JPS5835156A - 螢光標識ペプチド及びそれを利用するヒトβ型インタ−フエロンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な螢光標識ペプチド及びそれを利用する新
規なヒトβ臘インターフェロン０ＩＩＢ定法に関する。

本発明の螢光標識ペプチドは、下記一般式で表わされる
。

Ｒ−Ｍｅｔ　−５ｅｒ−Ｔｙｒ　−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　
−Ｌｅｕ　−Ｇｌｙ−Ｐｈ＠−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−８ｅｒ　−ｓｅｒ　　ｆｉｌＯＨ 〔式中、Ｒは螢光色素を示す。〕 本発明者らは上記一般式（１）で表わされる螢光標識ペ
プチドがヒトβ型インターフェロンの抗体に対して特異
的に免疫反応し、免疫複合体を形成するという事実及び
、この螢光標識ペプチドを螢光免疫測定法に利用するこ
とにより、ヒトβ型インターフェロンの測定が可能であ
るという事実を見い出し九。本発明はとれらの知見に基
づいて完成されたものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＣ，
ＩＵＢの規定、或いは当該分野における慣用記号に従う
ものとしその例を次に挙げる。

Ａｒｇ　　！フルギニン Ａｓｎ　　Ｈアスパラギン Ｓｅｒ　　；セリン Ｇｌｎ　　ｉグルタ之ン Ｍｅｔ　　；メデオニン Ｌｅｕ；　ロイシン Ｐｂｓ＋　　ｓフェニルアラニン Ｔｙｒ　　ｉチルシン （ｊｌＦ　　；グリシン ２　；カルボベンゾキシ基 Ｓｕ　　　ｉ　コハク酸インド基 Ｔｏｓ　　ｉ　Ｐ　　）ルエンスルホエル基Ｂｏｃｉ第
８級ブトキシカルボニル基 本発明の一般式（１）で表わされる螢光標識ペプチドは
、下記一般式 ％式％ （２１ で示されるペプチドを螢光色素で標識することによシ製
造することができる。

上記において用いられ一般式（２）のペプチドと結合し
て、本発明の一般式（１）の螢光標識ペプチド中ＫＲと
して組み込まれる螢光色素は、通常の螢光標識試薬から
選択される。その具体例としては、例えばフルオレツセ
イン・インチオシアナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチル
ローダミン・インチオシアナー）（ＴＲＩＴＣ）、置換
ローダミン・インチオシアナー）　（ＸＲＩＴＣ）、ロ
ーダミンＢイソチオシアナート、ジクロロトリアジンフ
ルオレツセイン（ＤＴＡＦ）等が挙げられる。螢光色素
の使用量は、特に限定はないが、一般式（２）のペプチ
ドに対して通常１〜１０倍モル、好ましくは２〜４倍モ
ル用いるのがよい。

上記一般式（２）のペプチドの螢光色素による標識反応
は例えば適尚な緩衝液中でアルカリ性、好ましくはＰＨ
８〜１２にて行なわれる。緩衝液としては、上記ｐＨ範
囲の性状を示す隈シ特に限定はなく広い範囲から選択さ
れるが例えばホウ酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、グリシ
ン緩衝液、バルビタール緩衝液、トリス緩衝液、アメジ
オール緩衝液、リンゲル氏緩衝液等を使用できる。又、
反応に供する一般式は）のペプチド及び／又は螢光色素
が上記緩衝液に溶解しない場合は、例えばメタノール、
エタノール、アセトン、ＤＭＦ　（ジメチルホルムアオ
ド）等の２勢ペプチド及び螢光色素を溶解し得る通常の
溶媒を反応系内に加えて上記標識反応を行なうことかで
１１石。

上記標識反応は、通常Ｏ℃〜４０℃好★しくはθ℃〜２
０℃にて進行し数分〜４８時間程度で終了する。

かくして本発明の一般式（１）で表わされる螢光標識ペ
プチドを得る。これは、通常の分離手段、例えば抽出、
分配、カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過法等により
単−ｎＩ！！される。

前記標識反応において原料として用いる一般式（２）で
示されるペプチドは、新規化合物であり、例えば下記反
応打揚式−１に示す方法によって製造することができる
。

く反応行程式−１〉 Ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｂ　　（３１ Ａ−Ｌｅｕ−Ｇ１７−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ
−８＠ｒ−８ｅｒ−ＯＨ２ ＯＨ Ａ−Ｔｙｒ−Ａ＠ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−５ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨａ＃
↓ Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｂ＠
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−５ｅｒ−８ｅｒ−ＯＲ（Ｉ
ｓＡ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−８ｅｒ
−８ｅｒ−ＯＨα９↓ Ｈ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−５ｅｒ−
８ｅｒ−ＯＨ（２１［上記各式中Ａはアミ）基の保護基
、Ｂは水酸基又はカルボキシル基の活性基、Ｃはアルギ
ニンのグアニジノ基の保護基をそれぞれ示す。〕ペプチ
ド（３）とペプチド（４）との反応は、溶媒の存在下に
行なうことができる。溶媒としては、通常のベグチド縮
合反応に使用し得る多種の４０１例えば無水ｉたは含水
のジメチルホルムアンド、ジ　　。

メチルスルホキシド、ピリジン、り四ロホルム、ジオキ
サン、ジク胃ルメタン、テトラヒドロ７ラン１酢酸エチ
ル％Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリア
ンド或いはこれらの混合溶媒勢を使用できる。ペプチド
（４１に対するペプチド（３）の使用割合は、特に限定
されず広い範囲内で適宜Ｒ択することができるが、通常
等量〜５倍量、好ましくは等量〜１．５倍量使用するの
がよい。反応温度は通常約−４０〜約６０℃、好ましく
は約−２０〜約４０℃の範囲とすればよく、反応時間は
一般に数分〜８０時間１度である。

ペプチド（６）とアミノ酸（７）との反応、ペプチド（
９）とペプチド（至）との反応、ペプチド（至）とペプ
チド０との反応及びペプチド（至）とペプチド（２）と
の反応は、いずれも上記ペプチド（３）とペプチド（４
）との反応と同様にして行なうことができる。

上記縮合反応終了後、得られるベプチＥＱｎ（ＤＡ及び
Ｃの保饅基は、常法によシ離脱できる。斯かる方法とし
ては例えば液体アンモニア中での金属ナトリウムによる
還元方法を挙げることができる。

金属ナトリウムは、反応浸液がパーマネントブルーに８
０秒〜１０分間程度呈色しているような量で用いられる
。この還元は通常−４０〜−７ｅｔ程度にて行なわれる
。

上記反応行程式−Ｉにおいて用いられるペプチド（４）
は、例えば下記反応行１式−２に示す方法によシ製造さ
れる。

く反応行程式−２〉 Ｈ−５ｅｔ−ＯＲ’ ｔＳ Ａ−８ｅｒ−Ｂ　　　　　　　　Ａ−８ｅｒ−８ｅｒ−
ＯＲ’ａ秒　　　　　　　　　　　　（社） Ｈ−８ｅｒ−Ｂａｒ−ＯＲｎ ■ Ａ−Ａｒｇ−５ｅｒ−８ｅｒ−ＯＲ（２１Ａ−Ａｒｇｉ
ｅｒ−５ｅｒ−ＯＨ＠４１Ｈ−Ａｒｇ−８ｅｒ−８ｅｒ
−ＯＨ（４１〔上記各式においてＲ１は低級アルキル基
を示す。Ａ、Ｂ及びＣは前記に同じ。〕 アさノ酸（２）と７オノ酸（至）との反応は、前記ペプ
チド（３）とペプチド（４）との反応と同様にして行な
うむとができる。

ペプチド（社）のＡの保饅基は、常法によシ離脱できる
・斯かる方法としては、例えば還元的方法（例パラジウ
ム、パラジウム黒尋の触媒を用いる水素添加、液体アン
モニア中金属ナトリウムによる還元）、アシドリシス（
例トリフルオロ酢酸、弗化水素、メタンスルホン酸、臭
化水嵩酸等の強酸によるアシドリシス）等を例示できる
。触媒を用いる水素添加の場合は、通常水素圧１気圧下
Ｏ〜４０℃にて行なわれる。触媒の使用量は通常１００
４〜１ｆ程度でよく、一般に１〜４８時間程度で反応は
終了する。またアシドリシスの場合は、熱溶媒下通常０
〜８０’Ｃｍ度、好ましくは０〜２０℃にて行なわれ、
一般Ｋ１５分〜菫時間程度で反応は終了する。酸の使用
量は原料化合物に対し通常５〜ｌＯ倍量１度とするのが
よい。また液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は１前記ペプチドαηの脱保護基反応と同様の条件下に
行ない得る。

ペプチド（社）とアミノ酸＠との反応は、前記ペプチド
（３）とペプチド（４）との反応と同様にして行なうこ
とができる。

ペプチド１２３ｔ−加水分解してペプチド−を得る反応
は、例えば塩酸、硫酸勢の鉱酸、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等のアルカリの存在下に水、メタノール、
エタノール、ジオキサン等の溶媒中で通常２０〜５０℃
にて８０分〜８時間程度を要して行々われる。

ペプチド（財）から保護基Ａを除去する方法としては、
例えばパラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素
添加、アシドリシス等の方法を挙げることができ′る。

これらの方法の県外は、既に述べ九条件と同様である◇
またペプチド（６）、（９）、ａ２及びｔ１！９は、夫
々ペプチド（５１、（８１、αυ及びａ４から上記と同
様にして保護基Ａを除去することによシ製造される。

また前記反応行程式−１において用いられるペプチド（
２）は例えば下記反応行程式−８によシ製造される。

〈反応性１式−８〉 Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＲ＠ Ａ−Ａｓｎ−Ｂ　　　　　　　　Ａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
ＯＲ’＠　　　　　　　　　　　　勾 一一ンＨ−Ａｓｎ−Ｌａｕ−ＯＲ＠ Ａ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌ＠ｕ−ＯＲ’　　（！。

↓ Ａ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨＣ１１）↓ Ａ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅａ−Ｂ　　Ｑ３【上記におい
てＲ’、Ａ％Ｂ及びＣは前記に同じ。〕アミノ酸（ハ）
とアミノ酸（至）との反応及びペプチド（２）とアきノ
酸■との反応は、前記ペプチド（３）とペプチド（４）
との反応と同様にして打力うことができる。

ペプチド圀からの保護基Ａの除去は、前記ペプチド■か
らの保護基Ａの除去と同様にして、またペプチド（至）
の加水分解反応は、前記ペプテドロの加水分解反応と同
様にして、夫々性なうことができる。

ペプチド（転）からペプチドａ３を得る好ましい方法と
しては、例えば混合酸無水物法、アジド法等を挙げるこ
とができる。諌混合酸無水物法は、適轟碌溶謀中塩基性
化合愉の存在下、アルキルハロカルボン酸を用いて行な
われる０アルキルハロカルボン酸としては、例えばクロ
四蟻酸メチル、ブロモ蟻酸エチル、クロ田蟻酸エチル、
ブロモ蟻酸エチル、りＩ２１２蟻酸イソブチル等を使用
できる。塩基性化合物としては、例えばトリエチルアミ
ン、トリエチルアミン、ピリジン、ジメテルアニＩＪ　
ｙ、Ｎ−メチルモルホリン、１．ｂ−ジアザビシフ掌［
４，８，０］ノネン−６（ＤＢＮ）、１，６−ジアザビ
シクロ［６，４，０）クンデセン−６（ＤＢＵ）、菫、
４−ジアザビシクロ［２，２，りオクタン（ＤＡＢＣＯ
）勢の有機塩基を炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
水素カリウム、炭酸水素ナトリウム勢の無機塩基を使用
できる０また溶媒としては、混合酸無水物法に慣用の溶
媒、４具体的には塩化メチレン、り、口寵ホルム、シフ
冑四エタン等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トル
エン、キシレン勢の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテ
ル、ナト２ヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、酢酸メチル、酢酸エチル尋のエステル類、Ｎ、Ｎ
−ジメチルホルムアＺド、ジメチルスルホキシド、ヘキ
サメチルリン酸トリア電ド等の非プｎトン性極性溶媒等
を使用できる。該反応は−２０〜１００”Ｃ好ましくは
一２０〜６０℃下に一般に５分〜１０時間好ましくは５
分〜２時間を要して行なわれる。

アジド化法は、まず活性化されたカルボキシル基、例、
ｔｔｆ／チルアルプール、エチルアルコール、ベンジル
アルコール勢のアルコールで活性化され本カルボキシル
基に、ヒドラジン水和物を適当な溶媒、例えばジオキサ
ン、ジメチルホルムアンド、ジメチルスルホキシド又は
これらの混合溶媒中で反応させることによｐ行なわれる
。該反応においてヒドラジン水和物は、通常活性化され
たカルボキシル基に対して６〜２０倍モル量、好ましく
はＩｓ〜１０倍毫ル量使用される。反応は通常６Ｇ”Ｃ
以下、好ましくは一２０〜８０℃にて行なわれる。

斯くして末端アミノ酸のカルボキシル基部分がヒドラジ
ンで置換された化合物（ヒドラジン誘導体）を製造し得
る。末端アミノ酸のカルホキ・シル基部分がアジドで置
換された化合物は、酸の存在下適当な溶媒中、上記で得
られるヒドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反追させると
とによシ製造される〇駿としては通常塩酸が用いられる
。溶媒としては例えばジオキサン、ジメチルホルムアン
ド、ジメチルスルホキシド又はこれらの温合溶媒等が挙
げられる。また亜硝酸化合物としては例えば亜硝酸ナト
リウム、亜硝酸イソアミル、塩化ニトロシル勢を挙ける
ことができ、斯かる亜硝酸化合物なヒドラジン誘導体に
対して通常等モル〜２倍毫ル量、好ましくは等そル〜亀
、５倍モル量用いるのがよい。

該反応は通常−２０〜０℃、好ましくは−２０〜−１０
℃にて行なわれ、一般に５〜１０分１度で反応は終了す
る。

上記のようにして製造された一般式（２）のペプチドは
、反応混合物から通常のペプチドの分離手段例えに抽出
、分配、カラムクロマトグラフィー等により単一精製さ
れる。

本発明の一般式（１）で表わされる螢光標識ペプチドは
、ヒトβ製インターフェロンのハプテンとしての機能を
有し、ヒトβ製インターフェロンの抗体と免疫複合体を
形成する特長を有する。従って鋏螢光標識ペプチドは、
これを利用して螢光免疫測定法によシヒトβ汲インター
フェロンの測定を可能とするものであシ、本発明はかか
るヒトβ型インターフェロンの測定方法をも提供するも
のである。

従来インターフ二−ンは、その生理活性に１づい九関談
的な生物学的測定法によシ淘定されている［ＦｉｎＬｅ
ｒ、Ｎ、Ｂ、ｉｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄＩｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ　　Ｉｎｄｕｃｅｒｓ　　（ｅｄ、Ｆ
ｉｎｔｅｒ。

Ｎ、Ｂ、）１８６−１７０（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎ
ｄ　。

Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　　１９７Ｂ）　ｌｏすなわち、
生きた細胞及びそれに感染する生きたウィルスを要して
、ウィルスによる細胞死滅の１度を直接あるいは間接に
定量することによってインターフェロンの力価が定量さ
れている。しかしながらこの生物学的測定法は、測定に
使う材料、が生物である為、安定性がなく測定値間のパ
ラツキが大きくなることは避は得ない。又、被検試料に
インターフェロン以外の抗ウイルス性作用を有する瞼質
が混入している場合、該方法によるインターフェロンの
定量は全く意味をなさなくなる。更に該方法によれば、
轟然にヒトβ製インターフェロンを選択的に測定するこ
とは不可能である。加えて該方法社測定のために数日を
簀し、これは煩雑な操作と相まって医学界の要請に合致
しないものである。

本発明方法は、上記従来方法とは異なってヒトβ型イン
ターフェロンを簡便に速やかにしかも高い１度で測定で
きるものであシ、斯界の簀訪に合致する他めて好ましい
ものである。

また螢光偏光解消法は従来よりよく知られ又いるが、こ
の方法が従来インターフェロンの定諷ニ利用された例は
皆無である。これは精製された螢光４１１１ｗｔインタ
ーフェロンの製造が困難な為と、たとえそれが可能であ
って本その様な大きな分子量の標識物質を用い九場合は
偏光度（Ｐ値）の変化が少く、十分な定量感度を得るこ
とができない為である。これに対し本発明の螢光標識ペ
プチドは、上記偏光度（Ｐ値）の変化を大きくして十分
な定量感度でと）β蓋インターフェロンを定量できる標
識物質として有効なものであシ、この螢光標識ペプチド
の開発によ〕、始めて上記螢光解消法によるヒトβ型イ
ンターフェロンの定量が可能となるのである。

以下本発明のヒシβ瓢インターフエ四ンの定量測定法に
つき詳述する。

本発明方法は、その測定手順及び操作において・通常の
螢光偏光解消法と基本的ＫＡなゐものではない。該方法
社、標準抗原としてのヒトβ型インターフェロン、それ
に対する抗体及び本発明の螢光標識ペプチドを用いて実
施される。ζこで標準抗原としては、生（ＮａｔｉマＣ
）のヒトβ蓋インターフェロン自体又はそれと抗原性の
等′しい前記一般式（２）のペプチドを使用する仁とが
できる・一般式１２）のペプチドを使用する場合は、抗
体に対するヒトβ型インターフェロンと一般式（２）の
ペプチドとの交差反応性を求めておくことにより容易に
、未知試料のインターフェロン力価を算定する仁とがで
きる。該一般式（２）のペプチドの使用は、特に標準抗
原としての精製品を得るための労力、費用、操作勢を考
慮すれば好ましいものである〇又、本発明方法において
用いられるインターフェロン抗体としては、ヒトβ型イ
ンターフェロン及び一般式（２）のペプチドに対する抗
体を全て使用することができるが、前記一般式（２）の
ペプチドをハプテンとして用いて得られる、ヒトβ型イ
ンターフェロンに対して特異性の高い抗体を用いるのが
よい。諌抗体は、一般式（２）のペプチドをハプテンと
して、ハプテン−担体結合試薬の存在下に担体と反応さ
せてペプチド−担体複合体からなるヒトβ型インターフ
ェロン抗原を製造し、この抗原よシ製造することができ
る（４１１願昭６６−４７８４２号）。

上記抗体を製造するための抗原の製造において担体とし
ては、通常抗原の作成に当シ慣用される高分子の天然若
しくは合成の蛋白質を広く使用でき、例えば馬血清アル
ブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アルプンン、人
血清アルプンン、ヒツジ血債アルブ瑠ン等の動物の血清
アルブミン類、馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、
ウサギ血清グｇプリン、人血清グ讐プリン、ヒツジ血清
グープリン等の動物の血清グロブリン類、馬テログロブ
リン、牛テログロブリン、ウサギチルグロブリン、人チ
ログｐプリン、ヒツジテログロプリン等の動物のテログ
ロブリン類、馬ヘモグロビン、牛ヘモグロブリン、ウサ
ギヘモグロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロ
ブリン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘモシアニ
ン類、回虫よシ抽出された蚤白質（アスカ−リス抽出物
、特開昭１５８−１８４３４号参照）、ポリリジン、ポ
リグルタきン酸、リジンーグルタンン酸共重合体、リジ
ン又はオルニチンを含む共重合体勢を挙げることができ
る。

ハプテン−担体結合試薬としては通常抗原の作成に当シ
慣用されているものを広く使用でき、具体的にはアミノ
基とアミノ基とを架橋結合させる、例えばグリオ中す−
ル、マロンジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、スク
シンアルデにド、アジボアルデヒド等の脂訪族ジアルデ
ヒド類、チオール基とチオール基とを架橋結合させる、
例えば、Ｎ、ゴー０−フェニレンジマレイミド、Ｎ、Ｎ
’　−ｍ−フェニレンシマレイミド勢のシマレイミド化
合物、アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例え
ばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒトルキシスクシン
インドエステル％４−（マレイセトメチル）−シクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル等のマレイ々ドカにボＩ’ｔＶｋ−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイイドエステル化合物、アミノ基とカ
ルボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合
形成反応に用いられる試薬、例えはＮ、Ｎ−ジシクロへ
キシルカルポジインド、Ｎ−エテル−ｄ−ジメチルアミ
ノカルボジイミド、１−エチル−８−シイツブ四ビルア
ンノカルボジイミド、１−シクロヘキシル−８−（２−
Ｊｌルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカル
ボジイミド類等の脱水縮合剤を挙げることができるが、
さらにはｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸部のジアゾニウ
ムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応
試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組み合わせたものも使
用可能である。

ヒトβ蓋インターフエ騨ンの抗原は、上記バッテンと担
体とをハプテン−袖体結合試薬の存在下に反応させるこ
とによ〕製造される。上記反応味、水溶液もしくはｐＨ
７〜１００通常の緩衝液中好ましくはｐＨ８〜９０緩衝
液中で０〜４０℃好ましくは室温付近で行なわれ、約１
〜２４時間、好ましくは８〜６時間で反応は完結する＠
上記において用いられる代表的ｌｌｉ衝液としては、次
の吃のを例示できる。

０．２Ｎ水酸化ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−ｏ、　ｇ
Ｍ塩化カリウム緩衝液、 ０４Ｍ炭酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ塩化
カリウム緩衝液、 ０、０５　Ｍ四ホウ酸ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０
、０５Ｍ塩化ナトリウム緩価液、 ０、１　Ｍリン酸二水素カリウム−０，０５Ｍ四ホク駿
ナトリウム緩衝液 上記においてハゲテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は適宜に決定できるが、通常ハプテンに対
して担体を２〜６倍重量好ましくは８〜６倍重量、及び
ハプテン−担体結合試薬５〜１０倍モルとするのがよい
。上記反応によシハグテンー担体結合試薬を仲介させて
担体とハブテンとが結合し九ペグテドー担体複合体から
成るヒトβ臘インター７二四ンの抗原が収得される。反
応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば透析法、ゲ
ル濾過法、分別沈殿法部によ如容易に単離精製できる。

かくして得られる抗原は、通常蛋白質１４ルに対しペプ
チドが平均６〜２０モル結合したものであシ、いずれも
引き続き再現性よく、ヒトβ製インターフエ田ンに対す
る特異性の高い抗体の作成を可能とするものであるが、
特に上記蛋白質に対するペプチドの結合子ル比がｌ：８
〜ＩＳＯものは、特異性が一層高く高力価、高感度の抗
体を作成し得るものであシ好ましい。

上記で得られる抗原による抗体の作成に蟲って社、常法
に従い抗原な哺乳動物に投与し、生体内に産生される抗
体を採取する方法を採用できる。

眼はないが、通常鬼子モルモットを用いるのが線管しい
。抗体の産生に肖っては、上記によシ得られる抗原の所
定量を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイントの補
助液（Ｃｏｍｐｌｅｔ＠Ｆｒｅｕｎｄ＠Ｊｄｊｕｖａｎ
ｔ）と混合して懸濁液を調整し、之を哺乳動物体に投与
すればよい。例えに兎に上記懸濁液を底内注射（抗原の
量として０．５〜ｌ５ｌＩＩＰＺ回）し、以後２週間毎
に２〜１０ケ月好ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化さ
せればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗
体が多量童画される時期、通常上記最終投与１〜２週間
経過後、免疫化された動−から採血し、之を遠心分離後
血清を分離採取することによシ行なわれる。

かくして得られる抗体は、後記試験例に示す通り殊に優
れたヒトのβ重インターフェロｙ％異性を有する。

本発明方法において一層、まず標準抗原を適当な希釈液
で希釈して希釈系列を作成する。希釈液としてｔ−１，
４１に限定はなく、通常この種の測定法に使用される各
種のものを使用できる。具体的には、例えば、ホウ酸緩
憤液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、
クエン酸リン酸緩衝液、グリシン緩衡液轡のｐＨ６〜１
０＠度、好ましくはｐＨ７〜８１１度の緩衝液等を挙げ
得る。又、吸着防止の為の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
、防腐剤としてのアジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ナ
トリフＡ＄の通常の添加物を希釈液中に加えてもよい・
次いでこの標準抗原の希釈系列に一定量の前記抗体及び
一定量の一般式（１）の螢光標識ペプチドを加えたもの
をす／グルとし０〜８７℃で３０分〜４８時間程度放置
後、通常の手段によシ喬直螢光偏光強度（Ｉｙａ）及び
水平螢光偏光強度（ＩＨＢ）を測定する０皺螢光偏光の
一定は、通常の測定装置例えば市販の測定装置ｆｌｓ−
ｓｏｘＪ（ｉｌｌμニオン技研社製）勢によシ容易に一
定することができる。

また上記サンプルと同様にして、一般式（１１の螢光標
識ペプチドを會ｔない以外は同一のレファレンスサンク
ルを作成し、同様に１直螢光偏光強度（ＩＶＲ）及び水
平螢光偏光強度（ＩＨＲ）を測定すゐ◎ かくして、標準抗原の希釈系列に対して偏光度（Ｐ値）
を下記式よシ求め標準曲線を得る。

標準抗原の替わシに１未知機度のヒトβ型インターフェ
ロンを含む検体を用いて、同様にしてＰ値を算出して前
記で得た標準曲線よシ、該検体のヒトβ型インターフェ
ロンを定量できる。

標準抗原として生のにトβ重インターフェロンを用いた
場合は、標準曲線よシ、直ちに検体のインターフェレン
力価を求めることができる。

又標準抗原として一般式（２）のペプチドを用いた場合
は、標準抗原として生のヒトβ型インターフェロンを用
い九場合との交差反応性を初めに求めておきインターフ
エシンカ価に換算すればよい。

以下本発明を更に詳しく説明するための参考例及び実施
例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない
。

尚参考例におけるＲｆ値はシリカゲル上の薄層クロマト
グラフィーにて下記混合溶媒を用いて測定したものであ
る。

Ｒｆ’・・・１−ブタノール−酢酸二本（４目！６）Ｒ
ｆ”−・・ｌ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（１６
ＳｌＯ：８！１２） くペプチドの合成〉 参考例Ｉ Ｚ−８ｅｔ−８ｅｔ−ＯＭｅ　Ｏｐ造 Ｚ　−Ｓｅ　ｒ　−ＮＨＮＨ！　　６．０６　Ｆを６０
　ｍｌのジメチルホルムアミドおよび６．６８　餠１の
６　Ｎ　−ＨＣＩ／ジオキサンに溶解し、−１６℃に冷
却後イソアミルナイトライド！、　６８　ｗＩｌｌを加
え、６分間撹拌する。

次いで６．６０４のトリエチルアミンを加えて中和する
。この溶液をＨ−８ｅｒ　・ＯＭｅ　−ＨＣｌ　　８．
　ｌ　Ｉ　Ｐとトリエチルアミン２．８０劉ｅを含有す
る８０４のジメチルホルムアミド溶液に加え、４℃で２
０時間撹拌する。ジメチルホルムアミドを留去し、得ら
れた残留物を酢酸エチルで抽出し、水洗後芒硝で乾燥す
る。酢酸エチ卆を留去後、エーテルを加え結晶化し、再
沈殿を酢酸エチル−エーテルで哲ない、Ｚ−８ｅｒ−８
ｅｒ−ＯＭｅ　　ＩＬ７６　Ｆを得る。

Ｒ１１値：０．６４、ＲｆＩ値：０．７７元素分析値（
Ｃ迅Ｈ部Ｎ２０７として）ＣＨＮ 計算値（％）　　５２．９４　　６．９２　　８．２８
実測値（チ）　　５２．６７　　６．８９　　　＆ｆ３
６参考例２ Ｚ　−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ　）−８ｅｒ−５ｅｒ−ＯＭｅ
の製造Ｚ−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＭｅ　＄！、６　Ｆを６
０　ｍｌのメタノール及び７．８４　餌（１（Ｄ　ｌＮ
−ＨＣ６に溶解し、６００１ｆ１値：ｏ、ｏｓ Ｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ＆８９　Ｆを４０−のテト
ラヒト四フラ、ン及び０．７６４ＯＮ−メチル毫ルホリ
ンに加え、−１６℃に冷却後０．９７ｇ４のインプチル
クｐロホルメイ）を加え３０秒間激しく撹拌する。

分間、４０℃で２分間、室温で１６分間それぞれ撹拌す
る。ナト２ヒドリアツン及びジメチルホルムアミドを留
去後酢酸エチルで抽出し、ＩＮ−クエン酸で３回、次い
で水で５回洗浄後芒硝で乾燥する。溶媒を留去し、メタ
ノール−酢酸エチル、エーテルで再沈殿を行ない、Ｚ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＭ＠Ｌ６６　
ｔ　を得る０Ｈ１１値客０．６１％ＲｆＫ＠　ｓ　ｏ、
　７　Ｂ元素分析値（ＣＩ８　Ｈ８Ｂ　’６０１゜Ｓと
して）ＣＩ　　　　　　　Ｎ 計算値（１Ｇ）　　６１，６８　　６．８８　　１１９
１実測値（９１）　　６１．６２　６．８２　１２．７
８参考例８ Ｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨの製造
Ｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｒ−８＠ｒ−ＯＭｅ　　Ｌ
６　ｙをメタノールＩｓ　Ｏｍｇ及び水１０　ｍｌに溶
解し、ｌＮ−ＮａＯＨ８，０６ｍｌを加え、室温下に４
ｂ分間撹拌し、タノールを留去後ｎ−ブタノールで抽出
する。水洗後ｎ−ブタノール及び水を留去し、残渣にエ
ーテルを加え結晶化し、メタノール−酢酸エチルよシ再
沈殿を行表い、Ｚ−Ａｒｇ（Ｔｏｅ）−８＠ｒ−８ｅｒ
−ＯＨ２，６Ｏｆを得る。

Ｒ１１値：０．２８、ＲｆＩ　：　０．５７元素分析値
（Ｃ，□−６Ｎ６０１゜Ｓ、　１／Ｉ　Ｈ，０として）
ＣＨＮ 計算値Ｃ％）　５０．２２　６．７７　１．ＯＬ！夾欄
値（％）　５０Ｊ４　　Ｉｓ、　６２　１１！０参考例
４ Ｈ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−５ｅｒ−８＊ｒ−ＯＨの製造Ｚ
−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｔ−８ｅｒ−ＯＲ１，８５ｆ
をメタノール５０−及び！０−”酢酸１０１１’４１？
に溶解し、５００−のＰｄ存在下２０℃、常圧にて接触
還元してＨ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ−）−８ｅｒ−８ｅｒ−
ＯＨを得る。

ＲＺＩ値！０．０８４ 参考例６ Ｚ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ　Ｄｆｌｌｉ造Ｚ−Ａｓｎ
−ＯＲ３，８２ｊｌをナト２ヒト０７ｊ／６０４、ジメ
チールホルムアミド１０４及びＮ−メチルモルホリン９
．．０４４に溶解し、イソプチルクロロホルメイトｌ！
、６４ｄ、Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＫｔ−ＨＣ６８，９１１’及
びトリエテルアミン２．８０−を含む４０−のジメチル
ホルムアミド溶液を用い、参考例２の方法に準じて反応
を行なう。溶媒を留去後１モルクエン酸水溶液を加え、
沈殿愉をＦ取、水洗、減圧乾燥して、酢酸エチルにて再
結晶してＺ−Ａｓｎ−Ｌ＠ｕ−ＯＥＬ　　６．１　ｆを
得る。

Ｒ／！値：０．７１、Ｒｆ”ｆｌｌ　！　０．８０元素
分析値（Ｃ！ｏＨ２９Ｎ、０６として）ＣＩ　　　　　
　　Ｎ 計算値（１Ｇ）６８．９３　７．１７　１０．８１実測
値（＊）　５８．９９　７．２８　１０．２６参考例６ Ｚ−Ｔｙｒ−ＡＩｎ−Ｌｅｕ−０１Ｃｔの製造Ｚ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｏｆｔ　　Ｂ、　０１　ｆをメタノール６
０４及びＩＮ−ＨＣＪ？、４ｄに溶解し、パラジウム黒
５０Ｇ−の存在下室温、常圧にて接触還元を行ない、Ｈ
−ＡＩｎ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ−ＨＣＩを得るＯＲ／’値：
０．２６ 上記で得られるＨ−Ａｓｎ−Ｌ＠ｕ−ＯＥｔ−ＨＣｇを
ジメチルホルムアミド４０．ｎｌ及びトリエチル７電ン
電、ＯＩｓ　ｓＪＫ溶解し、次にＺ−Ｔｙｒ−ＯＮＨ８
８，８５ｙを加え、室温下に２０時間放置する。ジメチ
ルホルムアミドを留去後１モルクエン酸水溶液を加え、
沈殿物をｆ取し、水洗後メタノールー酢酸エチルにて再
沈殿してＺ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ　８．５
８　ｆを得る。

ＲｆＩ値！０．７Ｂ、ＲＺＩ値：０．８２元素分析値（
Ｃ！Ｉ　Ｈ８８Ｎ４　ｏ、として）（ＨＮ 計算値（５６）　　６１．０４　　　６．７１　　　９
．８２実測値（％）　　６０．８４　　　６．７０　　
　９．８９参考例７ Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＮＨＮＨｇの製造Ｚ−Ｔ
ｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＥｔ　’ｉ！、７８　Ｆをメ
タノール８０１ｆ＋４！に溶解し、ヒドラジン水和物１
．２１４を加えて一夜放置し、生じた結晶なｐ取、少量
のメタノールニて洗浄してＺ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−ＮＨＮＨＩＢ、ｔｏｙを得る。

ＲｆＩ値：０１６、ＲｆＩ値！０．７５元素分析値（Ｃ
！？　Ｈ８６ＮＳ　Ｏｆとして）ＣＨＮ 計算値（％）　　５８．２６　　　　ｇ、！５２　　１
６．１０実測値（％）　　６７．９１　　　　ｇ、６６
　　１６．１２参考例８ （ａ）　　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏ＠）
−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＯＲ０，８４ｆをテトラヒド
ロフ用い、参考例２の方法に準じて行なう０テトラヒド
ロ７ラン及びジメチルホルムアミドを留去後残留物をブ
タノールで抽出する。ブタノール層を２−酢酸で洗浄後
ブタノールを留去し、メタノール−酢酸エチルで再沈殿
してＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８
ｅｒ−５ｅｒ−ＯＲ１，６４ｔを得る。

ＲｆＩ値！　０．１８、ＲｆＩ値：Ｏ，ｌＳ７元素分析
値（Ｃ８６Ｈ５？　ＮＩ　ＯＩｓ　Ｓ、Ｈｌ　０とし忙
）ＣＨＮ 計算値（チ）　　４８．７７　　　６．９０　　１４．
６２実欄値（１Ｇ）　　４８．７６　　　６．６１　　
１４．７８（ｂ）　Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨの製造 Ｂｏｃ−Ｌ＠ｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｍ）−８＠ｒ−
８ｅｒ−ＯＲ１、５０ｆ　ｔ−１０ｍｌのトリフルオロ
酢酸９１５分間室温で放置して脱Ｂｏｃ化し、乾蜂エー
テルを加えて結晶化し、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（
Ｔｏｓ）−８ｅｔ　−８ｅｔ−ＯＢを得る。　ＲｆＩ値
！０．０４参考例９ （ａ）　　Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨの製造 参考例８で得られるＩｉ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔ
ｏｓ）−８ｅｒ−８ｅｔ−ＯＲをジメチルホルムアミド
８０ｍ１及びトリエチルアミン０．２４ｄに溶解し、次
いでＺ−Ｐｈｅ−ＯＮＨ８Ｏ，？　７　ｆを加え、室温
で１！０時間放置する０ジメチルホルムアミドを留去後
残液をブタノールにて抽出し、２−酢酸で洗浄する。ブ
タノール層を換細し、エーテルを加えて結晶化し、得ら
れた結晶なＶ取し、熱エタノールよシ結晶を洗浄してＺ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ’−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−
８ｅｒ−８＠ｒ−ＯＨ１，４０Ｆを得る。

Ｒ１１値！　０．２２、ＲＩＫ値ｔ　０．６９元素分析
値（Ｃ４７Ｎ１４　Ｎ１゜ｏ１４ｓ、ｎ、ｏとして）Ｃ
ＨＮ 計算値（％）　　５４，１２　　　６．２８　　１８．
４８実測値Ｃ％’）　　５４．４１！　　　　６．８８
　　１８．８４参考例１０ （ａ）　　Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｉ
ｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）　−８ｅｔ−８ｅｔ−ＯＲ（２＞
製造 Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨＮＨＩ　Ｏ，８９Ｆをジメチ
ルホルム７ｔＹｒｓ＠ｌ及び６　Ｎ　−ＨＣＩＩ／ジオ
キサン０．６８．１に溶解し、イソアミルナイトライト
０．１６　ｍｌ。

トリエチルアミン０．４９　ｇＩ４及び参考例９（ａ）
で得たＺ−Ｐｈｅ−レｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）
−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＲを参考例８（ｂ）と同様にして
脱２化して得られたＨ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒ
ｇ（Ｔｏｓ）−８＊ｒ−８ｖｒ−ＯＨ１，０Ｏｒのジメ
チルホルムアミド１０４溶液を用いて参考例１と同様に
反応を行ない、さらＫＺ−Ｌｅｕ−ＧｌｙＮ、を当量加
えて４℃にて２０時間反応を行なう。ブタノールで抽出
し、２−酢酸で洗浄後ブタノール及び酢酸を留去し、エ
ーテルを加えて結晶化する。結晶を戸数して熱メタノー
ルにて結晶を洗浄し％Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｏ
ＨＯ，６６ｆを得る。

Ｒ１１値：０．１９、ＲＩＴｉ値：ｏ、６゜元素分析値
（Ｃ６６Ｎ７８　Ｎ１！　０１６　Ｓ　’　Ｈ！　Ｏと
して）ＣＨＮ 計算値（％）　　６４．４４　　６．６４　　１８．８
１５爽測値（９６）　　５４．７４　　１６６　　１８
．９８参考例１１ （ａ）　　Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）　−
８ｅｒ−８ｅｒ　−ＯＨの製造Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）　−８ｅｒ−
８ｅｒ−ＯＨ６０Ｇ−をメタノール６０　ｍｌ及びｔｏ
−ｅｍｔｏ−１ｉｃｅ解しパラジウＡ！５ｏ（ｌｄの存
在下意温常圧下にて接触還元を行ないＨ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−８
ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨを得る。　Ｒ１１値：ｏ、ｔ−５ Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＮＨＮＨ！４２０　ｍＷ
をジメチルホルムアミドロ　ｍｌ及び６Ｎ−ＨＣＩ／ジ
オキサン０、Ｂ７ｖｍｌｌＫ溶解し、イソアミルナイト
タイト０．１Ｏｎ及びトリエチルアミン０．８１４を用
い、′参考側１０方法に準じてアジド体を生成させ、こ
の溶液をＨ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
　ｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｒ−８ｅｒ−ＯＲの５キ
？／？ル９／ＩＩ）リア建ドｌＯ′−とジメチルホルム
アミド１０４の混合溶液に加え、４℃にて２゛０時間撹
拌する。ジメチルホルムアミドを留去して、残渣をブタ
ノールで抽出し、２−酢酸で洗浄後ブタノールを留去し
、残渣にエーテル□を加えて結晶化し、次いで得られる
Ｚ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ　）−８ｅｒ−８
ｅｒ−ＯＨをメタノール８０Ｊ及び１０−酢酸１０−に
溶解し、室温、常圧にてパラジウムの存在下に接触還元
した後セファデックスＧ−２５（ＢＸ１２０ａｍ、溶出
液６０−酢酸）Ｋてゲルー過してＨ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ）−８＠ｒ−８ｅｒ−ＯＨ６６０＠ｐを得
る。

ＲｆＩ値！　０．０　Ｍ、ＨＩＮ値＄　０．６８元素分
析値（Ｃ，、）Ｉ、８Ｎ１．０．、　Ｓ　、　２　Ｈ，
０として）ＣＨ，Ｎ 計算値ＵＧ）　　６Ｂ、ｆｆ１８　　　６．９１　　１
＆０８夷側値（ｔｓ）、５８．１０　　　６．４８　　
１４８４参考例１！ （ａ）　　Ｚ−Ｍｅｔ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒ
ｇ（Ｔｏ＠）−８ｅｒ−５ｅｒ−ＯＨの製造 Ｚ　−Ｍ　ｅ　ｔ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−Ｎ　ＨＮ　Ｈｔ　
　目］−をジ）ｌｆｋホにムアミド＆−１及び６Ｎ−Ｈ
ｃｌ／ジオキサン０．２１４に溶解し、イソアずルナイ
トライト０．０６５　ｇＩ＆ｌｌ及びトリエチルアミン
Ｏ，ｌ　７　ｖｍｌを用いて参考例１の方法に準じてア
ジド体を生成させ、次いでこの溶液をＨ−Ｔｙｒ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−３ａｒ−８ｅｒ−ＯＨ８０ＧＮ、
ジメチルホルムアミド６＃！４及びヘキすメチルリン酸
トリア建ドｂ−の混合ｆ＃箪に加え、４℃にて２４時間
撹拌す゛る。さらにＺ　−Ｍ　ｅ　ｔ　−Ｓ　ｅ　ｒ　
−Ｎ　ＨＮ　Ｈｇを８１８−加え、４℃にて７２時間撹
拌する。参考例１１（ａ）と同様にして精製を行ない、
Ｚ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）−５ｅｒ−８ｅｒ−ＯＲを得る◎（ｂ）　　Ｈ−Ｍ
ｅｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａ＠ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−８ｅｒ−８ｅ
ｒ−ＯＲの製造上記（ａ）で得られるＺ−Ｍ＠ｔ−８ｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｒ−８ｅ
ｒ−ＯＲを参考例８（ｂ）と同様の方法で脱２化するＯ 上記で得られるＨ−Ｍ＠ｔ−８＠ｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｍ−
Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌａｕ−Ｇｌｎ−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ）−８ｅｔ−８ａｒ−ＯＲを液体アン峰ニ
アｔ６領ｇに溶解し、金属ナトリウムの少片を加え、反
応液が青色に呈色したとき、乾燥塩化アンモニウム１ｆ
を加え、次いでアン七ニアを留去する。残液を６〇−酢
酸に溶解し、セファデックスＧ−２５（８Ｘ　１２　Ｇ
ｍｓ。

溶出液６０−酢酸）、さらにＬＨ−Ｌ！Ｏ（２Ｘ　８５
倒、溶出液０．００１　Ｎ−ＨＣＮ）にて精製し、Ｈ−
Ｍｅ　ｔ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−８ｅｒ−５
ｅｒ−ＯＨｌ　１９　＊ｆを得る。

Ｒ１１値！０．０１．Ｒ／”値：０．４５（１）ｇｏ　
！　−１５，７’（Ｃ”０．２５４．０．０ＯＩＮ−Ｈ
Ｃ４？）元素分析値（Ｃ，、Ｂ２゜、　Ｎ、、　０．。

Ｓ　、　５　Ｈ，０，ＣＭｓＣＯＯＨとして） ＣＨＮ 計算値（１１）　　４９．７Ｆ１７．２６　　　璽６．
１８実橢値（１Ｇ）　　４９．８ＯＬ９２　　１４．９
１アζノ酸分析値 Ａｔｐ　！　０．９６、Ｓｅｒ：１１．１６、Ｇｌｎｔ
ｌ、ＯＢ。

ＭｅｔｇＯ，９２、ＧＩＦ：１．０５、Ｌｅｕ　：　ｔ
ｏ　ｇ、Ｔｙｒ　：　１．００％　Ｐｈａ　：０．９８
、Ａｒｇ：０．９６〈抗原の製造〉 参考例１Ｂ 上記参考例１２（ｂ）で得られるペプチド（以下「ペプ
チドＡ」と略記する）８−及びＢ５Ａ２６−を酢酸アン
モニウム緩衝液（０，１モル、ｐＨ７，０）２４に溶か
す。との溶液Ｋ　Ｏ，１モルのゲルタールアルデヒド溶
液０．１１　ｍｌを加え、室温で６時間撹拌する０その
後、反応混合物を４８時間、４℃で水１．　ｇで透析す
る′。透析中６回水を交換する。その後、ペプチド−蛋
白質複合体を含む＊＊を凍結乾燥してヒトβ重インター
フェロン抗原（以下「抗原！」と略記する）　８１　＠
ｆを得る。この抗原ＩａＢＳＡ１モルに対してペプチド
人が平均９：Ｅ、ル結合したものである。尚この結合率
状以下の通シ測定された。

即ち上記で得られる抗原！をさらにセファデックスＧ−
６０（溶出液：生理食塩水、検出：ＯＤ２８０ｇｓｍ、
流出速度：８−（１量時間、分取量：ｉＪずつ）でゲル
濾過し、ＢＳＡＫ結合したペプチドＡのフラクシヨン［
１］と他の生成体（ペプチドＡの２量体）の７ラクシヨ
ン［１１とを分離し、フラクション（１３を０．６−食
塩水で４℃、２４時間透析後凍結乾燥して白色粉末状の
ペプチドＡ−ＢＳＡ複合体（以下「抗原！′」と略記す
る）を得る。この複合体はＢ５Ａｌモルに対してペプチ
ドＡが平均翫９モル結合したものである０上記ゲ〃濾過
では未反応のＢＳＡ及びペプチドＡの存在が認められな
いととによシ、ペプチドＡの２量体の標準濃度の検量線
を作成し、骸検量線より上記７ラクシヨンのペプチドＡ
の２量体の量を求め、之を出発原料として用いたペプチ
ドＡの量から差し引いて求めた値がすべてＢＳＡと結合
しているとして計算したものである。

〈抗体の製造〉 参考例１４ 参考例！３で得られる抗原Ｉ　　２１５声ｆを１．６Ｊ
の生理食塩水に溶解後２にフロイントの補助液ｌＪｇｎ
ｌｌを加えて調製した懸濁液を、４羽Ｏ兎（１，６〜８
０即）に皮下投与し、２週間毎に６回同量投与する０更
にその後１カ月毎に８回、最初投与した量と同量を投与
する。最終投与後７日経過してのち試験動争から採血し
、遠心分離して抗血清を採取してヒトβ鳳インターフェ
ロン抗体（以下「抗体夏」と略記する）を得る。

０標識ペプチドの製造 ペプチドＡをクロラζンＴを用いる方法で標識化する。

即ち上記ペプチド６μｔの０．２モルのリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７，４）２０Ａ！に［”’Ｉ　］　Ｎａ（ＭＥＮ
）１マイク四キエーリーのｏ、　２　Ｊ＋ニルリン酸塩
緩衝液を加え、次にフロラさン７８．６　ｍＰ／ｍｌの
ｏ、　ｇ毫ルリン酸塩緩衝液２０　ｐｇを加える。室温
で２０秒間放置して＠、４　ｍｆ／ａｌｌの０４Ｍリン
酸塩緩衝液のソジウムメタジサルフエートの６０μ１Ａ
−２５０カラム（１，０Ｘ８Ｇａｍ）にかける（溶出液
０．１＄ＢＳＡ及びＯ−１０％　ＮａＮ５を含む０．１
４ルトリスー塩酸緩衝液、ｐＨ８，６）。籐１７ツクシ
日ソをイオン交換クロマトグラフィーで精製してｌ！Ｊ
で標識された上記ペプチドを得る〇〇力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通〉一定する。

即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で１０，１０％１Ｏ１１
０’％１Ｇ’・・・・・・倍に希釈（イニシャル）シ、
これらの夫々１００μｌに、　１．１！ｌｉ標識ペプチ
ド（上記で得られる標識ペプチドを約１万ｃｐｍＫなる
ように希釈しえもの）　０．１　ｍｌ及び０．１モルリ
ン酸塩緩衝液（１）Ｈ−７，４）　［０，１９１ＢＳＡ
、０．１５４＝７に塩化ナトリウム及び０．０１　％　
Ｎ　ａ　Ｎｍを含む］Ｑ、２Ｊを加え、４℃で２４時間
インキエベートし、生成した抗体と！　標識抗原との結
合体を、デキストラン−活性炭法及び遠心分離法（４℃
、１６分間、８０　Ｇ　Ｏｒｐｍ　）によ如未反応（結
合し＆い）Ｉ”’標識ペプチドから分離し、その放射線
をカウントし、各希釈濃度における抗体の！１！６標識
ペプチドとの結合率（チ）を測定する。縦軸に抗体の■
１２５標識ペプチドとの結合率（−）及び横軸に抗体の
希釈倍率（イニシャル濃度）をとシ、各々の濃度におい
て結合率をプロットする。結合率が５０−と抗体１　　
　５２０００ ０抗体のヒトβ型インターフェロン特異性試験供試試料
として各種濃度のヒトβ型インターフェロン（東京都総
合臨床研究所製、比活性８ｘ１０’Ｕ／ｖｐ＋ｆプロテ
イン）、ペプチドＡ及びヒトａ蓋インターフェロン（林
原研究所製、Ｌｙｍｐｈ。

ｂｌａｓｔｏｌｄ　　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　Ｌｏｔ
、Ｎｏ、８００９２８）を使用する。また標準希釈剤と
して０．１１１ＢＳＡ・０、１　Ｉｓ　％　＃　ＮａＣ
１及びＯ，ＯＩ　ＩｓＯＮｍＮ５　＊含む０、１モルリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）を使用する。

各々の試験管に、標準希釈剤０．２Ｊ、供試試料０、１
　ｍ１１参考例１ＦＤで得られる抗体ＩＯ，Ｉｎ（力価
！５２０００）及び！１！Ｓ標識ペプチド（上記で得ら
れる標識ペプチドを約鳳万ｃｐｍになるように希釈し九
もの）　０．１４を入れ、４℃で４８時間イン中エベー
トし九後、ノーマルヒツジ血清（ｎｏｒｍａｌｓｈｅｅ
ｐ　　ｓｅｒｕｍ　）をＱ、　１　ｍＡ’加え、次いで
デキスト２ノで被膜し九活性炭Ｏ懸濁液０．６禦１を加
え、４℃で８０分間放置し、次に４℃、８０００　ｒｐ
ｍの条件下に８０分間遠心分離を行ない、抗体と１１″
″橡識ペプチドとの結合体及び未反応（結合しない）１
１１６ｇ識ペプチドを分離し、その放射線をカウントし
、用い九抗体の力価に相当する結合率（Ｂｏ）を１００
−として、各供試試料の一１ｔ６ 度及び希釈率における抗体と１　　標識ペプチドとの結
合体（６）の−百分率を求める。得られる結果を第１図
に示す。第１図中縦軸は結合−（Ｂ／Ｂ。

Ｘ１００）を、横軸は供試試料（ペプチドＡ、ヒトβ型
インターフェロン及びヒト４ｍインターフェレン）の濃
度を示す。また該図において曲線（イ）はペプチドＡを
、曲線（ロ）はヒトβ蓋゛インターフエｐンを、曲線（
ハ）はヒトα飄インターフェロンを夫々示す。第１図よ
シ抗体ｌは、ヒトβ型インターフェロンに対する反応性
とヒトβ型インターフェロンに対する反応性において明
確に区別される曲線を示し、仁のことよシヒトα製イン
ターフェロンとは８．７Ｘ１０　ユニット／ｍｌｔで交
叉しない特異性の高い抗体であることが判る。

実施側車 ペプチドＡ　Ｉ　１１１ＦとＦＩＴＣｌｍＦを６ｏンー
メタノールのＯ，！！　Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ＝９．６）に溶解する。室温で２時間反応後シリカゲ
ル薄層り四マドグラフィー（溶出１［：ブメノール：酢
酸：水＝４！１３６）にて分離する。スボッ）を集Ｊ６
／）ノールで溶出してＦＩＴＣＩＩＩＩＩＩＩペプチド
０．８　ｍｙを得る。

Ｒｆ’＊−０，１６、Ｒｆｎ値−０，５２元素分析値（
ＣｓＣ５５ＨｏｙＮｎｏ　Ｓ！　・’Ｈｚ　０−ＣｓＨ
ｓＣＯＯＨとして） ＣＨＮ 計算値（＊）　　６１６０　６．４２　　１２．９６分
析値（９１）　　ｆｓ２．６５　６．２２　　１１７４
ＩＩ論例２ １０”Ｈの塩酸０．０６　ｍｇに清解し九ペプチドＡＩ
　１１１２を１！１０ｖ／ｖ９６メタノールのＯ，ＲＭ
重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解する。Ｔ
ＲＩ　ＴＣｌｍＰｉ−ＯＪＭ−重炭酸ナトリウム（ｐＨ
９，５）に溶解し、上記溶液と混合する。室温にて２時
間反応後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（溶出液
：ブタノール−酢酸：水＝４：１：５）にて分離する。

スポットを集めメタノールで溶出してＴＲＩＴＣ標識ペ
プチドｏ、を鋼ｐを得る。

Ｒｆ’＊口０．１２、ＲＺＩＩ値−０，４２元素分析値
（Ｃ，、ＩＩ、□？　Ｎ１３０！４　Ｓ！　”　Ｈ！　
０・ＣＢ。

Ｃ０ＯＨとして） ＣＨＮ 計算値（チ）５８、Ｉｓ２　６．６９　　１８．８４分
析値（−）　　６８．２０　６．６璽　　１８．８０実
施例８ （ａ）　　螢光標識ペプチド溶液の調製実施例１で得九
ＦＩＴＣ標識ペプチドを、０．９ｗ／ｖ　＊　Ｎ　ａ　
ｃ　ｌ及び０．０ｇ％％ＢＳＡを含む０．１Ｍ−リン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）に溶解し、濃度を８　Ｘ
　１０−９ＭＩＣ調製する。これを以下ｒＡ液」とする
。

（ｂ）　　螢光ａｍペプチド溶液のブランク螢光標識ペ
プチドを含鷹ない以外は、上記Ａ液と同一の組成の液を
調製する。これを以下ＣＢ液」とする。

（Ｃ）　　抗体溶液の調製 参考例１４で得た抗体ｌを生理食塩水で８００倍に希釈
する。これを以下「Ｃ液」とする。

（ｄ）　　希釈液ＯＨ製 Ｈ，ＢＯ２９，８９ｙ／ｌ、Ｎａ、Ｂ、０．−１０Ｈ！
０４．８２　ｙ／１％Ｎａｃｌ　９　ｆ／１％ＮａＮ＠
　０．００６ｗ／、＄及びＢＳＡ　Ｏ，０１Ｗ／ｖ−を
含むｐＨ７，８の希釈液を調製する。これを以下ＥＤ液
」とする。

（ｅ）　　標準希釈系列の調製 ■　ペプチドＡを、０．９　ｗ／／％ＮａＣ４及び０、
０６　Ｗ／Ｖ　％　Ｂ　Ｓ　Ａを含むＯＩＭ−リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ−６，６）に溶解して　６μＦ！
／ｎｌの濃度に調製する０これを上記のＤ液で希釈して
ペプチドＡの濃度が６００．２６０゜１２１ｓ、６２．
６，８１．２６．１５．６．７．８．８．９．１．９Ｂ
。

０．９２５　、０．４６８　、０　ｎｆ／ｍｅ　と表る
希釈系列を調製する。

■　ヒトβ型インターフェロン（東京都鱒合臨床研究所
製）を用いて、上記■と同様にして２×璽　０　　１１
ＸＩＧ　　　、０．６Ｘ１０　　．０．２６Ｘ１０　　
　。

０．１２６Ｘ１０　．０．０６８ＸｌＯ，０，０８１Ｘ
１０　　。

ｏ、ｏｔａｘｔｏｌｌ、　ＯＵ／、Ｊの希釈系列を調製
する０ （ｆ）　　偏光度Ｐ値の測定 （ｅ）−〇で調製した希釈系列の各々ｏ、ｇ＠４’ＫＡ
液ｊ、０６４．　Ｃｌｌｌ０．１　ｖｒｌ及びＤ液０．
６６４を加えてペプチドＡのサンプルを作成する。

Ａ液の替わり０液ｏ、ｏ６ｍｇを用いる以外は全く同様
にしてペプチドＡのリファレンスサンプルを作成する。

上記と同様にして（ｅ）−〇で調製した希釈系列よシ、
ヒトβ型インターフェロンのサンプル及びリファレンス
サンプルを作成する。

更にＡ液０．０６　ｍｌ及びＤ液０．９５Ｊを混合して
、−抗体のブランクサンプル、Ｂ液ｏ、ｏｓｍｇ及びＤ
液０．９６＋Ｊを混合して抗体のブランクリファレンス
サンプルとした。

これらの各サンプル及び各リファレンスサンプルを、各
々４℃で１２時間インキュベート後、螢光偏光強度測定
装置により、螢光偏光成分を測定した。それぞれの希釈
系列及びブランクにおいて、下記式よシ偏光度Ｐ値を算
出した。

（式中、夏ＶＢはサンプルの垂直螢光偏光強度、ＩＨ８
はサンプルの水平螢光偏光強度、ＩＶＲはリファレンス
サンプルの垂直螢光偏光強度％ＩＨＲはり７アレンスサ
ンプルの水平螢光偏光強度を示す。） 結果を第２図及び第８図に示す◎両図よりＰ値の変化量
の半分に相当する濃度はペプチドＡについて１　ｎｆ／
Ｔｕｂｅｓヒトβ型インターフェロンについて２．　Ｉ
　Ｘ　１０’　Ｕ／Ｔｕｂｅ　　であり、両者の比２ｔ
ｏＵ／ｐｇが交差率として得られ九。

ヒトβ型インターフェロンの濃度未知の試料について、
同様にＰ値を測定して第２図又は第８図よ知力価の測定
ができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１４で得九ヒトβ重インターフェロン抗
体の特異性を示すグラフであｐ、第２図及び第８図は夫
々参考例１２（ｂ）で得九ペグチド及びヒトβ型インタ
ーフェロンにおける螢光偏光解消法によシ求められた偏
光度Ｐ値を示すグラフである。 （以上） 、ノ１ ５２ 第２図 ９７°ケ）−Ａ 第３図 ヒトβ１＝２！？−７，［］二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　一般式 ％式％ Ｅ式中Ｒは、螢光色素を示す。〕 で表わされる螢光標識ペプチド ■　一般式 ％式％ 【式中Ｒは、螢光色素を示す。】 で表わされる螢光標識ペプチドを用い螢光偏光解消法に
   よシヒトβ盟インターフェロンを測定することを特徴と
   するヒトβ型インターフェロンの測定法。