JPS5847257A - 改良された特異抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高い特異性と低い交叉反応性とを有する改良さ
れた抗体の製造法、詳しくはラジオイムノアッセイ法Ｃ
ＲＩＡ法）等の抗原−抗体反応を利用して生体内活性物
質を定量するイムノアッセイ法に適用して、ガストリン
やガストリン様化合物轡の交叉反応性抗原の存在下にお
いても、２等抗原との反応を惹起することなく、通常Ｃ
ＣＫ−８−Ｐ（コレシストキニンーオクタペブタイド）
と呼ばれるコレシストキニン−バンクレオチミンの特定
のＣ−末端ペプチドと非常に高い特異性をもって反応し
、該ＣＣＫ−８−Ｐ等の正確な定量を可能とする新しい
改良された特異抗体の製造法に関する。

ラムノアッセイ法とは例えばＲＩＡ法で代表されるよう
に、ラジオアイソトープで標識した一定量の標識抗原と
非標識抗原（可変量）とが、一定量の抗体に競合的に結
合する免疫反応（抗原−抗体反応）を利用して、上記非
標識抗原としての生体内活性物質尋の測定（定量）、認
識を行なう分析法である。しかしてこのイムノアッセイ
法は、検量に用いる試薬としての抗体が、被検物質とす
る抗原とのみ厳密に反応するとと即ち特異性を有するこ
とを前提として成シ立っている。しかしながら抗体とは
、本来免疫化された動物よシ採血して得られる抗血清（
各種抗原に対する反応性を有する抗体の混合物）であり
、試薬としての抗体は通常該抗血清より免疫吸着剤等を
利用して精製されるものではあるが、尚単一抗原とのみ
特異的に反応することは稀であシ、シばしば抗原として
の被検物質と類似構造を有する物質とも反応（交叉反応
）する。この様な交叉反応はイムノアッセイつて従来よ
シイムクアッセイ法における主要な研究は、上記被検物
質に対してのみ特異反応性を有する抗体の製造入手に向
けられており、例えば被検物質の化学構造上の種々の部
位に担体を結合させて抗原を作成し、該抗原の担体上に
、該抗原と交叉反応性を示す抗原とは構造を異にする部
分を立体化学的に露出させ、この露出された部分に対す
る抗体を収得しようとする試みが種々なされている。し
かし寿からこの様々抗体の製造法は、理論的には可能で
あっても、実際には極めて複雑な手法と合成過程を必要
とするものであり、しかもひとつの抗体についての成功
例を他の抗体に演紳すること自体困難である０　・ 一方コレジストキニンーバンクレオチミン（Ｃｈｏｌｅ
ｃｙｓｔｏｋｉｎｌｎ−ｐａｎｃｒｅｏｚｙｍｉｎ、以
下ＣＣＫ−ｐｚと略す）は、主に小腸から分泌され、膵
臓の酵素分泌を刺激し、胆嚢収縮を起こす消化管ホル８
− モンである。このＣＣＫ−ｐｚは、８３個のアミノ酸か
らなるポリペプチドでアリ、その生物活性はＣ−末端の
８つのアミノ酸部分（ＣＣＫ−８−Ｐ）に存在すること
が知られている。このＣＣＫ−８−Ｐおよびその反応性
リセゾターは近年、脳にも存在することが解明され、こ
の物質の神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔ
ｅｒ　）としての機能を調べることや、胃腸管の疾患と
密接に関係のあるこの物質の分泌と作用を知チ賃ること
か望まれている。しかるに上記ＣＣＫ−８−ＰのＣ末端
の５個のアミノ酸配列は、胃において酸分泌を刺激する
ホルモンとして知られているガストリンのＣ末端の５個
のアミノ酸配列と同じである。従って、従来抗ＣＣＫ−
８−Ｐ抗体は、通常ガストリンとも高い交叉性を示た。

本発明の目的は、上記の通り交叉反応性物質が４− できなかっ九ＣＣＫ−８−）’の正確な定量を可能とす
る新しい抗体を提供することにある。即ち本発明はＣＣ
Ｋ−８−Ｐに対して高い特異性を有し、カストリンのよ
うな交叉反応性を示す他の物質とは実質的に反応しない
特異な免疫反応性を有する抗体を提供することをその目
的としているＯ 本発明者は、上記目的から鋭意研究を重ねた結果、特定
のβ−アラニル　テ［ラカストリンとＤ−グルタミン酸
−Ｄ−リジン共重合体（以下Ｄ−ＧＬと呼ぶ）との結合
物を哺乳動物体に投与する時には、上記Ｄ−ＧＬに特有
のＢ細胞（抗体産生前駆細胞）に対する免疫学的無応答
誘導活性によって、之を投与された哺乳動物に、上記β
−アラニル　テトラガストリン又はこれと構造的に類似
する抗原決定基を有する抗原例えば晶体的にはガストリ
ンに対しては免疫学的に応答しない性質が誘起されると
いう事実及びＮ％ｐ）Ａ養土記動物体にＣＣＫ−８−Ｐ
−担体複合体を投与する時には、該動物体内に上記ＣＣ
Ｋ−８−Ｐに対して極めて特異選択的に反応し、上記ガ
ストリンに対しては実質的に反応しない特殊な抗体が産
生されるという事実を見い出した。

本発明は上記新しい事実の発見に基づいて完成されたも
のである。

即ち本発明は、式 ％式％ で表わされるβ−アラニル　テトラガストリンとＤ−Ｇ
Ｌとの結合物を喘乳動物繻に投与して上記β−アラニル
　テトラガストリン又はこれと構造的に類似する抗原決
定基を有する抗原に対して免疫学的無応答性を上記動物
に誘起させると共に該動物奪に式 で表わされるＣＣＫ−８−Ｐと担体との複合体から成る
抗原を投与し、生成する抗体を採取することを特徴とす
る、上記ＣＣＫ−８−Ｐに対して特異反応性を有する抗
体の製造法に係る。

本明細書において、上記β−アラニル　テトラガストリ
ン及びＣＣＫ−８−Ｐ並びに他のペプチド鎖の表示は、
ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの規定に従うものであシ、各基を
構成するアミノ酸は夫々法のものを意味する。

Ａｌａ・・・　β−アラニン Ａｓｐ・・・　アスパラギン酸 Ｔｙｒ・・・　チロシン Ｍｅｔ・・・　メチオニン Ｇｌｙ・・・　グリシン Ｔｒｐ・・・　トリプトファン Ｐｈｅ・・・　フェニルアラニン 本発明によれば、通常の免疫学的手法を利用することに
よって、従来製造不可能でおったＣＣＫ−８−Ｐに対し
て特異反応性を有する抗体を容易に製造することができ
る。

本発明方法により得られる抗体は、ＣＣＫ−８−のガス
トリン等とは実質的に反応しない。従ってこれは、イム
ノアッセイ法に利用して、上記ＣＣＫ−８−Ｐの正確な
定量を可能とするものであシ、本発明はかかるＣＣＫ−
８−Ｐの免疫学的測定技術をも提供するものである。ま
た本発明方法に従い特定の免疫学的無応答性を誘起され
た動物へのＣＣＫ−８−Ｐ抗原（ＣＣＫ−８−Ｐ−担体
複合体）の投与によれば、目的とする特異抗体産生能を
有し、交叉反応性が極力抑制された抗体を産生じ得るク
ローンが確立できる。該クローンからは、これを公知の
細胞融合技術に利用して上記目的の特異抗体産生能を有
するハイブリッド（交雑細胞）を作成することができ、
該ハイブリッドの利用によれば目的抗体の大量生産技術
をも提供できる。

本発明方法においては、まずβ−アラニル　テトラガス
トリンとＤ−ＧＬとの結合物を哺乳動物に投与して上記
β−アラニル　テトラガストリン又はこれと構造的に類
似する抗原決定基を有する抗原に対して免疫学的無応答
性を上記動物に誘起させる。

上記において、β−アラニル　テトラガストリンは、公
知であ如、市販のもの又は通常のペプチド合成法に従い
製造されたもののいずれも同様に利用できる。

上記ペプチド合成法は、具体的には、［ザ　ペプチド（
Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）　Ｊ第１巻（１９６６年
）［５ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ著、　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　］あるいは「ペ
プチド合成」〔東屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）
〕に記載されており、たとえばアジド法、クロライド法
、酸無水物法、混酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル
法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドエステル法、シアンメチルエステル法等）
、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾ
ール法、酸化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（ＨＯＮＢ
、　ＨＯＢＬ％ＨＯ８ｕ　）法などに従えばよい。上記
においては、同相合成法及び液相合成法のいずれをも適
用できるが、液相合成法が好ましい。

また上記において用いられるＤ−ＧＬも公知のものであ
り、本発明では特に分子量が、約２７．０００から約１
２０，０００のものが好ましく用いられる。

Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンのモル比は通常７０２８
０〜８０ニア０、好ましくは６０：４０のものが用いら
れる。この種の共重合体は、例えばマイルス・イエーダ
社（Ｍｉｌｅｓ　−Ｙｅｄａ　）から市販されている。

また上記Ｄ−ＧＬは、常法によシ、予めＤ−グルタミン
酸−γ−メチルエステルのＮ−カルボン酸無水物および
ε−Ｎ−カルボンベンジルオキシ−Ｌ−リジンのＮ−カ
ルボン酸無水物を合成し、之等を適当なアミンの存在下
に共重合させ、次いで脱保睦反応を行なうことによって
調製することもできる。

上記β−アラニル　テトラガストリンとＤ　−ＧＬとの
結合物は、ペプチド化学分野において常用される通常の
ペプチドと他物質との結合方法に従い容易に生成できる
。上記方法としては、例えばβ−アラニル　テトラガス
トリンに直接Ｄ−ＧＬを結合させる方法及び予めβ−ア
ラニル　テトラガストリン又はＤ−ＧＬに適当な反応基
例えば−ＮＨ２基、−８Ｈ基等を導入後これらを結合さ
せる方法を例示できる。之等の方法においては適当な結
合試薬例えばグリオキサール、マロンジアルデヒド、ゲ
ルタールアルデヒド、サクシンアルデヒド、アジボアル
デヒド等の脂肪族ジアルデヒド類ｉ　Ｎｌ脣−〇−フェ
ニレンジマレイミド、Ｎ、Ｎ　−ｍ−フェニレンジマレ
イミド等のシマレイミド化合物；メタマレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、４−（
マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ
ル−Ｎ−ヒドロギシサクシンイミドエステル等のマレイ
ミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロキシリフシンイミドエス
テル化合物ｉ　Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミ
ド、Ｎ−エチル−Ｎ−ジメチルアミノカルボジイミド、
ｌ−エテル−８−ジインプロピルアミノカルポジイミド
、ｌ−シクロヘキシル−８−（２−モルホリニル−４−
エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド類−Ｎ−サ
クシンイミジル−８−（２−ピリジルチオ）プロピオネ
ート等を使用できる。応等結合試薬を用いる方法の詳細
は、例えばバイオケミストリー［Ｆｕ−Ｔｏｎｇ　Ｌｉ
ｕ　ｅｔ　。

ａｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１８（４
）　、　６９０−６９７（１９７９））に記載されてい
る。

上記β−アラニル　テトラガストリンとＤ−ＧＬとの結
合反応において、β−アラニル　テトラガストリン及び
Ｄ−ＧＬの使用割合は、適宜に決定できるが、通常Ｄ−
ＧＬに対してβ−アラニルテトラガストリンを１０〜４
０倍モル、好ましくは１５〜２５倍モルとするのが好ま
しい。また上記反応は一般に適当な緩衝液例えば０．２
　Ｍ　１７ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）、０．１２５　Ｍ
　リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）等の緩衝液中０℃〜室温
にてｌθ〜６０分間程度を要して好適に進行する。

上記により目的とするβ−アラニル　テトラガス）　Ｉ
ＪンーＤ−ＧＬ結合物が得られる。これは常法に従い例
えは透析法、ゲル濾過法、分別沈殿法等によシ容易に単
離精製でき、また通常の凍結乾燥法によシ保存できる。

かくして得られる結合物中で、特にＤ−ＧＬＩモルに対
してβ−アラニルテトラガストリンが１６〜２５モル結
合したものは本発明に好ましく用いられる。

上記により得られるβ−アラニル　テトラガストリン−
Ｄ−ＧＬ結合物の１クロ乳動物への投与は、通常の免疫
学的方法に従い行なうことができる。

この際哺乳動物としては、特に制限なく各種の動物を利
用できるが、通常マウス、ラット、モルモット等の小動
物及びウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ等の大
動物を利用できる。上記投与は、好ましくはβ−アラニ
ル　テトラガストリン−Ｄ−ＧＬ結合物の所定量を生理
食塩水で適当濃度に希釈した液を、供試動物の皮下もし
くは腹腔内に投与することにより実施される。投与せは
、供試動物の種類等に応じて適宜に決定できる。通常マ
ウス等の小動物では、上記結合物をβ−アラニルテトラ
ガストリン換算で約１００〜５００μｙ／　１回／１匹
、１だウサギ等の大動物では、同様に約２〜１０　ｍｆ
７１回／１匹とすればよい。投与時期、投与回数、投与
期間等は特に限定されず、単−回投与のみによってもよ
いが通常２〜４週間毎に繰シ返し複数回（２〜１０回程
度）行なうのが好ましい。

本発明では、上記β−アラニル　テトラガストリン−Ｄ
−ＧＬ結合物の投与と共に（通常その投与後の適当な時
期に）、ＣＣＫ−８−Ｐ−担体複合体（抗原）の投与を
行なうことを必須とする。

ここでＣＣＫ−８−Ｐは公知であり、市販品及び前述し
たβ−アラニル　テトラガストリンと同様の通常のペプ
チド合成法に従い製造したもののいずれをも同様に使用
できる。また担体としては、通常抗原の作成に当シ慣用
される高分子の天然若しくは合成蛋白質を広く使用でき
る。該担体としては、例えば馬、牛、ウサギ、人、ヒツ
ジ婢の動物の血清アルブミン類、血清グロブリン類、チ
ログロブリン類、ヘモグロブリン類等；回虫よシ抽出さ
れた蛋白質（アスカ−リス抽出物、特開昭５６−１６４
１４号公報、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎ、、Ｉｌｌ　、２６０〜２６８（１９７Ｂ）
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎ、　、　１２２　、８０２〜８０８（１９７
９）、Ｊ　。

Ｉｍｍｕｎ、、９８，８９８〜９００（１９６７）及び
Ａｍ。

Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１９９，５７５〜５７８（１９
６，０）に記載されたものまたはこれらを更に精製した
もの）；ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン又はオ
ルニチンを含む共重合体；スカシガイのヘモシアニン（
Ｋｅｙｈｏｌｅ　１ｉｍｐｅＬ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉ
ｎ、　ＫＬＨ）等を例示できる。

上記ＣＣＫ−８−Ｐと担体との結合は、前記したβ−ア
ラニル　テトラガストリンとＤ−ＧＬとの結合と同様に
して、直接に又は同様の結合試薬を用い、これを中間に
介して行なうことができる。

特に上記結合試薬を用いる場合、該試薬としては、前記
β−アラニル　テトラガストリンとＤ−ＧＬとの結合に
用いたと同一のものを用いるのが好ましい。

上記ＣＣＫ−８−Ｐと担体との結合反応は、例えば適当
な緩衝液例えば０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）や
０．１２６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）等の緩衝液中
でθ℃〜室温下に約１０〜６０分間を要して好適に進行
する。また用いられる各試薬の使用割合は、担体１モル
に対して通常ＣＣＫ−８−Ｐを５〜８０倍モル、好まし
くは８〜２０倍モルとするのが適当である。反応終了後
得られる複合体は、常法に従い例えば透析法、ゲル濾過
法、分別沈殿法等によシ容易に単１１ｍ精製でき、更に
これは通常の凍結乾燥法によシ保存することができる。

かくして得られる複合体中、担体１モルに対してＣＣＫ
−８−Ｐが８〜２０倍モル結合した複合体は、特に本発
明に有利に用いられる。

上記によ９得られるＣＣＫ−８−Ｐ−担体複合体（抗原
）の哺乳動物への投与は、上記β−アラニル　テトラガ
ストリン−Ｄ−ＧＬ結合物と同様にして行なうことがで
きる。投与時期は、通常上記β−アラニル　テトラガス
トリン−Ｄ−ＧＬ結合物の投与の２〜８日後とするのが
好ましく、投与は通常上記複合体（抗原）を適当濃度に
希釈した生理食塩水の形態で、供試動物の皮下、腹腔内
もしくは足藤と背中とに行なうのがよい。また上記抗原
の投与は、好ましくは複数回繰返し行なうのがよく、投
与に際しては抗原を含有する生理食塩水と共に、施％４
６ｉ１ｋｋ完全フロイントアジユバ７　）　（Ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　ＡｄｊｕｖａｎＬ　）　　
や不完全７０イドアジユバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ
　ＦｒｅｕｎｄｓＡｄｊｕｖａｎｔ）を併用するのが好
適である。

上記抗原の１回投与量は、供試動物の種類等によシ一定
ではなく適宜に選択すればよい。通常マウス等の小動物
ではＣＣＫ−８−Ｐ換算で１匹！回当シ約！〜１００μ
ノ、またウサギ等の大動物では１匹１回当υ約ｌＯμｙ
−ｘｍｙ　とするのが好ましい。この抗原の投与は、特
に上記β−アラニルテトラガストリン−Ｄ−ＧＬ結合物
の投与と平行して即ち該結合物の投与の２〜８日後に繰
返して行なわれるのが好ましく、その投与回数及び投与
期間は、上記結合物のそれらと同様に２〜４週間間隔で
２〜ｌＯ回従って約１−１０ケ月を要して行なうのが望
ましい。

かくしてβ−アジニル　テトラガストリン−Ｄ−ＯＬ結
合物を投与し、引き続きＣＣＫ−８−Ｐ−担体複合体を
投与する免疫操作を繰シ返し行なうことによシ、供試動
物体に私、上記結合物の投与による特定抗原に対する免
疫学的無応答性が誘起されると共に、上記複合体（抗原
）の投与によって、該抗原に対してのみ特異選択性を有
する非常に低交叉性の、目的とする抗体が産生される。

目的抗体の採取は、上記結合物及び複合体（抗原）の最
終投与の１〜２週間後に、免疫化された動物よ如採血し
、これを遠心分離後抗血清を分離採取することによシ、
又はこれに引き続き得られる抗血清を適当な吸着担体を
用いたカラムクロマトグラフィー、アフイニテイクロマ
トグラフイー等により更に精製することもできる。

かくして本発明の特異抗体を得る。これは前述した通り
、非常に優れた特異性を有し且つ低交叉性を示し、従っ
てこれを利用して例えばＲＩＡ法によＪＣＣＫ−８−Ｐ
の定量を正確に高精度で行なうことができる。即ち本発
明によればガストリンとＣＣＫ−８−Ｐとに共通する下
記アミノ酸配列Ｔｒｐ　−Ｍｅ　ｔ　−Ａｓｐ　−Ｐｈ
ｅに対する抗体産生能が著しく抑制され、該アミノ酸部
位に対しては反応せず、ＣＣＫ−８−Ｐの残シのアミノ
酸配列部位に対して反応する抗体が得られる。従って本
発明抗体はＣＣＫ−８−Ｐの上記アミノ酸配列及び５０
８Ｈ基を強く認識することによって該ＣＣＫ−８−Ｐの
定量に有用であると共に該ＣＣＫ−８−Ｐの上記認識部
位と同一アミノ酸配列を有する例えばＣＣＫ　、２、Ｃ
ＣＫ８８、ＣＣＫ　８．〜Ｓ〜〜％〜等の各ペプチドと
も特異的に即ちガストリン等との交互反応なしに反応し
、之等の定量をも可能とするものである。

また本発明によシ得られる抗体は、これを酵素または螢
光物質で標識することによってエンザイムイムノアツセ
イ（ＥＩＡ）法、フローレツセンスイムノアツセイ（Ｆ
ＩＡ）法等に使用できる。

さらに該抗体は公知の不溶化させる物質と反応させて不
溶化抗体とすることもできる。

以下本発明を更に詳しく説明するため、β−アジニル　
テトラガストリン−Ｄ−ＧＬ結合物及びＣＣＫ−８−Ｐ
−担体複合体の夫々の製造例を参考例として挙げる。

参考例１ β−アラニル　テトラガストリン−Ｄ−ＧＬ結合物の製
造 ■　Ｓ−アセチル−メルカプト−サクシニル−Ｄ−ＧＬ
（Ａｃ−８−Ｄ−ＧＬ）の合成 り−ＧＬ（マイルスーラボラトリーズ社製、分子量６８
５００、Ｄ−グルタミン酸：Ｄ−リジン−６：４重量比
）の６００ｍＰＣ８，７６μモル）を、０．１２５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　１８．５ｍｌに溶解し、ｌ
Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整する。この溶
液にＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（シグマ社
製）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）溶液（酸無水
物８５．７　ｍｆをＤＭＦｌｍｇに溶解したもの）％７
５０μｆｆ　を加え、室温下８０分間撹拌する。その間
ｐＨは７．２と保持する。反応後、反応液をセファデッ
クスＧ−２５（ファルマシア社製）のカラムに通し、０
．０１Ｍ−エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む
リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）を用い４℃下に溶出させて
反応生成物と未反応の試薬とに分離する。

この反応生成物を含む溶液１００μｅに０．５ＭＮ−ヒ
ドロキシアミン（ｐＨ７，８）水溶液１００μＮ（６０
μモル）を加え、８７℃で２０分間インキニーベートす
る。

エルマン（Ｅｌｌｍａｎ　）らの方法［アーカイツクバ
イオケミー・バイオフイジイーク（Ａｒｃｈ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　、第８２巻ｐ７０
（１９５９））によ、りＤ−ＧＬに導入されたＳ−アセ
チルメルカプト基の数を算出した。即ち、この反応溶液
５０μｅに脱酸素した０、０１Ｍの５，５−ジテオビス
（２−ニトロ安息香酸）のメタノール溶液０、　Ｉ　ｍ
ｌを加え、ｐＨ８，０のトリス緩衝液中で２０分間反応
させ、次いで４１２　ｎｍの吸光度を測定する。

Ｄ−ＧＬＩ分子当りに導入されたＳ−アセチルメルカプ
ト基の数は約１９であった。

（１３１ｍ−マレイミドベンゾイルペンタガストリン（
ＭＢ−β−アラニル　テトラガストリンの合成 β−アラニル　テトラガストリン１８７ｍｊＪ（１７４
μモル）に、０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０
０Ｊを加え溶解し、これにｍ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ１ピア
スケミカル（Ｐｌｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　
、）社製）２７４゜２ｍ１ＰのＤＭＦ溶液１０．８　ｍ
ｌを一度に加え、室温下２０分間撹拌する。薄層クロマ
トグラフィー〔展開溶媒シクロヘキサン：酢酸エチル（
１：２）、容量比］によシ反応が充分進んでいることを
確認の上、ジクロルメタンで２回洗浄後、上層のＭＢ−
β−アラニル　テトラガストリンを含む緩衝溶液を得る
。

β−アラニル　テトラガストリン−Ｄ−ＧＬ結合物の合
成 前記０項で調製したＡｃ−８−Ｄ−ＧＬ浴溶液０項で調
製したＭＢ−β−アラニル　テトラガストリン溶液を混
合し、窒素気流下５Ｍヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ
７，８）斗５ｒｎｌを加え、室温で撹拌反応させる。

ヒドロキシルアミン水溶液を加えてから２時間後に２メ
ルカプトエタノール（最終濃度１．７８５　ｍＭ）を加
え、さらに２０分撹拌する。

この反応液を透析膜（セロファン膜）を用いて０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて約２４時間透析する
。透析後得られる溶液は直接もしくは希釈して使用する
。反応の完結は、２８゜ｎｍでの吸光度の変化によ）確
認した。

この様にして作成されたβ−アラニル　テトラガストリ
ン−Ｄ−ＧＬ結合物はＤ−ＧＬ　１モルに対してβ−ア
ラニル　テトラガストリン１８．９モル結合したもので
あった。

参考例２ ＣＣＫ−８−Ｐ−ＫＬＨ複合体の製造 ■　Ｓ−アセテルーメルカプト−サクシニル−ＫＬＨ（
Ａｃ−５−ＫＬＨ）の合成 参考例１−■におけるＡｃ−８−Ｄ−ＧＬの合成と同様
にする。合成に先立ちＫＬＨ（カルバイオケム社（Ｃａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍ社）製、分子量ｔｏｏｏｏｏ）のｌｊ
ｌを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解し、同
緩衝液で透析した。この溶液の２８０ｎｍでの吸光度測
定によるＫＬＨ含有量は約６９８．１＝ｆ／１５　ｍｌ
であった。

上記ＫＬＨ溶液に、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無
水物ｔ　ｏ　ｏ　ｍｙのＤＭＦ溶液６　ｍｌを加え、参
考例！−■項と同様の操作を行ない、ＫＬＨＩ分子に対
してＳ−アセチルメルカプト基１８．２７が結合（Ｓ−
アセチルメルカプト基総量９２．６８μモル）した目的
物を得る。

■　ｍ−アレイミドベンゾイル−〇ＣＫ−８−Ｐ（ＭＢ
−ＣＣＫ−８−Ｐ）の合成 ＣＣＫ−８−Ｐ　１０６　Ｍ？及びＭＢＳ　２５０　ｍ
ｙのＤＭＦ溶液を用いて参考例１−■項と同様の操作を
行ない目的物を得る。

ＯＣＣＫ−８−Ｐ−ＫＬＨの合成 上記０項で得たＡｃ−５−ＫＬＨ溶液と０項で得たＭＢ
−ＣＣＫ−８−Ｐ溶液とを混合し、参考例１−〇項と同
様の操作を繰返す。

目的物におけるＣＣＫ−８−ＰとＫＬＨとの結合モル比
は約１８．２７：１であった。

以下上記各参考例で得た試薬を用いた本発明実施例を挙
げる。

実施例１ 供試動物として、一群２〜５匹のウサギ（ＮｅｗＺｅａ
ｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｒａｂｂｉｔｓ　）を用いる。

グループＩ乃至■の各供試動物に、ＣＣＫ−８−Ｐ換算
で１００μ２０ＣＣＫ−８−Ｐ−ＫＬＨ（抗原）を、完
全フロインドアジュバントＩ　ｍ（ｌに懸濁させた液を
皮下投与する。

グループＩ乃至■は、上記抗原投与の２週間後に夫々、
上記と同量のＣＣＫ−８−Ｐ−ＫＬＨを、本完全フロイ
ンドアジュバント１ｍｇに懸濁させた液を皮下投与する
。この操作を合計７回繰返す。

また別個にグループ■については、上記抗原の第１回目
投与の８日前に各供試動物１匹当シ、β−アラニル　テ
トラガストリン換算で１．１ｍＷのβ−アラニル　テト
ラガストリン−Ｄ−ＧＬを生理食塩水１　ｍ（ｌに溶か
した液を腹腔内投与する。

グループ■については、上記抗原の第２回目及び第８回
目の投与の夫々８日前に、同量のβ−アラニル　テトラ
ガストリン−Ｄ−ＧＬの生理食塩水溶液１ｍｌを腹腔内
投与する。

グループ■については、上記抗原の第１回目、第２回目
及び第８回目の投与の夫々Ｂ日づつ前に、同量のβ−ア
ラニル　テトラガストリン−Ｄ　−ＧＬ生理食塩水溶液
１　ｍｌを腹腔内投与する。

グループ■については、β−アラニル　テトラガストリ
ン−Ｄ−ＧＬの投与は全く行なうことなくコントロール
とする。

上記最後の抗原投与の１０日後に、各供試動物の後眼耳
静脈より採血して夫々抗血清を得る。グループ■乃至■
の夫々の供試動物より得た各抗血清を夫々抗体Ｉ乃至■
とする。

〈抗体価の測定〉 標識抗原として１２５ＩでラベルしたＣＣＫ−戸２を用
いる。これはＣＣＫ−Ｉ４をポルトン−ハンター　（Ｂ
ｏｌｔｏｎ　−Ｈｕｎｔｅｒ　）試薬を用い１２５■で
ラベルした［　Ｈ、５ａｎｋａｒａｎｅｔ、　ａｌ　、
、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５４．９８４９−９３５１（１９７９））。

標準希釈液としてＯ，１２Ｍ−塩化ナトリウム、０．０
８Ｍ−ＥＤＴＡ、０．８チＢＳＡ（牛血清アルブミン）
、５００　ＫＩＵ／１ｉｌｒ　）ラジロール」及び０．
０２％ナトリウムアジドを含有する０、　１　Ｍリン酸
緩衝液ＣＩ）Ｈ７，８）を調製し、利用する。

上記実施例１で得た抗体Ｉ乃至■を夫々生理食塩水で１
０％１０２、ｌＯ８，１０’、ｔｏ５、・・・倍に倍々
希釈（イニシャル）シ、これらの夫々０．ｉｎ／に上記
標識ペプチドの０．２Ｍ−酢酸アンモニウム緩衝液（０
，１％ＢＳＡ含有、ｐＨ５，５）　０．１　ｍａｌ（約
１０００００　ｃｐｒｒｙ’ｍｌになるよう希釈したも
の）及び上記で調製した標準希釈液０．６ｍ１ｌを加え
、４℃下４８時間インキュベートする。次いでこれに正
常ヒツジ血清（ｎｏｒｍａｌ　　５ｈｅｅｐ　ｓｅｒｕ
ｍ　）０、１　ｍｌｊを加え、更にデキストランで被膜
した活性炭の懸濁液０．５　ｍｌを加え、その後４℃下
に８０分間放置し、次いで４℃下８０分間８０００ｒｐ
ｍにて遠心分離して、抗体と標識抗原との結合体を、未
反応（結合し々い）標識抗原から分離し、その放射線を
カウントし、各希釈濃度における抗体の標識抗原との結
合率（チ）を測定する。縦軸に結合率（チ）を、横軸に
抗体の希釈倍率（イニシャル濃度）をとシ、上記で測定
された各濃度における結合率（％）をプロットする。６
０チ結合率（％）における希釈倍率を抗体の力価として
求めた結果は、下記第１表の通りであった。

第　　１　　表 〈特異性試験〉 ■、供試試料として各種濃度の下記６種のペプチドを使
用する。

ガストリフ　　Ｉ　　（Ｐｙｒｏ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌ　ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｔｒｐ−
Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ＣＣＫ−ｐＩＬｙｓ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−
８ｅｒ−ＭｅＬ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｈ
ｉｓ−Ａｒｇ−Ｉ　ｌｅ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｏ８Ｈ Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２Ｃ
ＣＫ−８−ｐ　　Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｒｐ−ＭｅＬ−Ａｓｐ−５Ｏ８）Ｉ Ｐｈ　ｅ　−Ｎ’Ｈ２ ＣＣＫ−８−ｐ−ｎｏｎ−ｓｕｌｆａＬｅｄ　　Ａｓｐ
−Ｔｒｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−Ｎｌ（２Ｍｅ　Ｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ 標準希釈液としては、抗体価の測定で調製したと同一の
リン酸緩衝液を用いる。

各々の試験管に、標準希釈液ｏ、５ｍｇ、　　各供試試
料０．１ｍ／ｌ、各抗体（Ｉ乃至ＫＶ）Ｏ，ｌＪ及び上
記抗体価の測定で用いたと同一の標識抗原０．１ｍｌを
入れ、４℃下４８時間インキュベートする。その後、＼
〜正常ラビット血清（Ｎｏｒｍａｌ　　ｒａｂｉｔ　ｓ
ｅｒｕｍ　）を上記標準希釈液で４５０倍に希釈しだ液
０．１ｍｌを加え、次いでヤギ抗−ラピッ）ＩｇＧ抗体
を上記標準希釈液で５０倍に希釈しだ液０．５ｍｇを加
え、４℃下２４時間インキュベートする。４℃下８０分
間８０００ｒｐｍ　で遠心分離を行ない、抗体と標識抗
原との結合体及び未反応（結合しない）標識抗原を分離
し、その放射線をカウントし、用いた抗体の力価に相当
する結合率（ＢＯ）を１００優として、供試試料の濃度
及び希釈率における抗体と標識抗原との結合体（Ｂ）の
百分率を求める。得られる結果を抗体毎にＣＣＫ−８−
Ｐに対する交叉率を１００％として決めた時の各種交叉
反応率を下記第２表に示す。

第２表 ■、供試試料としてＣＣＫ−８−Ｐのｔｏｏｐν罰又は
５００　ｐｇ／ｍｅを単独で、又はこれに他の交叉反応
性物質の夫々１００　ｐｇ／ｍｌ又は５００ｐｇ／ｍ（
Ｊを混入させて用いる。

上記試料につき、特異性試験１．と同様の試験を行なっ
た結果は下記第８表の通りであった。

上記第８表よシ本発明によシ得られる抗体の利用によれ
ば、交叉反応性を有する物質を実質的に検出することな
く、極めて正確に目的とするＣＣＫ−８−Ｐを定量でき
ることが判る。

（以−ト　）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ０式 ％式％ で表わされるβ−アラニル　テトラガストＩ７７とＤ−
   グルタミン酸−Ｄ−リジン共重合体との結合物を哺乳動
   物に投与して上記β−アシエルテトラガストリン又はこ
   れと構造的に類似する抗原決定基を有する抗原に対して
   免疫学的無応答性を上記動物に誘起させると共に該動物
   に式 ％式％ で表わされるコレシストキニン−バンクレオチミンのＣ
   −末端ペプチドと担体との複合体から成る抗原を投与し
   、生成する抗体を採取することを特徴とする、上記コレ
   シストキニン−バンクレオチミンのＣ−末端ペプチドに
   対して特異反応性を有する抗体の製造法。