JPS584728A - α−１−抗トリプシンの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発生起源からα−１＝抗トリプシンを単離す
る方法に関する。抗キモトリプシンのような他の好まし
いタンパク質も同様にして単離することができる。好ま
しいタンパク質には、安定化に関与しないジスルフィド
結合（α−１−抗トリプシン内のジスルフィド結合のよ
うに）を有するタンパク質、結合を破壊するために使用
される試薬に対し化学的に影響され易くない安定化ジス
ルフィド結合を有するタンパク質、及びジスルフィド結
合を有していないタンパク質が包含される。好ましい実
施態様において、本発明は、プールした人のプラズマか
ら得られたサブフラクションである、コンフラクション
ＩＶ　−Ｉ　（Ｃｏｈｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ＩＶ−Ｉ
　）からα−１−抗トリプシンを単離する方法に関する
。

α−１−抗トリプシンは、人の血清におけるタンパク分
解酵素の主要な阻害剤である。α−１−抗トリプシンが
血清中に通常の人の１０〜１５％しかない、遺伝的に欠
乏している人が約７万〜８万人いる。これらの人々は肺
気腫に非常になりやすい。肺の損傷は、α−１−抗トリ
プシンの欠乏に帰因する不適当に規制される酵素の消化
作用から生じる。この他にも、敗血症、肺臓炎、呼吸機
能の減退、及びカーデイオパルモナリイバイパス（Ｃａ
ｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ　）等の急
性の臨床状態があり、これらにも、過度のタンパク質加
水分解が主要な原因であると思われる徴候がある。

本発明は、これらの症状の処置に用いられる精製したα
−１−抗トリプシンの製造方法を提供するものである。

本発明の方法は、目的生成物を、全体的に安価且つ簡単
で、再現性がある連続工程によって製造するものであり
、治療用として安全であると共に大規模な工業的処理に
も適用し得る、相対的に純粋な生成物を製造することが
できる。

プレパラテイブバイオケミストリイ　５（４）、１９７
５、の５６３〜３４８頁にチャールズビー、クレザ−、
ラッキー　カリツク及びロバート　ファラッドによって
発表された１人のプラズマのコンフラクションＩＶ−Ｉ
からのα−１−抗トリプシンの単離及び特性」には、イ
オン交換、バイオスペシフィックアフィニティ（ｂｉｏ
ｓｐｅｃｉｆｉｃａｆｆｉｎｉｔｙ　）及びゲル排除ク
ロマトグラフ法を利用してプールした人のプラズマから
α−１−抗トリプシンを単離することが記載されている
。

ＤＨＥＷパブリケーション＋（ＮＩＨ）　７８−１４２
２、の５２６〜３８８頁にアレン　ビー、コヘン及びハ
ロルド　ジエームスによって発表された「可能な治療剤
とし°Ｃのα−１−抗トリプシンの評価」には、α−１
−抗トリプシンの単離方法とその可能な治療上の用途が
記載されている。

アナリテイカル　バイオケミストリイ　８１（１９７７
）、の５３６〜５４５頁にシー、−ビー、ローレル、エ
バトウーリン及ヒフ　−ル。

ビー、パイウォーターによって発表された［セファロー
ズ結合したチオール化合物を用いてプラズマのタンパク
質を分離する、チオール−ジスルフィド交換クロマトグ
ラフ法」、及びヨーロピアン　ジャーナルバイオケミス
トリイ　５７（１９５７）、の１０７〜１１３頁にシー
、−ビー、ローレル、ジエイ、ピアス、ニー、パーソン
及びエフ、トウーリンによって発表された［チオール−
ジスルフィド交換によるプラズマからのα−１−抗トリ
プシンの精製」にニ゛、α−１−抗トリプシン内のジス
ルフィド結合を利用した、クロマトグラフ法によるα−
１−抗トリプシ／の精製が開示されている。

ジャーナル　ラボラトリ　クリニカル　メディカル１９
７９年１２月、８２６〜８３１頁にジョンエイ、ピアス
及びビビアナ　ジー、イラテイオによって発表された［
ジチオエリトリトールを用いて等′畦的に焦点を合わせ
ることによって同定する、改良された抗トリプシンフエ
ノタイプの同定−」には、等電的に焦点を合わせること
によって抗トリプノンフエノタイプ（Ａｎｔｉｔｒｙｐ
ｓｉｎＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　）を同定するために、ジ
チオトレトール及びジチオエリトリトールを使用するこ
とがｄ己載されている。

本発明は、血液プラズマのタンパク質の混合物の溶液か
らα−１−抗トリプシンを、下記の＜＆）、（ｂ）及び
（ｃ）工程により単離することを特徴とする、α−１−
抗トリプシンの単離方法を提供するものである。

（ａ）上記タンパク質を不安定化するに足る、上記タン
パク胃内のジスルフィド結合を破壊する。

（ｂ）不安定化したタンパク質を沈澱させる。

（ｃ）そして、上記溶液から非沈澱のα−１−抗トリプ
シンを回収する。

「不安定化」という用語は、相対的な意味で用いられて
お９、処理される溶液に対するタンパク質の溶解度に関
係する。不安定化したタンパク質は、単離されたタンパ
ク質（好ましい実施態様においてはα−１−抗トリプシ
ン）より溶解度が小さい。従って、不安定化したタンパ
ク質は、後述するように、溶液条件の適当な調整によっ
て選択的に沈澱させることができる。

この相対的な不安定性を得るために、存在する全てのジ
スルフィド結合を破壊する必要はないであろう。本発明
の方法は、目的とする選択的沈澱物を得るのに足る数の
ジスルフィド結合を破壊することを意図する。

好ましい実施態様においては、上澄み液からα−１−抗
トリプシンを回収する前に、先ず沈澱したタンパク質を
分離する。タンパク質内のジスルフィド結合を還元する
には十分な還元力を有するが、タンパク質の分断の原因
となる、ペプタイド結合等のような他のタンパク質の結
合を還元することはない、好ましい眩元剤を効果的な濃
度で用いてジスルフィド結合を適当に破壊する。本発明
において用いられる典型的な還元剤は、２−メルカプト
エタノールのようなモノチオール類、メルカルト酢酸、
及びシスティ／である。好ましい非チオール還元剤とし
ては、例えば水素化硼素ナトリウムが挙げられる。

還元剤としては、ジチオトレトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉ−ｔｏｌ　）若しくはその立体異性体であるジチ
オエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ
）のようなジチオールが好ましい。

本発明においては、ジスルフィド基をスルフヒドリルに
置元した環構造を形成するのに、ジチオール類が特に効
果的である。この環形成は、好適なエントロピー効果に
よって反応を完結させる。従って、立体的に好適なジチ
オール類は、約０．０１Ｍ若しくはそれ以上の＃度、通
常約０゜０３〜０．１Ｍの濃度で使用することができる
。

モノチオール類のようなやや効果の劣る還元剤は、最小
成約０．１Ｍの濃度、通常約０．５〜１．５Ｍの濃度が
要求される。

タンパク質溶液は好ましくはｐＨを約６．０〜８．５に
緩衝剤で調整される。好ましい緩衝剤としてはホスフェ
ート及びトリスが挙げられる。

ｐＨが上記範囲より高い場合、タンパク質はあまり安定
化されなくなるが、望むならば上記範囲より高いｐＨで
も本発明の方法を実施することができる。ｐＨが約６よ
り低い場合、α−１−抗トリプシンは変性し凝集する傾
向があるため通常あまシ満足し得る結果が得られない。

タンパク質沈澱工程において、タンパク質の溶解度を低
下せしめる試薬としては、例えば、ホリエチレングリコ
ール、エチルアルコールのようなアルコール類、グアニ
ジン及び尿素などを利用し得る。好ましい実施態様にお
いては、タンパク質は、タンパク質を沈澱式せるのに典
型的に使用されている塩類、好ましくは硫酸塩のような
２価の塩を十分に加えることによって塩析させる。次い
で、沈澱したタンパク質は遠　。

心分離のような適当な手段によって上澄み液から分離さ
れる。

α−１−抗トリプシンは、後述するような、いくつかあ
る方法のうちの何れかによって上澄み液から回収される
。空胴ファイバーを用いた限外Ｃ過は、多くの場合まず
まずの結果を与える。今までのところ、厳良の結果は、
特にＤＥＡＥ−セルロースカラムを用いたクロマトグラ
フ分離法によって得られたが、他のイオン交換樹脂ある
いは他のクロマトグラフ法（ゲルト過、ヒドロキシアパ
タイト、免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏａｄａｏｒ−ｂａｎ
ｔ）、シバクロンブルーを含有する親和性カラム、コン
カナバリンＡ、ＤＮＡなど）も使用することができる、
クロマトグラフのカラムと、α−１＝抗トリプシンが他
のタンパク質より強固に結合する、ｐＨ及びイオン濃度
を包含する溶媒条件とを選択することによって、カラム
の結合能力を超えるタンパク質濃度を導入することがで
きる。α−１−抗トリプシンはカラムに結会し、それよ
り弱い結合のタンパク質はカラムを通過する。そして、
α−１−抗トリプシンは、適当なさらに強い溶媒で溶離
することかできる。

本発明の方法は、他の方法では不可能な、カラムの上方
へ多量のタンパク質を充てんすることを可能にする。

本発明の方法は、最もよく知られたプラズマタンパク質
に存在するジスルフィド結合を利用する場合に特に効果
的である。ジチオトレトールのような還元剤は、他の変
性剤が存在しない場合でもこれらのタンパク胃内のジス
ルフィド結合の多くを還元する。ジスルフィド結合の主
要な作用はタンパク質の構造を安定化することである。

従って、ジスルフィド結合が破壊された場合、タンパク
質は溶液中で不安定となる。

そして、不安定化したタンパク質は、塩析、加熱、ｐＨ
変化、溶媒の添加等の適当な手段によって容易に沈澱さ
せることができる。

本発明の方法が効果的であるのは、α−１−抗トリプシ
ンがたった一つのジスルフィド結合を有し、この結合が
タンパク質の鎖の安定化に関与しないためでおると推察
される。このように、α−１−抗トリプシンは還元工程
において不安定化されず、−ヒ澄み液に残留する。望む
ならば、この一つのジスルフィド結合は還元工程後ＫＭ
生することができる。

通常の場合、α−１−抗トリプシンのような溶液中に残
留するタンパク質は、目的とするタンパク質であｐｌさ
らに使用するため回収される。しかしながら、本発明の
方法は、沈澱したタンパク質を変性した形態で使用する
ために、あるいは他の形態に転化させるために沈澱した
タンパク質を回収することを望む場合に、沈澱したタン
パク質を溶液中のタンパク質から分離することにも利用
することができる。

本発明の方法の使用から副次的利益が得られる。本発明
において用いられる還元条件は、タンパク質起原の肝炎
ビールスの伝染性を効果的に破壊するのに役立つ。これ
は、ビールスの膜が種々のジスルフィド含有タンパク質
を持っているため、本発明の方法の条件下ではビールス
の膜が変性され、それによってビールスがその伝染性を
失なうものと思われる。

好ましい実施態様においては、タンパク質溶液として人
の血液プラズマが利用される。好ましくハ、本発明の方
法では、α−１−抗トリプシンか豊富であり（タンパク
質の６〜１０チ）、又現在アルブミン及びγ−グロブリ
ンの製造の間中比較的使用されないサイドフラクション
であるため、出発原料として血液プラズマのコンフラク
ションＩＶ−Ｉを利用する。

コンフラクションＩＶ−Ｉのペーストハ、おおよそ、タ
ンパク質を２５〜３５チ、アルコールを３０〜３５チ、
Ｈ２Ｏを３０〜４０％含有し、少なくとも次のタンパク
質から構成されている。

アルブミン（約１５〜２０チ）、α−１−抗トリプシン
（約６〜１０％）、α−１−抗キモトリプシン（約４〜
６％）、セルロブラスミン（２゜５チ）、ハツトグロブ
リン（約２チ）、抗トロンビンＩ（約ｉ％）、トランス
フェリン（約７チ）、ヘモベキシン、α−２−グラスミ
ン阻吾剤、α−１−リボプロティン、プラスミノーゲン
、フイプリノーケ／、’２　＋　Ｃ５＋α−１−アシッ
ドグリコプロティン、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、インタ
ー−α−トリプシン阻害剤、Ｃ１エステラーゼ不活性化
剤。

本発明の方法において用いられるタンパク質溶液は、タ
ンパク質起原とは無関係に、タンパク質含有量が約５０
■／−未満になるように希釈するのが好ましい。タンパ
ク質の濃度がかなり高い場合には、過度のα−１−抗ト
リプシンが沈澱したタンパク質に吸収されて失なわれる
。

試　　　　験 原料及び方法 コンフラクションＩＶ−Ｉは、冷凍した均質化ペースト
として、カリフォルニア州、バークレイのカッターラボ
ラトリイズから入手した。トリブシ／阻害能力（’ｒ　
Ｉ　Ｃ）は、基質としてベンゾイル−ＤＬ−アルギニン
−ｐ−二ｌ−ロアニリドを用い、結晶化した、塩分を含
まない牛のトリプシンにュージャージー州、フリーホー
ルドのワシントンケミカル　カンパニー製）に対して測
定した。活性トリプシンのパーセンテイジはｐ−ニトロ
フェニルｐ′−グアニジノベンゾエートで滴定すること
によって測定した。α−１−抗トリプシンの濃度は、人
のα−１−抗トリプシン（ミネソタ州、チェス力のカレ
スタンドラプス製）にうさぎの抗−血清を用いてラジア
ルイミュノデイフユージョン法（ＲＩＤ）によって測定
した。比活性は、ｍｇ／−で表わしたＴｉＣを、ロウリ
ーの方法などによって測定したタンパク質の濃度あるい
は凍結乾燥したタンパク質の重址で除することによって
算定した（１５チ水分補正）。α−１−抗トリプシンの
吸光係数ｒよ １ｍ、２８０ｎｍ であり、タンパク質の濃度及び精製した生成物の比活性
の測定に使用した。

最終生成物は、酸性の不連続緩衝系を用いてスターチゲ
ル電気泳動によってフェノタイプにし、次いで抗原−抗
体電気泳動を交差ｌ−た。

分析ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動はラエムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、　１９７０　）の方法により９チゲルに
おいて行なった。免疫電気泳動はＬＫＢ系における標準
方法によって実施し、た。

コンフラクションＩＶ−Ｉペーストｌ”ｊ、ｐＨ８，５
で０．１Ｍの緩衝液（ホスフェート、トリス）に清解し
、アルコール除去の目的に役立つｐＨ７，６で００１Ｍ
の緩衝液に対して透析することによって活性化し得る。

このことは後述する実施例１において示されているが、
アルコールを除去するための透析は必須ではない。

実施例を通じて言及した分析方法は、次の参考文献に記
載されている通りである。

ＴｉＣ＝Ｂ、Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇｅｒ、　Ｎ、　Ｋｏｋ
ｏｗｓｋｙ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｃｏｈｅｎ。

伸傳、用恕榊醤町卯璧シ、　９５．２７１−２７８（１
９６１）。

ＲＩＤ＝＝Ｍ、　Ｍａｎｃｉｎｌ、　Ａ、　Ｐ、　Ｃａ
ｒｂｏｎａｒａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｆ。

Ｈｅｒｅｍａｎｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　２９．２５５−２５４　（１９６５）。

Ｌｏｗｒｙ＝０．　）Ｌ　Ｌｏｗｒｙ、　Ｎ、　Ｌ、　
Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ａ、　Ｊ、　Ｆａｒｒａｎｄ
　Ｈ，Ｊ、　Ｒａｎｄａｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　９
豐、、　１９３．２６５−２７２　（１９５１）。

実施例１ α−１−抗トリプシンの活性化及び塩析コンフラクショ
ンＩＶ−１１０ＤｆをｐＨ８，５の０．１Ｍホスフェー
ト１．０１Ｊツトルに溶解し、約３時間攪拌した。溶解
しなかった原料は１過によって除去した。溶液は次に示
す４つのアリコ−４に分けた。第１のアリコー）　（Ａ
）は約２０ｑ／−まで直接凝縮した。第２のアリコー１
　（Ｂ）は、光ｊ＝、１０．０００Ｍ、Ｗ、カットオフ
のＤＣ−２アミコン卒胴フアイバー（Ｄ　Ｃ−２Ａｍ１
ｃｏｎ　ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ）ヲ用いてｐＨ８，
５の０．（ＮＭホスフェートに対して透析し、次いで、
約２０η／−まで濃縮した。

第３のアリコート（Ｃ）は、約５０Ｔｎｇ／−まで限外
ｐ過によって濃縮した。第４のアリコー）　（Ｉ））は
、ｐＨ８，５の０．０１　Ｍホスフェートに対して透析
し、次いで約５０ｍ９／−まで濃縮した。これらの（χ
−１−抗トリプシン溶液の各アリコート（ＡｍＤ）をそ
れぞれ１０−ずつ用意した。それぞれ溶液の半分は０．
１Ｍジチオトレトール（ＤＴＴ）を用いて２５℃で３時
間又は２４時間処理した。

そし、て、全ての試料は５℃で５０チ（ＮＨ４）２５ｏ
ｉｌの最終濃度まで塩析し、−晩生攪拌した。次いで、
これを３００　Ｏｒｐｍで２時間遠心分離した。

沈澱物を５０％（ＮＨ４）ｚｓＯ＋＋で洗浄し、上亀み
液を一緒にした。各ザンプルについて、初期及び最終ト
リプシン阻害能力をＴＩＣ分析によって、又タンパク質
含有量をロウリーの方法によって測定した。その結果を
表１に総括する。

結論 １．塩析する前にアルコールを除去するためのコンフラ
クションＩＶ−Ｉ溶液の透析は必要としない。

２、ＤＴＴは、上澄み液中のα−１−抗トリプシンの回
収に不利益な影響を及ぼさずにタンパク質の沈澱物の媒
質を提供するのに非常に効果的である。

３、タンパク質の濃度が２０〜５０η／ゴの範囲におい
ては、同僚に極めて効果的に、選択的に塩析される。

実施例２ 抗トリプシンの回収を最大にするため、コンフラクショ
ンＩＶ−Ｉを透析しないで実施例１に記載したように活
性化した。活性化溶液は、ロウリーの方法（二よる測定
によれば約２７．７ｓＩｑ／ｙのタンパク質を含有して
いた。次のＤＴＴ濃度を使用した。０．０．０２　Ｍ、
　　０．０３　Ｍ、　　０．０５Ｍ、　　０．１０　Ｍ
、　　０．２０　Ｍ０各ＤＴＴ濃度に対し、分離培養を
３時間、８時間及び２４時間行なった。還元後、各アリ
コート１０ｍ１を、飽和（ＮＨｌｌ）２Ｓｏ、１０ｒｎ
ｔを用いて５℃で５０％の最終濃度まで沈澱させ、２４
時間培養し、次いで、遠心分離し、洗浄し、再び遠心分
離した。α−１−抗トリプシンのジスルフィド納金を再
生するため、上澄み液を、０．０１Ｍシスティンを含有
する、ｐＨ７，６の０．０１Ｍホスフェート緩衝＃ｉ、
１×４リットルに対して透析した。過剰のシスティンを
除去するために０．０１Ｍホスフェート緩衝液３×４リ
ツトルに対する最終透析を行なった。

結　　論 第１図及び第２図に示した測定結果から次のことがわか
る。

１、ジチオトレトール（ＤＴＴ）を用いて還元し７、次
いで（ＮＨ，、）２ＳＯ１（ｓ　ｏ％）を用いて沈澱さ
せることは、コン　フラクションＩＶ−［）α−１−抗
トリプシン含有タンパク員溶液から混入タンパク質を除
去するのに非常に効果的である。

２６　　効果は、還元剤の濃度及び還元時間に依存する
。０．０５Ｍ　ＤＴＴの８時間処理は、精製ファクター
８．０以上を与え、非常に効果的である（コントルール
の場合の精製ファクター５．０と比較して）。ＤＴＴの
濃度をさらに高くすれば幾分良くなるが、コストファク
ターが増大する上改良もほんのわずかに過ぎない。

３、アルブミンはこの処理で完全に除去される。

４、α−１−抗トリプシン活性の回収率はＴＩＣによる
測定によれば７５〜８０饅であり、ＤＴＴが存在しない
場合の回収率と近似している。

５、免疫学的活性の回収率（ラジアルイミュノデイフイ
ージョン）は約５５〜６０％である。

（注：これは、最初のコン　フラクションＩＶ−ｆ溶液
においてα−１−抗トリプシンが＃果したためであり、
このことは実施例３において示す。）実施例３ 抗トリプシン凝集体がコン　フラクションＩＶ−１に存
在するかどうかをみるため、タンパク質２５．６ツ／−
及びα−１−抗トリプシン１．７η／ゴ（ＴＩＣによシ
測定）を含有するコン　フラクンヨンＩＶ−１溶液のア
リコート０．６ｍｌを０．１０　ＭＮＨ，）（Ｃｏ、で
平衡状態にあるセファデックスＧ　−１５０カラム（１
，５Ｘ　９１　ｃｆｎ）の上方に注入した。

浴出液のＴＩＣ分析に対し７て、フラクション１８〜２
９はほんのわずかの阻害活性を示した。

そして、これらのフラクションをプールした（ピークＡ
）。大きな活性を持つフラクション３０〜４０を一緒に
した（ピークＢ）。

１　　”υ 結論 コンフラクションＩＶ−Ｉは約５２９６の凝集体を含有
していると思われる。これは、およそ次の２つの理由に
よる。１）ラジアル　イミュノデイフユージョン分析（
ＲＩＤ）は、単量体のα−１−抗トリプシンと重合した
α−１−抗トリプシンとを区別しない。重合したα−１
−抗トリプシンは寒天ゲル中に拡散しないのでその濃度
は低く評価される。、２）カラムが最適でなかったので
、単量体が若干ピークＡで溶離された。

そして、これがα−１−抗トリプシンの重合体を過大評
価させることになったと思われる。換言すれば、ピーク
Ａで見られた、限定されたトリプシン阻害活性は、コン
フラクションＩＶ−Ｉに存在することが知られている他
の分子量の高い阻害剤、即ちα−２−マクログロブリン
、インター−α−トリズシン阻害剤の結果でおると思わ
れる。

実施例会 抗トリプシン凝集体に対する還元及び塩析の効果を試験
するため、還元−塩析したコンフラクションＩＶ−Ｉの
上澄み液を０．１　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析し
、タンパク質１９．１ｍｇ及びα−１＝抗トリプシン９
．６■を含有するアリコート１−を同一の緩衝液で平衡
状態にあるセファデックスＧ−１５０カラム（１，５Ｘ
９１鋸）内へ注入した。

フラクションをプールし、Ａ（凝集体ピーク）及びＢの
標識を付した。そして、これらを、下記表面に示す通り
、種々の分析法によって分析した。

表　　■ Ａ　　　　　　０　　　　　　　　　　０Ｂ　　　　　
　Ｏ，４２５，５ 結論 コン７ラクシヨンをＤＴＴで処理し、次いで（ＮＨ４）
２８０４によって塩析した場合は、全ての凝集したα−
１−抗トリゾジノを効果的に除去することは明らかであ
ると思われる。

実施例５ 還元時間及び／又は還元剤のモル濃度を塩析系において
減少させることができるかどうかをさらに測定するため
、３７℃で実験した。

活性化ｔ、ＪｃコンフラクションＩＶ−Ｉをタンパク質
３１．９η／−を含有するアリコー）９．５ｄに分け、
種々の濃度のＤＴＴ又はシスティンを添加して３７℃で
２時間、４時間又は８時間処理し、た。還元剤を含有し
ないコントロールの溶液も同様に処理した。それから、
全てのアリコートを５０チ（ＮＨｌｌ）２８０＋４の最
終濃度まで処理し、５℃で２４時間培養し、１０．００
　Ｏｒｐｍで遠心分離し、沈澱物を冷５０％（ＮＨ４）
２８０４で洗浄した。

上澄み液を一緒にして、０．０１Ｍシスティンを含有す
るｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフェート１×４リット
ルに対して、次いでシスティンを含有していないｐＨ７
，６の０．０１　Ｍホスフェート３Ｘ４リットルに対し
て透析した。Ｔ　Ｉ　Ｃ，ロウリー及びアルブミン　ラ
ジアル　イミュノデイフユージョン分析を行なった。そ
の結果を表■に総括する。

表　　　　　■ ０．０１ＭＤＴＴ　７８，６１７．０２．０５．５０．
０５ＭＤＴＴ　　　７Ｂ、６　　　１１，５　　　　０
　　７．５０．１ＭＤＴＴ　７０．９１０．３０７．５
０．１Ｍシスティン　　８５．５　　　　２４．０　　
　　　？５．０　　　３．３１．０Ｍシスティン　７５
．５　　　　１６．０　　　　２１．ロ　　　５０口４
噴 コントロール　　　　８９，０　　　　５１．５　　　
　９？、５　　　５．００．０１ＭＤＴＴ　７４．２１
３．０７．７６．３０．０５Ｍ　　ＤＴＴ　　　　　　
　　６Ｂ、０　　　　　　　　　１０．８　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　６．８０．１ＭＤＴＴ　
７４．２９，６０８．５０．１Ｍ　システィン　Ｂ４．
８　　　　２５．８　　　　８９．３　　　５．５１．
０Ｍ　システィン　７４．２　　　　１２．９　　　　
　１．５　　　６．３８時間 コントロール　　　　　９４，８　　　　５２．８　　
　１００．０　　　４５．５０．０１ＭＤＴＴ　　　　
７６．８　　　　１３．０　　　　１．ロ　　　６．３
０．０５Ｍ　ＤＴＴ　　　８０．０　　　１１．３　　
　　０　　７．５０．１Ｍ　ＤＴＴ　　　　７３．８　
　　　９．４　　　　　０　　　８．５０．１Ｍ　シス
ティン　９１，５　　　　２４．７　　　　９９．０　
　　４，０１、ＯＭ　　７ステイン　　７９，８　　　
　１４，９　　　　　　　０　　　５．８結論 ＤＴＴを添加し、６７℃で４〜８時間処理して得られた
精製ファクターは、２５℃で２４時間処理した場合と同
様であった。システィンは１Ｍの場合でさえ、０．０５
ＭのＤＴＴより効果がない。

実施例６ 還元後の塩析におけるｐＨの影響を調べるため、エタノ
ールを除去せずにコンフラクションＩＶ−■を活性化し
た。この実験のために、塩析をｐＨ６，０及びｐＨ８，
５で行なった。ｐＨ８，５の０．１Ｍホスフェートに溶
解したコン７ラクシヨンＩＶ−Ｉ８０−（１５ｍｇ／ｍ
Ｊタンパク質、ロウリー渕を４０−ずつ２つのサンプル
（Ａ及びＢ）に分けた。サンプルＡを０．１ＭＤＴＴに
よって室温で２４時間処理した。サンプルＢはコントロ
ールとしてそのまま保持した（ＤＴＴなし）。還元後、
サンプルＡをアリコー）　ＡＩ及びＡ２に等分した。ア
リコートＡｌを攪拌下ＩＭＨＣ１でｐＨ６，０まで滴定
した（最終容積２２．ｓｍｊ）。了りコートＡ２を、ア
リコートＡ１と同じタンパク質濃度とするためにｐＨ８
，５で希釈した。　コントロールのサンプルＢもサンプ
ルＡと同様に処理した。各アリコー）　（Ａ１．　Ａ２
．　Ｂｌ、　Ｂ２　）からそれぞれ２０−とり、これら
を５０％塩の最終濃度まで５℃で（ＮＨ４）２８０１１
ｖｃよッテ処理した。２４時間培養した後、固体沈澱物
（５ｏｌｉｄ　ｐｐｔａ　）をｉｏ。

ＯＤＤ　ｒｐｍで遠心分離し、洗浄して、ｏ、　ｏ　ｉ
　Ｍシスティンを含有するｐＨ７，６の０．０１　Ｍホ
スフェ−１−ＩＸ４リットルに対して、次いでｐＨ７，
６の０．０１Ｍホスフェート３×４リツトルに対して透
析した。

−八４− 結論 塩析前にｐＨを６に調整した場合、全部のタンパク質の
沈澱量を幾分大きくするが、α−１−抗トリプシンの沈
澱量も増加する。精製ファクターは、ｐＨ６及び８．５
でほぼ同じ結果が得られる。α−１−抗トリプシンの損
失がｐＨ６で大きいので、ｐＨ８，５での塩析が好まし
いと思われる。

実施例７ プラズマを還元及び塩析することによって遂行される精
製ファクターを測定するため、肋溶性プラズマを２倍、
４倍又は６倍に希釈し、各溶液をそれぞれ２つに等分し
た。このうらそれぞれ１つを０．１ＭＤＴＴによって２
５℃で２４時間還元し、次いで５０チ（ＮＨｌｌ）２８
０４まで塩析した。他のそれぞれ１つは培養し塩析した
が、還元しなかった。還元アリコー）Ａ、ＢＸ　Ｃは１
０．００Ｏｒｐｍ　（５℃）で２０分間遠心分離するこ
とによって容易に除去し得る不溶性タンパク質を有して
いた。上澄み液と洗浄液とを一緒にし、５０　ｑ６（Ｎ
ｎ４）２ｓＯＩＩ飽和まで処理し、５℃で２４時間賠１
して前記の如く遠心分離した。コントロールも（Ｎｌ（
＋４　）２　ＳＯ＋４などで同様に処理した。

名溶液を、０．０１Ｍシスティンを含有するｐＨ７゜６
のホスフェート１×４リツトルに対して、次いでホスフ
ェ−１・単独に対して透析した。

＜ＩＩＧＱ（Ｊ　　　ρ　　に）　　１結　　論 直光−塩析系は、プラズマにおける精製ファクターを非
常に増大させる。プラズマ溶液の希釈は良好な結果を与
える。アルブミンは、ラジアルーイミュノデイフユージ
ョンによって示されたように、本質的に完全に沈澱し得
る。

実施例８ 上澄み液からのα−１−抗トリプシンの分離を説明する
ため、コンフラクションＩＶ−ＩＱ活性化し、前の実施
例に記載したように還元し塩析した。得られた溶液（７
７０Ｔｎｌ）は、タンパク質を約２．７７　ｍｙ　／　
ｍｌ含有していた。該タンパク質の約５０俤はα−１−
抗トリプシ／であった。２０ｍＪＤＥＡＥ−セルロース
カラムにｐＨ７，６の０．０１Ｍホスフェートを充てん
し平衡状態にした。抗トリプシン活性に関して溶出液フ
ラクションを監視するためにＴＩＣを用いた。タンパク
質の総計が１．８４ｆ又は樹脂１−当りのタンパク質が
９２■の、最大カラム能力に相当する溶液６６４　ｍｌ
を充てんした。それから不結合のタンパク質を除去する
ため樹脂を出発緩衝液で洗浄し、次いでｐＨ７，６の０
．０１ＭホスフェートからｐＨ６，０の、０．０１　Ｍ
ホスフェート」−０，０７ＭＮａＣ１へ次第に頌斜させ
た液４００ｄで溶離した。ＯＤ及びＴｉＣを監視した後
、活性フラクション（６０〜１１５）をプールシタ。タ
ンパク質の約５９７１ｎｇ（約５２饅）が樹脂に結合し
なかった。結果を表■に総括する。

結論 得られ九生成物は全く純粋であった（比活性０．９４■
抗トリプシン／■タンパク質）また、本実施例では、過
充てんし九カラムを効果的に利用できることが例証され
た。

実施例９ コンフラクションＩＶ−Ｉを、前の実施例で記載したよ
うに、活性化、還元及び塩析した。２３ｍｊＤＥＡＥ−
セルロースカラムｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフェー
ト緩衝液で平衡状態にし、樹脂１ｒｎｌ幽りのタンパク
質が２５．７１１９に相当するタンパク質溶液４３０−
を通した。不結合のタンパク質を出発緩衝液で洗い落し
、そして、カラムを、ｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフ
ェートからｐＨ６，０の、０．０１Ｍホスフェ？　＋０
．１　Ｍ　ＮａＣ１ヘ次第に傾斜させた液５００−で溶
解した。タンパク質溶離パタンを得、活性に関してタン
パク質を検査した後、チューブ１７５〜２１０をプール
した。結果を表■に総括する。

結論 過充てんしなかったＩ）ＥＡＥ方法は、カラムに充てん
されたα−１−抗トリプシンの総量に対して８４チの回
収率で純度の高い優れた生成物を与える。多量の抗キモ
トリプシンがカラムに強く結合していること、そして望
むならばこれを分離できることが明白である。

実施例１０ コンフラクションＩＶ−Ｉ溶ｔＬを、前の実ｍ例で記載
したように、活性化、還元及び塩析した。

タンパク質１６．３η／−及びα−１−抗トリプシン５
．９１１ｖ／−を含有し、０．０１Ｍ１Ｍホスフェ−０
，０１Ｍシスティンでｐ）（乙６に調整し、ＤＴ　Ｔ　
／　（ＮＨ４）２８０４処理したタンパク實溶液３６５
−を、限外濾過によって約２５０−まで濃縮した。この
溶液を、１００．０００Ｍ、Ｗ、のカットオフ空胴フ゛
アイバーを用いて０．０５　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３１９８
０−に対して透過した。Ｆｉ液及びチャンバー（Ｃｈａ
−ｍｂａｒ　ｌ内に残留した溶液の両方について、α−
１−抗トリプシン含量及び純度を検査し、ＤＥＡＥ−セ
ルロースから得られたα−１−抗トリプシンと比較した
。

１００、０００Ｍ、Ｗ、カットオフでのアミコン限外濾
過を用いた場合、α−１−抗トリプシンの８７チが膜を
通過し、１．８倍の精製ファクターが得られた。精製し
たタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、高
分子量の１つの主要な不純物、おそらくα−１−抗トリ
プシン凝集体を見せた。他方、ＤＥＡＥ−セルロースに
よって精製された物質は均質であった。生成物の純度に
ついても、プラズマのタンパク質とは異なった抗体を用
いて免疫電気泳動（ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓ１８）によって検査した。ＤＥＡＥ−セルロース
によって精製された阻害剤は、抗トロンビン璽及びα−
１−リポプロティンの不純物を示した。

アミコンによってｎ製したα−１−抗トリプシンは、上
記不純物に加えて、α−１−抗キモトリプシン、α−１
−アシッドグリコプロティン及びＣＩＳ不活性化剤も含
有していた。

結論 ＤＥＡＥ−セルロースによる精製工程は、純度（８９％
対７０〜７５チ）及び回収率（９１俤対８７　％　）　
Ｉｆ（おいて限外１過より優れている。

他方、限外ｐ過による精製は、非常に迅速且つ簡単で安
価でおり、また容易に規模を大きくすることができる。

実施例１１ ローレル等による刊行物（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、　５７：１０７−１１３．１９７５）においては
、α−１−抗トリプシンをチオール−ジスルフィド交換
させるためにプラズマを３０　ｍＭβ−メルカプトエタ
ノールで処理している。この工程では、チオールクロマ
トグラフイエ程の前にα−１−抗トリプシンを部分的に
精製するため硫酸アンモニウム分別を行なっている。

本実施例では、ローレル等によって記載された条件及び
本発明法で使用された条件を用いて、β−メルカプトエ
タノールとＤＴＴとの還元剤としての効果を比較した。

ローレル等の条件：３０ｍＭβ−メルカプトエタノール
で培養し、次いで、２５℃で５０チ飽和（ＮＨ４）２ｓ
Ｏｑで分別した。本発明法の条件；１００ｍＭＤＴＴで
２４時間培養し、次いで、４℃で５０％飽和（ＮＨ４）
２ＳＯ＋４で分別した。

下記表Ｘに列挙した実験を行なった。

最終の還元剤濃度（３０又は１００ｍＭ）を与えるため
、プラズマのアリコート２．０ｒｎｔに還元剤水溶液４
．　Ｏｒｎｔを添加した。これらの処理プラズマのサン
プルを２５℃で１時間又は２４時間培養し、次いで、１
００俤飽和（ＮＨ４）２８０４溶液６．０−を２５℃又
は４℃でそれぞれに添加した。

６時間後、サンプルを３．０００　ｘｇで２０分間遠心
分離し、５０チ飽和（ＮＨ４）２　ＳＯ＋＋で洗浄して
再び遠心分離した。上澄み液を、１０ｍＭシスティンを
含有するｐＨ７，６の１０　ｍＭリン酸ナナトリウム緩
衝液対して、次いでｐＨ７，６の１０ｍＭホスフェート
単独に対して透析した。透析した上澄み液及びプラズマ
のコントロールについて、ロウリー及びＴＩＣ分析を行
なった。その結果を表Ｘに示す。

表　　　　　Ｘ プラズマからのα−１−抗トリプシンの４′＃製におけ
るβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）とＤＴＴとの歯
元剤としての比較 コントロール　　２．５　　　　１３１．２　　０．０
１９　　１１、時間還元 還元剤なし　　　１．９５　　　　６６．８　　０．０
２９　　１゜５３０ｍＭ　　ＢＭＥ　　　２．１７　　
　　７２．５　　０．０３０　　１．６３０ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ　　　１．９６　　　　１８．０　　０．１０９　
　５．７１００ｍＭＢＭＥ　　１．８６　　　　７１，
１　　０．０２６１．４１００ｍＭ　Ｄ’Ｉ’Ｔ　　１
．７６　　　　　　Ｂ、１　　０．２１７　　１１．４
２４時間還元 還元剤なし　　　２．０８　　　　７２．０　　０．０
２９　　１．５３０ｍＭ　　ＢＭＥ　　　１．９６　　
　　７１．３　　０．０２７　　１．４５０ｍＭ　　Ｄ
Ｔ’ｌ”　　　０．９Ｂ　　　　　　４．５５　０．２
１５　１１．３１００ｍＭ　ＭＢＫ　　１．８８　　　
　５３，０　　０．０３５　　１．８１００ｍＭ　ＤＴ
Ｔ　　、１．０７　　　　　５，２８０．２０３　１０
．７結論 表Ｘの結果は次の結論を示している。

１．１時間培養、還元剤使用、２５℃での塩析： ａ、ＤＴＴと（ＮＨ４）２８０４を加えた場合は、５゜
チ飽和（ＮＨ４）２　ＳＯ＋＋単独の場合より、プラズ
マからのα−１−抗トリプシンの精製を著しく向上させ
る。１００ｍＭＤＴＴは、短い培養期間において３０ｍ
ＭＤＴＴより効果がある。

ｂ、　β−メルカプトエタノールと５０％飽和（ＮＩ（
４）２　ＳＯ４を加えた場合は、α−１−抗トリプシン
の精製において、（ＮＨ４）２５Ｏ１ｌ＊独の場合を超
える改良を生じていない。１００ｍＭβ−メルカプトエ
タノールと３０　ｍＭβ−メルカプトエタノールはいず
れも効果的でない。

Ｃ１ローレル寺の条件（３０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール、１時間培ＩＩＥ、５０％飽和（ＮＨｌＩ）２８０
１＋、室温（約２２℃））は、α−１−抗トリプシンの
精製において、（ＮＨ４）２ＳＯ＋４単独の場合を超え
る改良を生じていない。ローレル等の方法におけるβ−
メルカプトエタノールの使用は、次のチオール交換クロ
マトグラフィのためにα−１−抗トリプシ／を還元する
ためであり、混入タンパク員を不安定することによって
α−１−抗トリプシンの精製を向上させるためではない
。

２、２４時間培養、還元剤使用、４℃での塩析； ａ、ＤＴＴと５０優飽和（ＮＨｌｌ）２Ｓ０１１を加え
た場合は、（ＮＨｌｌ）２５ＯＩＬ単独の場合より、プ
ラズマからのα−１−抗トリプシンの精製を着しく向上
させる。３０ｍＭＤＴＴは、この培養期間において１０
０ｍＭＤＴＴと同じ位効果がある。

ｂ、　β−メルカプトエタノールと５０％飽和（ＮＨ＋
４　）２８０４を加えた場合は、１時間の還元において
さえも、α−１−抗トリプシンの精製において、（ＮＨ
ＩＩ）２８０Ｉｌ牟独の場合を超える改良を生じておら
ず、２４時間で１００ｍＭにおいて始めてわずかな改良
がみられた。

Ｃ１還元剤で２４時間培養した、３倍に希釈したプラズ
マのＤＴＴ処理サンプルにおけるα−１−抗トリプシン
の収率は約４０％であり、これは堅固なかたま９が構成
されたためである。α−１−抗トリプシンの収率におけ
る、このＤＴＴの効果は、１時間培養しまたサンプルに
おいても、また、前の実施例に示した如く、６倍に希釈
したプラズマにもみられなかった。

実施例１２ プラズマからのα−１−抗トリプシンの精製において、
還元−塩析系によるｆ＃製と比べて、ＤＴＴ単独でも１
−分効果があるかどうかをみるために、ド配表Ｍに列挙
した実験を行なった。。

ピアス及びエラジオ（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍ
ｅｄ、　９４：　８２６−８６１．１９７９）は、α−
１−抗トリプシンを等電的に焦点を合わせること（１ｓ
ｏｅｌｅｃｔｒｉａ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）によってフ
ェノタイツ゛する前に、プラズマからアルブミンを除去
するためにＬ）ＴＴを使用した。彼等は、３０　ｍＭ　
Ｄ　’ｒ　’１”を用いて、６７℃で１時間でアルジミ
ンが略同なかたまりになって沈澱することを発見した。

本実験では、３ｏ及びｉｏ。

ｍＭｍ度の還元剤を用いた場合、ＤＴＴと（ＮＨ４）２
８０４の組合せがＤＴＴ単独よりα−１−抗トリプシン
の楕製會向上させることを示した。

上ｒ＋己Ｄ　Ｔ　Ｔ　濃度を与えるため、プラズマのア
リコー）　２．０　ｍｇに還元剤水溶液０．２　〃Ｊを
添加した。歯元処理し／こプラズマのサンプルを３７℃
で１時１…培養し、それから、３０００ｘｇで遠心分離
するか若しくは５０％飽和（Ｎｌ（４）２８０４で分別
して遠心分離した。上澄み液を、１ｏｍＭ’Ｊン酸ナト
リウム（ｐＨ７，６）　＋１０ｍＭシスディン緩衝液に
対して、次いで１ｏｍＭホスフェート（ｐＨ７，６）Ｋ
対して透析した。サンプル及びプラズマのコントロール
をロウリ及びＴＩＣによって分析した。ぞの結果を表Ｍ
に示した。

表　　　　　ＸＩ プラズマからのα−１−抗トリプシンの精製におけルＤ
ＴＴ単独とＤＴＴ　＋　５０％飽和（ＮＦＩｌｌ）２ｓ
Ｏ１との比較 （Ｎｆ（１１）２ＳＯ５なし ＤＴＴなし　　　　１．６２　　　　　Ｂ８．９　　０
．０１８　　１，０３０ｍＭ　ＤＴＴ　　　Ｏ，６０１
３，２０，０４５２，５１００ｍＭＤＴＴ　　　Ｏ，６
４１４，９０，０４３２，４（ＮＨｌ）２ＳＯ１あり ＤＴＴなし　　　　　１．５５　　　　　４４．６　　
　０．０３５　　１．９３０ｍＭ　ＤＴＴ　　　Ｏ，６
１３，２６０，１８８１０，４１００ｍＭＤＴＴ　　　
Ｏ，４９５，１７０，１５５Ｂ、６結論 １、ＤＴＴ単独の場合は、非希釈のプラズマからのα−
１−抗ｌ・リプシンのわずかな？＃蜆を与える。

２、　　ＤＴＴと５０％飽和（ＮＨｌ）２Ｓ０１１を加
えた場合は、α−１−抗トリプシンの精製をＤＴＴ単独
の場合の約４倍改良する。

３、　ピアスとエラジオの条件（３０ｍＭ　ＤＴＴ、３
７℃で１時間）は、１）ＴＴ還元と５ｏ％飽和（ＮＨ，
）２８０．による分別の組合せによって示された、α−
１−抗トリプシン精製の驚異的な向上を示さない。

４、　　ＤＴＴ還元で培養した非希釈のプラズマからの
α−１−抗トリプシンの低収率（３０〜４０％）は、か
たま９が生成されたことに起因する。このＤＴＴの影響
け、前に示したように、６倍に希釈したプラズマには見
られナイ。

実施例１３ エアロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）　、燻蒸し九シリカ製品
であるが、これが還元−塩析法においてα−１−抗トリ
プシンの精製を改良することができるかどうかを試験す
るため、また、生成物が（トリプシンに加えて）エラス
ターゼに対して活性を保持しているかどうかを測定する
ため、次の実験を行なった。

コン　フラクションＩ　Ｖ−１中のα−１−抗トリプシ
ンの活性化を、ｐＨ８，５のｏ、ＩＭ）リス−ＭＣＩ０
．５を中にコン　フラクション■Ｖ−■ペースト５０〜
を蕗博し、この溶液な２５℃で一晩中撹打することによ
って行なつ７’＜、、２５ｍＭの一度のジテオトレトー
ヤを活性化したコン　フラクションＩＶ−１に２．５％
エアロジルＳａＯ（ディガツサ、インコーポレー？／ヨ
ン、チェイタ−ポロ、ニューシャーシー州）の存在下に
２５′Ｃで加え、２４時間攪拌した。エアロジル５８０
は燻蒸シリカ物質であり、水溶液からα−リボプロティ
ン、β−リボプロティン及びβ−グロブリンを除去する
のに効果があると報告されている。ジチオトレトール処
理溶液を４℃で５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析Ｌ７
、ぞして、−晩平衡状態にした後、３０００Ｘｒで１時
間遠心分離し友。沈澱物を５０−飽和（Ｎ′［■１ｌ）
２　ｓｏ、、で洗浄し１、再び遠心分離した。

上澄み液を一緒にして、１０ｍＭシスティンを含有する
しＨ７，６の１０ｒｎＭリン酸ナトリウムに対して透析
し、次いでｐＨ７，６のリン酸す）　ＩＪウムに対して
透析した。

※　エラスターゼ阻害能力（Ｅ　Ｉ　Ｃ）は、ｐ−ニト
ロフェニル−Ｈ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−
１−アラニンを基質として用いて豚の膵臓のエラスター
ゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）に対して
測定した。Ｖｉａｓｅｒ、　Ｌ、、　ａｎｄ　Ｂｌｏｕ
ｔ。

２５７−２６０゜ 結論 １、エアロジル法は、より大きな精製ファクターを与え
（約１６．７．１３．９対８．１５（嚢■））、混入タ
ンパク質を除去するのに効果があると思われる。α−１
−抗トリプシンの回収率はエアロジルの不存在下で行な
った実験の場合と同程度であった。

２、生成物は、トリプシン阻害能力に類似したエラスタ
ーゼ阻害能力を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は実施例２における測定結果を示すグ
ラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）血液プラズマのタンパク質の混合物の溶液からα
   −１−抗トリプシンを、下記の（ａ）工程、（ｂ）工程
   及び（ｃ）工程により単離することを特徴とする、α−
   １−抗トリプシンの単離方法。 （ａ）　　上記タンパク質を不安定化するに足る数の、
   上記タンパク胃内のジスルフィド結合を破壊する。 （ｂ）　　不安定化したタンパク質を沈澱させる。 （ｃ）　　そして、上記溶液から非沈澱のα−１−抗ト
   リプシンを回収する。 （２）さらに、上記α−１＝抗トリプシンを回収する前
   に上記溶液から沈澱したタンパク質を分離する工程を特
   徴する特許請求の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリ
   プシンの単離方法。 （３）　　上記ジスルフィド結合の破壊が、ジスルフィ
   ド結合を還元するのに十分であるが、タンパク質を分断
   するほど他のタンパク質の結合を還元するには不十分で
   ある還元力を有する、効果的濃度の還元剤で上記溶液を
   処理することによって行なわれる、特許請求の範囲第（
   １）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （４）上記還元剤がモノチオール類及びジチオール類か
   ら選択される、特許請求の範囲第（３）項記載のα−１
   −抗トリプシンの単離方法３、（５）上記モノチオール
   が約０．１〜１．５Ｍの濃度で存在し、また上記ジチオ
   ールが約０．０１〜０．１Ｍの濃度で存在する、特許請
   求の範囲第（４）項記載のα−１−抗トリプシンの単離
   方法。 （６）上記還元剤がジチオトレトール及びジチオエリト
   リトールから選択される、特許請求の範囲第（３）項記
   載のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （７）−Ｆ記還元剤が約０．０５〜０．１０Ｍの濃度で
   上記溶液に添加される、特許請求の範囲第（６）項記載
   のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （８）還元反応が約２５〜３７℃で約２〜２４時間行な
   われる、特許請求の範囲第（７）項記載のα−１−抗ト
   リプシンの単離方法。 （９）上記不安定化したタンパク質が塩析によって沈澱
   される、特許請求の範囲第（１）項記載のα−１−抗ト
   リプシンの単離方法。 ＯＱｌ　　上記塩析が硫酸塩を添加することによって行
   なわれる、特許請求の範囲第（９）項記載のα−１−抗
   トリプシンの単離方法。 （ＩＩ）　　上記血液プラズマのタンパク質が、ｐＨが
   約６〜８．５の緩衝溶液中に保持されている、特許請求
   の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方
   法。 （１２上ｄ己卯沈澱のα−１−抗トリプシンの回収がク
   ロマトグラフィ分離によって行なわれる、特許請求の範
   囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシ／の単離方法。 （１：１　　上記クロマトグラフィ分離が、上記非沈澱
   のα−１−抗トリプシンを含有する一ヒ記溶液ｉ　ＤＥ
   ＡＥ−セルロースのカラムに通すことによって行なわれ
   る、特許請求の範囲第α３項記載のα−１−抗トリプシ
   ンの単離方法。 Ｉ　上記浴液が、ＤＥＡＥ−セルロースの結合能力以上
   にタンパク質を導入する量で上記カラムに通される、特
   許請求の範囲第（１９項記載のα−１−抗トリプシンの
   単離方法。 ｆｌｓ　　上記非沈澱のα−１−抗トリプシンが、限外
   １過によって上記溶液から回収される、特許請求の範囲
   第（１）項記載のα−１−抗１−　ＩＪプシンの単離方
   法。 （１６）上記血液プラズマのタンパク質の混合物が人の
   プラズマのコンフラクションＩＶ−Ｉである、特許請求
   の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方
   法。 αη　上記不安定化したタンパク質が、塩析によって沈
   澱される前に、α−１−抗トリプシンの精製を向上させ
   るのに十分な量の燻蒸したシリカで処理される、特許請
   求の範囲第（９）項記載のα−１−抗トリプシンの単離
   方法。 （ｆｉｌｌ　　ｐＨが約６〜８．５で且つタンパク質の
   濃度が約５０■／−より少ない、血液プラズマのタンパ
   ク質のコンフラクションＩＶ−Ｉの緩衝溶液からα−１
   −抗トリプシンを、ドｄ己の（ａ）、（ｂ）　、（ｃ）
   及び（ｄ）工程により単離することを特徴とする、α−
   １−抗トリプシンの単離方法。 （ａ）　　上記タンパク胃内のジスルフィド結合を破壊
   するのに足る、ジチオトレトール及びジチオエリトリト
   ールから選択された還元剤を添加する。 （’ｂ）　　それから、上記タンパク質を沈澱させるの
   に足る、２価の塩を添加する。 （ｅ）　　上澄み液と沈澱したタンパク質とに分離する
   。 （ｄ）　　そして、クロマトグラフィ分離によって上呂
   己上澄み液からα−１−抗トリプシンを回収する。 叫　さらに、上記回収したα−１−抗トリプシンを再生
   する工程を特徴する特許請求の範囲第０８項記載のα−
   １−抗トリプシンの単離方法。 （２０）　　上記再生が、上記回収したα−１−抗トリ
   プシンをシスティンの緩衝溶液に対して透析することに
   よって行なわれる、特許請求の範囲第（１０項記載のα
   −１−抗トリプシンの単離方法。 （２Ｉ）　　安定化に利用されるジスルフィド結合を分
   子内に化学的に有していないタンパク質又は上記結合を
   全く有していないタンパク質を、上記結合を有するタン
   パク質を含むタンパク質の溶液から下記の（、）工程、
   （ｂ）工程及び（ｃ）工程により単離することを特徴と
   １−る、タンパク質の単離方法。 （１Ｌ）安定化したタンパク質を不安定化するに足る数
   の、上記安定化したタンパク胃内のジスルフィド結合を
   破壊する処理を上記溶液に対し行なう。 （ｂ）　　破壊されたジスルフィド結合を有するタンパ
   ク質を選択的に沈澱させる一方、他のタンパク質を上澄
   み液に残留させる。 （、）　　そして、（１）沈澱したタンパク質及び（２
   ）上澄み液に残留するタンパク質の、少なくとも一つを
   回収する。