JPS5843389B2 - ペプチド遊導体及びペプチド誘導体を用いるコラゲナ−ゼ活性の測定方法 - Google Patents

ペプチド遊導体及びペプチド誘導体を用いるコラゲナ−ゼ活性の測定方法

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JPS5843389B2
JPS5843389B2 JP10350576A JP10350576A JPS5843389B2 JP S5843389 B2 JPS5843389 B2 JP S5843389B2 JP 10350576 A JP10350576 A JP 10350576A JP 10350576 A JP10350576 A JP 10350576A JP S5843389 B2 JPS5843389 B2 JP S5843389B2
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隆弘 堺
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規ペプチド誘導体ならびにそれを用いるコラ
ゲナーゼ活性の測定法に関する。
更に詳しくは、コラゲナーゼに対する特異基質として有
用な新規オクタペプチド誘導体に関し、有用な本ペプチ
ド遊導体およびそれを用いるコラゲナーゼ活性の測定方
法を提供するものである。
近年、コラーゲンおよびそれを分解する酵素コラゲナー
ゼに関する研究が活発に行われ、結合織の病変が関与す
る疾患、例えば各種皮膚疾患、創傷、全身紅斑狼癒、胃
潰瘍の胃粘膜、角膜潰瘍、肝硬変、線維肉腫等の組織、
リウマチ性関節炎の滑液、更に本態性高血正症、動脈硬
化症、糖尿病等の患者の顆粒白血球等に含まれるコラゲ
ナーゼが著名に変動している現象が発見された。
また、発見者らの研究により、肝硬変、肝疾患の一部に
あってはその血清中のコラゲナーゼ活性が上昇している
ことが認められた。
従って、上記疾患ならびに関連疾患の診断上、生体のコ
ラゲナーゼ活性を測定することは重要な意義を有するの
である。
従来のコラゲナーゼ活性の測定は、天然のコラーゲン、
例えば動物の皮膚、鍵等より抽出したコラーゲンを基質
として、測定さるべきコラゲナーゼ標品を作用せしめ、
その分解率を求める方法にて行われてきた。
この方法では、■天然コラーゲンの分子量がきわめて大
きく、且つ広い分子量分布をもち、一定の分子量のもの
を得ることは極めて困難であり、且つその抽出操作は極
めて繁雑である。
■コラーゲンを抽出する動物の種類、部位によりコラー
ゲンの性質が一定していないこと、さらに■生体内コラ
ゲナーゼ活性を測定する際、測定試料に血清蛋白質のａ
２−マクログロブリンの混入がさけられないのであるが
、このａ２−マクログロブリンは天然コラーゲンを基質
としてコラゲナーゼ活性を測定する場合阻害物質として
作用する、などにより精密なコラゲナーゼ活性の測定法
としては適切なものでなかった。
上記第３の欠点を回避するために、コラゲナーゼａ２−
マクログロブリン等の阻害物質結合体を予めロダンナト
リウム等にて処理することにより、コラゲナーゼの活性
を復活させる試みがなされたが、副反応が起り測定値の
変動が大きく、実用的な正確度を期し難い。
従って、簡便で精密なコラゲナーゼ活性の測定法の確立
が待望されてきた。
本発明者らは、適当なペプチドを合或し天然コラーゲン
のモデル物質として基質に使用することにより、従来法
の欠点を克服できると考え、コラゲナーゼが特異的に切
断するペプチド結合の位置およびコラゲナーゼ、基質両
者間の特異性に関し鋭意研究した。
その結果、基質特異性を高度に保有し、しかもコラゲナ
ーゼ活性測定に於いて操作上特に有利なコラーゲンのモ
デル物質たる新規オクタペプチド誘導体を完成した。
更に本オクタペプチド誘導体は先述した血清蛋白質のａ
２−マクログロブリンによる阻害を全く受けることなく
、コラゲナーゼ活性を発現させ得るという優れた特徴を
有するものであることが認められた。
しかも、本オクタペプチド誘導体、特にその発色用基間
は安定で光に対しても分解することなく長期保存が可能
である。
即ち、本発明は、一般式 ％式％ （（但し、Ｘはｐ−（４−ヒドロキシ−１−ナフチルア
ゾ）ベンゼンスルホニル基またはｐ−フェニルアゾベン
ゾイル基を、ＯＨはＣ−末端が遊離カルボキシル基であ
ることを、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ｇｌｙ。
１１ｅ、ＡｌａおよびＡｒｇはそれぞれプロリン、グル
タミン、グリシン、インロイシン、アラニンおよびアル
ギニン単位を示す。
））で示されるペプチド誘導体およびそれを用いるコラ
ゲナーゼ活性の測定法である。
上記オクタペプチド誘導体はコラゲナーゼを作用せしめ
ると、疎水性を有するトリペプチド誘導体； Ｘ−Ｌ
−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ −ＯＨを遊離する。
このトリペプチド誘導体は疎水性であるので適当な有機
溶媒、例えば酢酸エチル、エーテル、ｎ−ブタノール等
によって容易且つ充分に抽出され、しかも発色団基間を
有するので抽出液を通常の比色定量等の光学手段を用い
て正確に定量することができる。
抽出に当っては本トリペプチド誘導体のみ抽出し、比色
定量領域に吸収を有するコラゲナーゼ含有試料中の他物
質は抽出しないことがコラゲナーゼ活性測定の精度上重
要であるが、他物質を抽出しない点で酢酸エチルが好ま
しい。
本トリペプチド誘導体は好適な酢酸エチルにて充分抽出
されるのである。
従って、本オクタペプチド誘導体を基質として用いるこ
とにより正確にしかも極めて簡便にコラゲナーゼ活性を
求めることができる。
本発明（ご、゛係る新規ペプチド誘導体はペプチド化学
に於いてよく知られている方法により製造することがで
きる。
即ち一般式％式％ （但し、Ｙはアルギニン単位のグアニジノ基の保護基を
、Ｒはアルギニン単位のカルボキシル基の保護基を示す
。
）で示される保護ペプチド誘導体を脱保護することによ
り通常得ることができる。
アルギニン単位のグアニジノ基の保護基Ｙとしてハトシ
ル基（ｐ−ｔ−ルエンスルホニル基）、ニトロ基、ベン
ジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカ
ルボニル基％２−（イソプロピルオキシカルボニル）−
３，４，５，６−チトラクロルベンゾイル基等公知の保
護基でよ＜、特に前三者が通虐好ましく用いられる。
一方、アルギニン単位のカルボキシル基の保護としては
、ペプチド化学で譜用されているエステル類に変換する
ことにより行われる。
即ち、保護基Ｒとしてはベンシル、ｔ−ブチル、ｐ−ニ
トロベンジル、ｐ−メトキシベンジル基、特にベンジル
基、ｔ−ブチル基が好ましく用いられる。
保護基の脱離方法にあっても個々の保護基に応じ適宜公
知方法を選択すればよいが、その際発色団基Ｘ等地の構
成単位が同時に脱離或いは変化することは許されない。
従って、両保護基を選択的に脱離せしめる脱離方法を、
的に保護基および発色団基に応じ選定することが肝要で
ある。
脱離方法としては弗化水素処理が、両保護基を同時に脱
離することができるので好ましく用いられる。
弗化水素で脱保護のために用いる場合、一般には無水の
状態で使用される。
反応は溶媒の存在下にも、非存在下にも行いうるが、通
常弗化水素を溶媒的に使用して行われる。
また、副反応を抑制するため、少量のアニソール、フェ
ノール等の共存下に反応を行うのが好ましい。
反応温度は一７０°〜２０℃、好ましくは−ｌＯ°〜ｌ
Ｏ℃程度である。
反応終了後、自体公知の手段で目的物を取得することが
できる。
出発物質たる保護ペプチド誘導体はペプチド化学で常用
されている方法により合成することができる。
具体的には、発色団基間にて修飾されたＬ−プロリンを
初めとする保護アミノ酸を順次固相、或いは液相にてペ
プチド縮合せしめる（所謂、Ｓｔｅｐｗｉｓｅ Ｅｌｏ
ｎｇａｔｉｏｎ）、或いは適当なフラグメント、例えば
Ｘ ＝ Ｌ −Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−ＯＨとア
ルギニン単位のグアニジノ基およびカルボキシル基を保
護したＬ−Ｉ １ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａ〒ｇ（Ｙ
）−ｏＲを予め合成し、次いで各フラグメントをウォー
ターソルブルカルボジイミド（エチルＮ、Ｎ−ジメチル
アミノプロピルカルボジイミドまたはその塩等）などの
縮合剤を用い、または活性エステル化法など他の縮合方
法によりペプチド誘導体は得ることができる。
発色団基は上記した如くＬ−プロリンに導入して後縮合
反応に供してもよいが、Ｌ−プロリンのＮ−末端を通常
のアミノ保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル、
ベンジルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニ
ル等で保護し縮合反応に供して後、合成途上のフラグメ
ントの段階にて、或いは最終段階にて轟該アミノ保護基
を発色団基に置換してもよい。
本発明に係るペプチド誘導体を用いてコラゲナーゼ活性
を測定する方法は、天然のコラーゲンを基質に用いる場
合とはゾ同一である。
即ち、まず初めに当該オクタペプチド誘導体の一定濃度
水性溶液を調製する。
この基質溶液ははゾ中性領域、より詳しくは約ｐＨ６〜
９、特にｐＨ７〜８に調整され、測定に供される。
本オクタペプチド誘導体のうち、Ｘ−ｈ’ ｐ −（４
−ヒドロキシ−１−ナフチルアゾ）ベンゼンスルフォニ
ル基のものは、溶解度が充分でない場合がある。
その様な時はアルコール、例えばエチルアルコールを添
加し溶解を促進せしめ使用する。
測定は、前記基質溶液にコラゲナーゼ含有試料を３００
〜４５℃、好ましくは３５°〜４０℃にて接触、作用せ
しめ、基質および酵素量に応じ適当な時間反応させた後
、塩酸を加えるなどして酵素を失活せしめる。
酵素作用により遊離生成するＸ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｙ−ＯＨが放出されるが、酢酸エチル、エーテ
ル、ｎ−ブタノールまたはこれらの混合溶媒等の適当な
有機溶媒にてこれを抽出し、使用発色団基に応じ最も有
利な波長を用い、例えばＸがｐ−（４−ヒドロキシ−１
−ナフチルアゾ）ベンゼンスルフォニル基ならば３８９
ｎｍ。
ｐ−フェニルアゾベンゾイル基ならば３２５ ｎｍにて
吸光度を測定する。
本オクタペプチド誘導体は極めて高度に基質特異性を有
するものであるから、通常のコラゲナーゼ含有試料、例
えば血精等にあってはこのオクタペプチド誘導体を基質
とする測定にて充分精度よくコラゲナーゼ活性は求める
ことができるが、肝臓、腎臓等の組織からのコラゲナー
ゼ試料の如く他の非特異的ペプチダーゼ活性の特に強い
試料にあっては、前記オクタペプチド誘導体の加水分解
が一部起り、コラゲナーゼ活性の精密測定には不十分な
場合があることが判明した。
そこで、この様な場合にも充分精度よく測定するにはコ
ラゲナーゼには不活性であるが、コラゲナーゼ含有試料
に随伴することの多い他の非特異的ペプチダーゼにより
加水分解を受けるペプチド誘導体に関し更に研究した結
果、上記オクタペプチド誘導体よりプロリン残基の欠如
した新規へブタペプチド誘導体がこれら条件を充たすこ
とを見い出した。
この場合には、プロリン残基の欠如したヘプタペプチド
誘導体を用い次の如く測定は行れる。
即ち、使用したオクタペプチド誘導体と同一の発色団基
Ｘを有するヘプタペプチド誘導体の同一モル濃度、同一
溶媒の対照基質溶液を調製する。
全く同一条件にて同量の試料を当該基質溶液に作用せし
めて後、放出された発色団基含有分解生成物を同様に抽
出し、同一波長により吸光度を測定する。
次いでオクタペプチド誘導体の場合の吸光度より対照実
験の吸光度を差し引くことにより試料中のコラゲナーゼ
活性が、試料中の他の非特異的ペプチダーゼによる影響
を受けることなく、高度に精密に求められるのである。
以上の説明にて明らかなとおり本発明は、医学特に診断
の分野に於いて重要な意義を有するコラゲナーゼ活性の
測定に極めて有利に用いることができる新規ペプチド誘
導体およびそれを用いるコラゲナーゼ活性の測定方法を
提供するものである。
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
なお実施例中の各略号は夫々次の意味を有する。
ＢＯＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニル基、Ｚ：ベンジル
オキシカルボニル基、ＮＡＢＳ ： ｐ−（ヒドロキシ
−■−ナフチルアゾ）ベンゼンスルフォニル基、ＰＡＢ
： ｐ−フェニルアゾベンゾイル基、Ｂｚｌ：ベンジル
基、Ｅｔ：エチル基、ＴｏｓＯＨ： ｐ−トルエンスル
ホン酸、ＷＳＣＩ：エチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノプ
ロピルカルボジイミド ＴＨＦ ：テヘ トラヒドロフラン、ＤＭＦニジメチルホルムアミド、 また実施例３および４にて用いた精製コラゲナーゼはＹ
、Ｎａｇａｌ ｅｔ ａｌ （Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 、 ２６３，５６４ （
１９７２））の方法により得たものである。
実施例 Ｉ ＮＡＢＳ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｉｌ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ −Ｄ−Ａｒｇ −Ｏ
Ｈの合成１）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ
−ＯＢｚｌの合成Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ｏＢｚ
ｌ （１１，８，９，０，０３ｍｏｌ）に冷却下トリフ
ルオロ酢酸（３０−）を加えた後、室温で２時間攪拌し
た。
薄層クロマトグラフィーで反応が終了したのを確認した
後、減圧下にトリフルオロ酢酸を留去し、残渣にエーテ
ルを加えて混練して固体にし、エーテルはデカントして
除いた。
同様の操作を２回繰り返した後、固体は水酸化ナトリウ
ム上減圧下に乾燥した。
この固体をｌＯ〇−のＴＨＦに溶解し、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐ
ｒｏ −ＯＨ（６，５ｇ、 ０．０３ ｍｏｌ ）、ｌ
−ヒドロキシベンット１ごアソ゛−ル（４，９ｇ。
０．０３６ ｍｏｌ ）を加え、冷却下にＷＳＣＩ （
６，６ｍｌ 、 ０．０３６ｍｏｌ ）を加え、 その
まま１時間攪拌した。
その後、室温で１夜攪拌した。反応液を減圧下に濃縮し
、残渣にクロロホルムを加えて溶解し、クロロホルム層
を、水、ＩＮ塩酸、水、５％炭酸水素ナトリウム水溶液
、水、飽和食塩水の順に洗浄した後、芒硝で乾燥した。
芒硝を除いた後、クロロホルムを減圧下に留去し、残渣
にヘキサンを加えて固体を得た。
メタノール−エーテルより再結晶した。
２）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨの
合成りｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ
ｌ（４，０Ｅｌ 、 ８．２ ｍｍｏｌ ）を９０％メ
タノール水溶液（６０ｍのに溶解し、Ｐｄ−大さじ１杯
加え、水素ガスを６時間通じた。
薄層クロマトグラフィーで反応が終了したのを確認した
後、反応液を濾過して触媒を除き濾液は、減圧下に濃縮
乾固した。
残渣にエーテルを加えて固体を得た。メタノール−エー
テルから再結晶した。
収量２．９ｇ（９１％） ３） Ｄ−ｋｒｇ （ＮＯ２） −０Ｂ ｚ １ ・
２Ｔ ｏｓＯＨの合成Ｈ，Ｇｉｂｉａｎ ｅｔ ａｌ
（Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ。
Ｃｈｅｍ、、６４２，１４５（１９６２）”］の方法に
より得たＤ−Ａｒｇ （ＮＯ２Ｘ １６．４ ’ｌ 、
７５ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸（３１，４
ｇ、１６５ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（３７ｍＡ
りをクロロホルム（１５０ｄ）に懸濁し、５時間還流し
均一溶液を得た。
上記均一溶液にトルエン（ｉｏｏｉ）を加え減ＥＥ濃縮
し、更にクロロホルム（１５０ｒｒＬｌ）ヲ加え５時間
還流した。
次いで、トルエン（１００−×２）を加え、減ＥＥ濃縮
し、残渣に乾燥エーテルを加え、析出した固体を濾取し
た。
固体は乾燥エーテルで洗浄後、メタノール乾燥エーテル
にて再結晶し五酸化リン上室温で１２時間乾燥した。
収量４２ｇ（８６％） 融点１３２°〜１３５°Ｃ Ｃａ）’ｄ −１２，０（Ｃ＝３ 、ピリジン）４）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−０Ｂｚｌ
の合成 に、Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ （Ｊ 、Ａｍｅ ｒ
、 ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、、８７，６２０（１９６５））の方法により得
たＢｏｃ−Ｌ−ＧＩｎ（５，０９，２０ｍ ｍｏｌ）と
Ｄ −Ａｒｇ （ＮＯ□） −０Ｂｚ １ ・２Ｔｏｓ
ＯＨ（１３，１ｇ 、２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ−ＴＨＦ
（５ＴｒＬｌ〜２０ＴＬｌ）に懸濁し、−１０℃に冷却
後、トリエチルアミン（２，Ｆ３ｒｎｌ 、 ２０ ｍ
ｍｏｌ） １−ハイドロキシベンツトリアゾール（２，
７ｇ、２０ｍｍｏｌ）ＷＳＣＩ （３，６ｒｕｌ、 ２
０ ｍ ｍｏ ｌ ）を順次加え、−１０℃で１時間、
次いで室温で１６時間攪拌した。
反応終了後、ＴＨＦを減圧留去し、残渣をクロロホルム
（３００ｒｎ０に溶解し、ｌＮ塩酸（ｌ Ｏ０ＴＬｌＸ
３ ）、水（１００ｍＯ１１０％炭酸ナトリウム水溶
液（１００就×３）、水（ｉｏ。
献×２）で洗浄した。
次いで、クロロホルムを減圧留去し残渣にエーテルを加
え、析出した結晶を濾取した。
結晶は水、エーテルで洗浄し、メタノール−エーテルよ
り再結晶し、五酸化リン上室温にて１２時間減圧乾燥し
た。
５）Ｂｏｃ−Ｌ−１１ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＥｔ
の合成Ｍ、Ｂｅｒｇｍａｎ ｅｔ ａｌ（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
１０９．３２５．（１９３５））の方法により得たＺ−
Ｌ−Ａｌａ −Ｇｌｙ −ＯＥ ｔ（１２，４ｇ、 ４
０ｍ ｍｏ ｌ）に冷却下２５％臭化水素酢酸溶液５０
縦を加え、室温で１時間攪拌した。
上記溶液にエーテルを加えると固体が析出した。
その固体をエーテルで洗浄し、水酸化ナトリウム上減圧
乾燥をした。
次に、得られた固体をＤＭＦ３０−に溶解し、冷却下ト
リエチルアミンでｐＨ７〜７．５としＮ−ｔ−ブチルオ
キシカルボニル−Ｌ−イソロイシンのＮ−ハイドロキシ
コハク酸イミドエステル１４．４ Ｆｉ （４４ｍｍｏ
ｌ）を加え室温で２４時間攪拌した。
反応溶液に水２００ＴｒＬｌを加え、酢酸エチル（２０
０ＴＬｌ、 １５０ｍｌ！、１００ｍＯで３回抽出し
、有機層をｌＮ塩酸、水：５％重炭酸水素ナトリウム水
溶液で順次洗浄後、脱水硫酸マグネシウムで乾燥した。
酢酸エチルを減圧留去し、残渣にエーテルを加えると結
晶が析出した、結晶を濾取し、酢酸エチル−エーテルよ
り再結晶し、五酸化リン上室でｖ２時間減減圧燥した。
収量１３．１（８４％） 融点１４８．５°−１４９°Ｃ （ａ ”ｇ” −５０，９，’ （Ｃ＝２．２ 、
エタノール）元素分析 ＣＨＮ％ 計算ｆ直（Ｃ１８Ｈ３□０６Ｎ８として） ５５．７
９８．５８１０．８５分析値 ５５
．５４８．７４１０．８０６） Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉ １ｅ
−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨの合成 Ｂｏｃ−ＬＩ １ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＥｔ （
３，９９、１０ｍ ｍｏｌ ） をジオキサン２０ｒＩ
Ｌｌに溶かし、冷却下攪拌しつつＩＮ水酸化ナトリウム
（Ｉ ＬｍｌＳｌ １ｍ ｍｏｌ） を滴下し、更に
室温で１時間攪拌した。
次いで、反応液をｌＮ塩酸で中和し、ジオキサンを減圧
留去した。
水層をｌＮ塩酸でｐＨ２とし、酢酸エチル（ｌｏｏＴＬ
ｌ。
５０ｍ０で２回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
酢酸エチルを減圧留去し、残渣にエーテルを加えると結
晶が析出した。
結晶を濾取し、酢酸エチル−エーテルより再結晶し、五
酸化リン上室温で１２時間減減圧燥した。
７） Ｂｏｃ−ＬＩ ｌｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ
−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇ （ＮＯ２） −０Ｂｚ ｌの合
成Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌ ｎ−Ｄ−Ａｒｇ （ＮＯ２） −
０Ｂｚ ｌ（５，５９，１０ｍ ｍｏｌ）に冷却下トリ
フルオル酢酸（２０ｍＪ）を加え、更に冷却下に５分間
、次いで室温にて４５分間攪拌した。
次いで、冷却下６Ｎ塩酸／ジオキサン（１，７ｍ７！、
１０ｍ ｍｏｌ）を加え、過剰のトルフルオル酢酸を
減圧留去し、残渣にエーテルを加えると固体が析出した
。
析出固体をエーテルにて洗浄し、水酸化ナトリウム上に
て減匡乾燥した。
得らレタ固体をＤＭＦ −ＴＨＦ （１０ｙｄ〜３０ｒ
ｆＬｌ）に溶解し、−１０℃に冷却しＮ−メチルモルホ
リンにてｐＨ５に調整後、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨ（３，６ｇ、１０ｍｍｏｌ）ｌ−ハ
イドロキシベンツトリアゾール（：ｌ。
１５ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＩ （２，７ｍｌ、１５ｍ
ｍｏｌを順次加え、−１Ｏ℃で１時間、次いで室温で１
６時間攪拌した。
反応終了後、ＴＨＦを減圧留去し、残渣にＩＮ塩酸（ｔ
ｏｏｍｌ）を加え、得られた固体を濾取し、水、５％炭
酸水素ナトリウム、水、エーテルにて洗浄後、ＤＭＦ−
メタノールに加温下に懸濁した。
酢酸エチルを加え、析出した固体を濾取し、五酸化リン
上室温にて１２時間減減圧燥した。
８）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−１
１ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｄ−Ａｒｇ
（ＮＯ２）−ＯＢｚｌの合成 Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ
−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−０Ｂｚｌ （１，２Ｅｌ 、
１．５ｍ ｍｏｌ）に冷却下にトリフルオロ酢酸（１
５ｍＡりを加え、その後室温で１時間攪拌した。
薄層クロマトグラフィーで反応が終了したのを確認した
後、トリフルオロ酢酸を減圧下に留去し、残渣にエーテ
ルを加えて混練し、エーテルはデカントして除いた。
同様の操作を２回繰り返した後、固体を水酸化ナトリウ
ム上減圧乾燥した。
得られた固体を６ＴｒＬｌのＤＭＦに溶解し、Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｐｒ。
−Ｌ−Ｇｌ ｎ−Ｇ１ ｙ−ＯＨ（０，６ｇ、 １．５
ｍ ｍｏｌ）１−ヒドロキシベンツトリアゾール（０
，：ｌ。
２、２５ ｍ ｍｏｌ）を加えた。
冷却下にＷＳＣＩ（０，４７７１７１！、 ２．２５
ｍ ｍｏｌ）を加え、そのまま１時間更に室温で１夜攪
拌した。
反応液にエーテルを加えて固体を析出させ、濾取した。
得られた固体を水、ＩＮ−塩酸、水、酢酸エチルの順に
洗浄した。
９）ＮＡＢＳ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−
１１ｅ−Ｌ−Ａｌ ａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ −Ｄ−Ａ
ｒｇ−ＯＨの合成 Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ −Ｌ−Ｇｌ ｎ−Ｇ１ ｙ−Ｌ−
Ｉ ｌｅ −Ｌ−Ａｌａ −Ｇｌ ｙ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｄ
−Ａｒｇ （ＮＯ２） −ＯＢ ｚ ｌ （３００ｍ９
．０．２８ｍ ｍｏｌ ）にアニソール（０，５ｍ１）
を加え、次いで０℃で弗化水素（７ｍｌ）を加え１時間
反応した。
余剰の弗化水素を減圧下に留去し、残渣にエーテルを加
えて混練して固体とし、エーテルはデカントして除いた
。
同様の操作を２回繰り返した後、水酸化ナトリウム上減
圧乾燥した。
得られた固体を５０％酢酸水溶液に溶解し、’ Ｄ ｏ
ｗｅｘｌ Ｘ ２ （アセテート型）に通じ、同溶媒で
流し出した。
流出液を減圧下に濃縮乾固し、残渣に５ＴＬｌの水を加
えて溶解し、炭酸水素ナトリウム（１１０ｒｎ９．１．
３ｍｍｏｌ）を加え、冷却下にｐ−（４−ヒドロキシ−
■−ナフチルアソ）ベンゼンスルフォニルクロライド（
２４０ｍ９．０．７ｍ ｍｏｌ ）をＴＨＦ５ＴＬｌに
溶解したものを加えた。
その後、室温で３時間攪拌した。
反応液を減圧下に濃縮してＴＨＦを除き、水層は酢酸エ
チルを加えて未反応のｐ−（４−ヒドロキシ−ｌ−ナフ
チルアゾ）ベンゼンスルフォニルクロライドを抽出して
除いた。
次に、水溶液は大量の水にて希釈した後、ハイポーラス
樹脂（ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０）に通じた。
樹脂を大量の水で洗浄した後、９０％メタノール水溶液
で溶出した。
溶出液を減圧下に濃縮乾固し、残渣に５０％酢酸水溶液
を加えて溶解し、Ｄｏｗｅｘ Ｉ Ｘ ２ （アセテー
ト型）に通じ５０％酢酸水溶液で流出した。
流出液は減圧下に濃縮乾固し、残渣に酢酸エチルを加え
て赤色固体を得た。
収量 １９０■（５７％） 融点（分解点） ２３０°〜２３９℃ 実施例 ２ ＰＡＢ−Ｌ−Ｐ ｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｉ
１ｅ−Ｌ−Ａｌａ −Ｇｌｙ −Ｌ−Ｇｉｎ −Ｄ−Ａ
ｒｇ−ＯＨの合成１）ＰＡＢ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ
−Ｇｌｙ−ＯＨの合成Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＧＩｎ−Ｇｌｙ
−ＯＨ（４００■、１．３ｍｍｏｌ） を５ＴＬｌの
水に溶解し、炭酸水素ナトリウム（２２０ｍｔｊｌ、
２．６ｍｍｏｌ）を加え、冷却下に、ｐ−フェニルアゾ
ベンジルクロライド（３２０ｍ９ 、１．３ ｍ ｍｏ
ｌ ）を５ｍｌのＴＨＦに溶解したものを加え、その後
室温で３時間攪拌した。
反応液を減匡下に濃縮してＴＨＦを留去した後、ＩＮ−
塩酸で水溶液のｐＨを２とし、酢酸エチルを加え抽出し
た。
酢酸エチル層は飽和食塩水で洗浄し、芒硝で乾燥した。
芒硝を除去した後、減匡下に濃縮乾固し、残渣をメタノ
ール−エーテルから再沈澱した。
収量 ３６０■（５３□） 融点（分解点）１８９８〜１９４℃ （ａ）２８ −２．０°（Ｃ＝０．５．ＤＭＦ）元
素分析 ＣＨＮ％ 計算値 ５５．６０５．８８１５．５
６（Ｃ２５Ｈ２８０ｅ Ｎｏ・７Ｈ２０として）分析値
５５．６１５．４８１５．３３２
）ＰＡＢ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−１１
ｅ−Ｌ−Ａｌａ −Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｄ−Ａｒｇ
（Ｎｏ２） −０Ｂｚｌの合成 りｏｃ −Ｌ−Ｉ １ｅ−Ｌ−Ａｌａ −Ｇｌ ｙ−Ｌ
−Ｇｌ ｎ−Ｄ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−０Ｂｚｌ （２０
０７７１、０，２６ｍｍｏｌ）に冷却下にトリフルオロ
酢酸を加え、室温で１時間攪拌した。
薄層クロマトグラフィーで反応が終了したのを確認した
後、余剰のトリフルオロ酢酸を減匡下に留去し、残渣に
エーテルを加え混練して固体とし、エーテルはデカント
して除いた。
同様の操作を２回続けた後、固体は水酸化ナトリウム上
減圧乾燥した。
得られた固体を３１１ＬｌのＤＭＦに溶解し、ＰＡＢ−
Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１３０ｍ１ｉ
ｌ 、 ０．２６ ｍ ｍｏｌ）ｌ−ヒドロキシベンツ
トリアゾール（７０■。
０、５２ ｍ ｍｏｌ）を加え、冷却下にＷＳＣＩ（０
，１ｍｌ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、１時間攪拌した
。
更にその後室温でｌ夜攪拌した。
反応液にエーテルを加えて固体を濾取し、水、ｌＮ塩酸
水、酢酸エチルの順に洗浄した。
収量 ２３０Ｔｎ９（７５％） ３）ＰＡＢ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｌ−１
１ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌ ｎ−Ｄ−Ａｒｇ
−ＯＨの合成 ＰＡＢ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｌ−Ｉ １ｅ−Ｌ−
ＡｌａＧｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ −Ｄ−Ａｒｇ （ＮＯ２）
−０Ｂ ｚ ｌ （２００１１１９、０，１７ｍ
ｍｏｌ）にアニソール０．５ｍｌを加え、ｏ’ｃで弗化
水素７ＴＩＬｌで１時間反応した。
余剰の弗化水素を減モ下に留去し残渣にエーテルを加え
て固体としエーテルはデカントして除いた。
同様の操作を２回繰り返し、得られた固体は、水酸化ナ
トリウム上減圧下に乾燥した。
この固体を５０％酢酸水溶液に溶解し、 −、Ｄｏｗｅ
ｘｌ×２（アセテート型）に通じ、５０％酢酸水溶液で
流出させた。
流出液は減圧下に濃縮乾固し残渣に酢酸エチルを加えて
橙色固体を得た。
収量 １５０１ｎ９（８０％） 融点（分解点） １９６８〜２０５℃ （ａ）背−−３４，９゜ （Ｃ＝０．４ 、５０％酢酸水溶吻 実施例 ３ 基質としてＮＡＢＳ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｌ−１１ｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｄ−
Ａｒｇ−ＯＨを用い基質濃度が５Ｘ１０”−’Ｍとなる
様に２０％エタノール −０，０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，８、０，１５Ｍ ＮａＣ１，５ｍＭ Ｃａ
Ｃ１２ｆｉ有）に溶解した。
上記基質溶液０．５１１Ｌｌに緩衝液で稀釈した精製コ
ラゲナーゼ（１７，４ｕｎｉｔｓ ７ｍｌ ） ０．１
−を添加し反応を開始した。
６０分後、反応液に０．１ｒｆｌｌの５Ｎ塩酸を加え酵
素反応を停止させた。
次いで酢酸エチル１ｍｌを加えてＮＡＢＳ含有疎水性分
解物を抽出した。
遠心機を用いて３，０００〜５．０００ ｒｐｍ １０
分間室温で遠心分離し、有機層を０．５−セルに分取し
３８９ ｎｍに於ける吸光度を測定し酵素活披を測定し
た、その結果活性はＯＤ ３８９／ ｈｒ／ｍＡ’＝０
．１００であった。
実施例 ４ 基質とじＰＡＢ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ−Ｃ１ｙ−Ｌ
−Ｌｌｅ−Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒ
ｇ−ＯＨを用い基質濃度が５Ｘ１０−’Ｍとなる様に０
．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８、０，１５Ｍ
ＮａＣ１。
５ｍＭ ＣａＣｌ２含有）に溶解した。
上記基質溶液０．１ ｍｌに緩衝液で稀釈した精製コラ
ゲナーゼ０．１ ｍｌを添加し反応を開始した。
６０分後、反応液にＩＮ塩酸０．５ ｒｒＬｌを加え反
応を停止させた。
次いで、食塩を加え飽和させた後ＰＡＢ含有疎水性分解
物を酢酸エチル１ＴＩＬｌにて抽出、以後実施例３と同
様に処理し、３２５ｎｍに於ける吸光度を測定した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １一般式 ％式％ （但し、Ｘはｐ−（４−ヒドロキシ−１−ナフチルアゾ
    ）ベンゼンスルフォニル基またはｐ−フェニルアゾベン
    ゾイル基を、ＯＨはＣ−末端が遊離カルボキシル基であ
    ることを、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ。 Ｇｌｙ 、 Ｉ ｌｅ 、 ＡｌａおよびＡｒｇはそれ
    ぞれプロリン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、
    アラニンおよびアルギニン残基を示す。 ）で示されるペプチド誘導体。 ２一般式 ％式％ （（但し、Ｘはｐ−（４−ヒドロキシ−■−ナフチルア
    ゾ）ベンゼンスルフォニル基またはｐ−フェニルアゾベ
    ンゾイル基を、ＯＨはＣ−末端が遊離カルボキシル基で
    あることを、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ。 Ｇｌｙ 、 Ｉ ｌｅ 、 Ａｌ ａおよびＡｒｇはそ
    れぞれプロリン、グルタミン、グリシン、イソロイシン
    、アラニンおよびアルギニン残基を示す。 ））で示されるオクタペプチド遊導体とコラゲナーゼ含
    有試料とを水性溶夜中にて接触せしめ、次いで遊離生成
    するＸ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨを定量
    することを特徴とするコラゲナーゼ活性の測定方法。
JP10350576A 1976-01-24 1976-08-30 ペプチド遊導体及びペプチド誘導体を用いるコラゲナ−ゼ活性の測定方法 Expired JPS5843389B2 (ja)

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US05/761,020 US4138394A (en) 1976-01-24 1977-01-21 Peptide derivatives and a method of measuring collagenase activity
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