JPS5836400A - Ｌ−システインの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１〕　　発明の背景 本発明は、Ｌ−システィン（以下Ｌ　−Ｃｙｓと略称す
る。）を新規酵素であるグルタチオン・スルフィドリル
・オキシダーゼ（以下ＧＳＯと略称する。）を用いて定
量する方法に関するものである。

従来、Ｌ　−（：ｙｓの定量法としては酸性ニンヒドリ
ン法または５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香
酸）、０−フタルアルデヒドなどのＳＨ（チオール）基
と反応する試薬を用いる化学的方法などが知られている
が、特異性、簡便性、感度あるいは夾雑物質の影響など
の点て必ずしも満足すべき方法は確立されていなかった
。

本発明者は、先にグルタチオン（以下ＧＳＨと略称する
。）に対して特異性の高い新規なスルフイドリル・オキ
シダーゼ、すなわちＧＳＯが微生物によって生産される
ことを発見し、本酵素の酵素学的性質を明らかにした（
特願昭５６−１６９９８号参照）。

本発甥者は、さらに本酵素をＬ　、−Ｃｙｓの定量に応
用すべく研究を重ねた結果、ＧｓＨなどの他のＳＨ化合
物が共存する試料であっても試料中のＬ−ＣｙｓをＧＳ
ＯのＩ）Ｈによる特異性の変化を利用することによって
特異的ζこかっ高感度に、しがも簡便に定量できること
を知見し、本発明を完成するに至った。

（ＩＩ）　　発明の概要 ！ｊ 本発明は、試料中のＬ　−Ｃｙｓを定量するに際し、酸
素存在下、ＧＳＯを試料に作用させ、反応にともなう酸
素消費量または反応物生成量を測定することを特徴とす
るＬ　−Ｃｙｓの定量法を提供するものである。特にＧ
ＳＨを含む試料中のＬ　−Ｃｙｓを定量するに際し、Ｇ
ＳＯによる酵素反応を、Ｉ）Ｈ７，０〜８．０およびｐ
Ｈ４，５〜５５において行い、ｐＨ７，０〜８０におけ
る反応液中の酸素消費量（Ａｌまたは反応物生成量（Ａ
つと、ｐＨ４，５〜５．５における反応液中の酸素消費
量ｆＢｌまたは反応物生成量（囮とを測定し、それらの
差（Ａ−Ｂまたは△′−■）からＬ　−Ｃｙｓ含量を求
める方法を提供するものである。

ｔ 本発明において使用するＧＳＯはｐＨ４，５〜５５にお
いてはＧＳＨに対する特異性が高く、至適酵素量を用い
れば試料中に存在するＳ　’Ｈ化合物のうち、ＧＳＨだ
けをほぼ特異的に酸化するが、１）Ｈ７，０〜８０にお
いては充分量の酵素が存在する場合、ＧＳＨとともにＬ
　−Ｃｙｓをも完全に酸化することができる。したがっ
て生体試料などのように、存在するＳＨ化合物のほとん
どがＧＳＨとＬ−Ｃｙｓによって占められている試料の
場合は、ｐＨ７，０〜８，０における酸素消費量（Ａｌ
または反応物生成量（ＸｌからＩ）Ｈ４，５〜５．５に
おける酸素消費量（Ｂ）または反応物生成量（囮を差し
引くことによって試料中のＬ　−Ｃｙｓの量だけを簡単
かつ正確に定量することがてきる。なお、試料中にＬ　
−Ｃｙｓ以外のＳＨ化合物、特にＧＳＨが実質的に存在
しない場合には、ｐＨ７，０〜８０における測定だけで
Ｌ　−Ｃｙｓを定量できることは言うまでもない。

本発明におけるＧＳＯの精製酵素標品の酵素化学的およ
び理化学的性質は下記のとおりである。

（１）　　作用 ＧＳＯは公知のラット精嚢分泌物からのスルフィドリル
・オキシダ−ゼ（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）１９．　２６８９−２６４５（１９８０）
参照）と同様に酵素の存在下においてＳＨ化合物を酸化
的に２分子縮合して対応するジスルフィド化合物を生成
するが、特にＧＳＨに強い親和性と高い基質特異性を示
し、かつ蛋白質中のＳＨ基に対しては微弱な活性しか示
さないという特徴を有する新規なスルフィドリル・オキ
シダーゼである。

ＧＳＯは、ＧＳＨを基質とした場合、下記反応式のごと
（、Ｇ　Ｓ　Ｈ２ｍｏｌにつき、１　ｍｏｌ　（７）酸
素を要求し、ｌ　ｍｏｌの酸化型グルタチオンとｌ　ｍ
ｏｌの過酸化水素とを生成する。

また、Ｌ−ＣｙＳを基質としたときも、ＧＳＨの場合と
同様にｌ、　−Ｃｙｓ　２ｍｏｌにつき、１ｍ０１ノ酸
素を要求し、ｌ　ｍｏｌのシスチンとｌ　ｍｏｌの過酸
化水素とを生成する。

２Ｒ５Ｈ＋０２→Ｒ５５Ｒ＋Ｈ２Ｏ２ （式中、Ｒ５ＨはＧＳＨまたはＬ　−Ｃｙｓを、Ｒ３５
Ｒは酸化型グルタチオンまたはシスチンを示す。）（２
）基質特異性 種々のＳＨ化合物に対して精製されたＧＳＯを酸性（ｐ
Ｈ５，０；０．２Ｍ酢酸緩衝液）、中性（ｐＨ７，４；
０．２Ｍりん酸緩衝液）およびアルカリ性（ｐＨ９，８
；　０．２Ｍ　）リス緩衝液）の各ｐＨで作用させた結
果が第１表である。第１表において各基質の濃度は５　
ｍＭである。また、酵素活性は、後記する酸素電極法に
より測定し、各ｐＨにおけるＧＳＨに対する活性の相対
値として表わした。

第１表 第１表から明らかなようにＧＳＯはｐＨ５，（ｉにおい
てＧＳＨに高い基質特異性を示した。ｐＨ７，４におい
てはＧＳＨの他にもＬ　−Ｃｙｓおよびジチオスレイト
ールに効率良く作用したが、生体試料に作用させる場合
、ジチオスレイトールは実質的１こは存在しないので、
充分量の酵素を使用すればＧＳＨとともにＬ−Ｃｙｓも
完全に酸化することができる。ｐＨ７，４におけるＫｍ
値を測定した結果、’Ｇ　Ｓ　Ｈニ対してはＫｍ値が６
．８　Ｘ−４０””　Ｍ　テあり、Ｌ　−Ｃｙｓ　ニ対
してはＫｍ値が８．７　’Ｘ　１０−８　Ｍ　テあった
。

なお、ＧＳＯは、ジチオスレイトール−に対して高い基
質特異性と強い親和性を示す公知のラット精嚢分泌物か
らのスルフィドリル・オキシダーゼとは明確に区別され
る。

また、ＧＳＯは蛋白質のＳＩ（基にはほとんど作用せず
、この点でも既知酵素と区別できた。たとえば、８Ｍ尿
素存在下、２−メルカプトエタノール中で還元したりボ
ヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅ　Ａ　；分子量１８７０
０）のＳＨ基にＧＳＯを作用させたところ、ＧＳＯを充
分量（５Ｕｙ’ｖｉｌ　）添加した場合Ｉこおいてさえ
、ＲＮａ８ｅ　Ａ　１分子当りのＳＨ基（８個）の減少
速度は４時間に１．５個程度であり、自然酸化によるｓ
Ｈ基の減少速度（１，０個／４時間）を若干上まわる程
度であった。これに対して、公知のラット精嚢分泌物の
スルフィドリル・オキシダーゼは、０．５　Ｕ／ｇｌ添
加した場合、４時間に７，５個／ｍｏ１以上の減少を示
しく前出１３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９、　２６８９
（１９８０）のＦｉｇ７参照）、ＲＮａＳｅＡに対し顕
著な活性を示す酵素である。

すなわち、本発明のＧＳＯは酸性および中性側でＧＳＨ
に強い親和性を示し、特異的に作用する新規なフラボプ
ロティン・スルフィドリル・オキシダーゼである。

（８）力価の測定 ＧＳＯの力価の測定は、酸素電極法で行った。

すなわち、１０ｍＭのＧＳＨを含む０．ＩＭりん酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，４）　１ｇ／を酸素電極セルに入
れ、１０７ｚ５の酵素液を添加して酸素消費速度を測定
した。８０℃で１分間に１μｍｏ＋の酸素を消費する酵
素量を１単位（Ｕｎｉｔ　Ｈ本明細書において、Ｕと略
称する。）とした。

（４）至適ｐＨ 至適１）ＨはｐＨ６，５〜７７付近、特にｐＨ７，１〜
７．８付近である。

なお、至適ｐＨの測定は、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム−
塩酸緩衝液、０．１５モル酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液
、０．１５Ｍりん酸カリウム緩衝液、０．１５Ｍ）リス
−塩酸緩衝液および０．１５Ｍグリシン−塩化ナトリウ
ム−水酸化ナトリウム緩衝液の各緩衝液を使用し、ｐＨ
２，４〜１０．８の範囲で行った。

ｆ５１　　ｐＨ安定性および熱安定性 ｐＨ安定性は、前記各緩衝液中、ｐＨ８，０〜　、１０
．８において、４５°Ｃ１１５分間保持した後、酵素活
性を測定したところ、ｐＨ５〜９の範囲で安定であった
。

また、熱安定性は、０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）中、４０〜８０°Ｃにおいて１５分間保持し
、酵素活性を測定した。結果は、５５°Ｃまては完全に
活性を維持していたが、８００Ｃでは完全に失活した。

（６）作用適温の範囲 ＧＳＯの酵素活性の測定に使用する酸素電極法において
は、温度によって反応液の溶存酸素量か異るので正確な
範囲は特定できないか、過酸化水素の生成を公知の方法
で測定したところ、およそ３０〜５０°Ｃの範囲が好適
であった。

（７）　　阻害、活性化および安定化 シアン化カリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩
化ニッケル、塩化アルミニウム、塩化ストロンチウム、
塩化バリウム、塩化第二鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜
鉛、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸リチウム、ヨウ化カリ
ウムなど種々功金属塩およびエチレンジアミン四酢酸（
ＥＤＴＡ）などの阻害剤１　ｍＭを含む０．１　Ｍりん
酸カリウム緩衝液（＋）Ｈ７，４）中で酵素反応を行い
、各物質による阻害の有無を検討した。その結果、ＧＳ
Ｏの活性は硫酸亜鉛、すなわち亜鉛イオンによって完全
に阻害され、硫酸マンガンによって２０％程度阻害され
たが、他の阻害剤にはほとんど阻害されなかった。

（８）紫外線吸収スペクトル λｍａｘ　　２７２ｎｍ　　、　　３６５ｎｍ　　、　
　４４３ｎｍＥ２８０ｎｍ１４．７８ １％ （９）補酵素 ＧＳＯを熱処理またはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処理し
、遠沈して得られた上清は、その吸収スペクトルがフラ
ビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と一致し、Ｄ−
アミノ酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化したので、本
酵素の補酵素がＦＡＩ）であることが判明した。また、
ＦＡ’Ｄは、Ｇ５０１ｍ０１あたり２ｍ０１存在してい
る。

＋ＩＱ　　ポリアクリルアミドゲル電気泳動および５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製酵素はいずれの方法でも単一バンドを示した。

（Ｌｌｌ　　等電点 アンフオライン（スウェーデン国、ＬＫＢ社製）を用い
た等電点電気泳動法により測定したところ、ｐＩ　　は
４，２１であった。

（１９分子量 ＧＳＯの分子量は、セファデックスＧ−２００（ファル
マシア・ファインケミカルズ社製）によるゲル濾過法で
は９４０００±５０００と測定された。また、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、ＧＳＯは分
子量４７０００±３０００のサブユニット２個から構成
される二量体酵素であることが示された。

（１３）結晶構造および元素分析 ＧＳＯは結晶化されていないので測定していない。゛ （］４）精製方法 ’　　ＧＳＯの精製は塩析法、等電点沈澱法、有機溶媒
による沈澱法、けいそう土、活性炭などによる吸着法、
各種クロマトグラフ法等を適宜に組合せて行うことがで
きる。精製方法の具体例は参考例に示すとおりである。

２）Ｇ　Ｓ　Ｏの製造 本発明において使用するＧＳＯは、前記の性質を有する
ものであればその起源、由来は問わず、その製法によっ
ても限定されない。製造法の一例として微生物によるＧ
ＳＯの製造法を参考例として、具体的に示す。

参考例 ８００ｖｔｌ容三角フラスコにフスマ８９　、水５　ｍ
ｌおよびもみがら１ｇを入れ、１２０℃、８０分間加圧
滅菌して調製した積用フスマ培地にペニシリウム・アク
レアタム　ＩＦＯ５７２９を植菌し、２８℃、７日間培
養して種菌を調製した。

５１容三角フラスコ２０本にそれぞれフスマ２００りお
よび水１４０露ｌを入れ、１２０℃、３０分間加圧滅菌
した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８°Ｃ，７日
間培養した。得られた培養物を８０１１の水に１時間浸
漬した後、濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵
素成約２７４を得た。

この粗酵素液に硫酸アンモニウムを６５％まで加え、生
成した不溶物を遠沈除去した。上清液にさらに硫酸アン
モニウムを添加して９５％飽和濃閲とし、生成した沈澱
を遠＼沈採取して０．０２　Ｍりん酸緩衝液（＋）Ｈ７
，４）１１に溶解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析
中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロ
ースカラム（５Ｘ７０α）に通し、吸着した酵素を食塩
０．２Ｍを含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出され
た活性区分を集め、透析濃縮後、セファデックスＧ〜１
００（ファルマシア・ファインケミカルズ社製）カラム
（８，，５×１００ｚ）を用イテ’ｆルｍ過を行い、活
性区分を集めて濃縮後、Ｑ、０２Ｍりん酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，４）で透析した。この透析内液を遠沈し、
上滑液を精密濾過した後、凍結乾燥してＧＳＯの精製標
品（収率４１％、比活性５４０　Ｕ／ｍｙ蛋白）４９〜
を得た。

使用微生物 本発明のＧＳＯの製造に使用される微生物は、アスヘル
ギ／ｌ／　ｘ　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　；以下、Ａ
と略称する。〕属、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ　；以下、Ｐ。

と略称する。）属、フザリウム（ｐｕｓａｒｉｕｍ　　
；　以下、Ｆと略称する。）属、トリーｙ　チル７　（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　；以下、Ｔと略称する。）属
、バエシロミセス（ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　；　ｐ
ａｅと略称する。）属またはグリオクラディウム（Ｑｌ
　ｉｏｃｌａｄｉｕｍ　；以下、Ｇ、ト略称する。）属
に属し、ＧＳＯ生産能を有する微生物である。これらの
属胃属するＧＳＯ生産菌の具体例としてはアスペルギル
ス・アワモリ（Ａ、　ａｗａｍｏｒｉ）ＩＡＭ　　２２
９９．アスペルギルス・バタタエ（Ａ、　ｂａｔａｔａ
ｅ　）　Ｉ　Ａ　Ｍ　　２０９８、アスペルギルス・イ
ヌイ（Ａ、ｉｎｕｉｉ）ＩＡＭ　　２２５５、アスペル
ギルス・オクラセウｘ　（Ａ、　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ　
）　Ｉ　Ｆ　０４３４５、アスヘルギＪＬｔ７．−オリ
ゼー（Ａ、　ｏｒｙｚａｅ　）ＩＦＯ４１８８，ペニシ
リウム・アクレアタム（ｐ、　ａｃｕｌｅａｔｕｍ　）
　Ｉ　Ｆ　０　５　？　２９、ペニシリウム・ヤンセニ
（Ｐ、　ｊｅｎｓｅｎｉ　）　Ｉ　ＡＭ　　７１９７、
へ二シリウム・シトリナム・トム　１１８１（Ｐｃｉｔ
ｒｉｎｕｍ　Ｔｈｏｍ　　１１８１　）微工研菌寄第１
８６８号、゛フザリウム・ソラニ（Ｆ、　５ｏｌａｎｉ
　）　Ｉ　Ｆ　０５２８２、フザリウム・サムブシナム
　（Ｆ。

ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）　ＯＵ　Ｔ　　４０２０、グリ
オクラディウム・テリクエセンス（Ｇ、ｄｅｌｌｑｕｅ
ＣｅｎＳ）ＯＵＴ４６１６、バエシロミセス・バリオチ
（ｐａｅｖａｒｉｏｔｉ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ４８５５、トリ
コデルマ・ビリデ（Ｔ、ｖｉｒｉｄｅ）ＡＴＣＣ２０５
８６ｔｘどが挙げられる。ただし、本発明の使用微生物
はこれらの菌株に限定されるものではない。また、これ
らＧＳＯ生産菌を通常の微生物突然変異誘導法、たとえ
ば紫外線、Ｘ線、ｒ線照射などの物理的処理、ニトロソ
グアニジンなどの薬剤による化学的処理などの処理法に
よって変異させて得られたＧＳＯ高生産性突然変異株の
いずれをも好適に使用できる。

ＧＳＯの調製 ＧＳＯの調製形態および精製度合は、本酵素による酸化
反応と、それに続く示標物質の検出系の種類に応じて適
宜に選択される。すなわち本酵素による酸化反応ならび
に示標物質の検出系における諸反応および／または検出
に対して妨害的に作用する物質を含まないかぎり、ＧＳ
Ｏの酵素剤中に夾雑物質が存在しても問題１こならない
。また、採用される定量システムの実施態様にしたがっ
て、可溶性酵素として、あるいは適、宜な担体に吸着も
しくは不溶化したものとして使用することができる。

３）Ｌ−ｃｙｓの定量 本発明におけるＬ　−Ｃｙｓの定量法は、試料中のＬ　
−（：：ｙｓのＧＳＯによる酸化反応、特にＧＳＨ共存
試料を対象とする場合にはｐＨ４，５〜５．５およびｐ
Ｈ７，０〜８．０の二点における特異的酸化反応と、こ
れにともなう酸素の消費量の測定もしくは反応物の生成
量の測定を行う示標物質の検出系とからなる。

ＧＳＯによる酵素反応 Ｌ　−ＣＹ８の定量におけるＧＳＯの酵素反応条件は次
のとおりである。すなわち、反応ｐＨは、ＧＳＯ安定ｐ
Ｈ範囲内であり、かつＬ　−Ｃｙｓに作用するｐＨ範囲
であればよいが、特にＧＳＨ共存試料中のＬ　−Ｃｙｓ
を測定する際にはｐＨ４，５〜５．５およびｐＨ７，０
〜８．０の１）Ｈ範囲でなければならす、両ｐＨ範囲で
反応を行うことによってはじめてＧＳＯのｐＨによる基
質特異性の変化を利用することができる。上記の場合、
参考例に示すバニシリウム属糸状菌のＧＳＯは、特にｐ
Ｈ５，０付近およびｐＨ７，４付近で反応を行うことに
よりｐＨによる基質特異性の変化を好適に利用できる。

なお、ＧＳＨの共存する試料を対象とする場合、基質に
対する酵素の使用量は、ｐＨ，７，０〜８．０における
反応では、Ｌ　−ＣｙｓおよびＧＳＨが完全に反応する
程度の過剰量であり、ｐＨ４，５〜５．５における反応
では、ＧＳＨのみ化作用する程度の量が好ましい。また
、酵素反応のｐＨを維持する目的で、酵素反応媒質とし
て各種の緩衝液を使用することが好ましい。緩衝液とし
ては、前記のｐＨ範囲を維持でき、かつ本酵素反応を阻
害しないものであ液などのｉｌＦ！−緩衝液が好適であ
る。

反応温度は、ＧＳＯの安定温度範囲である限り特に限定
されない。

示標物質の検出 本発明における示標物質は、酸素および酵素反一応にお
ける反応物（反応生成物）である。ＧＳＯの反応におけ
る反応物とは、過酸化水素および基質のＳ　Ｈ化合物に
対応するジスルフイドニ量体であるが、本発明の示標物
質としては過酸化水素が好適である。

Ｌ、−Ｃｙｓの定量は、酵素反応にともなう示標物質の
量の変化を測定すること１ンよって行なわれる。

具体的には、試料中のＧＳＨの有無にかかわらす適用で
きる方法として、ｐＨ７，０〜８．０における酵素反応
にともなう酸素の消費量（Ａｌまたは反応物の一つ、た
とえば過酸化水素の生成量ｆＡｊと、ｐＨ４，５〜５．
５における酵素反応にともなう酸素の生成量ｆＢｌまた
は前記と同じ反応物の一つの生成量（角を検出測定し、
両側定値の差（Ａ−ＢまたはＡ’　−Ｂ’　）を求める
ことによりＬ　−Ｃｙｓを定量する方法が挙げられる。

もちろん、明らかにＧＳＨを実質的に含まない試料を対
象とする場合にはＬ−ｃｙｓが充分に反応するｐＨ，た
とえばＩ）Ｈ７，０〜８．０において酵素反応を行い、
酸素消費量またはヌ応物生成量を測定することによりＬ
−Ｃ’ｙｓを簡単に定量することができる。

示標物質の検出系の選択は任意であり、これらの物質の
測定に通常採用される方法を適用できる。

また、示標物質の検出のための具体的方法にも特に限定
されない。

以下、それぞれの示標物質の検出測定法についてその代
表的な方法を例示するが、これらの示標物質の検出系は
公知方法に限定されず、今後さら夢（開発されるべき種
々の方法をも採用可能と考えられる。

酸素の消費量を測定する方法としては、ワールブルグの
検圧法、酸素電極法が知られている（生化学実験講座５
　酵素研究法（上）　第３５〜５２頁、東京化学同人、
１９７５年８月２０日発行）。

さらに、酸素電極の先端部にＧＳＯを固定化した酵素電
極法も採用できる。

過酸化水素を検出測定する方法には、大別して分光学的
測定法、けい光測定法、電気化学的測定法の三種の方法
がある。

過酸化水素の分光学的測定法としては、過酸化水素の活
性化物質と指示薬の組み合せによる方法が挙げられる。

過酸化水素の活性化物質と、しては、たとえば西洋わさ
びもしくはさつまいもなどのパーオキシダーゼのほかに
ヨウ化物、モリブデン酸塩などのいずれか一種あるいは
その混合物が有効に用いられる。指示薬としては、０−
ジアニシジン、０−トリジン、０−トルイジン、２．６
−ジクロロインドフェノール、ベンジジン、　８．８’
−５，５’−テトラアルキルベンジジン（８，８’〜ジ
メチル−５，５′−ジエチルベンジジンなど）、４−メ
トキシ−１−ナフトールなどのほか組合わせ指示薬を用
いることができる。組合わせ指示薬の例としては、４−
アミノアンチピリンとフェノールの組合わせが挙げられ
るが、特にこれ番こ限定されるものではない。た吉えば
、フェノールの代りに２，４−ジクロロフェノール、カ
テコール、レゾルシン、ヒドロキノン、クレゾール、グ
アイアコール、ピロガロール、オルシノールのような多
価アルコールもしくはフェノール誘導体、さらにアニリ
ン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリンのようなアニ
リン誘導体を用いることができる。一方、４−アミノア
ンチピリンの代りとしては、４−アミノフェナジン、各
種４−アミノピラゾロン誘導体ならびに３−メチルベン
ゾチアゾリノン−ヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびそのス
ルホン酸誘導体などが例挙される。なお指示薬としては
、前記のほかに定量条件において定量的に酸化されて色
調変化を示しうるものである限り、いずれも使用可能で
ある。他の過酸化水素の分光学的測定法には、メタノー
ルとカタラーゼの存在下で過酸化水素からホルムアルデ
ヒドを生成させ、これを酸化剤（たとえばカリウムシア
ノフエラート、塩化第二鉄など）の存在下でヒドラゾン
（たとえば３−メチル−２−（スルホニル）−ベンゾチ
アゾロンヒドラゾンなど）と反応させる方法がある。さ
らに、カタラーゼ−アセチルアセトン法、アルデヒドデ
ヒドロゲナーゼを用いるアルコールの酸化による方法、
銅イオン−ヒスタミン系でインジゴカルミンを酸化脱色
し、その色度の減量から定量する方法などが知られてい
る。

過酸化水素の電気化学的測定法としては、白金電極を用
いるポーラログラフ法などが知られている。また、カタ
ラーゼを共用した酵素電極を用いて酸素生成にともなう
酸素レベルの上昇幅および速度を測定し、過酸化水素を
定量する方法もある。

このほかヨウ素アニオンをモリブデン酸塩の触媒存在下
で過酸化水素によりヨウ素に酸化し、その生成速度を電
位差計もしくは電流計により検出して定量する方法など
もある。

過酸化水素のけい先決による定量法として、ホモバニリ
ン酸を過酸化水素とパーオキシダーゼにより２，２′−
ジヒドロキシ−８，８′−ジメトキシ−ジフェニル−５
，５′−ジアセチル酸のけい光体に変換して測定する方
法が知られている。ホモバニリン酸のほかに過酸化水素
とパーオキシダーゼによりけい光物質に変換されるもの
としてはｐ−ハイドロキシフェニル酢酸、ジアセチル−
区７′−ジクロロフルオレセインなどが挙げられる。ま
た６−メドキンー７−ハイドロキシー１，２−ベンゾピ
ロン、３．５−ジアセチル−１，４−ジノ１イドロルチ
ジンなどのけい光物質を過酸化水素−、＜−オキシダー
ゼにより酸化して非けい光物質に変換し、そのけ（１光
の減少を測定する方法がある。

妨害物質の影響の除去 前記のような示標物質の検出系にお−いて、定量目的物
中の示標物質以外の物質が検出を妨害する場合がある。

このような場合には妨害物質の影響を除去する必要があ
る。

たとえば、ｐＨ７，０〜８．０における酵素反応では、
定量目的物中のＧＳＨおよびＬ　−Ｃｙｓ以外のＳＨ化
合物あるいはｐＨ４，５〜５，５における酵素反応では
ＧＳＨ以外のＳＨ化合物は、ＧＳＯを作用させた後もそ
のまま残存するが、ＳＨ化合物カヂ存在すると前記の発
色試薬による発色が阻害され、Ｌ　−Ｃｙｓ測定を妨害
する。このような場合ＳＨ基封鎖剤によってＳＨ化合物
を封鎖する必要がある。

ＳＨ基封鎖剤としては、Ｎ−エチルマレイミド（以下、
ＮＥＭと略称する。）が好ましし）。

以下、本発明方法の実施の一例を示して具体的な説明を
加える。しかしながら、これらＩ！単なる例示であって
、本発明方法を何ら限定するものではない。なお、各実
施例で使用したＧ　Ｓ　０１！前言己の参考例の方法に
準じて＃≠曇噛ペニシ１ノウム・アクレアタム　ＩＦＯ
５７２９の培養物より調製したものである。

実施例 発色試薬：フェノール２０１１７，４−アミノアンチピ
リン１２■および西洋わさび、＜−オキシダーゼ（東洋
紡績■製、グレードｌ）２．５■（１００ｔＪ／ｍη）
をＳｏｍｅの０．２Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
４）に溶解した。

ＧＳＯ溶液１：精製酵素（５４０Ｕ／Ｗ）５０μｑを５
４Ｎ／の０．０２　Ｍ酢酸緩衝液（＋）Ｈ５，Ｏ）ｌこ
溶解した（’　０．５　Ｕ／ｇｌ　）。

ＧＳＯ溶液２：精製酵素（５４０Ｕ／＋ｙ）　５０Ｍｇ
を５．４　ｍｌの０．０２Ｍりん酸カリウム緩衝液（１
）Ｈ７，４）に溶解した（　５．０　Ｕ／ｍｌ　）。

ＮＥＭ溶液：　ＮＥＭ２００　μｍｏｌ　　を１０１！
ｌｌの０．５Ｍりん酸カリウム緩衝液（１）Ｈ７，４）
に溶解した。

操作法：試験管（イ）に０．１　ｍｌの０．５　Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５，０）および０．１譚ｔのＧ５−０溶液
１を入れ、試験管（切に０．１　ｍｌの０．５Ｍりん酸
カリウム緩衝液（＋）Ｈ７，４）および０．　ｉ　ｍｌ
のＧＳＯ溶液２を入れ、それぞれ３７°Ｃの恒温槽に入
れた。試験管（イ）および（ロ）ノ各ｋ　ｌｃ　Ｌ　−
ｃｙｓ　（０〜０．８　μｍｏｌ／＊／　）　　単独も
しくはＬ　７　ＣｙｓとともにＧ　Ｓ　Ｈ（０，４７１
ｍｏｌ／＊／）を含む標準液０．５　＃ｌ／を加えて反
応を開始し、２０分間好気的に振盪しながらインキュベ
ートした後、それぞれの試験管にＮＥＭ溶液０．１　ｔ
ｅｌを加え、さらに０．２　ｍｌの発色試薬を加えた。

試料無添加を対照として試験管（イ）および（ロ）各々
の５００　ｎｍ　ての吸光度（Ｂ’＃よびＡ’　；過酸
化水素生成量に比例する量）を測定し、両側定値の差ｔ
ｘ−ｇ）を求め、検量線を作成した（第１図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例における検量線を示す。 図において、たて軸はｐＨ７，４におけるＯＤ。 ５００　ｎｍ　での吸光度（粕との差（Ａ’−Ｂ’）を
示し、よこ軸はＬ　−Ｃｙｓ量（μｍｏｌ／チューブ）
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料中のし一システィンを定量するに際し、酸素存
   在下、グルタチオン・スルフィドリル・オキシダ一ゼを
   試料に作用させ、反応にともなう酸素消費量または反応
   物生成量を測定することを特徴とするし一システィンの
   定量法。 ２）グルタチオン・スルフィドリル・オキシダーゼによ
   る酵素反応を、ｐＨ７，０〜８０およびｐＨ４，５〜５
   ．５において行い、ｐＨ７，０〜８．０における反応液
   中の酸素消費量＋Ａ＋または反応物生成量＋Ａ＋と、ｐ
   Ｈ４，５〜５５における反応液中の酸素消費量（Ｂｌま
   たは反応物生成量１Ｂ′）とを測定し、それらの差（Ａ
   −ＢまたはＲ−Ｂ：）からＬ−システィン含量を求める
   特許請求の範囲第１項記載のＬ−システィンの定量法。 ３）試料がグルタチオンを実質的に含まない試料である
   特許請求の範囲第１項記載のし一システィンの定量法。 ４）測定する反応物生成量として過酸化水素生成量を用
   いる特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のし一
   システィンの定量法。