JPS60183557A - 標識メタロチオネイン及びこれを用いたメタロチオネインの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

技　術　分　野 本ざｔ明は標識メタロチオネイン並びにこれを用いたメ
タロチオネインの免疫学的ｉｎ’ｌ定方法及び該測定に
利用するキラｌ〜に関している。 背　円　技　（ｌ″ｉ 近年医学の進歩と共に、種々複雑な病気の診断、治療等
が可能になってきた。その反面例えば鉱工業等の発展に
伴う公害等より新たに各ｎの難治性疾病が生まれてぎて
いる。そのひとつに重金属汚染による重金属中毒症があ
り、該疾病の冶掠１う至予防法の確立、そのための基礎
ともなる該疾病の診断法乃至これに伴う技術の確立が斯
界７：要望されている。しかして生体は木来上記車金属
の毒性を中和する作用（毒性の発現をＩＩＪＩ止する作
用）を右（る物質（メタロチオネイン）を保有すること
が知られテイル［５ｃｉｃｎｃｃ、　Ｖｏｌ、　２１４
　。 ８０５〜８０７　（１９８１）　、　Ｎｏｒｄ　、　ｚ
ｙｃ＋。 Ｔｉｄｓｋｒ　、、４５．７６〜８２　（１９６４）］
。 該メタロチオネインとは分子量が１万たらずで、全組成
アミノ酸中的１／３がシスティン残基であり、重金属例
えばカドミウム、銅、亜鉛、水銀等どの新和力が非常に
強い低分子＠蛋白質であり、これは生体内への上記重金
属の導入により誘導（生合成）され、上記導入に伴い特
に肝臓、腎臓を中心にぞの量が増加し、血中′ｉｒ５度
も増加する［　、）　、Ｂ、Ｃ，、ｖｏｌ　２３６．　
Ｎｏ　９．　２４３５−２４４２　（１９６１）、蛋白
質核酸酵素、ｖｏ１２５、Ｎｏ　８．４６−６１　（１
９８０）及び現代化学第４０−４９頁（１９８０年３月
）］。従って生体内の上記メタロチオネインａを正確に
測定することができれば、前記重金属中毒症の診断が可
能となり、惹いてはその治魚法も確立できると考えられ
る。かかる観点及び他の観点から、従来よりメタロチオ
ネインのｍｌｌ定法としては、例えば吸光度からメタロ
チオネインの金属間の特有な結合を測定する方法、３５
３−システィンのとり込みによって得られるＳ　Ｈ基を
定量する方法、インごボにて１°９ＣｄＣＱ２投与にＪ
：り得られる標識メタロチオネインを標識抗原として利
用する方法及びポル１〜ンハンター試薬により０識抗原
を作成しこれを用いる免疫反応を利用する方法等が種々
提案されている。しかしながら＋！２察された測定法は
いずれも尚潜足できるものではなく、その感度、精度、
再現性、試薬の調製の煩雑性等において問題があった。 本発明者らも上記メタロチオネインが抗原性を有する蛋
白質であることに着目し、免疫反応（抗原−抗体反応）
を利用して該メタロチオネインの測定を行なう方法を確
立すべく鋭小研究を単ねた。 その結果、特定の結合試薬を用いてメタロチオネインと
チロシンとを結合させ且つこのチロシンを放射性沃素で
標識化して標識メタロチオネインを製造するに成功する
と共に、かくして得られる軒識メタロチオネインを標識
抗原とづる時には、検体中の１ｆｆｉのメタロチオネイ
ンをも、高感度で再現性Ｊ：り正確に定ｎできることを
見い出した。本発明はこの新しい知見に基づいて完成さ
れたしのである。 発明の（Ｒ成 本発明はメタロチオネインに一般式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
り、該チロシンが放射性沃素により標識されていること
を特徴とする標識メタロチオネイン並びにこれを用いて
メタロチオネインをラジオイムアッセイにより測定する
方法及び該測定のためのキラ１−に係る。 以下、本発明の標識メタロチオネインを、その製法によ
り詳述する。 本発明の標識メタロチオネインの製造において、メタロ
チオネインとしては、公知の各種起源のメタロチオネイ
ンをいずれも利用できる。椙造解析された該メタロチオ
ネインとしては、ヒ１〜及び伯の哺乳類例えばウマ、ウ
シ、ブタ、ウリーギ、ラツ１・、マウス等からの夫々二
つの主分子秤があり、他にニワ１〜りやススメ等の鳥類
、キンジョ等の魚類、貝グ１、軟体動物、芹類、カビ類
からのメタロチオネインも知られている。之等のうちで
曲孔動物のメタ［二１ヂオネインが好ましい。上記各ｆ
Ｉ罎のメタ１］ヂオネインは、公知の方法により分雅採
取りることができる。より有利には例えばＩＩｉ乳動物
のメタロチオネインは、起源動物に重金風を投与し、こ
れにより誘導され血液中に増加されるメタロチオネイン
を、該メタロチオネインの性質を利用した各行分離手段
により分子■される。より詳細には、例えばラツＩ・−
メタロチオネインはラッｌ〜の腹腔内に塩化カドミウム
等の重金風を投与し、肝臓を摘出後９’Ａ　’ＣＩアン
モニウム水溶液等を加えホモシネ−１〜し、次いでよ消
を８０℃で１分間加熱した後、４°Ｃまで冷却してセフ
ァデックスＧ〜７５（ファルマシア社）及びＤＥハ１Ｆ
−セファデックスく同」］社）で精製することにより得
られる［Ｔ　ｍｍｕｎｏ−ｃｌ＋ｅｍｉｓｔｒｙ、　１
５　、８５７＜１９７８＞　１　。 上記メタロチオネインとチロシンどの結合反応において
は結合試薬として上記一般式（Ｉ）で表わされる特定の
結合試斧を用いることが特に重要である。該結合試薬は
公知であり［Ｃｂ６ｍ。 ＰＩ＋ａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　２９．　’１１３０　
（１９８１）　参照］、一部ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）
より市販されており、また文献［Ｔ　、　Ｋ　ｉｔａｇ
ａｗａ他、Ｊ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（Ｔｏｋｙｏ＞　７９．　２３３　
（１９７６）　］に記載の方法に従い、アミノカルボン
酸とマレイミド誘導体との反応物に、Ｎ−ヒドロキシザ
クシンイミドを反応さけることにより容易に製造できる
。上記一般式（Ｉ＞の結合試興に含まれる代表的化合物
としてはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒト［」キシ
ザクシンイミドエステル（以下ｒＭＢｓＪという）を例
示できる。 上記結合試薬を用いてメタロチオネインとチロシンとを
結合させる方法は、通常の方法に従い予めチロシンと結
合試薬とを反応させた後、得られる反応物にメタロチオ
ネインを結合させる方法によるのが好ましい。上記チロ
シンと結合試薬どの反応は、例えばアルカリ水溶液又は
リン酸緩暫液、ホウ酸塩ｔｇ′ｆｆＪ液等のアンモニア
及びアミノ丼を含有しない通常の各杆紡衝液中、Ｉ）Ｈ
７，Ｏ〜９．０の条件及び約１０〜４．０’Ｃの温度下
に、通常約１０分〜１０時間、一般には約１０〜３０分
間を要して行なわれる。チロシンに対する結合試薬の使
用割合は、適宜決定されるが、通常約４〜１０倍モル量
とするのが望ましい。 かくして得られるチロシン−結合試薬結合物（以下、ｒ
ＭＢ−Ｔｙｒ−１という）は、常法に従い反応系より甲
部することもできるが、甲離覆ることなく引き続く反応
に供づ−ることもてきる。上記中部手段としては、例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフィー等の通常の弔
頗！′ｉ￥製手段を採用できる。 上記反応に引ぎ続くメタロチオネインと上記結合物ＭＳ
−Ｔｙｒとの反応は、例えば水溶液、生理食塩水もしく
はｌ’ｌＨ６〜８の通常の緩衝液中、好ましくはｐｌ」
７付近の緩衝液中で、０〜４０℃、好ましくは室温付近
で、好ましくは窒素気流中で行なわれる。該反応は通常
１〜２４時間稈時間一般には約２〜３時間で完結する。 メタロチオネインに対するＭ　Ｓ−Ｔ　ｙｒの使用割合
は、通常約５〜１０倍モル量の範囲で選択される。緩衝
液としては、前記反応で用いたものと同じものを使用で
きる。 かくして得られるチロシン−結合試薬−メタロチオネイ
ン反応物（以下ｒＭＴ−Ｔｙｒ−ｌという）は、例えば
抽出、分配、カラムクｎマドグラフィ〜、透析等により
単離箔製される。このＭ　Ｔ〜Ｔｙｒはメタロチオネイ
ン１モルに対しチロシンが１〜３モル等角、好ましくは
１モル等Ｃ結合したものである。 本発明の標識メタロチオネインは、上記により得られる
ＭＴ−ＴＶｒに放射性沃素を導入して標識することによ
り製造される。該放ｇＡｆｔ沃素の導入は、通常の方法
例えばクロラミンＴを用いる酸化的ヨード化法［Ｗ、　
Ｍ、　Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、　ｃ。 Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ：　Ｎａｔｕｒｅ　、　１９４　、
４９５（１９６２）　、Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、　Ｊ、　、
　８９．１１４゜（１９６３）参照１等にＪ：り行なう
ことかできる。 該方法は具体的には、適当な溶媒例えば０．２Ｍリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ＝７．４）等のｒｄ媒中、クロラミンＴ
の存在下室温付近にて１０〜３０秒程度で行なわれる。 ＭＴ−Ｔｙｒ、放射性沃素及びクロラミンＴの使用割合
は、例えばチロシン１個当り放射性沃素１個を導入する
場合には、ＭＴ−Ｔｙｒ中に含まれるチロシン分子１ナ
ノモルに対して放射性沃素を１ミリキユ一リー程度、ク
ロラミンＴを１０〜１００ナノモル程度用いるのがよく
、またチロシン１個当り放射性沃素２個を導入する場合
には、ＭＴ−Ｔｙｒ中に含まれるチロシン分子１ナノモ
ルに対して放射性沃素を２ミリキユ一リー程度、クロラ
ミンＴを１０〜１００ナノモル程度用いるのがよい。 かくして製造される放射性沃素により標識化されたＭＴ
−Ｔｙｒは、通常の分離手段、例えば抽出、分配、カラ
ムクロマミルグラフィー、透析等により！’ｔ！　Ｐｌ
ｆｔ　ｍ　’Ｈされる。このようにして）ｑられる、本
発明の標識メタロチオネインは必要ならば凍結乾燥させ
て保存しておくこともできる。 本発明のｍｒｌＦ−メタロチオネインは、上記の通り特
定の結合試薬を介してメタロチオネインにチロシンを結
合さ往た後・標識したものである。」−記メタロヂオネ
インと結合試薬どの結合は、メタロチオネインのＳＨ基
と結合試薬のマレイミド基との反応により行なわれ、エ
ルマン法 （３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　１８．６９０．１９
７９年）によるマレイミド基の消失及び吸光度の測定等
により確認される。結合試薬とチロシンどの結合は、薄
層クロマ１−グラフィー等によるニンヒドリンの消失及
び上記マレイミド基の導入数の測定により確認される。 またチロシンの標識化は放射性活性（＋２５１）の測定
により行なわれる。 本発明の標識メタロチオネインは、上記の特徴を右する
故に、ラジオイムノアラはイ法（Ｒ１Ａ法）により、検
体中のメタロチオネインを測定（定伝）する際の標識抗
原として有用であり、該標識抗原として、特有の顕著な
効果を秦し臂る。 即ち該標識メタロチオネインの利用によれば、ＲＩＡ法
にお

【プるメタロチオネインの定量が可能であり、該Ｒ
Ｉ　Ａ、法の精度、感度を一更向上させることができ、
しかも上記ＩＦａ識メツメタロチオネイン自体容易つ安
価に調製できる利点がある。 従って、本発明は上記標識メタロチオネインを利用して
ラジオイムノアッセイによりメタロチオネインを測定づ
る方法をも提供するものである。 この測定法は標識抗原として上記標識メタロチオネイン
を用いる以外、基本的には通常の競合法にＪ：るラジオ
イムノアッセイ法と異ならない。即ち通常の溶媒中、一
定口の標準抗原、標識抗原及び抗体を競合反応させ、次
いで抗原抗体結合物及び非結合抗原を分離し、そのいず
れか一方の標識活性を測定し、既知８度の標準抗原に対
する標準曲線を作成する。同様に標準抗原の代りに３度
未知の被検試料を使用してその標識活性を測定し、前記
標準曲線より被検試料中の使用した抗体に対重るメタロ
チオネイン但を定量することができる。 上記測定法に／ｌｊいるメタロチオネインの標準抗原（
非標識抗原）及び該抗原に対重る抗体は、いずれも通常
の方法ににり作成することができる。 即ちメタロチオネインの抗原（免疫抗原）は、メタロチ
オネインをハブテンとし、これを適当なハブテン−担体
結合試薬の存在下に担体と反応させることにより得られ
る。 」−２に用いるメタロチオネイン（Ｊ、本発明の標識メ
タロチオネインの製造に用いるそれと同一のものを用い
るのが好ましい。該メタロチオネインと結合させる担体
としては、通常抗原のイ′１成に当り慣用される高分子
の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該担体
どしては例えば馬面清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウザＶ面清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清
アル１ミン等の動物の血清アルブミン類：馬血清グ［１
プリン、牛血清グロブリン、つ４ツギ血消グロブリン、
人血清グロブリン、ヒツジ自消グＵプリン等の動物の血
清グロブリン￥１：馬ヂ１］グ］１プリン、牛ヂログロ
ブリン、ウサギヂｎグ０プリン、人ヂログロブリン、ヒ
ツジヂログ１］プリン等の動物のヂログロブリン類；馬
ヘモグロブリン、牛ヘモグ［−１ブリン、ウリギヘモグ
［］プリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグ「】プリ
ン等の動物のヘモグロブリン類；〜１−−ホールリンベ
ツ１〜ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ、　Ｈ）等の動物のヘモシ
アニン類；回虫より抽出された蛋白質（アスカ−リス抽
出１′９Ｊ、特１７ｉｌ昭５６−１６４１／Ｉ号公報、
Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、１１１　．２６０〜２６８　（１９
７３）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、１２２　。 ３０２　〜３０８　（１９７’９）　、、ノ　、　Ｉ　
ｍｎ＋ｕｎ、。 ９８　．８９３〜９００　（１９６７）及びΔｍ、、Ｊ
。 ｐｌ＋ｙｓｉｏ１．、１　９　９　．５　７　５〜ｂ７
８　＜１９６０）に記載されたもの又はこれらを更に精
製したちの）：ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン
−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む
共重合体等を挙げることができる。 ハブデンー担体結合試桑としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。 具体的にはアミノ基とアミン基とを架橋結合させる、例
えばグリオキザール、マロンジアルデヒド、ゲルタール
アルデヒド、スクシンアルデヒド、アジボアルデヒド等
の脂肪族ジアルデヒド煩；チオール基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばＮ　、Ｎ’−０−フェニレンジ
マレイミド、Ｎ　。 Ｎ７　ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化
合物二アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例え
ばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ＝ヒドロキシスクシン
イミドエステル、４−（マレイミドメチル）−シクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスクシン
イミドエステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル類二アミノ呈とカルボキ
シル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合形成反
応に用いられる試薬、例えばＮ　、Ｎ−ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’　−ジメチルアミ
ノカルボジイミド、１−エチル−３−ジイソプロピルア
ミノカルポジイミド、１−シクロへキシル−３−（２−
モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカルボ
ジイミド類等の脱水縮合剤等を挙けることができる。ま
た上記ハブテン−担体結含試イ３としては、ｐ−ジアゾ
ニウムフェニル酸ＢＷのジアゾニウムアリールカルボン
酸類と通常のメタ１］チオネイン結合形成反応試葵、例
えば上記説ノ１ζ縮合剤とをｉ１合けたものら使用可能
である。 １−記免疫抗原の製造反応は、例えば水溶波もしくはｐ
ｌ」７〜１０の通常のＵ買液中、好Ａニジ＜はｐＨ８〜
９の経ｔｒ、ｉ液中、Ｏ〜４０　’Ｃ、なｊ−ｊ、しく
は室）呂ｔ１近で行なわれる。、該反応は通常約１〜２
４時間、好ましくは３〜５時１１）で完、情覆る。」−
記において用いられる代表的援丙浩どしては、次のちの
を例示できる。 ０．２Ｎ水酸化す１〜リウム−０，２１〜１ホウ酸−〇
、２Ｍ塩化カリウム緩尚液、 ０．２Ｍ炭酸すトリウム〜０．２Ｍホウ酸−〇、２ＭＪ
ｎ化カリウム明（ｊ液、 ０．０５Ｍ四小つｐ：２プトリウムー０．２Ｍ小つバ’
ｔｏ、０５Ｍ塩化すトリウム縁百液、０．１ｉψリン酸
二水素カリウム−０，０５Ｍ四ホウ酎ナ耐リウム綴丙液 上記にＪ３いてハブテン、ハブテン−損体結合試桑及び
担体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハブテン
に対して担体を１〜６倍重吊程度、好ましくは１〜５倍
重琶￥ｊｄ度、及びハブテン−担体結合試薬を５〜１０
倍モル程厄用いるのがよい。 上記反応によりハブテン−担体結合試薬を仲介させて担
体とハブテンとが結合したメタロヂオネインー担体複合
体からなる所望のメクロチオネイン免疫抗原が収得され
る。 反応終了後前られる免疫抗原は常法に従い、例えば透析
法、ゲル濾過法、分別沈澱法等により容易に単πｆ　ｆ
ｉ’ｉ　胃できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法によ
り保存できる。 前クシて得られたメタ［ｌチオネイン免疫抗原は通常担
体１モルに対してメタロチオネインが平均１０〜１５モ
ル結合したしの−Ｃあり、いずれも引き続ぎ該抗原に対
して特異１．′４の高い所望のメタ［］チオネイン抗体
を再現牲よく製造可能とＪるちのである。 上記で得られる免疫抗原によるメタ１］チオネイン抗体
の作成は、例えば以下の如くして行なわれる。即ち上記
抗原を韻乳動物に投与し、牛体内に所望抗体を産生させ
、これを捉取Ｍることにより実施される。 抗体の製造に供せられる１１ｊ乳動物としては、特に制
限はないが、通常ウサギやモルモツ１〜を用いるのが好
ましい。抗体の産生に当っては、上記により（ワられる
免疫抗原の所定量を生理食塩水で適当９度に希釈し、フ
ロイントの補助液 （ＣｏＩＩｌｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ　’　ｓ　Ａｄ
ｊｕｖａｎｔ　）と混合して懸濁液を調整し、これを哺
乳動物体に投与でればよい。例えばウサギに上記９ｍ液
を皮内注剣（抗原の口として０．１〜５１１ｇ／回）し
、以後２週間毎に２〜１０ケ月、好ましくは４〜６ケ月
間投与し免疫化させればよい。抗体の採取は、上記懸濁
液のＤ柊投与後、抗体が多量産出される時期、通常上記
最終投与の１〜２週間経過後、免疫化された動物から採
血し、これを達心分ｖ１後、血清を分離ツることにより
行なわれる。 以下、本発明のＦ　ｍメタロチオネインと上記の如くし
て得られる免疫抗体とを用いＩＣ本発明のメタロチオネ
インの測定方法につき一詳述する。 本発明の測定法においては、ｊ、ず測定すべき検体を調
製する。該検体としては通常被検者の血液を帛法に従い
採血し、遠心分臼）［シて得られる血ｍ又は血清が右利
であるが、之等に限定されず、例えば被検者の尿、組織
、体液等で８うってもよい。 」−記分陪された血漿等の検体に所定量の標識メタロチ
オネイン、抗血清（抗体）、緩ｔｌＥ液を添加し、通常
４〜３７℃にて６〜７２時間程度インキュベー１〜する
。次に標識メタロチオネイン−抗体結合物（Ｂ）と非結
合メタロチオネイン（Ｆ）とを通常の分岨方法、例えば
デキスＩ〜ラン炭末法、二抗体法、固相法、ポリエチレ
ングリコール法、タルク法、硫安法、エタノール法等に
より分−１シ、それらの放射能をγ−カウンターを用い
て測定してＢ／（Ｂ＋Ｆ）値をめ、予め作成した標準曲
線より検体中のメタロチオネインの含有ｇ−＋をめる。 尚標準曲線は、」−記において被検体に代え、既知伶の
メタロチオネインを含む溶液を用い、同様にしてめたＢ
／ＢｆＦ値をプロワ１〜でることにより作成される。上
記測定法における倹体使用洛は１００μＱ程度を目安と
すればよく、該検体当り、の抗体量は１００ｕＱ前後、
緩衝液ａは２００μＱ前後及び標準抗原最は１００μＱ
（１００００ｃｐｍ　）前後とされるのが適当である。 かくして本発明の測定法によれば、検体中に微弔含まれ
るメタロチオネインをも、充分に検出測定することかで
きる。 上記本発明測定法の実施は、特に好ましくは本発明の標
識メタロチオネインを必須成分として含むキットを用い
て行なわれ、本発明はかかるメタロチオネイン測定用キ
ットをも提供する。 本発明キットは、上記標識メタロチオネイン（通常これ
は適当な緩衝剤溶液に調整される）と共に別個にメタロ
チオネインに対する抗体試薬を含む。該抗体試薬は上述
した方法により得られる抗体にグリセロールやウシ血清
蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を配合すること
ができ、好ましくは凍結乾燥される。また上記抗体試四
には水溶性もしくは水混和性溶媒を含有させることがで
き、更に再構成された試薬系を一定のｐＨに保つだめの
緩衝液を添加覆ることもできる。緩衝液はキット試薬の
必須成分とは考えられないが、本発明の測定法を実施す
る際に、ｐＨを６〜７．８とするものを用いるのが好ま
しい。また再（育成剤は好ましくは水を含んだものであ
るが、水の一部又は全部を水と混和しつる溶媒で置き換
えることもできる。水と混和しつる溶媒は当業者に周知
であり、例えばグリセリン、アルコール類、グリコール
類、グリコールエーテル類等を使用できるが、らちるん
これらに限定されない。 好ましいキラ１へにおける試薬の配合ωは、例えば１０
０検体用キツ１−の場合、本発明標識メタ［ｌチオネイ
ン１１＋＋＋１２、メタロチオネインに対重る抗体１１
１ＩＩＩＩ２、緩衝剤８０回及び第二抗体（スタンダー
ド）１１回どされ、標識メタロチオネイン以外は、すべ
て凍結乾燥品の形態であるのが望ましい。 斯くして本発明によりメタ［−１チオネインを有利に測
定ザることができる。工１１定されたメタ「１チオネイ
ンレベルを健庫人の当該レベルど比？Ｒすることにより
重金属中毒を早期、的確に診断することがぐきる。 実　施　例 以下本発明を更に詳しく説明づ−るために抗体の製造例
、柳識抗原の製造例、測定例を単ける。 〈免疫抗原の製造〉 製造例１ ５　ツｈ　−メタ０　チオネ、（ンーｉ　［Ｒｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌａｎｄ　Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｂ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、。 ８４．９０７　（１９７８）参照」　（以下Ｒ−Ｍ１−
■と略す）２０ｍ（＋とアスカ−リス抽出蛋白１５ｍｇ
とを０．１Ｍリンｌｌｌ１ｔｊ　Ｐ液（Ｄ　Ｈ７，０）
５ａＱに加え、この溶液に１４％グルタルアルデヒド水
溶Ｐ２１７５μＱを滴下し、室温で５詩間撹拌覆る。 その後反応混合物を４日間蒸留水４℃で４回透析し、凍
結乾燥して免疫抗原３４１［１りを得る。以下この抗原
を「抗原工」と称す。 抗原工はアスノＪ−リス１モルに対してＲ−ＭＴ−■が
平均１０モル結合したしのである。尚このＲ−Ｍ　Ｔ　
−Ｉどアスカ−リスとの結合率は、得られる抗原１を更
にレファデツクス（、−５０（溶出液：生理食塩水、検
出：０Ｄ２８０ｎｉ、流出速度：３ＩＩＩＱ／時間、分
取ｍ　：　Ｉ　ＩＱづつ）でゲル濾過した際、未反応の
アスカ−リス及びＲ−Ｍ　Ｔ　−Ｉの存在は認められな
いことより、該ゲル濾過にＪ：つてアスカ−リスに結合
したＲ−ＭＴ−Ｈのフラクションと他の生成体（Ｒ−Ｍ
Ｔ−Ｉの２員休）のフラクションどを分需［シ、Ｒ−Ｍ
Ｔ−Ｉ　２１体の標準濃度の検檜線を作成して、上記２
句体の舟をめ、これを出発原料として用いたＲ−ＭＴ−
Ｈの串から差し引いた値がすべてアスカ−リスに結合し
ているとしてめたものである。以下の抗原の製造例にお
いても同様とする。 製造例　２ Ｒ−Ｍ　１−−　Ｉの５ｍｇ及びアスカ−リス抽出蛋白
２５ｍｇを蒸留水３．０ＩＩＩＱに加え、この溶液にジ
シクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２００ｍａを
加え、室温で３時間撹拌する。その後反応混合物を一夜
蒸留水で４℃下に透析し、凍結乾燥して、免疫抗原２８
ｍＱを得る。以下この抗原を「抗原■」と言う。抗原■
はアスカ−リス１モルに対してＲ−ＭＴ−丁が平均１２
モル結合したものである。 製造例　３ 前記製造例１においてＲ−ＭＴ−工に代えてラフ１−−
メタ［−１ヂオネインーＨ（（Ｂ　ｉｏｃｌｌｅｍｉｃ
ａｌａｎｄ　３ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ。 ８４．９０７．１９７８年、以下Ｒ−ＭＴ−ｎと略す）
を用いて同様の操作によりＲ−Ｍ　Ｔ　−ＩＩＩのアス
カ−リス結合抗原を得る。以下この抗原を「抗原■」と
称ず。抗原■はアスカ−リス１モルに対してＲ−Ｍ　Ｔ
　−Ｉｆが１５モル結合したものである。 く抗体の製造〉 ■　抗原の製造例１で得た抗原■の１００μＱを１．５
−の生理食塩水に溶解後、これに７０インドの補助液１
．５鵬を加えて調整した８濁液を５羽の兎（２，５〜３
．０ｋＯ）に皮下投与し２週間毎に１０回同幻投与する
。最後の抗原投与後、採血し、遠心分離して抗血清（メ
タロチオネイン抗体）を得る。 ６兎に対し、抗体１〜抗体Ｖとする。 ■　前記抗体の製造例１において抗原■に代えて抗原の
製造例２で得た抗原■の同量を用いて同様の方法により
、５羽の兎より抗体を４「？る。６兎に対して抗体■〜
抗体Ｘどづる。 ■　−Ｆ記■と同様にして抗原■を用いて３羽の兎より
抗体ｍ〜抗体双を得る。 〈標識メタロチオネインの製造〉 実施例１ ■　ヂロシン２ｍｇを０．１Ｍリン酸級衝液（ｐ）」８
．０）９．０ｗ［にとかしメタマレインドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシザクシンイミド（以下ＭＢＳと称す）１
７．４ｎ＋ｇをジメチルホルムアミド１回にどかしたも
のを滴下し、２０分間至室温て反応させた後、ＨＦｔク
ロマトグラフィーによりニンヒドリン潤去を確認し過剰
のＭＢＳをジクロルメタンにて抽出除去し、水層にメタ
マレイミドベンゾイルヂＩＮシン（ＭＢ−Ｔ−ｙｒ）を
得た。 このＭＢ−Ｔｙｒはエルマン法により−１−ｙｒに導入
されたマレイミド基を測定（Ｂ　ｉＯｃｌｌｅｍｉｓｔ
ｒｙ　。 １８．６９０．１９７９年）してＴｙｒ１モル当りＭＢ
０．９モルが結合していることが確認された。 ■　Ｒ−Ｍ　７’−Ｉの２ＩＩ１ｇをＯ，ＩＭリン酸紡
衝液（ｐＨ７，５）２ｍＱにとかし、これに前記■で１
ｑたＭＢ−Ｔｙｒの６ＢＯｕＱ　（１，３２ｍｑ）をｈ
口え室温にて２時間反応さけた後、セファデックス（、
−５０カラム（溶出液　０．１Ｍリン酸緩雨液、ｐＨ７
，２、カラムリーイズ１．７×８３ｃｍ）に付し、各フ
ラクションを２ｍｌづつ分取りし、フラクションＮｏ３
５〜Ｎ０５４（ピークフラクションＮｏ４５）に目的物
Ｒ−Ｍ　１−−ＩとＭＳ−Ｔｙｒとのカップリング化合
物（以下Ｒ−ＭＴ−Ｉ−１−ｙｒど称す）を得た。 得られたＲ−ＭＴ−Ｉ−ＴｙｒはＯＤ２ａｏｌ１ｍでの
吸光度測定によりＲ−ＭＴ−１１モルに対しＴｙｒ１モ
ルが導入されていることが確認されＩこ。 ■　上記■で）び７ＣＲ−ＭＴ−Ｉ−ＴＶｒをクロラミ
ン■−を用いる方法でＪス下の通り標識化する。 即ちＲ−ｔｖｌＴ−Ｉ−１ｒ５４１の０．５モルリン酸
塩ＩＩ液（ｐＨ７，４＞２０１１ＱにＮａ［”　５Ｉ］
　＜ｃａｒｒｉｅｒ　ｆｒｅｅ　Ｎ、Ｅ、Ｎ、）１ミリ
キユーの０．５モルリ゛醜塩緩衝液２０μＱを加え、つ
ぎにクロラミン−Ｔ２０μｇを０．０５モルリン酸塩緩
衝液２０μＱに溶解したものを加える。室温下に２５秒
間撹１↑してチロシン１００μｇを０．０５モルリン酪
基塩緩衝液００μＱに溶解したものを加え反応を停止さ
せる。次いでこの反応混合物をセファデックスＧ−５０
のカラム（ＩＸ８０Ｃｍ）にかけ（溶出液０．１％ゼラ
チン、０．１５モル塩化す１〜リウム及び０．０２％Ｎ
ａＮ３を含む０．０５モルリン酸塩緩衝液、ｐ　Ｈ７，
４、流速７〜８．０１ｔｌＱ／ｌ＋ｒ）　、”　５　■
ｒａｉｇｈたＲ　−ＭＴ−Ｉ−丁ｙｒを溶液形態で得る
。以下これを「標識抗原■」と称す。 比活性　２．２５マイクロキユリ一／ｍＱセファデック
スＧ−５０にてゲル茅濾過しｔ、：結果カラムサイズ　
１．６Ｘ５０ｃｎ＋ 流速　８鶴／ｈｒ １フラクシヨン　Ｏ：　９　ｍＱ ビーク　Ｎｏ４７〜Ｎ０５４フラクシヨンメインビーク
　Ｎ０５２フラクシヨン 溶出液　０．１Ｍリン酸塩緩傍液（ｐＨ７，４，）０．
１５Ｍ　ＮａＣＱ 実施（９２ ■　実施例１の■においてＲ−ＭＴ−Ｉに代えてＲ−Ｍ
　Ｔ−Ｈを用いて、同様の操作によりＲ−Ｍ、Ｔ−ｎど
ＭＢ−Ｔｙｒどのカップリング化合物（以下Ｒ−ＭＴ−
ＩＩ−’１”Ｖｒと略す）を得た。 １すられたＲ−ＭＴ−ＩＩ−Ｔｙｒは０Ｄ２８Ｏｎｌｌ
ｌで吸光度測定によりＲ−ＭＴ−１１１モルに対しＴＶ
ｒ１モルが導入されていることが確認された。 ■　上記■で得たＲ−ＭＴ−ＩＩ−Ｔｙｒを用いて実施
例１の■と同様の方法により標識抗原を得る。 この標識抗原を「標識抗原■」と称す。 比活性　２．３０マイクロキユリ一／ｍＱレファデツク
スＧ−５０にてゲル濾過した結果カラムサイズ　１．６
Ｘ５０ｃｍ 流速　８鵬／１］ｒ １フラクシヨン　０−９９鴨 ビーク　Ｎｏ４７〜Ｎ０５４フラクシヨンメインビーク
　Ｎ０５２フラクション 溶出Ｍ　Ｏ，ＩＭＩＪンｆｉ９塩緩丙ｉａ　（Ｄ　Ｈ７
，４）０．１５Ｍ　Ｎａ　ＣＱ ○力価の測定 上記抗体の製造例で得られた各抗体の力価を次の通り測
定する。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で１０．１０２
．１０３．１０４．１０５・・・・・・・・倍に希釈し
、これらのそれぞれ１００μＱに、１２５Ｉ標識抗原（
上記各実施例で得られる標識抗原を約９５００ｃｐｍに
なるように希釈したもの）０．１ｍＱ及び０．０５モル
リンｌｌｉ！塩緩衝液（ｐ）Ｉ＝７．４）（０，２５％
ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴΔ及び０．０１％Ｎａ　Ｎ３を
含む）０．２−を加え、４℃で２４時間インキュベート
し、住成した抗体と１２５１標識抗原との結合体を、ポ
リエチレングリコール法及び遠心分ｎ１法〈４℃、３０
分間、３０００ｒｏｎ＋）ににり未反応（結合しない＞
＋２５１１Ｉ抗原から分訝し、その放（）Ｊ綿をカラン
１〜し各希釈濃度における抗体の１２５１標識抗原との
結合率（％）を測定する。縦軸に抗体の１２５１標識抗
原との結合率（％）及び横軸に抗体の希釈倍率をとり、
各々の濃度において結合率をプロワ１−する。結合率が
５０％となる抗体の希釈倍率即ち抗体の力価をめる。 又、上記と同様の方法ににリボ用１〜ルハンター法によ
り作成された１２５工標識抗原 （７ｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｐ
ｌ＋ａｒｍａｃｏｌｏｇ、　。 ５５．９４〜１０２．１９８０年、　３１ｏｃｌ＋ｅｍ
、　Ｊ　。 １３３．５２９〜５３９．１９７３年）を用いて抗体１
〜抗体Ｖを測定した結果を下記第１表に示す。 第１表 上記第１表より、本発明標識抗原がポル１−ンハンター
法による標識抗原より優れていることが判る。 くメタロチオネインのＲＩＡ法による測定〉０．０５Ｍ
リン酸塩緩衝液０．２ｍＱ（Ｄ　ｌ−１＝７．４．．０
．２５％ＢＳＡ、０．０１ＭＥＤＴＡ、、０．０１％Ｎ
ａ　Ｎ３及び２００ＫＩＵ１−ラジロール含有）に抗体
の製造例■で得た抗体Ｔの０．１戚（最終希釈倍率２０
０００）　、実施例１で得た標識抗原１の０．１回（１
００００ｃｐｍ　）及び被ｔｆ＜Ｆ＄、Ｆ２Ｏ、１ｍＡ
ヲ加工、４℃テ４８時間インキベーションした後、さら
にラビット抗体（４０倍希ＩＲ＞０．１地、正帛つサギ
向消０．１ｍ０（４００希釈）及び０．０５Ｍリン酸ｊ
ｎ１ｉｆｆに１５％１２１１度となるように溶かしたポ
リエチレングリコール０．２ｐ、２を加え、空温にて３
０分間インキコベーションを行ない、４℃、３０分間遠
心分離する。上清と沈澱物との放ＱＪ活性を夫々γ−カ
ウンターにて測定してメタロチオネイン聞を標準曲線よ
り搾出する。尚標準曲線は、被検試第１としてＲ−ＭＴ
−Ｉ（標準品）を用いて上記と同様にして各希釈倍率で
の故Ｑ１活性測定値をプロットすることによりめたもの
であり、５００１）ｇ／チューブ〜１１００ｎ／チ１−
ブの淵度内で十分な用伜−反応曲線が得られる。 上記において被験試料としてヒト尿を用い、高値を示し
た各検体（３種）につき夫々６４倍まで希釈していき、
標準曲線と対比させた結果を第１図に示す。第１図にｄ
３いて箱軸（より／５ｏ（Ｂ＋Ｆ）％を示し、横軸はメ
タＤ　ｙ−オネイン濃度＜ｎｇ／ヂコーブ）及び検体希
釈倍（げ１を示す。また図中（１）は標準曲線であり、
く２）〜（４）は夫々検体１〜３（ヒト尿）を示す。 第１図より検体における希釈曲線はいずれも標準曲線と
ほぼ平行しており、高感度でヒ１ヘーメタ口チオネイン
の測定が行ない（）ることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のラジオイノ１ノアツセイ法によるメタ
ロチオネインの測定結果を示すグラフである。 （以　上） 代理人　弁理士　三　枝　芙　二　；、’、、、”’２
．・′

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　メタロチオネインに一般式 （） で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
   り、該チロシンが放射性沃素により標識されていること
   を特徴とする標識メタロチオネイン。 ■　メタロチオネインをラジオイムノアッセイにより定
   ♀するに当り、標識抗原としてメタロチオネインに一般
   式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
   り、該チロシンが放射性沃素により標識されている標識
   メタロチオネインを用いることを特徴とするメタロチオ
   ネインの測定方法。 ■　メタロチオネインに一般式 で表わされる結合試薬を介してチロシンが結合されてお
   り、該チロシンが放射性沃素により標識されている標識
   メタロチオネインを標識抗原として含有することを特徴
   とするメタロチオネイン測定用キット。