JPS5810522A - 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアフィニティークロマトグラフィーにおいて、
不活化トロンビンをリガンドとして結合させた親水性ゲ
ルを用い、緩衝液と中性塩溶液及び血漿タンパク質混合
液とから成る溶離液をカラムを用いて通液させるか、あ
るいは回分法により容器内で両者を混合することにより
ゲルと接触させ、アンチトロンビン■を特異的に吸着さ
せることにより分離精製する方法に関するものである。

さらに詳しくは、トロンビンの反応中心セリン残基がデ
ヒドロアラニン残基に変換した不活化型トロンビンを基
体としたアフィスティーゲルを用い、アンチトロンビン
■のトロンビンとの親和力を利用して分離精製する方法
に係るものである。

血液は、赤血球、白血球、血小板から成る有形成分と血
漿と呼ばれる無形成分とから成り、血漿中には１００種
類以上のタンパク質が含まれる。これらのタンパク質は
電気泳動的にアルブミン、α、βおよびｒ−グロブリン
およびフィブリノーゲンに分類される。

アンチトロピン■は、α２−グロブリンに属する糖タン
パク質である。血漿中に通常３０〜５０ｍｇ１旧の割合
で含まれているのみである。しかし、トロンビンや活性
型Ｘ因子等と反応し、複合体をつくることにより、血液
凝固反応を阻害し、血管内での凝固反応の調節に大きな
役割をはたしている。

アンチトロンビン■の分離精製法としては従来 （ＩＪ　　硫酸アンモニウムなどの中性塩添加、ポリエ
チレングリコール等の水溶性高分子の添加による分別沈
澱法 （２）　　分子の荷電を利用したイオン交換クロマトグ
ラフィー法 （３）　　分子の大きさを利用した分子篩クロマトグラ
フィー法 （４）分子の等電点の差を利用する電気泳動法（５）　
　ヘパリンとの親和力を利用するアフィニティークロマ
トグラフィー法 などが知られており、これらの方法の一つ又は幾つかを
組み合せた方法が用いられている。

これらの方法のうち、（５）のアフィニティークロマト
グラフィー法を除く他の組み合せは夾雑タンパク質の分
離除去が難しく、何回も操作をくり返さねばならないこ
とから、回収量が少ないこと操作が繁雑であるといった
欠点がある。

一方、リガンドとの特異的な親和力により分離するアフ
ィニティークロマトグラフィー法は、アンチトロンビン
■のもつ特異的な性質を利用することから精製操作が簡
単であり夾雑物の分離がよく、活性回収率もよい利点を
もつ。

ところで、従来使用されているヘパリンを基体としたア
フィニティークロマトグラフィー法は、アンチトロンビ
ン■かヘパリンと結合することを利用したものであり、
他の方法に比べ、簡単で効率的である。しかしながら、
現在工業的に広く行なわれている冷エタノール法による
ｉｌｌ　分画からこの方法によってアンチトロンビン■
を精製すると収率がきわめて低い。また、加熱処理血漿
より精製した場合においても収率が低い。すなわち、こ
の方法はアンチトロンビン■のヘパリン結合部位である
リジン残基付近の構造に依存するものであるので、この
部分の構造が低温エタノール処理、熱処理に対し不安定
であるため効率が悪いものと推定される。したがって、
アフィニティークロマトグラフィーに利用する構造とし
ては、アンチトロンビン■中の他の構造部位である、ア
ルギニン反応中心残基付近の構造を利用することが望ま
しい。

本発明者らは、前述の点に着目しこれらの欠点を改善す
べく鋭意研死の結果、アンチトロンビン■のアルギニン
反応中心を利用したアフィニティークロマトグラフィー
によシ、血漿中および冷エタノール分画等の血漿タンパ
ク質混合液中に含有されるアンチトロンビン■を効率良
く、分画することが出来る方法を見出し本発明を完成し
たものである。

すなわち、本発明は、アフィニティークロマトグラフィ
ーにおいて従来用いられていたリガンドに代わり、不活
化トロンビンすなわち、アンチトロンビン■と反応し共
有結合性の複合体形成はしないが、親和性をもつトロン
ビンを用い、緩衝液、中性塩溶液および血漿タンパク質
からなる混合液を接触させ、アンチトロンビン■を特異
的に吸着せしめ、それを溶出することにより迅速かつ簡
便に効率よく分離精製する方法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いる不活化トロンビンは精製人トロンビンを
ｐＨ８，０イオン強度０．０−５のトリス塩酸緩衝液中
で、フェニルメタンスルホニルフルオリドと反応させ、
活性中心セリン残基とエステル結合を形成せしめ、トロ
ンビン活性を失わせた。その後ｐＨ９，０に調整し、低
温に保ち、エステル結合を解離させ、ると共にセリン残
基をデヒドロアラニン残基に変換した。次に、ベンズア
ミジンを基体とするアガロースゲルヲ用い、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行い、親和性を示す分画を採
取し、アンヒドロトロンビンとして用いたものである。

なお、本発明はおける精製トロンビンは、低温エタノー
ル法（Ｅ、Ｊ、　Ｃｏｈｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、６
８：４５９（１９４６））により得られたコーンペース
ト■分画より、ポリエチレングリコール沈澱およびＢａ
Ｃｌ２沈澱によりプロトロンビン複合体を精製し、牛脳
より抽出したトロンボッ；ラスチンにより活性化し、そ
の後に、ＤＥＡＥセフ７デツクスカラムクロマトグラフ
イーおよびベンズアミジンセファロースカラムクロマト
グラフィーにより精製したトロンビンを用いた。

そして、該リガンドをアガロースに固定したゲルに血漿
タンパク質混合液を接触することにより、アンチトロン
ビン■を特異的に吸着し、それを溶出することにより分
離精製するものである。

本発明において該リガンドを結合するのに用いられる担
体は通常用いられている親和性の担体から任意に選ぶこ
とができる。架橋アガロースゲル（商品名：セファロー
ス４Ｂ、および６Ｂ）架橋デキストランゲル（商品名：
セファデックスＧ１００、Ｇ１５０、Ｇ２００）架橋ア
クリルアミドゲル（商品名：セファクリル５２００゜５
３００）などを挙げることができる。

本発明において、血漿タンパク質混合液の吸着には、ｐ
Ｈ６〜８かつイオン強度０〜１．０の緩衝液と中性塩溶
液とからなる溶離液を用いるものである。

溶離液中の緩衝液はｐＨ６〜８域を示す緩衝液を任意に
選ぶことができるが特にトリス緩衝液、リン酸緩衝液が
好ましく、中性塩溶液は通常用いられる中性塩溶液から
任意に選ぶことができるが、特にＮａＣ１，ＫＣＩの水
溶液が好ましい。

本発明における吸着アンチトロンビン■分画の溶出液に
はｐＨ５，０〜５．５イオン強度１〜４の緩衝液かある
いは、ｐＨ４，０〜５．５の基質類似物を用いるもので
ある。

緩衝液はｐＨ４，０〜５．５のｐＨ域を示す緩衝液を任
意に選ぶことができるが、特に酢酸緩衝液がよく、中性
塩溶液は通常用いられる中性塩溶液から任意に選ぶこと
が゛できるがＮａＣ１の水溶液が好ましい。

基質類似物としては、べ／ズアミジン！ニトロベンズア
ミジンラアミノベンズアミジンを挙げることができる。

０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを用い、ｐＨ４，０〜５．５と
して用いるものである。

次に本発明において使用される血漿タンパク質の状態に
ついて説明する。

血漿タンパク質の一つにフィブリノーゲンがある。血液
が体外に出ると凝固するが、これはフィブリノーゲンが
フィブリンとなつそ血栓をつくることが原因となってい
る。したがってクロマトグラフィーにおいてもフィブリ
ンが析出し、担体に付着する。この現象を防ぐため、フ
ィブリンを除く前処理を施した方が好ましい。

血漿を６０℃で数分間加熱し、フィブリノーゲンを除去
後、用いることができる。血漿を低温でエタノールを用
いてフィブリノーゲンを除去すると共に沈澱、濃縮処理
を行った後溶離緩衝液に溶解して用いることができる。

血漿に水溶性高分子を共存させてフィブリノーゲンを除
去する前処理として利用することができる。また、中性
塩を共存させ、フィブリノーゲンを予め除去後、塩強度
を１．０以下になるように水で希釈し、用いることがで
きる。

したがって、本発明における血漿タンパク質を含む溶液
とは、水溶液、水溶性高分子、中性塩、またはアルコー
ル類を共存する水溶液を用いるものである。

水溶性高分子とは、ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸
、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルデン
プンを挙げることができる。

また、中性塩としては、ＮａＣ１、ＫＣＩ　、ＮＨ，Ｃ
１、Ｎａ２５Ｏ＜、Ｋ２Ｓ０．、（Ｎ　Ｈ４）２　Ｓ　
Ｏｉ　を挙げることができる。

アルコール類としては、炭素数２〜５を有するアルコー
ルを挙げることができる。

以上、述べたように溶離液および血漿タンパク質を含む
溶液を通液あるいは混合し、不活化トロンビンゲルに吸
着させ、それを溶出液で回収−しアフィニティークロマ
トグラフィーを行うものである。

本発明においてカラム法を用いる場合は不活化トロンビ
ンゲルはガラス製のカラム内に充填されたものをはじめ
処理量にみあった任意の大きさの種々のカラム内に充填
されて使用される。

該カラムはあらかじめ溶離液を通し平衡化させておく方
が望ましい。

溶離液の流速は種々変化させることが出来るが、本発明
はアフィニティークロマトグラフィー法を基本とするた
め、流速は０．５　ｍｌ／ａｍ２以下であることがよシ
好ましい。流速をさらに高めることは、溶離液中に１〜
５単位／ｍｌ　のヘパリンを共存させることにより可能
である。

溶出液の流速は、使用した担体の機械的強度のｌ、５囲
において変化させることができる。

また、溶出液に基質類似物を含む水溶液を用いた場合は
、拳法による分離精製後、基質類似物を除去するためｐ
Ｈ７，０、イオン強度１．０以上の緩衝液中で、透析あ
るいは分子篩クロマトグラフィーを行い該物質の除去す
ること望ましい。

本発明において回分法を用いる場合も血漿タンパク質を
含む溶離液とゲルの量は処理量にみあって変化させるこ
とができる。ゲルと溶液の混合時間は攪拌の度合あるい
は容器の形状により異なるが一般に２時間以上行なうこ
とが望ましい。この操作でアンチトロンビン■を吸着さ
れたゲルは、ガラスフィルター上等で溶離液により洗浄
を行なった後、前述のカラム法に準じ溶出液で洗浄しア
ンチトロンビン■を回収するものである。

以上の操作はアンチトロンビン■の活性を安定に保存す
るため低温で行うことが望捷しい。

以上、説明したように本発明は不活化トロンビンゲルを
用い種々の血漿タンパク混合液と接触させ、アンチトロ
ンビン■を特異的に吸着せしめ、それを溶出することに
より、迅速かつ簡便に、効率よく分離精製できるもので
ある。

以下、本発明を実施及び比較例により詳細に説明する。

実施例１ アンヒドロトロンビンは人トロンビンかう次に示す方法
によシ調製した。精製したヒトα−トロンビン（７１６
０００単位、　３００ｍｇ　）を５０　ｍＭ　トリス緩
衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、２１℃で１ｏｏｏ倍量ノ
フェニルメタンスルホニルフルオライトヲ加え３０分間
放置し、トロンビン活性を消失させた。−トロンビンの
エステラーゼ活性を測定したところ９９．９５％が失な
われた。その後５０ｍＭ　　トリス緩衝液（ｐＨ９，０
＞で平衡化した脱塩カラム（商品名＝セファデックスＧ
−２５）で脱塩を行ない、そのまま４℃で１昼夜放置し
た。この分画を５０　ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５）
で平衡化したベンズアミジンアガロ−ヌカラム（ゲル床
容積３０ｍ１）に通液し、同緩衝液で洗浄した。５．ｍ
ｌづつ分取し、２８０ｒｔｍの吸光度とＦｏｌｉｎ法に
よるタンパク量を測定したところ第１図に示される如く
不活化トロンビンの大半はとのカラムに吸着し基質結合
能を有することが示された。これは第１図に示されると
と（，０，２Ｍベンズアミジン（ｐＨ７，５）で溶出さ
れ。

１ＭＮａＣ１を含む５０ｍＭ　　トリス緩衝液（ｐＨ７
，５）で透析し、ベンズアミジンを除去し、アンヒドロ
トロンビンとした。

つぎに、アンチトロンビンｍにあらかじめアンヒドロト
ロンビンを加え３７℃でインキュベートし、トロンビン
と混和し、フィブリノーゲン液に加え凝固時間を測定す
ることによシその活性の阻害率を調ベアン千トロンビン
活性を測定した。アンヒドロトロンビンと共に加温する
ことによりアンチトロンビン活性は低下し、アンチトロ
ンビン■とアンヒドロトロンビンが相互作用することが
示すした。また、アンヒドロトロンビンをトロンビンに
加えてもその活性が上昇しないことから、アンヒドロト
ロンビンが活性を示さないことが確かめられた。

該アンヒドロトロンビンを０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ−（ｐ
Ｈ１ｓ３　）で透析し、活性化架橋アガロースゲル（商
品名−活性化ＣＨセファローズ４Ｂ）と混合することに
よりアンヒドロトロンビンセファロースケルヲ合成した
。

実施例２ 血漿を６０℃に３分間加熱後、低温にて遠心分離し、上
澄みを集め０．２μのポアーサイズを有するフィルター
を用いて濾過し、その４ｍｌ　　を不活化トロンビンセ
ファローズカラム（ゲル床容積４ｍｌ　）Ｋ通液し、５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５）につづいてＯＩＭＮ
ａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、４ＭＮａＣｌを含む５
０　ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）で吸着タンパク質を
溶出した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。その結果溶出
物は波長２Ｆ３０ｎｍの紫外部吸光度測定によシ第２図
に示す如く、夾雑タンパク質よシなるピークの他にｐＨ
５，５で溶出した分画があった。この分画のアンチトロ
ンビン■活性を測定し、アンチトロンビン■が含まれる
こと、また第３図に示す如く、電気泳動像より、極少量
の夾雑タンパク質のみを含む、純度の高いアンチトロン
ビン■分画であることが確認された。表■に示される如
く、添加した加熱膜フィブリン血漿よシ該アンチトロン
ビン■分画へのアンチトロンビン■の活性回収率は９０
％であシ、Ｆｏｌｉｎ法にょシ測定したタンパク質量当
シの活性の値は加熱膜フィブリン崩漿に比べて１７５倍
に上昇した。電気泳動像においてみとめられる微量の夾
雑タンパク質は、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラ
フィー（商品名＝　ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０）
にょシ除去しさらに高純度のアンチトロンビン■を得る
ことができた。（表１参照） 表１　実施例２におけるアンチトロンビン■の精製実施
例３ 実施例２において用いた溶出液を０．２　Ｍベンズアミ
ジン（ｐＨ５，５）と変えた以外は実施例２と同様な操
作・測定を行った。ただし、アンチトロンビン■分画は
、１ＭＮａｃｌを含む５０　ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ
７，５）で透析した。その結果、実施例２とはぼ同様の
純度を保ち、アンチトロンビン■の活性も同程度に回収
されることが確認された。

実施例４ 低温エタノール法を用いて人血漿タンパク質を分画する
方法は古＜　Ｃｏｈｎ　らによ多系統的な分画法が開発
され（Ｅ、Ｊ、Ｃｏｈｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍ
ｅｒｉ　−ｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ
、６８：４５９（１９４６））現在も工業的に広く利用
されている。

この方法で分画されたＩＶ−１ペイスト（湿重１ｇ）を
４ｍｌの５０　ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶
解し、０．２μのポアーサイズを有するフィルターを用
いて濾過し、実施例２と同様な操作でアンチトロンビン
■を分離精製した。波長２３０ｎｍの吸光度測定の結果
、順次溶出するタンパク質は実施例１と同様なピークに
分れることを確認した。実施例２と同様にｐ　Ｈ５，５
イオン強度４の溶出液で溶出されるピークを採取したと
ころ、表２に示される如く、アンチトロンビン■の活性
回収率は８０チであシ、効率よく回収されていることが
確認された。また、タンパク当りのアンチトロンビン■
の活性の比もカラムに添加前に比べ１７７倍に上昇した
。（表２参照） 表２　実施例４におけるアンチトロンビン■の精製実施
例５ 血漿に終濃度５ｏｍＭになるようにトリスアミノメタン
を加え、０．ＩＮ塩酸でｐＨ７，５とし冷却しながら５
０％ポリエチレングリコール４０００溶液ヲ加工、ポリ
エチレングリコールの最終濃度を１５俤とする。低温に
て遠心分離し上澄みを集め、フィルターを用いて濾過し
４ｍｌ　　を不活化トロンビンゲルカラム（ゲル床容積
４ｍ１）に添加し、実施例２　、！：　ホホ同程度の純
度のアンチトロンビンｍを同程度の効率で回収できるこ
とがわかった。回収率は８５ｇ６比活性はクロマトグラ
フィーの前後で１６５倍上昇した。

実施例６ 実施例２において用いた溶離液を５０　ｍＭト、ＩＪス
緩衝液（ｐＨ８，０）と変えた以外は実施例２と同様な
操作・測定を行った。その結果得られたアンチトロンビ
ン■は、実施例とほぼ同程度の純度であ−たが、活性の
回収率は６０チであった。

実施例７ 実施例２において用いた溶離液をＩＭＮａＣＩを含む５
０　ｍＭ　Ｕン酸緩衝液（ｐＨ６，０）と変えた以外は
実施例２と同様な操作・測定を行った。その結果アンチ
トロンビン■は、実施例とほぼ同程度の純度であったが
、活性の回収率は５０％とやや低かった。

実施例８ 血漿に低温で終濃度２０チとなるように（ＮＨ，）２Ｓ
Ｏ４の粉末を加え、３０分間放置後、遠心分離し、上澄
を取シ、５０　ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で１
００倍に希釈した。その後、フィルターを用いて濾過４
００ｍ１を実施例２と同様な純度のアンチトロンビン■
を回収率約８０ｑ６で精製することができた。

実施例９ 回分法によシアンチトロンビンｍを精久シた。

実施例２と同様な操作で加熱によりフィブリノーゲンを
除去した血漿１００ｍ１を得た。それに５０ｍ１のアン
ヒドロトロンビンゲルを加え％４℃で３時間攪拌した。

グラスフィルター上で吸引しながらゲルを回収し、さら
に２５０ｍ１の０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄後、１００ｍ１ノ５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）でアンチトロンビン■分画
を溶出した。

タンパク質量とア、ンチトロンビン■活性を測定したと
ころ、回収率は約８０％であること比活性はクロマトグ
ラフィー前後で１５０倍に上昇し、純度は実施例２に近
いものであることが確認された。

さらに、ＤＥＡＥセファデックスカラムクロマトグラフ
ィーを行ったところ高純度の標品が得られた。

実施例１０ 実施例５と同様な操作で血漿にポリエチレングリコール
を加え、フィブリノーゲンを除去した後その１５０　ｍ
ｌを実施例９と同様な操作で回分法によりアンチトロン
ビン■の分離精製を行った。

回収率、純度とも実施例７と同程度であった。

比較例１ ヘパリンをリガンドとしたアガロースゲル（商品名＝ヘ
パリンセファロース（ＣＬ６　Ｂ　）　全充填したカラ
ム（ゲル床容積：２０ｍ１）にコーンＩＶ−１ペイスト
（湿重５ｇ）を２０　ｍｌの５０ｍＭ）リス緩衛液（ｐ
’Ｈ７，５）に溶解し濾過後添加した。同緩衝液１００
ｍ１でカラムを洗浄後０−２．　ＯＭＮａＣｌで直線的
に濃度勾配をつけた同緩衝液で吸着タンパク質を溶出し
た。流速は０．３ｍｌ／ｍｉｎであった。該溶出液は５
ｍｌ毎に分取し、　２３０ｎｍの吸光度測定およびアン
壬トロンビン■活性の測定を行ったうその結果第４図に
示す如く溶出される２つの夾雑タンパク質ピークは各々
アンチトロンビン■活性を示した。したがってアンチト
ロンビン■は三つのピークに分かれるが、その純度から
アンチトロンビンｍ分画として採取されるのは第３のピ
ークのみである。表３に示す如く、この分画のタンパク
質当りのアンチトロンビン■活性は添加前ト比べ１５０
倍に上昇し、純度が高い標品であることがわかった。し
かし、アンチトロンビン■活性の回収率は３０％と低い
値であり、効率が悪い。

（表３参照） 表３　比較例１におけるアンチトロンビン■の精製第１
図はアンヒドロトロンビンのベンズアミジンセファロー
ズアフィニティークロアトゲラムである。

■、　アンヒドロトロンビン 第２図および第４図はアンヒドロトロンビンセファロー
ズアフィニティークロマトグラフィーにより分離された
血漿タンパク質混合液のクロマトグラムである。

２、　アンチトロンビン■ 第３図ハ、アンヒドロドロンピンセファローズアフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製されたアンチトロン
ビン■のポリアクリルアミドディスク電気泳動像である
。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　アフィニティークロマトグラフィー法を用い
   て、緩衝液、中性塩溶液および血漿タンノ々り質混合液
   を含むｐＨ６〜８かつイオン強度０〜１の溶離液とゲル
   を接触させることにより、アンチトロンビン■を特異的
   に吸着せしめ、ｐＨ４，ｏ〜５．５の中性塩溶液あるい
   は基質類似物により溶出することを特徴とするアンチト
   ロンビン■の分離精製法。ただし、ここでいう基質類似
   物とは、トロンビンの競合阻害剤のことである。
2. （２）　　アフィニティークロマトグラフィーに用いる
   ゲルが親水性担体にアフィニティーリガンドとして化学
   修飾不活化トロンビンを結合しだものであり、それ自身
   トロンビン活性を示さず、基質結合能のみを有するゲル
   である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）　　アフィニティーリガンドとしての修飾不活化
   トロンビンがアンヒドロトロンビンである特許請求の範
   囲第（１）項または第（２７項記載の方法。
4. （４）　　緩衝液が、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢
   酸緩衝液である特許請求の範囲第（１１項ないし第（３
   １項記載の方法。
5. （５）　　中性塩溶液が、ＮａＣ１，ＫＣＩ　、　ＮＨ
   ４Ｃｌ　、（ＮＨ４）２Ｓ０４である特許請求の範囲第
   （１）項ないし第（３）項記載の方法。〜
6. （６）基質類似物がベンズアミジン、アミノベンズアミ
   ジン、ニトロベンズアミジンである特許請求の範囲第（
   １ｊな、リシ第（，３１項記載の方法。
7. （７）血漿タンパク質を含む溶液が水溶液である特許請
   求の範囲第（１＋項ないし第（６）項のいずれかの項記
   載の方法。
8. （８）　　血漿タンパク質を含む溶液が中性塩を共存す
   る溶液である特許請求の範囲第（１）ないし第（６）項
   のいずれかの項記載の方法。
9. （９）血漿タンパク質を含む溶液がポリエチレングリコ
   ールなどの水溶性高分子を共存する水溶液である特許請
   求の範囲第（１）項ないし第（６ン項のいずれかの項記
   載の方法。