JPS5840099A - 光−放射ポリヌクレオチドの交雑診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 現在、核酸交雑検定法は主として完全なＤＮＡ（デオキ
シリボ核酸）、ＤＮＡの混合物あるいはＤＮＡフラグメ
ントの混合物中で独自（ｕｎｉｑｕｅ）のＤＮＡ配列ま
たは特定遺伝子の検知および同定用の研究手段として使
用されている。この技術の多くの県警は組換えＤＮＡ研
究で使用されるものとして存在する（Ｒ．Ｗｕ編「Ｍｅ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ」６８巻ｐｐ
３７９−４６９，１９７７年およびＤｕｎｎ，Ａ．Ｒ．
およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ著「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」６５巻，第１部，使用されて
いる方法の１つはサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の汚点が
濾紙交雑法（ｂｌｏｔ　ｆｉｌｔｏｒ　ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれる（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ，Ｅ著「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８巻，５０
３，１９７５年参照）。この方法は通常電気泳動により
ＤＮＡフラグメントの混合物から分離された特定のＤＮ
Ａフラグメントを同定するために使用される。その方法
は一般にある生体から単離されたＤＮＡの試料を制限エ
ンドヌクレアーゼ消化されて次いでゲル（アガローゼ、
アクリルアミド等）上で試料を電気泳動させることによ
り行なわれる。分離されたＤＮＡフラグメントを含むゲ
ルはニトロセルロース濾紙（あるいはジアゾ化紙など）
に接して置かれる。ＤＮＡ片は転移してニトロセルロー
スシートに結合する。

ＤＮＡフラグメントを含むゲル−移動ニトロセルロース
シートは次いで加熱され（９５℃）ＤＮＡを変性する。

この点で、変性の起った放射標識（３２Ｐ）“特定のＤ
ＮＡプローブ”を含む溶液でシートを処理して交雑を起
させる。交雑は与えられた条件により３−４８時間かか
るが、交雑されない“特定のＤＮＡプローブ”は洗い流
される。ニトロセルロースシートを次いでＸ線フィルム
のシート上に置いて通常−７０℃で数日間照射させる。

Ｘ線フィルムを次いで現像する。フィルム上の照射面は
どのＤＮＡフラグメントが交雑しておりかつ“特定のＤ
ＮＡ片”の配列に類似の配列を有するかを同定する。

他の多くの変形のみならずこの方法はＸ線照射の使用を
必要としかつ明らかに非常に複雑で時間を消費する。こ
れらの問題および他の問題がある故に、ＤＮＡ交雑測定
は基礎研究のための手段としてのみであり、臨床診断な
どの応用面あるいは商業面では一般に使用されていない
、 これらの問題のいくつかを、特にＸ線照射の使用を避け
る交雑法があると非常に望ましい。交雑測定は病原菌の
同定および微生物中の抗生物質耐性遺伝子の決定用とし
て価値ある診断方法であろう。それらの検定はまた遺伝
的も基づく人細胞の分類系および遺伝病の診断に対して
使用されるであろう。

一般に、本発明は相補二本鎖（ｄｓ）の核酸（ＤＮＡ，
ＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡおよび合成ポリヌクレオチド）
において塩基認識法（ｂａｓｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ−
ｏｎ）の固有の高忠実度に基づく交雑検定に関する。

その検定は放射性同位元素のかわりに化学光成分、螢光
成分、あるいはリン光成分を使用して適切な条件化で固
有の問題なく放射性同位元素に等しい感度を与える交雑
法を包含する。本発明は特に臨床診断で使用するには複
雑すぎかつ時間がかかり過ぎる従来の方法を越えた利点
を有する。

１つの観点では、本発明は標的微生物あるいは検定され
る遺伝的特徴の際だった特徴である標的ヌクレオチド鎖
の検定によりある遺伝的特徴の存在だけでなくビールス
、バクテリア、および他の微生物の存在および同定を決
定する診断方法にある。

特に、本発明は、 （ａ）適当な支持体上に試料の一本鎖のヌクレオチドを
固定化し、 （ｂ）交雑条件下で、固定化された試料を標的一本鎖ポ
リヌクレオチドの代表的部分と相補的な光−標識反応剤
の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントとを接触させ、 （ｃ）固定化された試料から交雑されていない反応剤の
一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを分離し、 （ｄ）光標識を励起する手段に固定化された試料をさら
し、および（ｅ）固定化された試料から光応答を検出す
る、 各工程からなる。

非常に特定の方法で補足鎖と結合する一本鎖ポリヌクレ
オチドの能力故に本発明の方法はこのポリヌクレオチド
に向けられている。本発明の目的に役立つ一本鎖ヌクレ
オチドは変性、すなわち二本鎖ポリヌクレオチドを二本
の相補鎖に分けることにより二本鎖ポリヌクレオチドか
ら容易に得られる。これは代表的には約５−１０分間約
７０℃に加熱することにより成し遂げられる。上記“標
的”一本鎖ヌクレオチドは特徴が特定の遺伝子などの究
極的に向けられている二本鎖ポリヌクレオチド（標的二
本鎖ポリヌクレオチド）を変性させることにより得られ
る２種類の一本鎖ポリヌクレオチドのどちらかである。

同様に、診断される生理学的試料（血液、尿その他体液
等）から二本鎖ポリヌクレオチドを単離しそして二本鎖
ポリヌクレオチドを変性させて相応の一本鎖を形成する
ことにより“一本鎖ポリヌクレオチド試料”を、得ても
よい。代表的なそのままの配列が試料のポリヌクレオト
ド鎖と対の塩基に利用できるので、ポリヌクレオチド配
列でかなりの数の塩基を不活性にしないあらゆる適切な
方法により試料の一本鎖ポリヌクレオチドの固定化を行
ってもよい。一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを種々
の支持体に付しあるいは固定化してもよく、これら支持
体のいくつかは活性ガラスビーズ；ポリアクリルアミド
；アガローゼ又はセファデックスビーズ：およびセルロ
ースを包含する。多くの方法はポリヌクレオチドのどち
らかの末端部を与えられた支持体に結合することにある
（ワイズバック、Ａおよびプーアニン、Ｍ著「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第■■■■巻、
Ｂ部、４６３−４７５、１９７４年）。

また、ポリヌクレオチドの誘導体、たとえば末端アミノ
ヘキシルヌクレオチドを運ぶものを容易に種々の支持体
に付してもよい（モスバック、Ｋ等著「Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ」第■Ｌ■、８５９−８
８６、１９７６年）。オリゴポリヌクレオチドを種々の
支持体の硼酸塩誘導体に固定化してもよい。試料（もし
あるならば）および試薬の一本鎖ポリヌクレオチドセグ
メント中で標的一本鎖ポリヌクレオチドの塩基対合を行
うに必要な交雑条件を、試薬のポリヌクレオチド配列に
付された光標識の性質；試薬のポリヌクレオチド配列の
大きさ；試薬および試料のポリヌクレオチド配列の〔Ｇ
〕＋〔Ｃ〕（グアニン＋シトシン）含量；および試料の
ポリヌクレオチドの調整法；等種々の因子により決定す
る。光標識は交雑反応に置いて温度と塩濃度に影響する
。化学光触媒は吸収体／放射体成分が許容する温度およ
び塩濃度に敏感であってもよい。

試薬のポリヌクレオチド配列の大きさは交雑反応におけ
る温度と時間に影響する。類似の塩および試薬濃度の場
合、１０，０００ないし１００，０００個の範囲のヌク
レオチドの試薬ポリヌクレオチド配列を含む交雑は６７
℃で４０ないし８０分間を必要とし、２０ないし１００
個のヌクレオチドを含む交雑は２５℃で５０ないし３０
分間を要するであろう。同様に、試薬と試料のポリヌク
レオチド配列の〔Ｇ〕＋〔Ｃ〕含量は交雑反応における
温度と時間に影響する。高含量の〔Ｇ〕＋〔Ｃ〕含量を
もったポリヌクレオチド配列は低含量の〔Ｇ〕＋〔Ｃ〕
含量をもったポリヌクレオチド配列よりもより低温でか
ちより短時間で交雑する。最後に、試料のポリヌクレオ
チド配列を調整しそしてそれを一本鎖形態で保持するた
めに使用される条件は交雑反応の温度、時間、および塩
濃度に影響する。試料のポリヌクレオチド配列を調整す
る条件は必要なポリヌクレオチド長さおよび〔Ｇ〕＋〔
Ｃ〕含量に影響する。

一般に、配列が長いほどまたは〔Ｇ〕＋〔Ｃ〕含量が高
いほど必要な温度および／または塩濃度が高い。

試薬の一本鎖ポリヌクレオチド片は試料に標的一本鎖ポ
リヌクレオチドのない場合に陽性試験の虚偽の指示を与
えないように標的一本ポリヌクレオチドの代表的部位に
相補的でなければならない。

本方法の所望の正確は目的とともに変化するので用語“
代表的”は正確な用語ではないと思われる。

理想的には、試薬の一本鎖ポリヌクレオチドは標的一本
鎖ポリヌクレオチドと対になるだけでありかつ後者のポ
リヌクレオチドが試料に存在するときはいつもそうなる
であろう。もし標的一本鎖ポリヌクレオチド塩基配列が
非常に独自であれば、非常に高度の正確さが得られる。

好ましくは、試薬の一本鎖ポリヌクレオチド片は標的二
本鎖ポリヌクレオチドから調製され、ここで標的一本鎖
に分離される。どちらかの一本鎖は光標識である反応剤
材料として選ばれてもよいが、しかしそれらのうちの唯
一１つは反応剤がそれ自身と交雑するのを防ぐため実際
に使用されてもよい。試料の一本鎖ポリヌクレオチドは
この方法で分離されることを必要としないが、その場合
、標的二本鎖ポリヌクレオチドから誘導される試料に存
在する唯一半分の一本鎖ポリヌクレオチドは適した交雑
の候補となろう。配列が知られているならば、次いで試
薬の一本鎖ポリヌクレオチドは有機合成技術により作ら
れてもよい。

光標識は化学光、生体発光、リン光、あるいは螢光であ
ってよく、かつ試薬の一本鎖ポリヌクレオチド片上のあ
らゆる点に付されてもよい；しかし、末端部位は最も望
ましい。化学光型の適した光標識は、制限なく、ペルオ
キシターゼおよび鉄ポルフィリン誘導体を包含する。化
学光型の適した光標識は限定されることなく細菌ルシフ
ェラーゼ（ルシフェラーゼおよび関連した脱水素酵素の
１つあるいは両方）、ほたるルシフェラーゼ、フェラビ
ンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、アデノシン三リン酸（
ＡＴＰ）、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＰＨ）、および種々の長鎖アルデヒド類（デシ
ルアルデヒド等）を含む。適した螢光標識は、制限なく
、種々の螢光ヌクレオチド類（エテノ−アデノシンヌク
レオチド類、エテノ−シチジンヌクレオチド類等）ある
いは官能化ヌクレオチド類（アミノ−ヘキサンアデノシ
ンヌクレオチド類、水銀ヌクレオチド等）を含み、これ
らは最初に螢光を発して標識化されそして次いで試薬の
一本鎖ポリヌクレオチドセグメントに共有して付される
。種々の方法はオリゴリボヌクレイチドの螢光誘導体の
調製用のために存在する（Ａ．ファウレおよびＧ．Ｋ−
マス著「Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
，Ｂｉｏｅｎｇ．」ｐｐ１５７−１９５，１９８１年）
。適したリン光標識は、限定されることなく、２，３−
ブタジオン、１−〔カルボシキフェニル〕−１，２−ペ
ンタジオン、および１−フェニル−１，２−プロパンジ
オンなどの２−ジケトン類を含む。光標識を試薬の一本
鎖ポリヌクレオチドセグメントに付する手段は当業界で
証明されている。

交雑が生じているかをそしてそれ故に試料中の標的ポリ
ヌクレオチドの存在を決定するために、最初に交雑され
ていない光標識の試薬を除去することが必要である。こ
れは最も簡単には適当な緩衝溶液ですすぎあるいは洗浄
することにより成し遂げられる。交雑されていない試薬
の完全な除去は達成される目標であるが、固定化支持体
に残りあるいは試料と可能な限り部分的に交雑するある
残存反応剤があるのでこのような完全な除去はかならず
しも目標とはならない。これらの発生は光応答を測定す
るときに“背景”を引き起しそして試験結果を解析する
ときに説明されなければならない。

分離工程の後に、固定化試料は光標識を励起するための
手段にさらされて、もし存在するならば反応剤と固定化
一本鎖ポリヌクレオチドとの間の交雑を通して固定化さ
れるようになってもよい。

螢光またはリン光標識の場合は、試料は適当な光の波長
で照射されるのみを必要とする。この技術は当業界で周
知である。化学光又は生体発光の標識の場合は、試料は
使用されてきた光標識に特に依存する光試薬系にさらさ
れなければならない。

このような光試薬も当業界で周知である。例えば、光標
識そして３種類の異なる光放射触媒、すなわち細菌ルシ
フェラーゼ、ほたるルシフェラーゼ、およびペルオキシ
ダーゼを使用して光応答が引き出されるかを以下の反応
が説明している：過剰の反応剤の存在下で、光応答は固
定化試料と交雑されるような光標識反応剤の一本鎖ポリ
ヌクレオチドセグメントの数とともに変化するであろう
。標識の選択は標識化の容易性および光反応剤系の経済
面により決定されるであろう。

光応答の検知は商業的に利用できる多くの検知装置で行
なうことができる。例えば、光電子増倍管を使用すると
１０−３ないし１０−９ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＨ２水準、
１０−３ないし１０−７ｍｇ／ｍｌのＨ２Ｏ２水準を測
定できる。

上気した通り、支持体に試料の一本鎖ポリヌクレオチド
を固定化することは必要である。上記固定化法に加えて
、交雑条件下で試料を固定化された一本鎖ポリヌクレオ
チド反応剤セグメントと接触させて試料の一本鎖ポリヌ
クレオチドを固定化してもよく、ここで上記最高の一本
鎖ポリヌクレオチド反応剤セグメントは一部の標的一本
鎖ポリヌクレオチドと相補的である。試料に標的一本鎖
ポリヌクレオチドが存在するとそのポリヌクレオチドは
固定化された第一の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セグ
メントと交雑する。

次いで第一の一本鎖ポリヌクレオチド試薬の部分に関し
て排他的部分の標的一本鎖ポリヌクレオチドと実質上相
互に相補的な光−標識の第二の一本鎖ポリヌクレオチド
反応剤セグメントとの交雑用のひな型として標的一本鎖
ポリヌクレオチドは使用される。この方法は２つの交雑
プロセスを含むので改良された特徴の利点を有する。

第一および第二の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セグメ
ントは本質的に標的一本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列
と相補的な塩基から成らなければならない。その第一お
よび第二の部分は実質上相互に排他的部分の標的一本鎖
ポリヌクレオチドと相補的であることが必要である。換
言すれば、標的ポリヌクレオチドとの交雑時に第一およ
び第二の反応剤セグメントは交雑が妨げられる範囲で同
じ塩基配列と競合的であるべきではない。ある場合には
、第一と第二のセグメントは重ならずかつそれらの間に
ある塩基対の空間をほとんどあるいは全くもたずに徹頭
徹尾（３′端から５′端へ）一列に並ぶであろう。しか
し、他の場合第一と第二の一本鎖ポリヌクレオチド反応
剤セグメントが標的一本鎖ポリヌクレオチド上で２つの
幅広く分離されているが独自の配列と相補的であること
が非常に望ましい（なぜならそれは特徴を改良するであ
ろうから）。

第一と第二の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セグメント
は重要な生物からの標的核酸の適当な制限エンドヌクリ
アーゼ処理から調製されるか、あるいは、独自の部分の
塩基配列が知られているならば、これら第一と第二の一
本鎖ポリヌクレオチド試薬の部分は有機合成技術により
合成されてもよい（Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ，Ｊ．等。、Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．４，３５３，１９７７年；
Ｇｏｕｇｈ，Ｇ．Ｒ．等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
．６、１５５７、１９７９年；Ｇｏｕｇｈ，Ｇ．Ｒ．等
、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．７、１９５５、１９７
９年；Ｎａｒａｍｇ，Ｓ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５巻、■部、６１０−６２０
、１９８０年）。

上記反応剤セグメントの長さは１０個のヌクレオチドな
いし１００，０００個のヌクレオチドであってよい。１
０個以下のヌクレオチドを有する交雑は安定ではなくか
つ約２０℃で変性し始めるであろう。１００，０００個
以上のヌクレオチドで、交雑（再生）は緩慢になり不完
全は方法となる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｇ．Ｓ．ＳｔｅｎｔおよびＲ．Ｃａｌｅｎｄｅｒ著
、ｐｐ２１３＊２１９，１９７１年参照）。

理想的には、小さい配列は螢光標識化され、大きい配列
は化学発光成分をもつより小さい試薬部分の標識はある
場合には交雑方法を妨げるかもしれない。

本発明の範囲から離れることなく多くの変形が行なわれ
ることは当業者に理解できるであろう。

特許出願人　スタンダード・オイル・カンパニー代理人
　弁理士　湯浅恭三

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）交雑条件下で、支持体に固定化した試料の一
   本鎖ポリヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの
   代表的な部分と相補的である光−標識反応材の一本鎖ポ
   リヌクレオチドセグメントとを接触させ； （ｂ）固定化した試料から交雑されていない試薬の一本
   鎖ヌクレオチド部分を分離し、 （ｃ）標識化した光を励起する手段に固定化した試料を
   さらし；および （ｄ）上記試料からの光応答を検知する；各工程からな
   る一本鎖ポリヌクレオチド試料中の標的一本鎖ポリヌク
   レオチドを検定する方法。 ２、（ａ）交雑条件下で、試料を標的一本鎖ポリヌクレ
   オチドの一部と相補的である第一の固定化された一本鎖
   ポリヌクレオチド反応剤のセグメントとを接触させるこ
   とにより、試料の一本鎖ポリヌクレオチドを固定化し；
   および（ｄ）光−標識反応剤の一本鎖ポリヌクレオチド
   セグメントが、第一の一本鎖ポリヌクレオチド反応剤セ
   グメントに関して実質上相互に標的一本鎖ヌクレオチド
   の排他的部分と相補的な第二の光−標識一本鎖ヌクレオ
   チド反応剤セグメントである； ３、光−標識が化学発光標識である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ４、化学発光標識がペルオキシダーゼと鉄ポルフイリン
   誘導体の群から選ばれる特許請求の範囲第３項記載の方
   法。 ５、螢光標識はエテノ−アデノシンヌクレオチド、エテ
   ノ−シチジンヌクレオチド、アミノ−ヘキサンアデノシ
   ンヌクレオチド、および水銀ヌクレオチドからなる群か
   ら選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、光標識が生体発光標識である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ８、生体発光標識は細菌ルシフェラーゼ、ほたるルシフ
   ェラーゼ、フラビンモノヌクレオチド、アデノシン三リ
   ン酸塩、還元ニコチンアミドアデノシン三リン酸塩、還
   元ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド、還元ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオリドリン酸塩、およびデ
   ジルアルデヒドからなる群から選ばれる特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 ９、光標識がリン光標識である特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １０、リン光標識が２，３−ブタジオン、１−〔カルボ
   キシフェニル〕−１，２−ペンタンジオン、および１−
   フェニル−１，２−プロパンジオンからなる群から選ば
   れる特許請求の範囲第９項記載の方法。