JPS6210159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔〕 発明の背景 技術分野 本発明は新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
を用いる分析試料中のＬ−グルタミン酸の分析法
に関する。また、本発明はＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼを含有するＬ−グルタミン酸の分析用試
薬に関する。さらに本発明はＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼを利用するＬ−グルタミン酸の分析用
キツトに関する。 従来技術 従来、Ｌ−グルタミン酸の分析法としてクロマ
トグラフイー法、微生物定量法、電気泳動法およ
び酵素法が知られているが、一般にはクロマトグ
ラフイー法および酵素法が用いられている。 クロマトグラフイー法としてはアミノ酸自動分
析計を使用する方法が一般的である。この方法は
精度および信頼度が高く優れた方法であるが、装
置が高価であり、試料によつては除蛋白が必要で
試料調製法が複雑となるなどの問題点がある。 酵素法としてはＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素
を用いる方法およびＬ−グルタミン酸脱水素酵
素を用いる方法が知られている。しかし、これら
の既知酵素を用いる方法は以下のような問題点が
ある。 すなわち、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸酵素を用
いる方法においては、反応の測定は反応生成物で
ある炭酸ガスを検出することによつて行われてお
り、通常○イワールブルク検圧計を用いる方法、ま
たは○ロオートアナライザーを用いる方法が採用さ
れている。○イのワールブルク検圧計を用いる方法
は精度は高いが、かなりの熟練を要する方法であ
り、測定に長時間を要し、サンプル処理能力が低
い。また、○ロのオートアナライザーを用いる方法
は、炭酸ガスをフエノールフタレインの炭酸ナト
リウム溶液に吸収させ、減色度から発生した炭酸
ガス量を測定する方法であるので、あらかじめ酵
素液と緩衝液中の炭酸ガスおよび酸素の脱気を冷
却しながら行うなど、予備操作が必要であり、反
応後に気液分離が必要であり、装置が複雑化する
という問題点がある。なお、グルタミン酸脱炭酸
酵素としては一般にカボチヤもしくは大腸菌由来
の酵素が使用されるが、カボチヤ由来の酵素は、
ウレアーゼ活性を有しており、尿素を含有する試
料を対象とする場合には尿素由来の炭酸ガスによ
つて測定誤差を生じるおそれがあり、またこの酵
素は酢酸等の有機酸の阻害を受けるため、有機酸
を多く含むサンプルでは酵素活性が阻害されて正
確な結果を得られない欠点がある。また、大腸菌
由来の酵素は、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタ
ミンに対して活性を示すので、これらのアミノ酸
を多く含む試料を対象とする場合には正確な結果
が得られない。また、酵素自体の保存性も良くな
い。 Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素は、Ｌ−グルタ
ミン酸と水とをNAD（酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）の存在下に反応させてα
−ケトグルタル酸、アンモニアおよびNADH（還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を
生成する反応を触媒するが、この酵素を用いる方
法においては、反応の測定はNADHの生成量を
340nｍにおける吸光度の増加を検出することに
よつてなされる。しかし、この酵素反応の平衡は
Ｌ−グルタミン酸形成に傾いており、この酵素を
使用してＬ−グルタミン酸を分析するためには、
反応の平衡をα−ケトグルタル酸を生成する側に
寄せなければならず、このため種々の工夫が必要
となる。この目的で通常α−ケトグルタル酸の補
捉剤が反応系に添加されるが、濃度を厳密に調節
しなければ反応を阻害することもある。さらに
NAD濃度も厳密に調節しなければならない。な
お、醤油など測定波長において吸収を示す物質を
含有する試料を対象とする場合、空試験の値を用
いて反応によつて得られた値を補正しなければな
らない。また、使用する酵素に乳酸脱水素酵素活
性が存在する場合があるのでこのような酵素活性
の影響も考慮しなければならない。 最近、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性の
高いＬ−アミノ酸オキシダーゼがストレプトマイ
セス（Streptomyces；以下、「S.」と略すことも
ある。）属に属する微生物、具体的にはストレプ
トマイセス・バイオレツセンスの培養によつて生
産されることが見出された（特開昭57−43685号
公報参照）。このグルタミン酸オキシダーゼ（以
下、「公知酵素」と略すこともある。）の蛋白質と
しての理化学的性質は明らかではないが、酵素学
的性質として記載されている性質を挙げると次の
とおりである。 (1) 基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する活性を100とした
場合、Ｌ−グルタミン酸に対して8.4、Ｌ−ヒ
スチジンに対して6.8の相対活性を示し、他の
アミノ酸に対しては実質的な活性は示さない。 (2) 至適PH PH５〜６ (3) PH安定性 PH3.5〜6.5の範囲（37℃、１時間保持）で安
定である。 (4) 温度安定性 50℃まで（10分間保持）安定である。 (5) 阻害剤の影響 水銀イオン、銅イオンおよびジエチルジチオ
カルバメイトによつてほぼ完全に阻害される。 上記のような公知酵素をＬ−グルタミン酸の分
析に利用するには種々の問題点がある。すなわ
ち、公知酵素は従来知られていたＬ−アミノ酸オ
キシダーゼと比較すればＬ−グルタミン酸に対す
る基質特異性は高いが、上記のとおり依然として
他のアミノ酸に明確な活性を示すのであり、これ
らのアミノ酸の存在下におけるＬ−グルタミン酸
の特異的定量には使用できない。また、公知酵素
はPHおよび熱安定性が高くはなく、分析用試薬と
しての保存安定性および使用安定性も必ずしも良
いとは考えられない。さらに、分析試料中に銅イ
オンが存在する場合、公知酵素活性は顕著に阻害
され分析が困難になると考えられる。また、各種
の生化学的分析、特に血液中の酵素活性の分析に
おいて、反応液のPHは中性付近が一般的である
が、公知酵素はPH7.5では37℃、１時間の処理で
完全に失活することから、中性付近での分析を行
うことは困難である。 なお、従来、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを使用
するＬ−アミノ酸の分析法は知られていたが、公
知のＬ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｌ−グルタミ
ン酸に対しては作用しにくく、このような酵素を
使用する方法ではＬ−グルタミン酸の特異的な分
析はできなかつた。 〔〕 発明の概要 要 旨 本発明は、前記のような従来技術の問題点を解
決すべくなされたものであり、新たに分離された
ストレプトマイセス属微生物の培養物より本発明
者らによつて見出された新規なＬ−グルタミン酸
オキシダーゼが適当な条件下においてＬ−グルタ
ミン酸に極めて特異的に作用し、定量的に酸素を
消費して過酸化水素、アンモニアおよびα−ケト
グルタル酸を生成することを知見し、この知見に
基づいて本酵素の応用について研究を重ねた結
果、本発明を完成するに到つた。 本発明は、分析試料中のＬ−グルタミン酸に対
し、下記の特性を有するＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（以下、「本発明酵素」と略称することも
ある。）を酸素と水の存在下、作用させ、反応に
ともなう酸素の消費または過酸化水素、アンモニ
アもしくはα−ケトグルタル酸の生成を検出する
ことを特徴とするＬ−グルタミン酸の分析法を提
供するものである。 イ 基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性がきわ
めて高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸に
は実質的に作用しない。 ロ 至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。 ハ 安定PH範囲 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の
範囲において安定である。 ニ 熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件においては、65℃
まで安定であり、85℃で約50％の残存活性を示
し、PH7.5、15分間保持の条件では、50℃まで
安定であり、75℃で約60％の残存活性を示す。 ホ 分子量 ゲル濾過法（セフアデツクスＧ−200（フア
ルマシア・フアインケミカルズ社製））で測定
した分子量が、135000±10000である。 また、本発明は前記Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼを含有してなるＬ−グルタミン酸の分析用試
薬を提供するものである。 さらに、本発明は前記Ｌ−グルタミン酸オキシ
ダーゼと該酵素による反応の検出試薬とからなる
Ｌ−グルタミン酸の分析用キツトを提供するもの
である。 効 果 本発明酵素はＬ−グルタミン酸に特異的に作用
し、他のアミノ酸には実質的には作用しないＬ−
アミノ酸オキシダーゼとしては初めて見出された
酵素である。 したがつて、多種類のアミノ酸を含有する試料
であつても、本発明酵素を使用するＬ−グルタミ
ン酸の分析法、分析用試薬および分析用キツトを
採用すれば、本発明酵素の反応を検出することに
より、試料中のＬ−グルタミン酸を特異的に分析
することができる。また、本発明のＬ−グルタミ
ン酸の分析法、分析用試薬および分析用キツトに
おいては、Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性
がきわめて高い本発明酵素を使用しているため、
分析時に試料中のアミノ酸を分別するなど前処理
は一切必要ない。 例えば、多種類のアミノ酸を含有する醤油、そ
の他の液体調味料などの食品は、Ｌ−グルタミン
酸含量がその品質評価の重要な指標になるが、本
発明方法によれば、これらの試料中のＬ−グルタ
ミン酸を容易かつ迅速に、しかも特異的に定量す
ることができる。 また、臨床検査における重要な測定項目である
グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
（GOT）、グルタミン酸・ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）、γ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ（γ−GTP）などの活性測定を、これ
らの酵素の反応生成物であるＬ−グルタミン酸を
本発明方法によつて直接分析することにより行う
ことができ、これらの酵素活性の測定をより迅速
に、かつ容易に行える道が開けた。 なお、本発明方法は、使用する酵素の酵素反応
形式が臨床検査あるいは食品分析等において最も
広く実用化されているオキシダーゼ反応であるこ
とから、酵素反応の検出もオキシダーゼ反応の検
出手段として汎用されている公知の方法をそのま
ま転用できる利点がある。 さらに、本発明酵素は公知酵素をはじめ一般の
分析用酵素と比較しても高い安定性を有している
ので、そのような酵素を使用する本発明のＬ−グ
ルタミン酸の分析法、分析用試薬および分析用キ
ツトは、使用および保存などに際して安定であ
り、高い耐久性、汎用性および経済性を備えてい
るばかりでなく、本発明酵素を酵素電極としてＬ
−グルタミン酸の連続分析に応用する際には、公
知酵素を使用した際と比較して耐久性、安定性の
点で格段の差が生じる。 加えて、至適PH範囲を中性付近に有する本発明
酵素を使用する本発明のＬ−グルタミン酸の分析
法、分析用試薬および分析用キツトは、温和な条
件で分析可能という酵素分析の特徴を十分に生か
すことができ、かつ分析時に使用する他の酵素、
試薬および器材の選択の幅が非常に拡大した。 〔〕 発明の具体的説明 (1) 本発明酵素 本発明酵素は、Ｌ−グルタミン酸に対する基
質特異性がきわめて高く、Ｌ−グルタミン酸以
外のアミノ酸には実質的に作用せず、安定性の
高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼであればよ
く、その起源・由来を問わず、その調製法も問
わない。 以下に本発明酵素の一例としてストレプトマ
イセス属微生物の培養物より得られた酵素を挙
げ、この例示酵素について具体的性質および調
製法を説明する。 (A) 本発明酵素の酵素学的および理化学的性質 後に示す参考例の方法で製造したＬ−グル
タミン酸オキシダーゼの精製酵素標品の酵素
学的および理化学的性質は下記のとおりであ
る。 (1) 作用 本発明酵素はＬ−グルタミン酸を基質と
した場合、下記反応式のごとくＬ−グルタ
ミン酸1molにつき、1molの酸素と1molの
水を要求し、1molのα−ケトグルタル
酸、1molのアンモニアおよび1molの過酸
化水素を生成する。 (2) 基質特異性 種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精
製標品を作用させた結果が第１表である。
各基質の濃度は10ｍＭであり、反応はPH
7.4（0.1Mりん酸カリウム緩衝液）および
PH6.0（0.1M酢酸緩衝液）で行つた。酵素
活性は後述する酸素電極法により測定し、
Ｌ−グルタミン酸に対する活性の相対値と
して表わした。

【表】

【表】 以上のとおり本発明酵素はＬ−グルタミ
ン酸に対する基質特異性が高く、他のアミ
ノ酸に対しては、PH7.4においてＬ−アス
パラギン酸にわずかな活性（0.6％）を示
すだけで、Ｌ−グルタミンおよびＬ−ヒス
チジンを含む他のＬ−アミノ酸およびＤ−
グルタミン酸には実質的には全く活性を示
さず、PH6.0においてはＬ−アスパラギン
酸に対しても実質的に活性を示さない。 以上の本発明酵素に対し、前記のとおり
公知酵素はＬ−アスパラギン酸に対しては
活性を示さない（0.1％以下）が、Ｌ−グ
ルタミンに対して8.4％、Ｌ−ヒスチジン
に対して6.8％の活性をそれぞれ示す酵素
であり基質特異性において両者は異る。 なお、本発明酵素のＬ−グルタミン酸に
対するKm値はPH7.4において2.1×10^-4M
で、Ｌ−アスパラギン酸に対するKm値はPH
7.4において2.9×10^-2Mである。 (3) 力価の測定 本発明酵素の力価の測定は、酸素電極法
で行つた。すなわち、10ｍＭのＬ−グルタ
ミン酸ナトリウムを含む0.1Mりん酸カリ
ウム緩衝液（PH7.4）１mlを酸素電極セル
に入れ、10μの酵素液を添加して酸素消
費速度を測定した。30℃で１分間に１μ
molの酸素を消費する酵素量を１単位
（Unit；本明細書において「Ｕ」と略称す
る。）とした。 なお、反応液の溶存酸素濃度は温度の上
昇とともに減少するので高い反応温度での
活性測定には上記方法は使用できない。こ
のような場合にはMBTH法（アナリテイ
カル・バイオケミストリー（Anal.
Biochem.）、25、228（1968）参照）によ
つて行う。すなわちＬ−グルタミン酸ナト
リウム、カタラーゼおよび本発明酵素を含
有する反応液を適当温度で20分間インキユ
ベートし、トリクロロ酢酸（TCA）を加
えて反応を停止し、この反応停止液に酢酸
緩衝液（PH5.0）および３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾンハイドロク
ロライド（MBTH）を加えて50℃で30分
間インキユベートした後、室温まで冷却し
て316nｍの吸光度を測定し、検量線から
生成したα−ケトグルタル酸を定量する。 (4) 至適PH 至適PHは第１図に示すとおり、PH７〜
8.5付近である。各PHにおける酵素活性の
測定は、基質としてＬ−グルタミン酸ナト
リウムを使用し、緩衝液として0.2M酢酸
緩衝液（PH3.5〜6.0）、0.2Mりん酸カリウ
ム緩衝液（PH6.0〜8.5）および0.2Mグリシ
ン−塩化ナトリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液（PH8.5〜12.0）を使用し、30℃で行
つた。 なお、第１図には本発明酵素と公知酵素
の至適PHの比較のため、本発明酵素（実
線）と公知酵素（点線：特開昭57−43685
号公報の第１図より引用した。）のPH活性
曲線を併記した。 第１図から明らかなように本発明酵素は
至適PHにおいても公知酵素とは相異する。 また、アスパラギン酸を基質とした場合
の作用PH範囲は狭く、至適PHは７〜８であ
るが、PH6.0以下およびPH10.0以上におい
てはＬ−アスパラギン酸に対してほとんど
作用しない（PH6.0においてグルタミン酸
に対する活性の0.1％以下）。 (5) PH安定性 PH3.5〜11.5の各PHにおいて37℃、60分
間、45℃、15分間および60℃、15分間の各
条件で保持した後、PH7.4においてグルタ
ミン酸に対する酵素活性を測定した。 その結果、37℃、60分間保持の条件では
PH5.5〜10.5の範囲において安定であり
（第２図、実線）、45℃、15分間保持の条件
でもPH5.5〜9.5の範囲において安定であり
（第３図）、60℃、15分間保持の条件ではPH
5.5〜7.5の範囲において安定であつた（第
４図）。 なお、第２図には本発明酵素と公知酵素
のPH安定性の比較のため、公知酵素のPH安
定曲線（特開昭57−43685号公報の第２図
より引用し、点線で示した。）を本発明酵
素のものと併記した。 以上の第２〜４図から明らかなように、
本発明酵素と公知酵素の安定PH範囲を比較
すると、両者は明らかに異なり、前者の方
が後者に比べて広いPH範囲において安定で
ある。 (6) 作用適温の範囲 30℃〜80℃の各温度においてＬ−グルタ
ミン酸ナトリウムを基質として20分間反応
し、前記MBTH法で酵素活性の測定を行
つた。 その結果、本発明酵素の作用適温の範囲
は30〜60℃であり、作用至適温度は50℃付
近であつた（第５図）。 (7) 熱安定性 40℃〜90℃の各温度においてPH5.5、PH
7.5およびPH9.5の各条件で15分間保持した
後、PH7.4においてグルタミン酸に対する
酵素活性を測定した。 その結果、PH5.5においては65℃まで安
定であり、85℃で約50％の残存活性を示す
（第６図、▲−▲）。PH7.5においては50℃
まで安定であり、75℃で約60％の残存活性
を示す（第６図、●−●）。PH9.5において
も45℃まで安定であり、70℃で約50％の残
存活性を示す（第６図、■−■）。 なお、本発明酵素と公知酵素の熱安定性
の比較のため、公知酵素の温度安定曲線
（特開昭57−43685号公報の第３図より引用
し、点線で示した。）を本発明酵素のもの
と併記した。 第６図より明らかなように、本発明酵素
は公知酵素よりも温度安定性が高い。 (8) 阻害、活性化および安定化 本発明酵素に対する種々の添加物質の影
響を調べるために、第２表に示す各物質１
ｍＭを含む反応液（PH7.4）中で酵素反応
を行つた。 その結果は第２表に示すとおりである。

【表】

【表】 第２表より明らかなように本発明酵素
は、パラクロロマーキユリベンゾエイトに
よつて約45％阻害されるが、塩化第二銅お
よびジエチルジチオカルバメイトによつて
は全く阻害されない。一方、公知酵素は塩
化第二銅およびジエチルジチオカルバメイ
トによつて完全に阻害される。したがつて
両酵素は阻害剤による影響という点におい
ても相異する。 なお、本発明酵素の活性化剤および安定
化剤はまだ見出されていない。 (9) 紫外線吸収スペクトル（第７図参照） λ_nax：273nｍ、385nｍ、465nｍ 肩：290nｍ付近、460nｍ付近 (10) 補酵素 本発明酵素を熱処理またはトリクロロ酢
酸（TCA）処理し、遠沈して得られた上
清は、その吸収がフラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）と一致し、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化したの
で、本発明酵素の補酵素がFADであるこ
とが判明した。 また、薄層クロマトグラフイーにおける
Rf値からもFADであると同定された。 FADは本発明酵素1molにつき2mol存在
するものと推定された。 (11) ポリアクリルアミドゲル電気泳動 精製された本発明酵素は単一バンドを示
した。 (12) 分子量 本発明酵素の分子量は、セフアデツクス
Ｇ−200（フアルマシア・フアインケミカ
ルズ社製）によるゲル濾過法では135000±
10000と測定された。 (13) 等電点 アンフオライン（LKB社製）を用いた
等電点電気泳動により測定したところ、pI
は6.2でであつた。 (14) 結晶構造および元素分析 本発明酵素は結晶化されていないので測
定していない。 (15) 精製方法 本発明酵素の精製は塩析法、等電点沈澱
法、有機溶媒による沈澱法、けいそう土、
活性炭などによる吸着法、各種クロマトグ
ラフ法等を適宜に組合せて行うことができ
る。精製方法の具体例は参考例に示すとお
りである。 (B) 本発明酵素の調製 次に本発明酵素を微生物の培養によつて製
造する方法を具体的に示す。 使用微生物 本発明酵素の製造に使用される微生物は、
ストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属し、本発明酵素を生産する能力を有する微
生物である。 このような微生物の具体例としては、千葉
県香取郡東庄町の土壌より分離され、単一の
菌株として単離されたＸ−119−６株を挙げ
ることができる。この菌株の菌学的性質を以
下に記載する。 Ａ 顕微鏡的観察 気菌糸は、直線状でその幅は0.9〜1.0μ
であり、単純分枝を示す。胞子柄は、多数
の胞子の連鎖よりなつており、２〜５回転
の螺旋を形成する。胞子はやや惰円形で、
その大きさは0.9〜1.0×1.1×1.2μであ
り、電子顕微鏡によつて表面はとげ状構造
であることが観察される。基菌糸の分断は
認められない。 Ｂ 肉眼的観察 各種培地における生育（30℃、16日間培
養）の肉眼的観察の結果は次のとおりであ
る。 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地 その生育は不良である。基菌糸は灰褐
色で寒天中に侵入せず、気菌糸は粉状で
寒天上に放射状に薄く広がる。色は灰褐
色で、灰色の胞子を形成する。培地中へ
の色素の生成は認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄
色で寒天中に侵入するとともに わずか
に盛り上る。気菌糸は白色で、貧弱であ
り、培地中への色素の生成は認められな
い。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄
色で、寒天中に侵入するとともに 盛り
上る。気菌糸は形成されず、培地への色
素の生成も認められない。 (4) 澱粉・無機塩寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄
色で、寒天中に侵入するとともに 盛り
上る。気菌糸は白色で、豊富であり、灰
色の胞子を着生する。培地中への色素の
生成は認められない。 (5) チロシン寒天培地 その生育は良好である。基菌糸は白黄
色である。気菌糸は白色で、豊富であ
り、灰色の胞子を着生する。培地中への
色素の生成は認められない。 (6) 栄養寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸
は白黄色で寒天中に侵入するとともに
盛り上る。気菌糸は白色で、胞子の着生
は認められない。培地中への色素の生成
も認められない。 (7) イースト・麦芽寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸
は白黄色で、寒天中に侵入するとともに
盛り上る。気菌糸は白色で、豊富であ
り、灰色の胞子を着生する。培地中への
色素の生成は認められない。 (8) オートミール寒天培地 その生育は極めて良好である。基菌糸
は白色で、寒天中に侵入するが、培地上
には盛り上らない。気菌糸は白色で、豊
富であり、灰色の胞子を着生する。培地
中への色素の生成は認められない。 Ｃ 生理的性質 生育温度範囲は８〜40℃であり、35℃近
辺が最適である。 チロシン寒天培地およびペプトン・イー
スト・鉄寒天培地では、共にメラニン様色
素は生成せず、ゼラチンをわずかに液化
し、澱粉を加水分解する。 Ｄ 各種炭素源の同化性 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上での
各種炭素源の利用性は第３表のとおりであ
る。

【表】 以上の性状を要約すると次のとおりであ
る。すなわち、気菌糸は螺旋状で、胞子の
表面はとげ状である。培地上での発育では
白黄色または灰褐色を呈し、気菌糸は白色
〜灰褐色で、溶解性の色素およびメラニン
様色素の生成を認められない。また、スタ
ーチ水解性は強い方である。 これらの結果と第３表に示した炭素源の
同化性を基準にバージエーズ・マニユア
ル・オブ・デイタミネーテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey′S Manual of
Determinative Bacteriology）第８版
（1974年）における分類体系に従つて本菌
株の同定を行つたところ、本菌株はストレ
プトマイセス属に属するが、本菌株の特徴
に十分に合致する公知の種は見出せず、本
菌株を新菌株であると同定し、ストレプト
マイセス・エスピー Ｘ−119−６
（Streptomyces sp.X−119−６）と命名し
た。 本菌株について、昭和56年通商産業省告
示第178号に従つて工業技術院微生物工業
技術研究所に対して寄託申請を行い、昭和
57年６月５日付けで受託され、受託番号と
して微工研菌寄第6560号（FERM Ｒ−
6560）が付与されている。 上記菌株は本発明酵素の生産能の高い菌
株の一例であり、本発明の使用微生物はこ
れに限定されるものではない。また、この
ような本発明酵素生産菌を通常の微生物突
然変異誘導法、たとえば紫外線、Ｘ線、γ
線照射などの物理的処理、ニトロソグアニ
ジンなどの薬剤による化学的処理などの処
理法によつて変異させて得られた本発明酵
素の高生産性突然変異株のいずれをも好適
に使用できる。さらに前記微生物による本
発明酵素の製造は基本的には、前記微生物
の本発明酵素の生産に関する遺伝情報を担
う遺伝子デオキシリボ核酸（DNA）によ
る酵素蛋白の合成機能を利用することであ
る。したがつて、このような遺伝子DNA
を適当なベクターに組み込み、前記以外の
属の微生物へ形質転換により移入させる
か、または遺伝子DNAをプロトプラスト
法による細胞融合によつて他属微生物に取
り込ませるなど遺伝子操作的手法によつて
得た微生物によつても本発明酵素は製造す
ることができる。 培養方法および条件 前記使用微生物の培養方法および条件
は、該微生物が良好に生育し、本発明酵素
が十分に生産される方法および条件であれ
ば特に限定されないが、固体培養法もしく
はそれに準ずる方法が好適である。 固体培養に使用する固体培地は通常使用
されるものと何ら変らない。すなわち、固
体培地とはフスマ、脱脂大豆、米ヌカ、ト
ウモロコシ、菜種粕、小麦、米、もみがら
等の天然固体原料の単独あるいは二種以上
の組合せたものを主体とし、さらに必要に
応じて使用微生物が質化可能な栄養源、た
とえばグルコース、シユークロース、アラ
ビノース、フラクトース、マンニトール、
イノシトール、可溶性澱粉、エタノール等
の炭素源、各種アミノ酸、ペプトン、大豆
粉、蛋白質加水分解物、コーンステイープ
リカー、肉エキス、酵母エキス、各種アン
モニウム塩、各種硝酸塩、尿素等の窒素
源、各種のナトリウム塩、カリウム塩、カ
ルシウム塩、マンガン塩、マグネシウム
塩、亜鉛塩、鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の
塩類、サイアミン、リボフラビン、ニコチ
ン酸、パントテン酸、ビオチン、ｐ−アミ
ノ安息香酸、ビタミンB₁₂等の発育素を適
宜添加した培地、またはこれらを適宜な配
合、大きさ、形状に造料した培地などであ
る。このような固体培地は常法により滅菌
あるいは変性処理し、種菌を接種して固体
培養を行う。 また、上記以外の培養法、たとえばスポ
ンジ等の適宜の担体に液体培地を吸収また
は被覆し（特開昭49−14679号公報参照）、
種菌を接種して培養する方法であつても使
用微生物が繁殖し、本発明酵素を良好に生
産する限り採用できる。 培養条件は使用微生物の種類に応じて酵
素の生産に最適の条件を選択すればよく、
特に限定されない。通常、たとえば20〜30
℃、PH５〜７で５〜15日間培養すればよ
い。 本発明酵素の採取 使用微生物の培養により生産された本発
明酵素は、適当な抽出法により培養物、す
なわち培地および／または培養菌体から抽
出分離され、そのまま粗酵素液として使用
するか、あるいは前記したとおり通常の酵
素精製法に従つて使用目的に応じた精製段
階に精製される。 抽出法は、特に限定されず、常法により
行われる。たとえば、固体培養物からの抽
出は、通常、水または緩衝液により行われ
る。また、菌体内の本発明酵素は常法によ
り菌体を破砕し、可溶化して抽出する。 (2) 分析試料 本発明において「分析試料」という用語は、
その含有成分としてＬ−グルタミン酸を含有
し、もしくは含有することが予想される試料で
あつてＬ−グルタミン酸含量もしくはその有無
を分析すべき試料、またはＬ−グルタミン酸
を遊離し、もしくは遊離することが了想される
反応系を含有する試料であつて、その系のＬ−
グルタミン酸含量の変化を測定することによ
り、その系に関与する酵素活性もしくはその系
においてＬ−グルタミン酸に変換する物質の含
有量あるいはこれらの物質の有無を分析するた
めの試料を意味する。 上記に分類される試料としては、食品（た
とえば、醤油、アミノ酸調味料、各種エキス
類、液体だしの素などの液体調味食品、清酒、
みりんなどのアルコール含有食品、水産ねり製
品、ソーセージ、ハムなどの固型食品の抽出液
など）、生体試料（尿、血液など）、その他が挙
げられ、に分類される試料としては、グルタ
ミナーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、GOT、
GPTγ−GTPなどＬ−グルタミン酸を反応生
成物とする酵素とその基質を含有する系、もし
くは前記の系と他の一種または二種以上の他の
共役酵素系とを含有する系が挙げられる。 (3) Ｌ−グルタミン酸の分析 本発明におけるＬ−グルタミン酸の分析法
は、試料中のＬ−グルタミン酸の本発明酵素に
よる酵素反応系、特に多量のアスパラギン酸が
共存する試料中のＬ−グルタミン酸に対しては
PH５〜６における酵素反応系と、これにともな
つて消費もしくは生成される示標物質の定量的
もしくは定性的な検出を行う示標物質の検出系
とからなる。 酵素反応 Ｌ−グルタミン酸の分析における酵素反応条
件は次のとおりである。 すなわち、反応PHは、本発明酵素が失活せ
ず、Ｌ−グルタミン酸に対して十分に作用する
PHであればよく、さらに示標物質の検出系がPH
に依存するものであればこのような条件も考慮
してPHを設定することが好ましい。通常、PH５
〜９の範囲で酵素反応は行われる。なお、試料
中に実質的に本発明によるＬ−グルタミン酸の
分析に影響を与える程度多量のＬ−アスパラギ
ン酸が含まれる場合、本発明酵素は至適PH付近
ではＬ−アスパラギン酸に対して多少作用する
ので、Ｌ−グルタミン酸に対しては示標物質の
検出に十分な程度作用し、Ｌ−アスパラギン酸
に対しては作用しない条件を選択して反応を行
うことによりこのような試料でもＬ−グルタミ
ン酸を特異的に分析することができる。このよ
うな条件としてはPH５〜６の反応条件が好適で
ある。 また、酵素反応のPHを好適な範囲に維持する
目的で、反応媒質として各種の緩衝液を使用す
ることが好ましい。緩衝液としては、前記のPH
範囲を維持でき、かつ本発明酵素を阻害しない
ものであり、示標物質の検出系に影響を与えな
いものであればよい。たとえば、りん酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、くえん
酸緩衝液、ベロナール緩衝液などが例示され
る。 反応温度は特に限定されない。本発明酵素の
至適温度、安定温度および使用する示標物質の
検出系などを勘案して当業者ならば容易に決定
することができる。 また、反応に際し、本発明酵素は可容性酵素
または、包括法（格子型、マイクロカプセル型
など）、担体結合法（共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着法など）、架橋法などの一般的
な方法によつて固定化された固定化酵素として
使用される。 固定化の態様は特に限定されない（「固定化
酵素」、千畑一郎編集、昭和50年３月20日、(株)
講談社発行、参照）。たとえば、固定化担体の
素材としてはセルロース（セロフアン）、アセ
チルセルロース、ニトロセルロース（コロジオ
ン）、カルボキシメチルセルロースなどセルロ
ース系誘導体、でん粉、デキストラン、アガロ
ース、キトサンなどの多糖類、コラーゲン、フ
イブロイン、ケラチン、アルブミンなどの蛋白
質、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリド
ン、ポリビニルアルコール、カラギーナン、ア
ルギン酸、キサンタンガム、寒天などの高分子
性ゲル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポ
リカーボネート、ナイロン、テフロン、、光硬
化樹脂吸着樹脂、イオン交換樹脂などの合成有
機高分子、ガラス、シリカ、セラミツク、アル
ミナなどの無機高分子などが使用され、膜状、
ゲル状、粒状、粉末状、マイクロカプセル状、
チユーブ状、、繊維状、ホロフアイバー状容器
状の形態の担体が使用される。固定化方法とし
ては、本発明酵素の高分子性ゲル等による包
括、多孔性もしくはイオン交換性物質等への吸
着、ペプチド法、アルキル化法、ジアゾ化法等
による担体への共有結合、グルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート等の多官
能性架橋剤による担体への架橋、もしくは酵素
相互の架橋などの適宜な方法を採用することが
できる。 固定化酵素としての使用態様は反応方式およ
び／または測定方式によつて異るが、たとえば
酵素電極として反応するときは膜状固定化酵素
として電極に密着して装着され、もしくは電極
表面に直接固定化されて使用され、リアクター
方式によつて反応するときは粒状固定化酵素カ
ラムによるカラム型リアクター、チユーブ内面
に酵素を固定化したチユーブ型リアクター、ま
たは測定容器の内壁に酵素を固定化して使用す
ることができる。 示標物質の検出系 本発明方法によつてＬ−グルタミン酸を分析
するための示標物質は、酵素反応によつて消費
される酸素ならびに生成する過酸化水素、アン
モニアおよびα−ケトグルタル酸である。 各示標物質の検出はそれぞれ任意の方法によ
つて行われ、本発明はその検出方法には限定さ
れない。すなわち、検出方法は通常公知の方法
が採用されるが、今後さらに開発されるべき
種々の方法も採用可能と考えられる。 なお、「示標物質の検出系」とは以下に示す
各示標物質の検出プロセスとその検出結果に基
いてＬ−グルタミン酸を定性的もしくは定量的
に分析するプロセスを含むものである。 以下、各示標物質の検出方法について説明す
る。 (1) 酸素の検出 消費された酸素を検出する方法としては、
ワールブルク検圧法（生化学実験講座５ 酵
素研究法（上）第35〜41頁、(株)東京化学同
人、1975年８月20日発行）と酸素電極法（電
極法による酸素測定、萩原文二編、(株)講談
社、1977年11月20日発行）が知られており、
本発明においてはいずれの方法を採用しても
よい。 酸素電極法に使用する電極としては作用電
極として白金、金、イリジウムなどの貴金属
電極を用い、対照電極として銀、銀／塩化銀
系、飽和カロメル、鉛、亜鉛、アルミニウム
などの電極を用い、これらの電極および水酸
化ナトリウムもしくは水酸化カリウム溶液な
どの電解液が被験液とテフロン膜、ポリプロ
ピレン膜、ポリエチレン膜のような酸素透過
性の電極膜でへだてられるように一体化され
た複合型電極（クラーク型電極などの隔膜酸
素電極）あるいは作用電極側と対照電極側が
塩橋で連結された分離型電極が使用される。
その方式はポーラログラフ方式であつても、
ガルバーニ電池方式であつてもよい。 酸素電極によつて酸素を測定するに際して
は、酸素反応液の溶存酸素を通常の方法で測
定すればよい。また、酸素電極と電極表面に
装着された本発明酵素からなる酵素電極、た
とえば固定化酵素もしくは半透性膜で覆われ
た可溶性酵素をクラーク型電極の電極膜に密
着して装着した酵素電極を使用して測定して
もよい。 (2) 過酸化水素の検出 生成する過酸化水素を検知する方法として
は、電気化学的分析法、分光学的分析法、け
い光分析法、化学発光分析法などが知られて
おり、本発明においてはいずれの方法を採用
してもよい。 電気化学的分析法としては、前記の酸素電
極と同様の構造の過酸化水素検知型電極を使
用し、電流法によつて測定する方法が一般的
である。たとえば、白金などの貴金属電極か
らなる作用電極と銀電極などからなる対照電
極と過酸化水素透過性膜からなるクラーク型
過酸化水素電極を使用する方法は本発明に好
適に用いられる。また、酸素電極と同様に酵
素電極として使用してもよい。また、上記の
方法の他、電気化学的分析法として本発明酵
素とともにパーオキシダーゼまたはモリブデ
ン酸塩などの過酸化水素分解用触媒を使用
し、過酸化水素とヨウ素イオンを反応させ、
電極表面におけるヨウ素イオンの活量減少を
ヨウ素イオン電極で測定する方法も使用でき
る。なお、この方法は本発明酵素とパーオキ
シダーゼもしくは触媒を含有する固定化酵素
をヨウ素イオン電極に装着した酵素電極とし
て好適に使用される。 分光学的分析法としては、被酸化性発色
剤をパーオキシダーゼもしくは同様の活性を
示す物質の存在下に過酸化水素と反応させ、
生成色度の吸光度測定を行うパーオキシダー
ゼ法、アルコールをカタラーゼの存在下に
過酸化水素と反応させ、生成するアルデヒド
を発色系に導き、生成色度の吸光度測定を行
うか、またはアルデヒド脱水素酵素をニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）
の共存下に作用させ還元型NAD（NADH）
の生成を測定するカタラーゼ法、ならびに
Ti（）／キシレノール・オレンジ系、Ti
（）／４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノ
ール系、Ｖ（）／キシレノール・オレンジ
系などを使用する化学的方法その他の方法
がある。 のパーオキシダーゼ法において呈色反応
は、発色剤単独の酸化反応または発色剤とカ
ツプラーとの酸化縮合反応である。前者の方
法では発色剤としてｏ−ジアニシジン、ｏ−
トリジン、ｏ−トルイジン、ｏ−アミノフエ
ノール、２・４−ジクロロインドフエノー
ル、ベンジジン、３・3′・５・5′−テトラア
ルキルベンジジン（３・3′・５・5′−テトラ
メチルベンジジンなど）、４−メトキシ−１
−ナフトール、２・2′−アジノージ（３−エ
チルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、
グアヤク脂（グアイヤコール）、Ｎ−（４−ア
ンチピリル）−アニリン誘導体（Ｎ−（4′−ア
ンチピリル）−２−カルボキシ−４−ヒドロ
キシアニリンなど）、ｐ−ヒドロキシフエニ
ル酢酸、Ｎ・Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレン
ジアミンなどを使用することができる。ま
た、後者の方法では発色剤として４−アミノ
アンチピリン、４−アミノアンチピリンアミ
ドなどの４−アミノアンチピリン誘導体、４
−アミノフエナゾン、４−アミノ−Ｎ・Ｎ−
ジメチルアニリン、ｐ−フエニレンジアミ
ン、４−アミノ−Ｎ・Ｎ−ジエチル−ｍ−ト
ルイジンなどのフエニレンジアミン誘導体、
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（MBTH）などが使用され、カツプラ
ーとしてはフエノール、カテコール、レゾル
シン、ヒドロキノン、クレゾール、グアイヤ
コール、ピロガロール、オルシノール、ｐ−
クロロフエノール、ｐ−ブロモフエノール、
２・４−ジクロロフエノール、２・４−ジブ
ロモフエノール、２・４・６−トリブロモフ
エノール、アニリン、Ｎ・Ｎ−ジメチルアニ
リン、Ｎ・Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−Ｎ−アセチ
レンジアミン、３−アセトアミノ−Ｎ・Ｎ−
ジエチルアニリン、Ｎ・Ｎ−ジエチル−ｍ−
トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジ
ン、Ｎ−グリシル−Ｎ−エチル−ｍ−トルイ
ジン、ｐ−ジメチルアミノフエノール、ｏ−
アミノフエノール、ｍ−アミノフエノール、
ｐ−メチルアミノフエノール、２−クロロ−
６−メチルフエノール、４−クロロ−３−メ
チルフエノール、３・５−ジクロロ−２−ヒ
ドロキシベンゼンスルホン酸などのフエノー
ル系、アニリン系もしくはトルイジン系化合
物、または４−ハロゲノ−１−ナフトール−
２−スルホン酸（４−クロロ−１−ナフトー
ル−２−スルホン酸など）、１−ナフトール
−２−スルホン酸、２−アミノ−５−ナフト
ール−７−スルホン酸、２・４−ジクロロ−
１−ナフトール、１−ヒドロキシ−２−ナフ
トイツク酸、４・５−ジヒドロキシナフタレ
ン−２・７−ジスルホン酸などのナフトール
系化合物、ナフチルアミンもしくはその誘導
体、ヒドロキシキノリン、アミノキノリンな
どのキノリン系化合物などを使用することが
できる。発色剤とカツプラーの好適な組合せ
例としては、４−アミノアンチピリンとフエ
ノール、Ｎ・Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ・Ｎ
−ジエチルアニリンもしくはＮ−ジエチル−
ｍ−トルイジンとの組合せ、または３−メチ
ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと
Ｎ・Ｎ−ジメチルアニリンとの組合せが挙げ
られる。本発明はこれらの発色剤または発色
剤とカツプラーの種類には限定されず、定量
的に酸化されて色調変化を示しうるものであ
る限り、いずれも使用可能である。また、パ
ーオキシダーゼは通常、西洋わさび（ホース
ラデイシユ）またはさつまいも由来の酸素が
使用されるが、パーオキシダーゼ様活性を示
すものであればよく、特に限定されない。さ
らに、パーオキシダーゼと同様の活性を示す
触媒であつてもよい。 のカタラーゼ法において発色剤を用いる
方法には通常アルコールとしてメタノールが
使用され、過酸化水素との反応で生成したホ
ルムアルデヒドを酸化剤（たとえば過ヨウ素
酸ナトリウム、フエリシアン化カリウム、塩
化第二鉄など）の存在下でヒドラゾン（たと
えば３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５
−メルカプト−１・２・４−トリアゾール
（AHMT）など）と反応させて発色させる方
法、ホルムアルデヒドをアセチルアセトンお
よびアンモニウム塩とハンツ反応で反応させ
て発色する方法などが採用される。また、グ
ルタチオンを使用し、過酸化水素−グルタチ
オンパーオキシダーゼにより酸化型グルタチ
オンに導き、これをNADPHの存在下にグル
タチオンレダクターゼにより還元し、
NADPHの酸化量を測定する方法（アナリテ
イカル・バイオケミストリー（Anal.
Biochem.）76、184−191（1976））、銅イオ
ン−ヒスタミン系でインジゴカルミンを酸化
脱色、その色度の減量から定量する方法など
もある。 けい光分析法としては、ホモバニリン酸を
パーオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反
応させてけい光性の２・2′−ジヒドロキシ−
３・3′−ジメトキシビフエニル−５・5′−ジ
酢酸に変換し、けい光強度を測定する方法が
挙げられる。同様の方法で、ホモバニリン酸
の代りにｐ−ヒドロキシフエニル酢酸、ジア
セチルフルオレスシン誘導体（ジアセチルフ
ルオレスシン、ジアセチルジクロロフルオレ
スシンなど）などを発けい光試薬として用い
てもよい。また、スコポレチン、３・５−ジ
アセチル−１・２−ジヒドロルチジンなどの
けい光性物質を過酸化水素／パーオキシダー
ゼにより酸化して非けい光性物質に変換し、
けい光の減少を測定する方法もある。 化学発光分析法としては、ルミノールをパ
ーオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応
させて酸化し、発光量を測定する方法（特開
昭57−71399号、特開昭57−71400号参照）が
ある。同様の方法でルミノールの代りにイソ
ルミノール、ピロガロール、ビス（２・４・
６−トリクロロフエニル）オキザレートなど
を使用してもよく、パーオキシダーゼの代り
にヘモグロビン、ヘマチン、ヘミン、シアン
化鉄（）カリウム、塩化コバルトなどを触
媒として使用してもよい。 (3) アンモニアの検出 アンモニアはミクロケルダール法、ネスラ
ー法、インドフエノール法、ニンヒドリン
法、フエノサフラニン法などの方法によつて
分析できる。また、カチオン選択性電極によ
つてアンモニウムイオンを分析する方法また
は疎水性のガス透過性膜を装着したガラス電
極からなるアンモニアガス電極によつてアン
モニアガスとして分析する方法など、電気化
学的分析法によつて分析してもよい。さら
に、これらの電極と本発明酵素を組合せた酵
素電極によつてアンモニアを検出し、Ｌ−グ
ルタミン酸を分析してもよい。 (4) α−ケトグルタル酸の検出 α−ケトグルタル酸は、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）
と反応させて出成物の吸光度を測定する方
法、２・４−ジニトロフエニルヒドラジンと
反応させ、生成物の吸光度を測定する方法、
ｏ−フエニレンジアミンと反応させて生成物
の吸光度を測定する方法、その他公知の方法
を使用することができる。 分析用試薬 本発明の分析用試薬は少なくとも本発明酵
素を含有する試薬である。すなわち、その形
態は限定されず、溶液状、凍結状、粉末状も
しくは顆粒状の可溶性酵素であつてもよく、
さらに、前記のごとく、各種の方法によつて
膜状、ゲル状、粒状、粉末状、チツプ状、マ
イクロカプセル状、チユーブ状、繊維状、ホ
ロフアイバー状もしくは容器状の担体に固定
化された固定化酵素であつてもよい。また、
本発明酵素の他に液状もしくは粉末状のりん
酸緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤、酢酸緩衝
剤、くえん酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤など
の緩衝剤、塩類（塩化ナトリウムなど）、糖
類（シヨ糖など）、多価アルコール類（グリ
セロール、プロピレングリコール、ソルビト
ールなど）、補酵素類（FADなど）、その他
適宜の安定化剤、界面活性剤などを添付して
もよい。 Ｌ−グルタミン酸の分析に際し、上記分析
用試薬は、前記各種の検出法に応じて、必要
な酵素活性が得られるように使用される。ま
た、予め各検出法に応じた量を試薬ビン、ア
ンプルなどの容器に封入してもよい。 分析用キツト 分析用キツトは前記の本発明酵素を含有す
る分析用試薬と本発明酵素による反応を検出
する手段である検出用試薬から構成される。
検出用試薬とは前記した示標物質の検出に必
要な試薬である。すなわち、過酸化水素を示
標物質とする場合、検出用試薬としては、た
とえばパーオキシダーゼもしくはパーオキシ
ダーゼ様活性物と発色剤もしくは発色剤およ
びカツプラーとの組合せ、カタラーゼもしく
はカタラーゼ様活性物とアルコールと発色系
に必要な試薬もしくは共役酵素系に必要な試
薬との組合せ、パーオキシダーゼもしくはパ
ーオキシダーゼ様活性物と発けい光剤との組
合せ、パーオキシダーゼもしくはパーオキシ
ダーゼ様活性物と発光試薬との組合せなどが
例示される。これらの試薬の具体例は前記
「過酸化水素の検出」の記載より明らかであ
る。 また、アンモニアまたはα−ケトグルタル
酸を示標物質とする場合も同様に必要な検出
試薬を本発明酵素を含有する分析用試薬と組
合せ、分析用キツトとして構成することもで
きる。なお、本発明酵素を含有する分析用試
薬と前記の検出試薬は全てを混合して単一の
試薬としてもよく、相互に干渉する成分が存
在する場合には各成分を適宜な組合せとなる
ように分割してもよい。また、これらは溶液
状もしくは粉末状試薬として調製してもよ
く、さらにこれらを濾紙もしくはフイルムな
どの適当な支持体に含有させ、試験紙もしく
は分析用フイルムとして調製してもよい。 なお、本発明の分析用キツトには上記の組
合せ試薬の他、Ｌ−グルタミン酸の一定量を
含有する標準試薬を添付してもよい。 本発明の分析用キツトの好適な一例として
は過酸化水素の分光学的な検出によつてＬ−
グルタミン酸を分析するキツトが挙げられ
る。たとえば、パーオキシダーゼ法によるキ
ツトの場合、通常、本発明酵素0.02単位
（Ｕ）以上／テスト、パーオキシダーゼ１〜
10U／テスト、発色剤として４−アミノアン
チピリンとフエノールもしくはＮ・Ｎ−ジメ
チルアニリンとを使用する場合、これらの試
薬は生成する過酸化水素に対して１モル以
上、好ましくは２モル以上使用される。 (4) 具体例 以下、本発明の分析法、分析用試薬および分
析用キツトの具体例一例を実施例として示す。
また、本発明酵素の製造法を参考例として示
す。ただし、本発明はこれらの実施例および参
考例に限定されるものではない。 実施例 １ (1) キツトの調製 試薬Ａ：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１mg
（10U／mg）、パーオキシダーゼ５mg（100U／
mg；西洋わさび由来、東洋紡績(株)製）および４
−アミノアンチピリン40mgが１本の試薬ビンに
含まれるように0.2Mりん酸カリウム緩衝液
（PH6.5）２mlに溶解し、常法により凍結乾燥し
た。 試薬Ｂ：フエノール40mgを0.1Mりん酸緩
衝液（PH6.5）に溶解し、100mlとして試薬ビン
に入れ、またはジメチルアニリン100mgを
0.1Mりん酸カリウム緩衝液（PH6.5）に溶解
し、100mlとして試薬ビンに入れた。 (2) 操作法 試験管にＬ−グルタミン酸ナトリウムの標準
液および水をそれぞれ0.1ml分注し、上記試薬
Ａの凍結乾燥物を試薬Ｂのまたはいずれか
の溶液100mlで溶解したものを上記各試験管に
それぞれ0.9ml添加し、37℃で好気的に振盪し
ながら20分間インキユベートした。水での盲検
を対照として上記を使用する場合は500nｍ
の、上記を使用する場合は565nｍの吸光度
を測定した。これらの検量線を第８図（試薬Ｂ
がの場合）および第９図（試薬Ｂがの場
合）に示す。 実施例 ２ (1) 試薬の調製 発色試薬：フエノール20mg、４−アミノアン
チピリン20mgおよび西洋わさびパーオキシダー
ゼ３mg（100U／mg）を50mlの0.2Mりん酸カリ
ウム緩衝液（PH7.4）に容解した。 Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ：精製酵素
300μｇ（55U／mg）を30mlの0.02Mりん酸カリ
ウム緩衝液（PH7.4）に溶解した（0.55U／
ml）。 (2) 操作法 試験管に発色試薬0.8mlを分注し、Ｌ−グル
タミン酸オキシダーゼ溶液0.1mlを加え、37℃
恒温槽に入れて５分間加温した。標準Ｌ−グル
タミン酸ナトリウム溶液（０〜２μmol／ml）
または試料溶液（各種製品醤油を水で150倍に
稀釈した溶液）0.1mlを加えてよく攪拌し、37
℃で好気的に振盪しながら20分間インキユベー
トした。盲検を対照として500nｍの吸光度を
測定し、第１０図に示す検量線を作成した。こ
の検量線から求めた前記試料中のＬ−グルタミ
ン酸定量値をＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素を用
いた従来法（テクニコン・オートアナライザー
によつてフエノールフタレインの減色度を測定
する方法）による同試料中のＬ−グルタミン酸
定量値と比較して第４表（実施例３の後に示
す。）に示した。なお、相関係数γ＝0.997、回
帰式ｙ＝1.005x−0.575であつた。 実施例 ３ 試験管に0.1Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）
0.7ml、カタラーゼ（1000U／ml；牛肝臓由来、
シグマ・ケミカル社製）溶液0.1mlおよびＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（0.6U／ml）溶液0.1ml
を取り、37℃で５分間加温した。これに標準Ｌ−
グルタミン酸ナトリウム溶液（０〜５μmol／
ml）または試料溶液（実施例２と同一の製品醤油
稀釈液）0.1mlを加えて反応を開始させた。37
℃、20分間好気的に振盪しながらインキユベート
した後、25％トリクロロ酢酸0.1mlを加えて反応
を停止させた。反応停止液に1M酢酸緩衝液（PH
5.0）1.9mlと0.1％３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン塩酸塩溶液0.8mlを加え、攪拌
後、50℃で30分間インキユベートした。室温まで
冷却後、盲検を対照として316nｍの吸光度を測
定し、第１１図に示す検量線を作成した。この検
量線から求めた試料中のＬ−グルタミン酸定量値
をＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素を用いた従来法に
よる試料溶液中のＬ−グルタミン酸定量値と比較
し、第４図に示した。なお、相関係数γ＝
0.996、回帰式ｙ＝1.026x−3.122であつた。

【表】 実施例 ４ (1) 試薬の調製 発色試薬：フエノール30mg、４−アミノアン
チピリン30mg、西洋わさびパーオキシダーゼ４
mg（100U／mg）およびＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ１mg（10U／mg）を0.2Mりん酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）50mlに溶解した。 基質溶液Ａ：Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム
200mgおよびα−ケトグルタル酸15mgを0.1Mり
ん酸カリウム緩衝液（PH7.0）10mlに溶解し
た。 基質溶液Ｂ：Ｌ−アラニン140mgおよびα−
ケトグルタル酸15mgを0.1Mりん酸カリウム緩
衝液（PH7.0）10mlに溶解した。 (2) 操作法 グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミ
ナーゼ（GOT）の活性測定 試験管に基質溶液A0.2mlを取り、標準酵
素液（ベーリンガー山之内(株)製、380U／
mg）0.1mlを加え、37℃、30分間インキユベ
ートした後、25％トリクロロ酢酸0.1mlを加
えて反応を停止させた。反応停止液に1Mり
ん酸カリウム緩衝液（PH6.5）0.1mlおよびＬ
−グルタミン酸オキシダーゼを含む発色試薬
0.5mlを加えて37℃で20分間インキユベート
した。盲検を対照として500nｍの吸光度を
測定し、第１２図に示す検量線を作成した。 グルタミン酸・ピルビン酸トランスアミナ
ーゼ（GOT）の活性測定 試験管に基質溶液B0.2mlを取り、標準酵素
液（ベーリンガー山之内(株)製、140U／mg）
0.1mlを加え、37℃、30分間インキユベート
した後、25％トリクロロ酢酸0.1mlを加えて
反応を停止させた。反応停止液中のＬ−グル
タミン酸含有をと同様に測定し、第１３図
に示す検量線を作成した。 実施例 ５ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（0.5U／ml）
を含む0.1M酢酸緩衝液（PH5.5）１mlを30℃の恒
温水を循環しているポーラログラフ方式の酸素電
極のキユベツトへ密封し、50μのＬ−グルタミ
ン酸標準液（０〜２μmol／ml）を注入して酸素
消費量を測定し、第１４図に示す検量線を作成し
た。 この検量線から求めた試料（各種製品醤油）中
のＬ−グルタミン酸定量値をＬ−グルタミン酸脱
炭酸酵素を用いた従来法による試料中のＬ−グル
タミン酸定量値と比較し、第５表に示した。な
お、相関係数γ＝0.953、回帰式ｙ＝0.930X＋
6.11であつた。

【表】

【表】 実施例 ６ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（12.5U／ml）
溶液0.5mlを多孔性ニトロセルロース膜（東洋科
学産業(株)製、TM−５；孔径0.1μｍ、直径25mm、
膜厚140μｍ）上に滴下・吸引することにより吸
着固定し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ膜調製
物を得た。 上記固定化酵素膜を円形に裁断（直径5.0mm）
した後、隔膜酸素電極（(株)石川製作所製、Ｕ−２
型）のガス透過性膜（テフロン膜、膜厚10μｍ）
上に装着し、さらに固定化酵素膜にセルロース透
析膜を装着してＬ−グルタミン酸センサーを製作
した。 同センサーを用いて既知濃度（0.05〜1.0μ
mol／ml）のＬ−グルタミン酸ナトリウム標準溶
液に対する電流減少値を測定し、第１５図に示す
検量線を作成した。 実施例 ７ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（448U／ml）
溶液0.1mlを30mm×30mm四方のセロフアン膜（膜
厚30μｍ）に滴下、乾固し、これに2.5％グルタ
ルアルデヒド溶液0.1mlを浸潤させ、４℃で一晩
乾燥し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化セ
ロフアン膜を得た。 上記固定化酵素膜を実施例６と同じ方法で隔膜
酸素電極上に装着し、Ｌ−グルタミン酸センサー
を製作した。このセンサーを用いて実施例６と同
様にＬ−グルタミン酸標準液に対する電流減少値
を測定したところ0.05〜1.0ｍＭの濃度範囲で直
線関係を得た。 上記センサーを使用して各PHのＬ−グルタミン
酸ナトリウム溶液（0.8ｍＭ）に対する応答性を
測定（30℃）し、結果を第１６図に示した。第１
６図から明らかなように同センサーの至適PHはPH
6.5〜9.5付近であつた。 また、上記センサーの各種アミノ酸に対する応
答性を測定し、結果を第６表に示した。なお、Ｌ
−グルタミン酸以外のアミノ酸は2.0ｍＭ濃度の
溶液を使用し、Ｌ−グルタミン酸は0.4ｍＭ濃度
の溶液を使用して測定し、測定値を換算して相対
応答値を算出した。反応はPH5.5（0.1M酢酸−酢
酸ナトリウム緩衝液）で行つた。

【表】 なお、上記センサーを３℃、0.02Mりん酸緩衝
液中に保存し、各経過日において上記と同様にＬ
−グルタミン酸ナトリウム溶液に対する応答性を
測定したところ、１ケ月間にわたり当初の応答性
を保持していた。したがつて、上記固定化酵素膜
は３℃において少なくとも１ケ月間は安定であ
る。 実施例 ８ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ2UおよびＬ−
グルタミン20μmolを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
5.5）１mlを30℃の恒温水を循環しているクラー
ク型酸素電極のキユベツトへ密封し、20μの大
腸菌由来のグルタミナーゼ標準液（４ｍＵ〜20ｍ
Ｕ）を注入して酸素消費速度を測定し、第１７図
に示す検量線を作成した。 同様に醤油麹懸濁液（醤油麹10ｇを50mlの
0.1Mりん酸緩衝液（PH7.0）で1000rpm、５分間
ホモジナイズした後、同緩衝液を加えて300mlと
した液）50μを注入して酸素消費速度を測定
し、醤油麹１ｇあたりのグルタミナーゼ活性を求
めたところ3.7Uであつた。 参考例 500ml容三角フラスコにフスマ20ｇおよび水16
mlを入れ、120℃、30分間加圧滅菌して調製した
フスマ培地にストレプトマイセス・エスピー Ｘ
−119−６（微工研菌第6560号）を植菌し、28
℃、７日間培養して種菌を調製した。 ５容三角フラスコ25本にそれぞれフスマ200
ｇおよび水160mlを入れ、120℃、30分間加圧滅菌
した後、前記の種菌を無菌的に接種し、28℃で２
日間培養後、温度を20℃に下げてさらに２週間培
養した。 得られた培養物を37.5の水に１時間浸漬した
後、濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵
素液約34を得た。この粗酵素液に硫酸アンモニ
ウムを50％飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採
取して0.02M酢酸緩衝液（PH5.5）3.9に溶解
し、57℃で30分間加熱した。この熱処理した酵素
液を５℃以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエ
タノールを加え、生成した沈澱を遠沈採取して
0.02Mりん酸緩衝液（PH7.4）２に溶解し、同
一緩衝液で一夜透析した。透析中に生成した沈澱
を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で平衡化した
DEAE（ジエチルアミノエチル）−セルロースカ
ラム（3.5×50cm）に通し、吸着した酵素を食塩
0.35Mを含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出
された活性区分を集め、0.05Mの食塩を含む
0.05M酢酸緩衝液（PH5.5）で一夜透析した。こ
の透析内液を同一緩衝液で平衡化したDEAE−セ
フアロースCL−6B（フアルマシア・フアインケ
ミカルズ社製）カラム（２×10cm）に通し、吸着
した酵素を食塩0.05〜0.75Mのリニアグラジエン
ト法で溶出した。容出された活性区分を集め、透
析濃縮後、セフアデツクスＧ−200（フアルマシ
ア・フアインケミカルズ社製）カラム（2.5×120
cm）を用いてゲル濾過を行ない、活性区分を集め
て濃縮後、0.02Mりん酸カリウム緩衝液（PH
7.4）で透析した。この透析内液を遠沈し、上清
液を精密濾過した後、凍結乾燥してＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼの精製標品（比活性55.1U／mg
蛋白、収率18.4％）30mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点
線）の作用PH範囲を示す。第２図は本発明酵素
（実線）と公知酵素（点線）の安定PH範囲（37
℃、60分間保持）を示す。第３図は本発明酵素の
安定PH範囲（45℃、15分間保持）を示す。第４図
は本発明酵素の安定PH範囲（60℃、15分間）を示
す。第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。
第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線、
〇………〇）の安定温度範囲を示す。第６図にお
いて▲−▲はPH5.5、●−●はPH7.5、■−■はPH
9.5の各条件における温度安定曲線を示す。第７
図は本発明酵素の紫外線吸収スペクトルを示す。
第８図および第９図は実施例１のキツトにおい
て、試薬Ｂとしてフエノール溶液またはジメチル
アニリン溶液を使つた場合のＬ−グルタミン酸の
検量線をそれぞれ示すものである。第１０図は実
施例２におけるＬ−グルタミン酸の検量線を示
す。第１１図は実施例３におけるＬ−グルタミン
酸の検量線を示す。第１２図は実施例４における
GOT活性の検量線を示す。第１３図は実施例４
におけるGPT活性の検量線を示す。第１４図は
実施例５におけるＬ−グルタミン酸の検量線を示
す。第１５図は実施例６の酵素電極を使用して得
られたＬ−グルタミン酸の検量線を示す。第１６
図は実施例７の酵素電極の各PHにおける応答性を
示すものである。第１７図は実施例８におけるグ
ルタミナーゼ活性の検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分析試料中のＬ−グルタミン酸に対し、下記
   の特性を有するＬ−グルタミン酸オキシダーゼを
   酸素と水の存在下で作用させ、反応にともなう酸
   素の消費または過酸化水素、アンモニアもしくは
   α−ケトグルタル酸の生成を検出することを特徴
   とするＬ−グルタミン酸の分析法。 イ 基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性がきわ
   めて高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸に
   は実質的に作用しない。 ロ 至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。 ハ 安定PH範囲 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の
   範囲において安定である。 ニ 熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件においては、65℃
   まで安定であり、85℃で約50％の残存活性を示
   し、PH7.5、15分間保持の条件では、50℃まで
   安定であり、75℃で約60％の残存活性を示す。 ホ 分子量 ゲル濾過法（セフアデツクスＧ−200（フア
   ルマシア・フアインケミカルズ社製））で測定
   した分子量が、135000±10000である。 ２ Ｌ−グルタミン酸とともにＬ−アスパラギン
   酸を含有する分析試料中のＬ−グルタミン酸をＬ
   −グルタミン酸オキシダーゼを用いて分析するに
   際し、PH５〜６の条件下にて分析する特許請求の
   範囲第１項記載の分析法。 ３ 下記の特性を有するＬ−グルタミン酸オキシ
   ダーゼを含有してなるＬ−グルタミン酸の分析用
   試薬。 イ 基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性がきわ
   めて高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸に
   は実質的に作用しない。 ロ 至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。 ハ 安定PH範囲 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の
   範囲において安定である。 ニ 熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件においては、65℃
   まで安定であり、85℃で約50％の残存活性を示
   し、PH7.5、15分間保持の条件では、50℃まで
   安定であり、75℃で約60％の残存活性を示す。 ホ 分子量 ゲル濾過法（セフアデツクスＧ−200（フア
   ルマシア・フアインケミカルズ社製））で測定
   した分子量が、135000±10000である。 ４ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼとともに該酵
   素の反応に適する緩衝剤を含有してなる特許請求
   の範囲第３項記載の分析用試薬。 ５ Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが担体に固定
   化された固定化酵素である特許請求の範囲第３ま
   たは４項記載の分析用試薬。 ６ 下記の特性を有するＬ−グルタミン酸オキシ
   ダーゼと該酵素による反応の検出試薬とからなる
   Ｌ−グルタミン酸の分析用キツト。 イ 基質特異性 Ｌ−グルタミン酸に対する基質特異性がきわ
   めて高く、Ｌ−グルタミン酸以外のアミノ酸に
   は実質的に作用しない。 ロ 至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。 ハ 安定PH範囲 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の
   範囲において安定である。 ニ 熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件においては、65℃
   まで安定であり、85℃で約50％の残存活性を示
   し、PH7.5、15分間保持の条件では、50℃まで
   安定であり、75℃で約60％の残存活性を示す。 ホ 分子量 ゲル濾過法（セフアデツクスＧ−200（フア
   ルマシア・フアインケミカルズ社製））で測定
   した分子量が、135000±10000である。 ７ 反応の検出試薬が過酸化水素、アンモニアま
   たはα−ケトグルタル酸を検出するための試薬で
   ある特許請求の範囲第６項記載の分析用キツト。 ８ 反応の検出試薬が単独の発色剤または発色剤
   とカツプラーとの組合せ試薬である特許請求の範
   囲第６または７項記載の分析用キツト。