JPS5843797A - 酵素電極 - Google Patents
酵素電極Info
- Publication number
- JPS5843797A JPS5843797A JP56140324A JP14032481A JPS5843797A JP S5843797 A JPS5843797 A JP S5843797A JP 56140324 A JP56140324 A JP 56140324A JP 14032481 A JP14032481 A JP 14032481A JP S5843797 A JPS5843797 A JP S5843797A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- membrane
- electrode
- immobilized
- immobilized enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化酵素を備えたＩＩ素電極に関する。
固定化酵素膜を備え九酵素電極は、酵素がその基質に対
してのみ選択的に反応を行う機能を利用し九もので、優
れた選択性を有していることと酵素は触媒的作用をなす
ので長時間繰り返し使用できるので高価な酵素でも安価
に分析が行えることから将来の発展が注目されて匹る＠
特に、生化学分析、臨床化学分析等の分野で重畳な役割
をはたし得るものである。例えばウリカーゼを利用した
場合、痛風診断における重畳な役割をはたす尿酸の分析
ができ、糖尿病診断・治療に極めて重畳なグルコースの
分析にはグルコースオキシダーゼが利用できる等、酵素
を利用した酵素電極では、短時間にしかも容易に分析が
行えるので早期診断、ベッドサイドでの治療時等に有用
である。
してのみ選択的に反応を行う機能を利用し九もので、優
れた選択性を有していることと酵素は触媒的作用をなす
ので長時間繰り返し使用できるので高価な酵素でも安価
に分析が行えることから将来の発展が注目されて匹る＠
特に、生化学分析、臨床化学分析等の分野で重畳な役割
をはたし得るものである。例えばウリカーゼを利用した
場合、痛風診断における重畳な役割をはたす尿酸の分析
ができ、糖尿病診断・治療に極めて重畳なグルコースの
分析にはグルコースオキシダーゼが利用できる等、酵素
を利用した酵素電極では、短時間にしかも容易に分析が
行えるので早期診断、ベッドサイドでの治療時等に有用
である。
しかし従来は、直接固定化酵素膜が被検液体である血液
、尿等に接触するので、これらに含まれるタンパク質、
血球、＃素等の付着による性能低下中タンパク質分解酵
素等による酵素の分解等のため、さらに固定化された酵
素が安定性に欠くため酵素電極の感度応答性の低下が著
しくひんばんに洗浄を繰り返したυ、短期間に固定化酵
素膜を交換しなければならない不、便さがあった。また
。
、尿等に接触するので、これらに含まれるタンパク質、
血球、＃素等の付着による性能低下中タンパク質分解酵
素等による酵素の分解等のため、さらに固定化された酵
素が安定性に欠くため酵素電極の感度応答性の低下が著
しくひんばんに洗浄を繰り返したυ、短期間に固定化酵
素膜を交換しなければならない不、便さがあった。また
。
酵素を固定化する際に蝶、固定化方法によシ異なるが一
般に酵素活性が低下し九〇、ｌＩ１票が膜から脱落して
しまい安定性のない固定化酵素膜しか得られなかった。
般に酵素活性が低下し九〇、ｌＩ１票が膜から脱落して
しまい安定性のない固定化酵素膜しか得られなかった。
又、固定化酵素膜の保存は、乾燥状態で又は緩衝液中に
て保存する丸め長期間保存における安定性が必ずしも充
分なものといえず実用的な性能が化酵素層を備えた高感
度で長期間安定な酵素電極を提供することを目的とする
。
て保存する丸め長期間保存における安定性が必ずしも充
分なものといえず実用的な性能が化酵素層を備えた高感
度で長期間安定な酵素電極を提供することを目的とする
。
本発明は電気信号取出のための電極と、酵素賦活剤およ
び酵素又は粒状担体に固定化した酵素をゲル親水性物質
に分散せしめ、かつ前記電極表面に設けられた固定化酵
素層と、前記固定化酵素膜表面に設けられた選択透過層
とを具備した酵素電極であシ、さらに選択透過層として
厚さ方向で孔径の不均一な非対称多孔質膜を用いる事に
より一層優れた特性０酵素電極が得られるというもので
ある。
び酵素又は粒状担体に固定化した酵素をゲル親水性物質
に分散せしめ、かつ前記電極表面に設けられた固定化酵
素層と、前記固定化酵素膜表面に設けられた選択透過層
とを具備した酵素電極であシ、さらに選択透過層として
厚さ方向で孔径の不均一な非対称多孔質膜を用いる事に
より一層優れた特性０酵素電極が得られるというもので
ある。
この様な本発明においｙ、、は固定化酵素膜として酵素
賦活剤および酵素又は粒状担体く固定化した酵素をゲル
親水性物質（分散せしめた固定化酵素を用いる事によ）
酵素活性を高め、高感度とすると共に、さらに酵素の安
定性を高め寿命を著しく改善する事が出来るというもの
である。
賦活剤および酵素又は粒状担体く固定化した酵素をゲル
親水性物質（分散せしめた固定化酵素を用いる事によ）
酵素活性を高め、高感度とすると共に、さらに酵素の安
定性を高め寿命を著しく改善する事が出来るというもの
である。
また本発明における固定化酵素膜表面に設けられた選択
透過膜は被検体よの血球や夕・バク質が固定化酵素層に
付着し汚染するのを防ぎ固定化酵素層においての酵素反
応を防害する成分の影響を低減することができる。特に
選択透過膜として厚さ方向で孔径の不均一な非対称多孔
質膜を用い九場合には酵素が固定化されたゲル親水性物
質が非対称の選択透過膜の孔径が大きい側にうめこまれ
るような固定化酵素膜となり、被検体液に接している側
の小さい孔径からは脱落することがなく、長期間、高感
度を維持している定電な酵素電極が得られる。
透過膜は被検体よの血球や夕・バク質が固定化酵素層に
付着し汚染するのを防ぎ固定化酵素層においての酵素反
応を防害する成分の影響を低減することができる。特に
選択透過膜として厚さ方向で孔径の不均一な非対称多孔
質膜を用い九場合には酵素が固定化されたゲル親水性物
質が非対称の選択透過膜の孔径が大きい側にうめこまれ
るような固定化酵素膜となり、被検体液に接している側
の小さい孔径からは脱落することがなく、長期間、高感
度を維持している定電な酵素電極が得られる。
なお本発明゛における選択透過膜とは、例えばグ・ｉｌ
ルコース、・尿酸、′昇素、コレステロール等の＃素反
応の基質となる化・□番物（主に分子量数十〜千程度）
の１゜ 透過に対して実質的な障害とならず、汚染等の主役をは
たす巨大分子（血液中のタンパク質のほとんどが２万以
上のもの）を通さないものであれば適宜選択する事がで
き、セルロース鐸導体、ポリアミド、ポリアクリロニト
リル、ポリスチレ／等溶媒を決める事が好ましい。また
上記選択透過層は、薄い程応答速度が速くなるが実用上
１０λ〜数μｍ程度とする事が好ましい。
応の基質となる化・□番物（主に分子量数十〜千程度）
の１゜ 透過に対して実質的な障害とならず、汚染等の主役をは
たす巨大分子（血液中のタンパク質のほとんどが２万以
上のもの）を通さないものであれば適宜選択する事がで
き、セルロース鐸導体、ポリアミド、ポリアクリロニト
リル、ポリスチレ／等溶媒を決める事が好ましい。また
上記選択透過層は、薄い程応答速度が速くなるが実用上
１０λ〜数μｍ程度とする事が好ましい。
また、必要に応じて用いられる酵素を結合する一担体と
しては、ポリビニールアルコール、多孔性ガラス、ＰＶ
Ａ繊ｆｉ、スーパーファインファイバー、グラスピース
、ポ、リアノオノマービーズなどが使える。またゲル親
水性物質としては、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ルアミド鱒導体、ポリビニールアルコール、ポリアクリ
ル酸ナトリウムゲル、ポリエチレンオキシド等合成物質
および天然高分子物質のゼラチンデンプン、コンニャク
粉などが使える。
しては、ポリビニールアルコール、多孔性ガラス、ＰＶ
Ａ繊ｆｉ、スーパーファインファイバー、グラスピース
、ポ、リアノオノマービーズなどが使える。またゲル親
水性物質としては、ポリビニルピロリドン、ポリアクリ
ルアミド鱒導体、ポリビニールアルコール、ポリアクリ
ル酸ナトリウムゲル、ポリエチレンオキシド等合成物質
および天然高分子物質のゼラチンデンプン、コンニャク
粉などが使える。
又、酵素活性を促進又は保護する酵素賦活剤としてはウ
レアーゼなどの８Ｈ基をもつ酵素ではシスティン、メル
カプトエタノール、トリプシノーゲンではトリプシンな
どがある◇ 酵素活性の阻害作用を除去する物質としては、一般に酵
素活性を阻害する金属イオンを除去するためのＥＤＴＡ
があシ、ウリカーゼでは混在してぃ篭 るカタラーゼが活性を抑制していると考えられているの
で、カタラーゼの活性を阻害するアジ化ナトリウム（Ｎ
ａＮ５ ）が使用できる。その他、！ＩＩ素に結合して
いる補体、金属イオン等を適宜加える事も安定性、寿命
向上の点から効果がある。
レアーゼなどの８Ｈ基をもつ酵素ではシスティン、メル
カプトエタノール、トリプシノーゲンではトリプシンな
どがある◇ 酵素活性の阻害作用を除去する物質としては、一般に酵
素活性を阻害する金属イオンを除去するためのＥＤＴＡ
があシ、ウリカーゼでは混在してぃ篭 るカタラーゼが活性を抑制していると考えられているの
で、カタラーゼの活性を阻害するアジ化ナトリウム（Ｎ
ａＮ５ ）が使用できる。その他、！ＩＩ素に結合して
いる補体、金属イオン等を適宜加える事も安定性、寿命
向上の点から効果がある。
本発明に用いられる酵素としては、ウレアーゼウリカー
ゼ、トリプシノーゲン、グルコースオキシターゼ、コレ
ステロールオキシターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、クレアチンナーゼ、Ｌ−アミノ酸Ｉ酸化酵素などそ
の他多くの酵素を適宜選択する事ができ、さらにこれら
の酵素はシア端ヒ法、アずド化法、アルキル化法等の共
有結合反応や多官能性試薬（例えば、グルタアルアルデ
ヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート等）を介して化
学結合により上記担体に固定化することができる。
ゼ、トリプシノーゲン、グルコースオキシターゼ、コレ
ステロールオキシターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、クレアチンナーゼ、Ｌ−アミノ酸Ｉ酸化酵素などそ
の他多くの酵素を適宜選択する事ができ、さらにこれら
の酵素はシア端ヒ法、アずド化法、アルキル化法等の共
有結合反応や多官能性試薬（例えば、グルタアルアルデ
ヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート等）を介して化
学結合により上記担体に固定化することができる。
さらに本発明に用いられる電極としては、酸素電極、過
酸化水素電極、炭酸ガス電極、アンモニウムガス電極、
アンモニウムイオン電極、水素イオン電極、カチオン電
極、電導度電極等を用いることができる。
酸化水素電極、炭酸ガス電極、アンモニウムガス電極、
アンモニウムイオン電極、水素イオン電極、カチオン電
極、電導度電極等を用いることができる。
・以下本発明を実施例を用いて詳細に説明する〇実施例
１ カルボキシル基を有する粒子（平均ｆｆ１２μｍ） ３
ｇを塩酸で弱酸性ＫｐＨ調整したイオン交換水２５ｍ１
、中に加え、続いて１．８−ジアンノー４−アミツメチ
ルオクタンを１．５ｍ７加見て攪拌状１１に保つ。粒子
が液中に分散した後、ペプチド合成用水溶性カルｙｉｔ
ジイミド鱒導体（１−シクロへキシル−３−く２−モ
ルフォリノエチル〉カルボシイオド−メソ−Ｐ−）ルエ
ンスルフォネート；］Ｅ）Ｘ化成）ｏ、ｓ ｇを加えて
室温で３時間反応する。続いて。
１ カルボキシル基を有する粒子（平均ｆｆ１２μｍ） ３
ｇを塩酸で弱酸性ＫｐＨ調整したイオン交換水２５ｍ１
、中に加え、続いて１．８−ジアンノー４−アミツメチ
ルオクタンを１．５ｍ７加見て攪拌状１１に保つ。粒子
が液中に分散した後、ペプチド合成用水溶性カルｙｉｔ
ジイミド鱒導体（１−シクロへキシル−３−く２−モ
ルフォリノエチル〉カルボシイオド−メソ−Ｐ−）ルエ
ンスルフォネート；］Ｅ）Ｘ化成）ｏ、ｓ ｇを加えて
室温で３時間反応する。続いて。
この粒子を５ｓグルタルアルデヒ、ド溶液（ｐＨ７，６
）に接触させて酵素固定化用の粒状担体とした０さ、、
に２゜ヨウ、。ついアー贅□１シイ８８ヶオヵル社）溶
液に加えウレアーゼを固定し所定の固定化酵素を得た。
）に接触させて酵素固定化用の粒状担体とした０さ、、
に２゜ヨウ、。ついアー贅□１シイ８８ヶオヵル社）溶
液に加えウレアーゼを固定し所定の固定化酵素を得た。
なお酵素固定化用の粒状担体への酵素固定化量はウレア
ーゼ溶液の吸光度の減少よシ算出したところ約５ｍｇ／
ｇ ｗｅｔ粒子の固定化ウレアーゼ粒子が得られた。
ーゼ溶液の吸光度の減少よシ算出したところ約５ｍｇ／
ｇ ｗｅｔ粒子の固定化ウレアーゼ粒子が得られた。
一方、ゲル親水性物としてケン化度９８．５％、重合度
５００のポリビニールアルコールｔ ”ｌｎＭ ｐＨ７
，５のリン酸緩衝液中に加重量慢になるように調製し、
５０’０に加熱した後急冷し脱気した。この溶液にβ−
メルカプトエタノール１ｍＭを添加して、さらに先のウ
レアーゼを固定した固定化酵素を加え攪拌し、５℃にて
保存した。
５００のポリビニールアルコールｔ ”ｌｎＭ ｐＨ７
，５のリン酸緩衝液中に加重量慢になるように調製し、
５０’０に加熱した後急冷し脱気した。この溶液にβ−
メルカプトエタノール１ｍＭを添加して、さらに先のウ
レアーゼを固定した固定化酵素を加え攪拌し、５℃にて
保存した。
使用の際に第１図に示すように非対称多孔質膜からなる
選択透過膜（１）を５重量−のホウ酸溶液に浸漬して５
分後ひきあけ（第１図ｃＡ））非対称の選択透過膜の孔
径の大きい側（ＩＪＩ）に前記固定化酵素の分散した溶
液をぬ＞（第１図（Ｂ））組成物中のポリビニールアル
コールをゲル化する。
選択透過膜（１）を５重量−のホウ酸溶液に浸漬して５
分後ひきあけ（第１図ｃＡ））非対称の選択透過膜の孔
径の大きい側（ＩＪＩ）に前記固定化酵素の分散した溶
液をぬ＞（第１図（Ｂ））組成物中のポリビニールアル
コールをゲル化する。
このようにしてで髄た固定化ウレアーゼ粒子を：。
分散せしめ九固定化酵素膜（２）が設けられた。選択透
過膜（１）を０．５重量係のホウ酸溶液で洗浄しく第１
図（０＞水溶性物質を除き非対称多孔質膜からなるｊ択
透過１［）内１１（ｌａ）Ｋ接してアンモニｆｔ Ａ
ｌｊ ｘ電極（オリオン社９５−１ｏ）を設け、又外側
（ＩＪＩ）に被検液が接する如くして酵素電極を作成し
九〇このようにした得られた酵素電極（第２図）を用い
、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５をｍｌ１分の速度で
連続的にポンプにょシ送シながら酵素電極の入口で緩衝
液流中に尿素の試料（資）μノをマイクロシリジで注入
する。なお第２図中（１）は固定化酵素膜、（２）は選
択透過膜、（３）はアンそニウム電極筒体、（４）はア
ンモニウムガス透過膜、（５）はスペーサー、（６）は
電極内部液をそれぞれ示す。
過膜（１）を０．５重量係のホウ酸溶液で洗浄しく第１
図（０＞水溶性物質を除き非対称多孔質膜からなるｊ択
透過１［）内１１（ｌａ）Ｋ接してアンモニｆｔ Ａ
ｌｊ ｘ電極（オリオン社９５−１ｏ）を設け、又外側
（ＩＪＩ）に被検液が接する如くして酵素電極を作成し
九〇このようにした得られた酵素電極（第２図）を用い
、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５をｍｌ１分の速度で
連続的にポンプにょシ送シながら酵素電極の入口で緩衝
液流中に尿素の試料（資）μノをマイクロシリジで注入
する。なお第２図中（１）は固定化酵素膜、（２）は選
択透過膜、（３）はアンそニウム電極筒体、（４）はア
ンモニウムガス透過膜、（５）はスペーサー、（６）は
電極内部液をそれぞれ示す。
尿素は固定化酵素膜内で次式のように分解されるのでア
ンモニウムイオンの生成量を電圧変化で測定することに
より尿素量を測定した。
ンモニウムイオンの生成量を電圧変化で測定することに
より尿素量を測定した。
ＪＲ素＋ ＨｚＯ力Ｇ上−＜ ２ＮＨ４” ＋ ＨＣＯ
ｓ−このようにして得た本発明に係る酵素電極を用い人
血清を試料として使用したとき、最初に示し友感度を示
し九まｔ ａｏｏ回以上の繰ｐ返し使用に耐えることが
できた。なお従来方法にょシ得た３０ｇアクリルアシド
モノマーと０．５８ ｇ Ｎ −Ｎメチレンビスアクリ
ルアシドを２５ｒｎｌ Ｏ０，ＩＭ ）リス緩衝液ｐＨ
７，０でとかした固定化ウレアーゼ膜は４００回程度で
使用不可能となった。又、固定化ウレアーゼ粒子の分散
している溶液は５℃で３ケ月以上はウレアーゼ活性の低
下はみられなかった。
ｓ−このようにして得た本発明に係る酵素電極を用い人
血清を試料として使用したとき、最初に示し友感度を示
し九まｔ ａｏｏ回以上の繰ｐ返し使用に耐えることが
できた。なお従来方法にょシ得た３０ｇアクリルアシド
モノマーと０．５８ ｇ Ｎ −Ｎメチレンビスアクリ
ルアシドを２５ｒｎｌ Ｏ０，ＩＭ ）リス緩衝液ｐＨ
７，０でとかした固定化ウレアーゼ膜は４００回程度で
使用不可能となった。又、固定化ウレアーゼ粒子の分散
している溶液は５℃で３ケ月以上はウレアーゼ活性の低
下はみられなかった。
以上詳述した如く本発明によれば、被検体液の酵素電極
の汚染を防ぎ、高感度で長期間安定な酵素電極ができ、
臨床化学分析の七ンサ一部等に使用していくことが可能
である。
の汚染を防ぎ、高感度で長期間安定な酵素電極ができ、
臨床化学分析の七ンサ一部等に使用していくことが可能
である。
第１（５０■（Ｂ） （０は本発明における固定化酵素
膜の製法工程を示す図、第２図は本発明における酵素電
極の断面図である。 １・・・固定化酵素層、 ２・・・選択透過膜（穴径２ ａ＞２ ｂ ）、３・・
・アンモニウムガス電極筒体、 ４・・・アンモニウムガス透過１１１．．５・・・スペ
ーサー、 ６・・・電極内部液 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（はか１名）第
１ 図 第 ２ 図
膜の製法工程を示す図、第２図は本発明における酵素電
極の断面図である。 １・・・固定化酵素層、 ２・・・選択透過膜（穴径２ ａ＞２ ｂ ）、３・・
・アンモニウムガス電極筒体、 ４・・・アンモニウムガス透過１１１．．５・・・スペ
ーサー、 ６・・・電極内部液 代理人 弁理士 則 近 憲 佑（はか１名）第
１ 図 第 ２ 図
Claims (1)
- （１）電気信号取出のための電極と、酵素賦活剤および
酵素又は粒状担体に固定化した酵素をゲル属水性物質に
分散せしめ、かつ前記電極表面に設けられ九固定化酵素
Ｊｌ、！−、前記固定化＃素膜表面に設けられ九選択透
過膜とを具備することを特徴とした酵素電極。 （２、特許請求の範囲第１項において選択透過膜として
厚さ方向で孔径の不均一な伸対称多孔質膜を用いた事を
特徴とする酵素電極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140324A JPS5843797A (ja) | 1981-09-08 | 1981-09-08 | 酵素電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56140324A JPS5843797A (ja) | 1981-09-08 | 1981-09-08 | 酵素電極 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5843797A true JPS5843797A (ja) | 1983-03-14 |
Family
ID=15266163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56140324A Pending JPS5843797A (ja) | 1981-09-08 | 1981-09-08 | 酵素電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5843797A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020509373A (ja) * | 2017-03-03 | 2020-03-26 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． | ナノビーズを含むバイオセンサーの製造方法及びその使用 |
-
1981
- 1981-09-08 JP JP56140324A patent/JPS5843797A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020509373A (ja) * | 2017-03-03 | 2020-03-26 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． | ナノビーズを含むバイオセンサーの製造方法及びその使用 |
| US11585809B2 (en) | 2017-03-03 | 2023-02-21 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Nanobead containing biosensors and methods of production and use thereof |
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