JPS5840092A - ムコン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アジピン酸は化学工業における、特にポリマー合成のコ
モノマーとして消費するための、重要な必需品である。

アジピン酸はシクロヘキサンまたはシクロヘキサノール
の酸化によつて得ることができる。別の有望な方法はム
コン酸（ジオシフィン性不飽和アジピン酸誘導体）の水
添による方法であり、次式で示される。

ムコン酸の将来性のある便利な資源は種々の炭化水素質
の微生物学的酸化によるものである。炭化水素の微生物
学的酸化はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
，９（５），３８３（１９６１）および“Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｋｉｇｙ”，２７，４６９−
５４６（１９６５）〔Ｉｎｔｅｒｅｓｃｉｅｎ　ｃｅ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊行〕に論説されている。

米国特許第３，３８３，２８９号には、１〜４個のメチ
ル基をもち少なくとも２個の連続した非置換環状炭素原
子をもつＣ７〜Ｃ１０メチルベンゼン類を栄養媒質の存
在下および■酵条件下にノカルデイアのオルソジヒドロ
シキル化および非脱カルボキシル化の菌株の作用に付す
ることを包含するメチル置換ムコン酸および／または２
，３−ジヒドロキシ安息香酸の製造法が記載されている
。Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４１（１６），３７７６（
１９６６）には、プソイドモナスユピテイダによるカテ
コールおよびプリトカテチユエートからβ−ケトアジペ
ートへの転化が報告されている。カテコールの転化はム
コン酸中同体を経由するオルソ経路によつて次式の如く
進行する。

上記の反応式中に示す化学構造はそれぞれカテコール、
ムコン酸、ムコノラクトン、β−ケトアジペートエノー
ルラクトンおよびβ−ケトアジペートである。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｒｉｏｌｏｇｙ，
１３４，７５６（１９７８）には、土壌バクテリア中の
トルエンおよびキシレンの代謝をコード化するプラスミ
ドの遍在の研究が報告されている。単離したプソイドモ
ナスピユテイダの突然変異体菌株の１つは、β−ケトア
ジペートからバイオマスおよび二酸化炭素へのオルソ経
路によりベンジルアルコール、ベンズアルデヒド、安息
香酸およびカテコールを経てトルエンを代謝する能力を
もつていた。

オルソ経路によるトルエン代謝機能をもつ酵素には、ト
ルエンモノ−オキシターゼ、ベンジルアルコールデハイ
ドロジエナーゼ、ベンズアルデヒドデハイドロジエナー
ゼ、ベンゾエートオキシジエナーゼ、ジヒドロジヒドロ
キシベンゾエートデハイドロジエナーゼ、カテコール１
，２−オキシジエナーゼおよびムコネートラクトン化酵
素が包含されていた。次いで生成したβ−ケトアジペー
トは更にバイオマスおよび二酸化炭素に同化された。オ
ルソ経路を経てトルエンを代謝したこの突然変異体菌株
はムコン酸を蓄積しなかつた。このムコン酸代謝物はム
コネートラクトン化酵素の存在で更に変化したためであ
る。

周知の天然産微生物（たとえばプソイドモナスピユテイ
ダ）のどれ１つとして芳香族炭化水素気質たとえばトル
エンをムコン産およびβ−ケトアジペートを経るオルソ
経路によつて代謝することは知られていない。野生の菌
株はムコン酸中間体の代りに２−ヒドロキシムコンセミ
アルデヒドを経るメタ経路によつて芳香族炭化水素気質
を代謝する。

従つて、ムコン酸の便利な資源としてのトルエンの微生
物学的酸化の可能性は（１）オルソ経路によつてトルエ
ンを代謝し且つ（２）更なる同化なしにムコン酸の蓄積
を許す、突然変異体菌株の微生物の作成を必要とする。

それ故、本発明の目的は微生物学的酸化によるトルエン
からムコン酸への効率的な転化のための方法を提供する
ことにある。

本発明の別の目的はオルソ経路によつてトルエンを代謝
する新規な突然変異体菌株の微生物の作成のための方法
を提供することにある。

更に本発明の目的は、トルエンをムコン酸に定量的に代
謝し且つ転化用媒質の１ｌ当り１ｇ以上のムコン酸を蓄
積するプソイドモナスピユテイダバイオタイプＡ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ　Ｐｕｔｉｄａ　Ｂｉｏｔｙｐｅ
　Ａ）の新菌株を提供することにある。

本発明のそのほかの目的および利点は以下の記述から明
らかであろう。

本発明の１つまたはそれ以上の目的は新規な微生物菌株
を作成するための方法を提供することによつて達成され
る。その方法は次の諸工程からなる。

（１）カテコールからムコン酸へのオルソ経路によつて
トルエンを代謝し、えられたムコン酸をひきつづいてβ
−ケトアジペートを経てバイオマスおよび二酸化炭素に
代謝するところの菌株Ａ１を得るために微生物の種を選
択的に培養する；（２）唯一の炭素源としてのトルエン
上での急速な生育のために菌株Ａ−１を連続的に且つ選
択的に培養して菌株Ａ−２を得る； （３）唯一の炭素源としてベンゾエートを含み且つ生育
する細胞のみを殺す抗生物質を含む媒質中での選択的富
化サイクルにおいて菌株Ａ−２を培養する； （４）菌株Ａ−２の細胞を回収し、この細胞を非選択的
炭素源を含む媒質中で希釈および培養する；（５）限定
量の非選択的炭素源および過剰のベンゾエートを含む栄
養媒質上を菌株Ａ２でおおう； （６）単一の小さい群生から細胞を単離し、この単利細
胞を培養し、そしてトルエンをムコン酸に転化し且つ活
性のムコネートラクトン化酵素を欠く菌株Ａ３を選択す
る。

出発微生物はトルエン上で生育することができ且つカテ
コール１，２−オキシジエナーゼを所有する任意の微生
物、たとえばプソイドモナド、でありうる。天然産の種
々の微生物はこれらの特徴をもつており、これらにはプ
ソイドモナスピユテイダ種、プソイドモナスアエルギノ
サ種、プソイドモナスフルオレツセンス種の若干のメン
バー；およびアゾトバクター属およびナカルデイア属の
若干のメンバー；ならびに多数の分類されていない菌類
（カビ類およびイースト類）が包含される。

別の態様において、本発明は生育媒質中の低水準のムコ
ン酸の存在下で抑制されない活性をもつカテコール１，
２−オキシジエナーゼを所有する作成された微生物の菌
種を提供する。

本発明により作成される好ましい微生物は（１）ジヒド
ロヒドロキシベンゾエートデハイドロジエナーゼ酵素お
よび（２）カテコール１，２−オキシジエナーゼ酵素を
含み、育成媒質中で約１ｇ／ｌ以上のムコン酸の存在で
抑制されない活性をもつ新規な酵素の組合せを所有する
ものである。

本発明の微生物の実例はそれぞれが次の特性をもつ螢光
性プソイドモナスの作成された菌種である。

（ａ）生育媒質中の低水準のムコン酸の存在下で抑制さ
れない活性をもつカテコール１，２−オキシジエナーゼ
酵素を所有する； （ｂ）カテコール２，３−オキシジエナーゼ酵素を実質
的に欠く； （ｃ）ムコネートラクトン化の作用をもつ酵素を欠く；
（ｄ）細胞が桿状で、激しい運動性があり、且つ極部的
に鞭毛をもつ；そして （ｅ）細胞がｐ−ヒドロキシベンゾエート上でよく生育
する。

本発明により作成され且つ上記の特性をもつプソイドモ
ナスピユテイダバイオタイプＡの新規な菌株はＡｍｅｒ
ｉｃａｌ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎに寄託されＡＴＣＣＮｏ．３１，９１６と命名さ
れた。

更に別の態様において、本発明は螢光性プソイドモナス
微生物の新菌株、たとえばＡＴＣＣＮｏ．３１，９１６
と命名されたものに対応する菌株を含む緩衝水性媒質に
トルエンを供給することを特徴とするムコン酸の製造法
を提供する。

トルエンの転化速度は代表的には、細胞の乾燥重量１ｇ
当り毎時３０ｍｇのムコン産が生成される速度である。

トルエンの転化は１ｌ当り５０ｇの乾燥重量の細胞濃度
で容易に進行し、１ｌ当り毎時１．５ｇのムコン酸製造
速度がえられえる。

最適条件下では、ムコン酸の蓄積量の限界は生育媒質１
ｌ当り約５０ｇのムコン酸にまで近づき得る。この微生
物学的酸化法は通常３１℃までの周囲温度で行なわれる
。

オルソ経路（β−ケトアジペート経路またはカテコール
１，２−オキシジエナーゼ経路としても知られる）はプ
ソイドモナスピユテイダ、アシネトバクターカルコアセ
テイカス、およびアルカリジエニーズユートロフアスに
おいて研究された。これらの微生物は天然に遍在するも
のであり、ベンゾエート含有媒質上での富化培養によつ
て容易に単離される。ベンゾエート代謝の初期反応は細
胞中への分子の移動であり、ジヒドロジヒドロキシベン
ゾエートを経てカテコールに至るベンゾエートの転化が
これにつづく。カテコールをβ−ケトアジペートに転化
する一連の酵素はオルソ経路プロパーを構成する。これ
らの酵素の第１のもの、すなわちカテコール１，２−オ
キシジエナーゼは結晶にまで構成され、よく特徴づけら
れる。上述のようにカテコールからムコン酸への転化の
役割を果すのはこの酵素である。

Ｎａｔｕｒｅ　１８８，５６０（１９６０）には、メタ
経路（２，３−オキシジエナーゼ経路としても知られて
いる）を使用してカテコールおよびその前駆体を二酸化
炭素および細胞炭素にまで代謝することが報告されてい
る。カテコールの後の第１の中間体は強い黄色の２−ヒ
ドロキシムコンセミアルデヒドである。この経路中での
速度限定反応はこのセミアルデヒド形成後のある点で起
るので、この化合物は誘起細胞がカテコールに露出され
るとき媒質中に排せつされる。この現象はオルソ経路ま
たはメタ経路のいずれかを使用する細胞間の区別の根拠
として役立つ。

オルソ経路を経てベンゾエートを消費して生育する微生
物は、メタ経路を経てベンゾエート上に生育する微生物
よりもかなり高い速度で、すなわちタブリング当り５０
分対２１０分で、生育する。それ故、オルソ経路を経て
トルエンを代謝しうる微生物は決定的な選択的利用をも
つものと思われる。

本発明のプソイドモナスピユテイダバイオタイプＡの新
規な菌株は、トルエンを微生物学的に転化してムコン酸
を商業的に実施可能な速度および濃度で製造および蓄積
する点でユニークな特性をもつものである。

第１に、母体微生物は迅速な速度で、たとえばトルエン
上で約１．５時間の生育タブリング時間で、生育するこ
とができる。

第２に、この微生物はカテコール１，２−オキシジエナ
ーゼの作用によるカテコール開裂を経るオルソ経路によ
つてトルエンを代謝する。付随的に活性化テコール２，
３−オキシジエナーゼがこの微生物の培養中に誘起され
ることはない。

第３に、カテコール１，２−オキシジエナーゼ活性は低
水準のムコン酸の存在、たとえば生育媒質中１ｇ／ｌ以
下の水準のムコン酸の存在、によつて阻止または抑制さ
れることはない。これは約１ｇ／ｌより高い水準でのム
コン酸の蓄積を可能にする。

第４に、オルソ経路系の転化反応はカテコールからムコ
ン酸が生育した後に阻止される。この微生物は活性なム
コネートラクタン下酵素の存在を欠く。それ故、ムコン
酸は生成したままの状態で蓄積することができ、これは
水性栄養媒質中のムコン酸の水準がカテコール１，２−
オキシジエナーゼ酵素の活性を阻止するまで、すなわち
ムコン酸が生育媒質１ｌ当り約５０ｇの水準にまで蓄積
されるまで、つづく。芳香族炭化水素からこのような水
準にまでムコン酸を製造し且つ蓄積する能力を示すこと
の知られている微生物は文献には報告されていない。

本発明に従い、トルエンをムコン酸に迅速に転化する微
生物菌株を単離する方法が開発された。第１工程はオル
ソ経路、すなわちムコン酸を中間体とする経路、を経て
トルエン上で生育するもとの螢光性プソイドモナド型の
突然変異体を単離することである。

もとの単離体はまずメタ−トルイル酸上で生育させる成
分とする。次いでこの第１の菌株をメタ経路を消去して
トルエン上で生育する能力を保持した細胞をえらぶよう
に設計されたサイクルにかける。細胞をまず安息香酸上
の低希釈から生育させる。これらの細胞を唯一の炭素源
としてメタ−トルイル酸を含む媒質に移す。１時間後に
、抗生物質であるペニシリンおよびＤ−シクロセリンを
それぞれ１２ｍｇ／ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌの濃度
で加え、培養を４〜６時間つづける。培養後に、細胞を
洗つてトルエンを唯一の炭素源をして含む媒質に５０：
１の希釈率で加える。やく３６時間たつと、目にみえる
生育が起る。

ベンゾエートを含むカンテン上に接種すると小区画と大
区画との混合物が生成する。大区画の実質的にすべては
オルソ経路を経てトルエンを代謝し、中間体としてムコ
ン酸を生成する。オルソ経路を経てトルエン上で生育す
ることによつて特徴づけられるこの第２の菌株は活性な
カテコール２，３−オキシジエナーゼを所有しない。そ
のトルエン上のタブリング時間は約２１／２時間である
。

この第２の菌株を唯一の炭素源としてのトルエン上で連
続的に培養することによつて迅速生育率の選択にかける
。培養が約４時間のタブリング時間においてひとたび安
定化したならば、希釈率は増大して約３時間のタブリン
グ時間を必要とする。細胞が２１／２時間のタブリング
時間で生育するまでのこの方法をくりかえす。この第３
の菌株はそれが少なくともカテコール１，２−オキシジ
エナーゼを成分としてもつ点で母体微生物とは異なる。

第３の菌株はトルエンをムコン酸に転化するが、ムコン
酸をバイオマスおよび二酸化炭素に転化もする。ムコン
酸を蓄する菌株を得るためには、官能性のムコネートラ
クトン化酵素を欠く細胞をを単離することが必要である
。第３の菌株をトルエン上で一夜生育させる。これらの
細胞を唯一の炭素源として安息香酸を含む媒質に移す。

１時間後に、ペニシリンおよびＤ−シクロセリンを加え
て培養を４〜６時間つづける。

培養後、細胞を回収し、洗浄して、唯一の炭素源として
ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含む媒質中に５００：１
の希釈率で移す。ｐ−ヒドロキシベンゾエート上で一夜
生育させた細胞を唯一の炭素源としてベンゾエートを含
む媒質に移し、この富化サイクルをくりかえす。６回の
サイクル後に、生き残つた菌株を５ミリモルの安息香酸
および０．５ミリモルのコハク酸を含むカンテン上に接
種する。この媒質上で、ベンゾエートを代謝しえない細
胞は小区域を形成する。

単一の小区画を拾つて培養し、トルエンによる誘起後に
そのムコネート生産能をチエツクする。トルエンをムコ
ン酸に効率よく転化する能力を示す菌株をえらぶ。

次の実施例は本発明を更に説明するためのものである。

構成要素および特定の成分は代表例として示すものであ
り、種々の変性が上記の説明にかんがみ本発明の範囲内
で誘導しうる。

すべての系について使用した基礎塩類媒質は次の組成を
もつものである。

Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　５０ミリモル ＫＨ２ＰＯ４　　　　１００ミリモル （ＮＨ４）２ＳＯ４　　１７ミリモル ＭｇＳｏ４　　　　　　　１ミリモル ＣａＣｌ２　　　　　０．１ミリモル ＦｅＳＯ４　　　　０．０１ミリモル この媒質は６．２のｐＨをもち、実施例にしようしたも
のとの微生物は天然の単離物から作成した。

培養のために、トルエンのような炭素源を接種前に無菌
状態で加えた。培養は２５０ｍｌの振とうフラスコ中で
行なつた。

振とうは回転振とう器中で２８℃に制御された温度で行
なつた。

炭素源としてのトルエンはその毒体および揮発性のため
に問題を提起した。トルエンはエタノールで滅菌した透
析バツグから、あるいはフラスコ底部のパラソインソツ
クスの５ｍｌ層から振とう器にいれた。後者の場合、溶
融パラフインをピペツトでフラスコに入れ、フラスコを
オートクレープで滅菌し、まだ熱いうちにトルエンを加
えパラフインと混合した。

固化した後に、滅菌した基礎塩類媒質を無菌状態で加え
た。

透析バツグの場合には、透析チユーブをよく洗つて煮沸
し、可塑剤として含まれているグリセリンを除いた。ｍ
ｌ当り約６×１０８個の細胞の範囲にまで微生物を生育
させるのを支えるために十分なグリセリンを残した。こ
の系において、７．５×１０８／ｍｌの過剰の生育のみ
で十分であると考えられた。

基礎塩類媒質は非限定炭素源が存在するときｍｌ当り３
．３×１０９個の細胞の生育を支えることができた。

生育は、代表的には＃６６赤色フイルタを使用するクレ
ツト−サマーソン熱量計中での細胞懸濁液の濁度を求め
ることによつて測定した。１クレツト単位は１ｍｌ当り
３×１０６個の細胞、または１ｌ当たり１７．５ｍｇの
湿潤重量もしくは１ｍｌ当たり３．５ｍｇの乾燥重量、
と当価であることが見出された。

培養物は液体窒素下で貯蔵した。

実施例１ この実施例はトルエン酸化用微生物の単離を説明するも
のである。

種々の地域から土壌サンプルを集め、トルエンを含有す
る媒質およびパラフインに加えた。２８℃で２４時間振
とうした後に、媒質中に生育が認められた。ふたをあけ
た１本のアンプル分のトルエンを含むカンテンプレート
上にすじを付けることによつて菌株を分離した。約３６
時間後にカンテン上に区域（コロニー）がみえた。これ
らの区域の大きさは１〜５ｍｍの範囲であつた。これら
の区域の代表的なサンプルをとつて培養物を長期保存の
ため窒素下で貯蔵した。

最も大きな区域の１つから誘導された菌株をえらんで更
に処理してＭＷ１０００と名付けた。個の菌株は次の基
準をもとにしてプソイドモナスピユテイダバイオタイプ
Ａと同定された。

（ａ）細胞は桿状で、激しい運動性があり且つ極部的に
鞭毛をもつていた。

（ｂ）細胞はベンゾエートおよびｐ−ヒドロキシベンゾ
エート上でよく生育した。

（ｃ）ベンゾエート上での細胞の生育はカルボキシムコ
ネートラクタン酵素の合成およびカルボキシムコノラク
タンデカルボキシラーゼの合成は誘起したが、プロトカ
テユエートオキシジエナーゼの合成は誘起しなかつた。

このパターンはプソイドモナスピユテイダバイオタイプ
Ａのみの特性である。

（ｄ）誘起された酵素類、ムコノタクトンイソメラーゼ
、カルボキシ−ムコネートラクトン化酵素、およびカル
ボキシ−ムコネートラクトンデカルボキシラーゼは文献
で広範囲に研究されている死物寄生微生物の１種である
プソイドモナスピユテイダバイオタイプＡによつて合成
される酵素類と免疫学的に同じであつた。

トルエン上のＭＷ１０００の生育研究を行い、この微生
物が約３．５時間のタブリング時間で生育し、５時間の
タイムラーグをもつこと見出した。トルエンで生育させ
たＭＷ１０００はトルエン、ベンジルアルコール、ベン
ズアルデヒド、メタ−トルエートまたはカテコールを与
えたとき、ただしベンゾエートは与えなかつたとき、酵
素を消費した。カテコールを用いたときは媒質は黄色に
なり、過剰の２−ドロキシコンセミアルデヒドの生成を
示した。

メタ経路の存在は細胞を含まない抽出物の２，３−オキ
シジエーナーゼ活性の実証、ならびに過酸化水素処理に
よる２、３−オキシジエナーゼの不活性化の後でさえ、
１，２−オキシジエナーゼが実証されなかつた事実、に
よつて確認された。ＭＷ１０００はまたベンゾエート誘
起後にメタ経路を経てベンゾエートを酸化した。

実施例２ この実施例はオルソ（β−ケトアジペート）経路を経て
トルエンを酸化する微生物菌株の作成法を説明するもの
である。

オルソ経路を経てトルエンを代謝する一連の突然変異体
を、まずメタ経路を阻止し、次いでベンゾエート上での
生育能を再び獲得した表現型復元体を単離することによ
つて作成した。

メタ経路ブロツクをもつ菌株を、ベンゾエート上で生育
しない微税物をペニシリンおよびＤ−シクロセリンで富
化した後に単離した。若干の５０個単離物を次いでカン
テンプレート上にスポツト状におとし、トルエンの存在
下で培養した。実質的にすべての単離物が復元としてト
ルエン上で生育した。

このプレートに１０ミリモルのカテコールを噴霧し、復
元体の約２５％が２−ヒドロキシムコンセミアルデヒド
を生成しないことを見出した。無色復元体のうちどれ１
つとしてトルエンによる誘起後に活性なカテコール２，
３−オキシジエナーゼをもるものは見出されなかつた。

オルソ経路は高い生育速度を支えるため、ベンゾエート
上の生育はそのＴＯＬプラスミドの集団を治癒する傾向
があることはＷｏｒｓｅｙおよびＷｉｌｌａｍｓによつ
てＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３０，１１４９（１９７
７）誌上に示されている。トルエンはメタ経路を経るの
みで代謝されうるので、そのＴＯＬプラスミドの集団を
治癒する別法は、ペニシリンおよびＤ−シクロセリンの
方法を使用してトルエン上で生育しえない細胞を富化す
ることである。

これらの技術の両者は連続して使用され、次いでトルエ
ン上の生育のためのカウンター選択が行なわれた。ＭＷ
１２００がますトルエン上で生育された。この培養物の
小部分（０．０５ｍｌ）が５０ｍｌのベンゾエート媒質
に移された。ベンゾエート上での生育の後に、細胞をト
ルエートに移して約１時間培養した。次いでペニシリン
およびＤ−シクロセリンを上述のように加えて培養を４
〜６時間つづけた。細胞を回収して洗浄し、トルエン含
有媒質に移した。トルエン上の生育は約３６時間を必要
とした。これはこの選択法に生き残つた細胞の数が例外
的に低いことを示すものである。

トルエン上での生育の後に、細胞をベンゾエート・カン
テン上に接種して４８時間培養し、多数の大きな区域お
よび小さな区域のすべては黄色に変つた（メタ経路の存
在を示す）が、大きな区域はいすれも黄色に変らなかつ
たことが見出された。大きな区域を拾つて培養したとこ
ろ、トルエン上での生育後に、これらの菌株は官能性の
２，３−オキシジエナーゼを含まないが１，２−オキシ
ジエナーゼを十分に誘起することがわかつた。これらの
菌株はオルソ経路によりトルエンを代謝した。ＭＷ１２
１０と命名した１つの単離体をえらんで更に処理した。

ＭＷ１２１０についての生育研究は約２時間のダブリン
グ時間を示した。

これらの突然変異体の単離のために開発した方法は、高
度に反復性のあるものであることが照明された。メタ−
オキシダイザーとオルソ−オキシダイザーとの間の区域
の大きさの相違はプレートを４８時間観察して反復性が
あつた。

この方法の後のオルソ−オキシダイザーの頻度はプレー
ト上の全区域の５０〜１００％の範囲にあつた。個々の
工程における突然変異体の濃度を検査する手段はなかつ
たけれども、単一サイクルからの富化は、１０７のオー
ダーにあつた。

実施例３ この実施例は本発明の新規なプシオドモナスピユテイダ
バイオタイプＡ菌株ＡＴＣＣＮｏ．３１，９１６７の作
成を説明するものである。

実施例２の菌株を唯一の炭素源としてトルエンを用いる
連続培養にかけた。はじめに、０．１５ｈｒ−１の希釈
率ものを使用した。培養を安定化した後に、希釈率は０
．２５ｈｒ−１、０．３４ｈｒ−１、および０．４６ｒ
−１へと逐次増大させた。この後者の希釈率における培
養を支配する細胞から単離物を作つた。この菌株を次い
で、ムコン酸を１ｇ／ｌ以上蓄積する菌株を作成するた
めに使用した。

上記の菌株を唯一の炭素源としてのトルエン上の液体媒
質上で一夜培養し、次いでベンゾエートを５ミリモルの
水準にまで加えて培養を約１時間つづけた。ペニシリン
ＧおよびＤ−シクロセリンをそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌお
よび０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた。抗生物質培養を
約５時間つづけた。次いで細胞を遠心分離によつて回収
し、滅菌立つイオン水で２回洗つた。

ついでこれらの細胞の分別量を唯一の炭素源としてｐ−
ヒドロキシベンゾエート０．５ミリモルを含む新鮮な媒
質に移し、この媒質を一夜培養した。この方法をベンゾ
エートによる誘起をスタートとしてくりかえした。

６サイクル後に、ｐ−ヒドロキシベンゾエート上で一夜
生育させた後の培養物中に存在する細胞を希釈して、独
占炭素源として０．５ミリモルのサクネシートおよび５
ミリモルのベンゾエートを含むカンテン媒質上に接種し
た。３６時間の培養後に、プレートは大きな区域と小さ
な区域との混合物を示した。多数の小さい茎からの細胞
を液体媒質中で培養し、トルエンで誘起させ、そしてそ
のムコン酸蓄積能を試験した。

２０個の単離物を一群とする若干の群のうち、一菌株が
ムコン酸蓄積体であつた。

実施例４ この実施例は転化用媒質１ｌ当り１ｇ以上のムコン酸を
蓄積しつつトルエンをムコン酸に転化する方法を説明す
るものである。

使用した微生物は実施例３で述べたプソイドモナスピユ
テイダバイオタイプＡのＡＴＣＣＮｏ．３１，９１６菌
株であつた。

ＡＴＣＣＮｏ．３１，９１６培養物を含む媒質中に唯一
の炭素源としてサクシネートを使用した。定常用に到達
した後に、この媒質にトルエンを加えて適切な酵素を誘
起した。約２．５時間後に、細胞を遠心分離によつて回
収し、緩衝液で洗つた。

ｐＨ７．５のナトリウム・カリウムりん酸塩緩衝液１５
０ミリモル中で転化反応を行なつた。細胞濃縮物を媒質
１ｌ当り５０ｇの乾燥重量に調製した。トルエン容器中
に空気または酸素の流れを吹き込むことによつてトルエ
ンを蒸気相で徐々に添加した。これによつて生成したム
コン酸の濃度を２６０ｍｍにおける吸収増加によつて分
光高度計により測定した。ムコン酸の濃度は、反応が抑
制される前に、添付の図面に示すようにやく３５〜４０
ミリモルに上昇した。

ムコン賛成生物の同定は、高圧液体クロマトグラフ、融
点および核磁気共鳴スペクトルによつて確認された。

【図面の簡単な説明】

添付の図面は本発明の方法によりＡＴＣＣＮｏ．３１，
９１６菌株を使用してトルエンをムコン酸に微生物学的
に添加する際のムコン酸の生成量と培養時間との関係を
示すグラフであり、横軸は培養時間（単位分）、縦軸は
ムコン酸生成量（単位ミリモル）をそれぞれ示す。 特許出願人セラニーズコーポレーシヨン代理人　弁理士
川瀬良治 　〃　　　〃　斉藤武彦

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のすなわち （ａ）生育媒質中の低水準のムコン酸の存在下で抑制さ
   れない活性をもつカテコール１，２−オキシジエナーゼ
   酵素を所有し、 （ｂ）活性なカテコール２，３−オキシジエナーゼ酵素
   を欠き、 （ｃ）活性なムコネートラクトン化酵素を欠き、（ｄ）
   細胞が桿状で、激しい運動性があり、且つ極部的に鞭毛
   をもち、そして （ｅ）細胞がｐ−ヒドロキシベンゾエート上でよく生育
   する、 という特性をもつ螢光性プソイドモナス微生物菌株を含
   む緩衝水性媒質にトルエンを供給することを特徴とする
   ムコン酸の製造法。 ２、微生物が、細胞の乾燥重量１９当り毎時３０ｍｇの
   ムコン酸生成速度でトルエンをムコン酸に転化し且つ水
   性媒質１ｌ当り１ｇ以上のムコン酸を蓄積するプソイド
   モナスピユテイダバイオタイプＡ菌株の微生物学的に実
   質的に純粋な培養物である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３、微生物がプソイドモナスピユテイダバイオタイプＡ
   のＡＴＣＧＮｏ．３１，９１６菌株である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ４、水性媒質がほぼ中性のｐＨを付与するためのリン酸
   ナトリウムカリウムで緩衝されている特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ５、はじめの細胞含量が水性媒質１ｌ当り約５０ｇの乾
   燥重量の濃度である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、微生物学的酸化を約３１℃までの周囲温度で行なう
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、トルエンと分子状酸素含有の流れの蒸気相成分とし
   て水性媒質に添加する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ８、水性媒質中でのムコン酸の生成をトルエンの微生物
   学的酸化の期間中、分光光度計によりモニターする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ９、水性媒質がコハク酸塩、酢酸塩、グルコースおよび
   リジンからえらばれた炭素源を含む特許請求の範囲第１
   項記載の方法。