３−２０ＴＬｌにわたり変化できる。

反応時間は約１０分から４時間のあいだが良い。

脱保護工程はＴＦＡと溶媒の混合物を沢去することによ
って完結する。

残ったＴＦＡは、トリエチルアミンの５−３０％溶液（
溶媒はメチレンクロリド、クロロホルム、ベンゼン又は
それらの均等物）を３−２ Ｑｍｌ（ＢＨＡ樹脂１１当
り）用いて洗滌することによってＬ−プロリン樹脂から
除去される。

トリエチルアミンの代りに他の３級又は２級有機アミン
例えばトリメチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ジイ
ソプロピルアミン又はそれらの均等物を用いても良い。

Ｌ−プロリン樹脂の遊離アミン力価はドルマン滴定法（
Ｌ、 Ｃ，ドルマ☆☆ン：テトラヘドロンーレターズ１
９６９ ２３１９−２１）により定量できる。

この脱保護反応は次の式で示される。

サイクル３１ サイクル３２の結果得られたプロリルＢＨＡ樹脂をカッ
プリング溶媒にげんだ＜Ｌ、ＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｌ−ス
レオニン誘導体を加え、その混合物を同様に平衡させる
。

カップリング剤ＤＣＣを加え、ニンヒドリン試験でしら
べて反応の完結后、反応混合物を沢過することによりＢ
ＯＣ−０−Ｂｚ−スレオニルプロピルＢＨＡ樹脂から除
去する。

★★ペプチド樹脂は溶媒で洗う。

反応物質や溶媒の量、そして反応時間はサイクル３２で
述べたと同様である。

ＢＯＣ基はサイクル３２で述べたような脱保護法でペプ
チド樹脂から除去する。

得られる０−Ｂｚ−スレオニルプロピルＢＨＡ 樹脂は
ついでサイクル３０で用いられる。

サイクル３１の反応は次の式で示される。

便宜上、この得られた樹脂ペプチドを略式命名法を用い
て次のように書くとと工する。

☆サイクル３０ このサイクル３０でカップリング反応及びまた脱保護反
応は、ＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｌ−スレオニンの代りにＢＯ
Ｃ−グリシンを用いる点を除きサイクル３１と同様に行
われる。

カップリング及び脱保護反応は次のように表わされる。

この化合物は本発明者の知る限りでは未だ報告がなく、
そして後述するようにサケ・カルシトニンに変換できる
。

サイクル２９ ★★
このサイクル２９においては、カップリング及び脱保
護反応はアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｌ−
セリンで置き換える点を除きサイクル３１におけると同
様に行われる。

即ちサイクル２８ このサイクル２８においては、アミノ酸反応物としてＢ
ＯＣ−グリシンを用いること以外はサイクル３１と同様
にカップリング及び脱保護反応が行われる。

カップリング及び脱保護反応は次の式％式％ このサイクルではカップリングと脱保護反応は※サイク
ル３１と同じアミノ酸反応物を用いて行い次の化合物を
うる。

サイクル２に のサイクル２６ではカップリング反応は ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンの活性エステル誘導体を用い
て行う。

ＤＣＣカップリング剤を用いてＢＯＣ−アスパラギン又
はＢＯＣ−グルタミンの際におこる公知の副反応を避け
るために、ＤＣＣカップリング法に代え活性エステル法
を用いる。

この反応はＢＨＡ樹脂の遊離アミン１当量に対し２−１
０当量のＢＯＣ−Ｌ−アスパラギンの活性エステル誘導
体と、当初使用ＢＨＡ樹脂１ｒあたり２−２−２Ｏの溶
媒（ジメチルホルムアミド単独か、又はそれとベンゼン
、メチレンクロリド、クロロ☆☆ホルムもしくはそれら
の均等物との混合物）の中で行われる。

反応時間は１−７２時間である。反応混合物はニンヒド
リン試験で反応の完結をしらべたのちｒ過してＢＯＣ−
ペプチド樹脂から除く、使用される活性エステル誘導体
は２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエ
ステル、ペンタフルオロフェニル体又はそれらの均等物
である。

誘導体の活性エステル部をあられすのにＡＥという記号
を用いる。

このカップリング反応は次のようである。

ＢＯＣ基を除去するところの脱保護反応はサイクル３２
におけるようにして行う。

サイクル２５−２１ ２５から２１までの各々のサイクルで、カップリング及
び脱保護反応はサイクル２５ではＢＯＣＢｚ−Ｌ−スレ
オニンを、サイクル２４ではＢＯＣ−ω−Ｔ−Ｌ−アル
ギニン、サイクル−２３ｒ★ではＢＯＣ−Ｌ−プロリン
を、サイクル２２ではＢＯＣ−Ｗ−Ｌ−チロシンを、そ
してサイクル２１ではＢＯＣ−０−Ｂ ｚ−Ｌ−スレオ
ニンを用いて、サイクル３１における方法及び同量の反
応物を用いて行われる。

サイクル２１の完結により得られる化合物は次のようで
ある。

サイクル２０ このサイクル２０ではアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−Ｌ
−グルタミン活性エステル誘導体を用※※い、サイクル
２６の方法及び量の反応物を用いてカップリング及び脱
保護反応を行う。

次の化合物が得られる。

サイクル１９ このサイクル１９ではアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−Ｌ
−ロイシンを用いてサイクル３１におけるようにして反
応を行う。

れる化合物は サイクル１９で得ら サイクル１８ このサイクル１８ではアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−ε
−Ｖ−Ｌ−リジンを用いることができ☆☆る。

それ以外はサイクル１８の方法は、サイクル３１におげ
ろように行って次の化合物をうる。

サイクル１７−１５ このサイクル１７−１５は、サイクル１７においてはＢ
ＯＣ−Ｎ（ｉｍ） −Ｖ−Ｌ−ヒスチジンを、サイクル
１６ではＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを、そしてサイクル１５
ではＢＯＣ−Ｌ−グルタミン★★酸Ｂｚエステル（Ｂｚ
はセリン及びスレオニンにおいて表わすと同様の基を表
わす）を反応体とすること以外はサイクル３１における
ように行い、サイクル１５からは次の化合物を得る。

サイクル１４−８ サイクル１４はアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−Ｌ−グル
タミン−ＡＥを用いてサイクル２０と同様に行うことが
できる。

サイクル１３−８は、サイクル１３ではＢＯＣ−０−Ｂ
ｚ −Ｌ−リジンを、サイクル１２ではＢＯＣ−Ｌ−ロ
イシンを、サイ☆☆クル１１ではＢＯＣ−ε−Ｖ−Ｌ−
リジンを、サイクル１０ではＢＯＣ−グリシンを、サイ
クル９ではＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを、そしてサイクル８
ではＢＯＣ−Ｌ−バリンを用いること以外はサイクル３
１と同様にして行うことができ、次の化合物をうる。

サイクル７ アミノ酸誘導体としてＢＯＣ−８−Ｒ−Ｌ−システィン
を用いること以外はサイクル３１と同様☆☆にしてサイ
クル７を行うことができる。

サイクル７で得られる化合物は次の式で表わされる。

サイクル６−２ サイクル６から４迄はアミノ酸誘導体としてサイクル６
ではＢＯＣ−０−Ｂｚ−Ｌ−スレオニンを、サイクル５
ではＢＯＣ−Ｂｚ−Ｌ−セリンを、そしてサイクル４で
はＢＯＣ−Ｌ−ロイシンを用いる以外はサイクル３１と
同様にして行う。

サイク★★ル３はＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン活性エステ
ルを用いサイクル２６と同様にして行う。

サイクル２はアミノ酸誘導体としてＢＯＣ−０−Ｂｚ−
Ｌ−セリンを用いサイクル３１と同様に行う。

サイクル２で得られる化合物は サイクル１ このサイクルはＢＯＣ−８−Ｒ−Ｌ−システィン誘導体
を用い、サイクル７と同様にして行うことができる。

システィンのために選択される基Ｒはサイクル７におい
て用いられるものと同一であるか又は異る。

例えばもしサイクル７でＢＯＣ−８−エチルチオ−Ｌ−
システィンを用いたならばサイクル１ではＢＯＣ−８−
４−メトキシベンジル−Ｌ−システィンでも良く、もし
サイクル７でＢＯＣ−８−４−メトキシベンジル−Ｌ−
システィンを用いたならばサイクル１でもまたこの化合
物を用いて良い。

サイクル１で得られる化合物は次の式をもつ。

サイクル１はサケ・カルシトニン樹脂ペプチドの完成を
表わす。

この樹脂ペプチドは反応容器から除き減圧乾燥する。

樹脂ペプチドの重量は、本合成の当初に用いたＢＨＡ樹
脂の重量の２．０から３．５倍であることが期待され得
る。

樹脂ペプチドの分解 サイクル１で得られる樹脂ペプチドを液状フッ化水素（
ＨＦ）で分解してペプチドとする。

このＨＦ分解は樹脂ペプチドとアニソール（樹脂ペプチ
ド１１に対して０．５−５ｍ１）の混合物を液状ＨＦ
（樹脂ペプチド１１に対して２−２０Ｔｌ旬を用い一２
０°から＋１５°Ｃで０．５−２０時間処理して行われ
る。

反応后、過剰のＨＦを溜置し、得られるペプチドと樹脂
粒の混合物を有機溶媒（たとえば酢酸エチル、ジエチル
エーテル、ベンゼン等等）で抽出しアニソールと残りの
ＨＦを除く。

ペプチドは樹脂粒から酢酸水溶液に抽出することにより
分離できる。

この段階におけるペプチドは環状のサケ・カルシトニン
ではなく、分子中１位及び７位のシスティン間に環状の
ジスルフィド結合のないところの非環式生産物である。

☆☆ このＩＦＴＰＦ理は、７位又は１位
のシスティン残基のチオール官能基に、Ｓ−アルキルチ
オ保護基を用いて作った材料におけるものを除いて、ペ
プチドからすべての保護基を除去する。

Ｓ−ノルマルアルキルチオ−Ｌ−システィン残基はＨＦ
分解処理に安定であり、分解及び抽出の工程を通じてそ
のま工で残る。

５−Ｂｚ−Ｌ−システィン残基はＨＦにより分解され、
遊離チオール官能基をもつシスティン残基を与える。

本発明の合成法においては両種の保護基が、それのみで
又は両方で、７位及び１位に用いられる。

かくて、ＨＦ分分解圧得られるペプチドは、樹脂ペプチ
ド合成に用いられるシスティン誘導体のチオール官能基
のために選ばれる保護基に応じて種々のタイプのものＬ
一つであり得る。

もしＢＯＣ−８Ｂｚ−Ｌ−システィン誘導体が、樹脂ペ
プチド合成のサイクル７及び１で用いられるならば、Ｈ
Ｆ分解で得られるペプチドはタイプＩのもので、両方の
システィン残基ともに遊離チオール官能基をもつであろ
う。

このペプチドは次の式で表わされる。

もしＢＯ（、−８−ノルマルアルキルチオ−Ｌ−システ
ィン誘導体がサイクル７でそしてＢＯＣ−８−Ｂｚ−Ｌ
−システィンが１位で用いられ工ば、☆☆分解后のペプ
チドはタイプＨの如きもので次の式％式％ もしＢＯＣ−Ｓ −Ｂ ｚ−Ｌ−システィンが７位で、
ソシてＢＯＣ−８−ノルマルアルキルチオ−Ｌ −シス
ティンが１位で用いられたならば、ＨＦ分解★★で得ら
れるペプチドはタイプ■のもので、次式で表わされるで
あろう。

上述の３つのタイプの各々は以下に述べる方法で、充分
に活性なサケ・カルシトニンに変換され得る。

ジスルフィド環構造の形成 ＨＦ分解処理で得られた粗ペプチド溶液は、非環式ペプ
チドを１位及び７位のシスティン残基間にジスルフィド
結合をもつ環式のものに変えることにより活性サケ・カ
ルシトニンに変換することができる。

ジスルフィド環形成に用いられる方法は、樹脂ペプチド
合成に用いたシスティン誘導体により決まる。

樹脂ペプチドのＨＦ分解后に得られるタイプ■ペプチド
は、酸化的環形成法を必要とする。

タイプ■及び■のペプチドは新規な非酸化的方法を用い
る。

これらの方法を以下に述べる。タイプ■のペプチド タイプ■ペプチドは遊離チオール基をもつシスティン残
基を含んでいる。

ジスルフィド閉環は酸化的方法で行う。

反応は、酸化剤として大気圧の酸素を用いることができ
る。

ＨＦ分解で得たペプチドの粗水性酢酸溶液を蒸溜水で稀
め、分解された樹脂ペプチド１１あたり５０５０−２Ｏ
０の量とする。

この溶液のｐＨを、水酸化アンモニウム添加により６．
０から８．５に上げる。

空気を溶液中に２−２０時間、又は溶液にもはや遊離チ
オールが検出されなくなる迄導入しても良い。

溶液のｐＨを、酢酸添加により３−５に下げる。

するとペプ☆☆チドはサケ・カルシトニンに変換され精
製される。

大気圧酸素以外の酸化剤たとえばフェリシアニドイオン
やジアゼン・ジカルボン酸（Ｎ−Ｎ−ジメチルアミド）
を用いても良い。

反応は次のようである。

ペプチドは今やサケ・カルシトニンに変換された。

得られた粗ペプチド溶液はクロマトグラフで精製し、天
然のサケ・カルシトニンと化学的性状及び生物活性が同
一の凍結乾燥生成物を得ることができる。

タイプＨのペプチド タイプ■ペプチドはシスティンの１位に遊離チオールを
、そしてシスティンの７位にＳ−ノルマ★★ルアルキル
チオ基をもっている。

このペプチドは別途出願中の明細書に書いである新規な
非酸化的方法で環状サケ・カルシトニンに変換すること
ができる。

この方法はジスルフィド結合を転位させて、ノルマルア
ルキルメルカプタンの移動と共にサケ・カルシトニンの
内部ジスルフィド結合を形成することを包含する。

この反応は次のように表わされる。

タイプ■ペプチド タイプ■ペプチドはシスティンの７位に遊離のチオール
を、また１位にはＳ−ノルマルアルキルチオ基をもって
いる。

このペプチドもまた別途出願中の新規非酸化的方法によ
り環状サケ・カルシ☆☆トニンに変換することができる
。

該方法はジスルフィド結合の転位により、ノルマルアル
キルアミンの移動と共にサケ・カルシトニンの内部ジス
ルフィド結合を形成する。

この反応は次のように示される。

この反応はタイプ■及び■の何れのペプチドについても
行なわれる。

即ちＨＦ分解で得た粗タイプ■又は■ペプチドの水性酢
酸溶液を蒸溜水で稀め、最終的には、分解樹脂ペプチド
１１あたり５Ｏ−２００１ｒＬｌの容量とする。

この溶液のｐＨは水酸化アンモニウム添加により６−９
に調節し、混合物は２−４８時間にわたって窒素のよう
な不活性ガス流中で、閉じた容器の中でかくはんする。

反応は、流出ガスがノルマルアルキルアミンを含まなく
なったら停止させる。

反応混合物のｐＨは、氷酢酸を加え３．５−５．５に下
げる。

かくてペプチドはサケ・カルシトニンに変換された。

得られた粗ペプチド溶液はクロマトグラフで精製し、化
学的性状も生物活性も天然のサケ・カルシトニンと同一
の凍結乾燥品とする。

粗サケ・カルシトニンの精製 上記で合成の粗サケ・カルシトニン溶液（ｐＨ５，０）
はイオン交換操作により濃縮する。

濃縮物はゲルＥ過法及びイオン交換クロマトグラフ法に
より精製する。

最終生成物は溶液を凍結乾燥することにより、ふわふわ
した白色固体として得られる。

本生成物は文献（Ｓ、グツトマンほか：ヘルペチカ・キ
ミカ・アクタ５２．１７８９−９５（１９６９））に記
載のものに化学的にも生物学的にも同等のものである。

本生成物は、サケ・カルシトニンに相当する正しいアミ
ノ酸分析値を与える。

以下に本発明によるカルシトニン製造の特定の例を示す
。

実施例 １ 樹脂の活性化 ０、６１ ｍｅｑ／ｆのアミン力価のＢＨＡ樹脂（５ｉ
）をペプチド合成用反応器にューヨー久オレンジハーク
のシュワルツ・マン・インコーホレーテッド発売）に入
れる。

樹脂を次の溶媒２５ｍ１で処理し、各々の処理后に沢過
を行う。

メチレンクロリド（２分） クロロホルム（２回、各２分） １０％トリエチルアミン（クロロホルム溶液）（２回、
各５分） クロロホルム（２分） メチレンクロリド（３回、各２分） サイクル３２ （カップリング） ＢＨＡ樹脂、メチレンクロリド２５１ｒＬ１１及びＢＯ
Ｃ−Ｌ−プロリン１．２９ Ｆ （０，ＯＯ６モル）を
１０分間攪拌する。

ジシクロヘキシカルボジイミドのメチレンクロリド溶液
６． Ｏｒｕｌ （溶液１ｙｒｔｌ中ＤＣＣ１ミリ当量
含有）を加え、これを６時間かきまぜる。

反応混合物を濾過して、反応器から除きそしてＢＯＣ−
プロリルＢＨＡ樹脂を次のもので各々２５ｍ１で２分洗
滌し、それぞれ沢過して洗液を除去する。

メチレンクロリド（２回） メチルアルコール（２回） メチレンクロリド（３回） （アセチル化） 次いで該樹脂を、トリエチルアミン（ＴＥＡ ）ｌ、
５ ｍｌ、無水酢酸ｌ ｍｌ及びクロロホルム２５７７
１１の混合物で２時間かきまぜる。

反応混合物は濾過して除去し、樹脂を次のもので各々２
５１１１１で２分洗滌する。

クロロホルム（２回） メチルアルコール（２回） メチレンクロリド（３回） （脱保護） ＢＯＣ保護樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１５ｍ
ｌ及びメチレンクロリド１５ｍ１の混合物で５分間かく
はんする。

この混合物を濾過し、樹脂を、ＴＦＡ １５ｍｌとメ
チレンクロリド１５ｍ１の別の混合物で３０分かくはん
し、反応混合物を沢過し、樹脂を次のもの２５Ｔｌｌで
洗滌する。

メチレンクロリド（２回、各２分） メチルアルコール（２回、各２分） クロロホルム（２回、各２分） １０％ＴＦＡ −クロロホルム溶液（２回、各１０分
） クロロホルム（２回、各２分） メチレンクロリド（２回、各２分） アミン乃至プロリンカ価を確立するためＬ−フロリンＢ
ＨＡ樹脂を滴定する。

その値は樹脂Ｉｆ？あたり、アミン乃至プロリン０．５
５ミリ当量であった。

サイクル３１ （カップリング） Ｌ−プロリル樹脂、メチレンクロリド２５ｍ１及びＢＯ
Ｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン１．７１（０，００
５５モル）を１０分間かくはんする。

次いでジシクロへキシルカルボジイミドのメチレンクロ
リド溶液（溶液１ ｍｌ当りＤＣＣ１ミリ当量）の５．
５ ｒｒｔｌ！ （即ちＤＣＣ全量０．００５５モ＃）
を反応器に加え、この混合物を２時間かくはんする。

反応混合物を反応器から除き、樹脂を次のもので２５ｍ
１．２分ずつ洗い、洗液はそのたびに枦去する。

メチレンクロリド（２回） メチルアルコール（２回） メチレンクロリド（３回） （脱保護） サイクル３２で説明した保護基脱離操作を、このサイク
ルにおいても繰り返す。

サイクル３０から２７ これらのサイクルで用いられるカップリング及び脱保護
操作は、スレオニン誘導体の代りに次のアミノ酸誘導体
を使用する点以外はサイクル３１に於けると同様である
。

即ちサイクル３０・・・・・・・・・ＢＯＣ−グリシン
０．９７ｊ？（０１００５５モル） サイクル２９・・・・・・・・・ＢＯＣ−０−ベンジル
−Ｌセリフ １．６２ｆ？（０，００５５モル）サイク
ル２８・・・・・・・・・（サイクル３０に使用のもの
と同一） サイクル２７・・・・・・・・・（サイクル３１に使用
のものと同一） サイクル２６ （カップリング） サイクル２７から得たペプチド樹脂はジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）２５ｍｌずつで２度洗う。

次いでＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニル
エステル２．９ｆ（０，００８モル）のＤＭＦ″３、５
ｍｌ溶液と２４時間かきまぜる。

反応混合物を沢過し、樹脂ペプチドを次の溶剤すなわち
ＤＭＦ、メチレンクロリド、メタノール、メチレンクロ
リドの各２５ ｒｒｔｌで２度ずつ２分間ずつ洗滌する
。

各各の溶媒は戸去する。

ニンヒドリン試験は陰性であった。

（脱保護） サイクル３２と同様の脱保護方法をくりかえす。

サイクル２５ サイクル３１と同じ材料及び分量を用いてカップリング
及び脱保護反応を行う。

サイクル２４ （カップリング） サイクル２５で得られる樹脂ペプチドを、ＤＭＦ２５ｍ
ｌずつで２回洗う。

ついで樹脂ペプチドをＢＯＣ−Ｎ−γ−トシルーＬ−ア
ルギニン３．４３９ （０，００８モル）及びＤＭＦ
２５ｍ１の混合物と１０分間かくはんする。

ついでＤＣＣ８１ｒｌｌのメチレンクロリド溶液（ＤＣ
Ｃｏ、ｏｏｓモルに相当）を加え、その混合物を６時間
かくはんする。

反応混合物を沢去する。

樹脂ペプチドを次の溶媒２５ｍ１ずつで２回ずつ各２分
間洗滌する。

即ちＤＭＦ、メチレンクロリド、メチルアルコール、メ
チルクロリド、ニンヒドリン試験は陰性であった。

（脱保護） サイクル３２で用いたと同一の脱保護操作をくりかえす
。

サイクル２３ （カップリング） サイクル２４で得たペプチド樹脂はＢＯＣ−Ｌプロリン
１．７７Ｐ（０，００８モル）及びメチレンクロリド２
５ｍ１で１０分間かくはんする。

ＤＣＣ８ｍｌのメチレンクロリド溶液（ＤＣＣｏ、ｏ
ｏ ｓモル相当）を加え、混合物を６時間かくはんする
。

反応混合物を沢過し、樹脂ペプチドを次の溶媒（即ちメ
チレンクロリド、メチルアルコール、メチレンクロリド
）の各２５ｒＩｌｌで２回ずつ２分間ずつ洗滌スル。

各々の洗液は沢過により除去する。ニンヒドリン試験は
陰性。

（脱保護） サイクル３２で用いた脱保護工程をくり返す。

サイクル２２及び２１ このサイクルで用いるカップリング及び脱保護操作は、
ＢＯＣ−Ｌ−プロリンに代え次のアミノ酸誘導体をカッ
プリング反応に用いろ点を除きサイクル２４と同様であ
る。

サイクル２２・・・・・・・・・ＢＯＣ−０−ベンジル
−Ｌ −チロシン ２．９７ｆ（０，００８モル）サイ
クル２１・・・・・・・・・ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ
スレオニン ２．４７９ （０，００８モル）サイクル
２０ この工程は、アスパラギン誘導体の代りにＢＯＣ−Ｌ−
グルタミン ｐ−ニトロフェニルエステル３．０ｆ（０
，００８モル）を用いること以外はサイクル２６と同様
である。

サイクル１９から１５ スレオニン誘導体の代りに次のようなアミノ酸誘導体を
用いること以外はサイクル３１と同じ方法を用いる。

サイクル１９・・・・・・・・・ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン
１．３７Ｐ（０，００５５モル） サイクル１８・・・・・・・・・ＢＯＣ−ε−カルボベ
ンジルオキシ−Ｌ−リジン ２．０９Ｐ（０，００５５
モル） サイクル１７・・・・・・・・・ＢＯＣ−Ｎ（ｉｍ）−
カツウボベンジルオキシーＬ−ヒスチジン ２．５８♂
（０，００５５モル） サイクル１６・・・・・・・・・（サイクル１９を見よ
）サイクル１５・・・・・・・・・ＢＯＣ−Ｌ−グルタ
ミン酸γ−ベンジルエステル １．８Ｆｌ（０，００５
５モル） サイクル１４ サイクル２０を見よ りイクル１３ カップリングの際にフロリン誘導体の代りにＢＯＣ−０
−ベンジル−Ｌ−セリン２．３１’（ｏ、ｏｏｓモル）
を用いる以外はサイクル２３と同じ。

サイクル１２から９ カップリングの際にスレオニン誘導体の代りに次のアミ
ノ酸誘導体を用いる以外はサイクル３１と同じ。

サイクル１２・・・・・・・・・（サイクル１９におけ
ると同様の材料） サイクル１１・・・・・・・・・サイクル１８における
と同様の材料を使用 サイクル１０・・・・・・・・・サイクル３０における
と同様の材料を使用 サイクル９・・・・・・・・・サイクル１９におけると
同様の材料を使用 サイクル８ （カップリング） サイクル９で得た樹脂ペプチドをＢＯＣ−Ｌバリン１．
７９Ｐ（ｏ、ｏｏ８モル）及びメチレンクロリド２５ｍ
１と１０分間かくはんする。

次いでＤＣＣ８ＴＬｌのメチレンクロリド溶液（ＤＣＣ
ｏ、ｏｏｓモル相当）を加えこの混合物を１６時間かく
はんする。

反応混合物を濾過し、樹脂ペプチドを次の溶媒（即ちメ
チレンクロリド、メチルアルコール、メチレンクロリド
）の各２５７７１１スつで２回ずつ、２分ずつ洗滌する
。

各々の洗液は濾過して除く。

（脱保護） サイクル３２を見よ。

サイクル７ カップリングにおいてスレオニン誘導体の代りＫＢＯＣ
−８−エチルチオ−Ｌ−システィン１．５５ｆ（０，０
０５５モル）を用いること以外は。

サイクル３１と同様に行う。

サイクル６ 材料及び方法はサイクル３１に同じ。

サイクル５ 材料及び方法はサイクル２９に同じ。

サイクル４ 材料及び方法はサイクル１９に同じ。

サイクル３ 材料と方法はサイクル２６に同じ。

サイクル２ 材料と方法はサイクル２９に同じ。

。サイクル１ スレオニン誘導体の代りにＢＯＣ−８−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システィン１．８８５’（０，００５５モ
ル）を用いること以外はサイクル３１と同じ。

サイクル１の完結后、樹脂ペプチドはノルマルヘキサン
２５ＴｒＬｌずつで２回洗滌する。

ペプチド材料を反応器から移し、４０℃及び０．１ ｍ
ｍＨｇで２４時間電気真空かまで乾燥する。

フッ化水素による分解 乾燥した樹脂ペプチド１６１及びアニソール１６ｍ１を
テフロンの反応器に入れる。

テフロン被覆のマグネチック・スターラーを備えた反応
器をドライアイス−アセトン浴中におき、フッ化水素ガ
ス１００７７２１を反応器中へ凝縮させる。

この混合物を水浴中で１時間Ｏ℃でかくはんする。

フッ化水素は減圧で溜置する。

・残渣を酢酸エチル１００ＴＬｌずつで６回こねる。

ペプチドは、０．１モル酢酸水溶液８００７７１１を使
って樹脂粒から抽出する。

ペプチドのサケ・カルシトニンへの環化 フッ化水素分解で得られた水性酢酸抽出物に蒸溜水７０
０ＴＬｌを加えて１．５リツトルにうすめる。

この溶液のｐＨを濃水酸化アンモニウム添加により７５
に調節する。

溶液を窒素気流下に２４時間、閉じた容器中でかくはん
する。

この時は発生する。窒素気流中にはエチルメルカプタン
は検出されない。

窒素気流中のエチルメルカプタン含量は、この気流をエ
ルマン試薬（Ｇ、Ｌ、エルマン：アーカイブズ・オフ・
バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス生２
，７Ｏ−７（１９５９））の溶液に通じることにより測
定される。

反に混合物のｐＨは氷酢酸添加により５．０に調節する
。

粗サケ・カルシトニンの精製 ｐＨ５，０における上記の合成法からの溶液１．５リツ
トルを、ＳＰ−セファデックス Ｃ−２５イオン交換カ
ラムを用いて濃縮する。

０．５モルの塩化ナトリウム溶液でカラムから移した濃
縮液７５継を、セファデックス Ｇ−２５（微粉体）ゲ
ル１過カラムを通しそして０．０３モル酢酸水溶液で溶
離することによって脱塩し精製する。

このカラムからのサケ・カルシトニンに水酸化アンモニ
ウム液を加えてｐＨ６，０とする。

この溶液を、酢酸アンモニウム緩衝液で溶離したホワッ
トマンＣＭ５２を用いるイオン交換クロマトグラフでさ
らに精製する。

このカラムからのサケ・カルシトニン画分に氷酢酸を加
えてｐＨ５，０とする。

この溶液を、ＳＰ−セファデックス Ｃ−２５イオン交
換カラムを用いて濃縮する。

０．５モル塩化ナトリウム液でカラムから移した３０ｍ
ｙｅの濃縮物は、セファデックスＧ−２５（微粉末）ゲ
ルを過カラムで脱塩する。

精製されたサケ・カルシトニン分画を集め凍結乾燥する
。

生成物はふわふわした白色固体として得られる。

本島は文献（Ｓ、グツトマンほか：へルベチカ・キミカ
・アクタ５２．１７８９９５〔１９６ＣＪｌ）に記載の
ものと生物学的にも化学的にも同等のものであることが
見出された。

これ迄に記載し又は実施例１に述べた化合物の製法は多
くの点において変えることができる。

しかし一つ以上の因子を変更すれば、変更した因子の何
れの一つをも標価することが困難になる。

このために、単に一因子のみを変えた一連のテストを行
い、その結果を比較すること工する。

実施例 ２ サイクル２４においてＢＯＣ−Ｑ−）シルーＬ−チロシ
ンの代りにＢＯＣ−ｇ−二トローＬ−アルキニン２゜５
５ Ｐ （０，００８モル）ヲ用いル以外は、実施例１
におけると同様の材料を同量用い、可能な限りすべての
同一の条件で反応を行った。

得られた結果は実施例１に述べたものと実質的に同一で
ある。

実施例 ３ サイクル２２でＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−チロシンの
代りＫＢＯＣ−０−２−７”ロモベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−チロシン３．４５５’（ｏ、ｏｏｓモル）を
用いた以外は、実施例１におけると同じ材料を同量用い
同一条件下で反応を行った。

得られた結果は実施例１におけると類似のものであった
。

実施例 ４ サイクル１８及び１１においてＢＯＣ−ε−ベンジルオ
キシカルボ′ニルーＬ−リジンの代りに、いずれもＢＯ
Ｃ−ε−２−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジン２．２８５’（０，００５５モル）を用いる以外は
すべての方法、材料、条件を実施例１と同様にして行っ
た。

得られた結果は実施例１におけるものと実質的に同一で
あった。

実施例 ５ サイクル７においてＢＯＣ−８−エチルチオルーシステ
ィンの代りにＢＯＣ−８−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−
システィン１．８８１！ （０，００５５モル）を用い
た以外は実施例１の樹脂ペプチド台底におけると同一の
材料、方法及び条件を用いタイプ■のペプチドを作る。

フッ化水素分解から得た水性酢酸抽出物に、蒸溜水８０
０１ｒＬｌを加えて１．５リツトルに稀め、ｐＨを濃水
酸化アンモニウム添加により７０に調節する。

ついで溶液中へ３時間にわたり空気流を送る。ついで氷
酢酸を加え、反応混合物のｐＨを５．０に下げる。

粗サケ・カルシトニンの精製は実施例１に記載のものと
同様な方法で行う。

実施例 ６ サイクル７においてＢＯＣ−８−エチルチオルーシステ
ィンの代りにＢＯＣ−８−メチルチオＬ−システィン１
．４８ｆ（０，００５５モル）を用いる以外はすべての
方法、材料及び条件を実施例１と同様に行い、実施例１
と類似の結果を得る。

実施例 ７ サイクル１においてＢＯＣ−ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｌ−システィンの代すにＢＯＣ−８−３・４−ジメチ
ルベンジル−Ｌ−システィン１．６６ｆ（０，００５５
モル）を用いる以外はすべての材料、方法及び条件を実
施例１と同様に保ち、実施例１におけると類似の結果を
得る。

実施例 ８ 次の点板外はすべての材料、方法及び条件を実施例１と
同様に行う。

得られる結果は実施例１に類似。

実施例 ９ サイクル７に於てはアミノ酸誘導体はＢＯＣ−８−ｐ−
メトキシベンジル−Ｌ−システィン１．８８Ｓ’（０，
００５５モル）であり、またサイクル１ではアミノ酸誘
導体はＢＯＣ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン１．５
５１（０，００５５モル）であること以外はすべての材
料、方法及び条件は実施例１と同様に行いタイプ非ペプ
チドを製造、これを環化しついで環化生成物を精製して
、実施例１における如きサケ・カルシトニンを製造する
。

本発明のある実施態様のみが特異的にくわしく述べられ
たが、しかし他の特異的実施態様も行いうろことや多く
の変更が本発明の精神のなかですべて為しうろことは当
業者にとって明白である。

すべてのそのような他の実施態様や変更は冒頭の特許請
求の範囲のなかにあるのである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アミド結合によってプロリン残部を一般式（ここで
   ■は樹脂のポリスチレン部分を示す）の樹脂支持体へ結
   合し、つづいてサケ・カルシトニンの３１位の構成アミ
   ノ残部を固相合成法によって導入し、樹脂支持体と存在
   する保護基を無水フッ化水素で分離してサケ・カルシト
   ニン前駆体を生成し、ついで第１位のシスティン単位を
   第７位のシスティン単位に結合して環状のジスルフィド
   構造を形成することから成るサケ・カルシトニンを製造
   する方法において： （１）一般式 原子である）のサケ・カルシトニン前駆体を製造し、 （２７ついで該前駆体を不活性ガス流の存在下で処理し
   て環状構造を形成することを特徴とする前記方法。