JPS584914B2 - 酵素固定化用の支持体マトリックス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 酵素は本質的にタンパク質性で普通には水溶性の物質で
あり、これが生体内で起る多くの多様な化学反応の制御
作用をする生物学的触媒であることは周知である。

酵素は単離されて、分析、医学および産業用の用途に使
用されることもある。

たとえば、酵素の産業用の用途としては、チーズやパン
のような食品の製造ならびにアルコール飲料の製造があ
る。

産業における酵素の利用例をいくつか具体例に列挙する
と、アミノ酸の分解；ペニリシンの変性による各種のそ
の基質の生成；各種プロテアーゼの利用によるチーズの
製造、食肉の軟化、洗剤調合、皮革の製造および消化剤
としての用途；カルボヒドラーゼの利用によるでんぷん
の加水分解、シヨ糖転化、グルコース異性化など；ヌク
レアーゼの利用による香味の調節；或いはオキシダーゼ
の利用による食品の酸化防止お主び着色抑制がある。

文献には上記およびその他の多くの利用法が詳細に記載
されている。

前述したように、酵素は普通には水溶性であり、しかも
一般に不安定で簡単に不活性化するので、酵素をその後
の再利用のために使用溶液から取り出すこと、或いは酵
素の触媒括性を比較的長期間持続することはいずれも困
難である。

この難点により、酵素を頻繁に取り替えることが必要と
なり（この交替は通常は１回の使用ごとに必要）、当然
の結果として工業用途における酵素の使用のコスト上昇
をもたらす。

取り換えによる高コストを阻止するために、酵素を使用
前に固定化すなわち不溶化することが提案された。

後で詳述する各種の方式により酵素を固定化することに
よって、酵素を適切に安定化させることができ、これ以
外の方法では不活性化を受けるか、反応媒質中で消失す
る酵素の再利用が可能となる。

このような固定化または不溶化酵素は、使用する基質の
性質に応じて、充填塔、撹拌槽形反応器などの各種の反
応器系で使用されうる。

一般に、酵素の固定化は、耐環境および構造安定度をよ
り有利かつ広範囲にし、排水の問題および取り扱う材料
の種類を少なくし、酵素自体の活性を良質化する可能性
をもたらす。

前述したように、酵素の固定化の実施に対してはいくつ
かの一般的方法と多数のその改良法がこれまでに記載さ
れている。

一般的方法の１つは、酵素を固体表面上に吸着させるこ
とである。

たとえば、アミノ酸アシラーゼのような酵素のＤＥＡＥ
一セルロースのようなセルロース誘導体ヘの吸着、パパ
インもしくはリボヌクレアーゼの多孔性ガラスの吸着、
カタラーゼの木炭への吸着、トリプシンの石英ガラスも
しくはセルロースへの吸着、キモトリプシンのカオリナ
イトへの吸着などの例がある。

別の一般的方法は酵素のゲル格子内への封鎖であり、た
とえば、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、パパイ
ンなどのポリアクリルアミドゲル中への封鎖、アセチル
コリンエステラーゼのでんぷんゲルもしくはシリコーン
ポリマー中への封鎖，グルタミン酸−ピルビン酸トラン
スアミナーゼのポリアミドもしくは酢酸セルロースゲル
中への封鎖などの例がある。

さらに別の一般的方法は、２官能性試薬による架橋であ
り、この方法は上記の一般的固定化法のいずれかと併用
されることもある。

この方法を利用する場合、分子間架橋を生ずる２官能性
または多官能性試薬は、酵素間を相互に、並びに酵素を
固体支持体に共有結合させる。

この方法の例は、グルタルアルデヒドまたはビスジアゾ
ベンジジン−２，２′−ジスルホン酸を利用したパパイ
ンのような酷素の固体担体への結合などである。

さらに別の酵素固定化法は、有機または無機多孔性固体
支持体に各種の方法で付着されている重合体物質に、グ
ルコアミラーゼ、トリプシン、パパイン、プロナーゼ、
アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペプシン、レン
ニン、カビプロテアーゼ、ラクターゼなどの酵素を共有
結合により固定化する共有結合法である。

この方法も、上記の固定化法と併用されることがある。

上述した酵素固定化法はいずれも何らかの欠点を有して
おり、それによりその工業的プロセスにおける利用が阻
害される。

たとえば、酵素を支持体表面に直接吸着させた場合、従
来技術では支持体の孔径と酵素のスピン直径の関係が適
当であればこの種の比較的安全な複合体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）が得られることが指摘されてはいるが、酵素と
支持担体との間に生ずる結合力は極めて弱いことが多い
。

しかも、この場合に支持体の孔径は約１，０００Åをこ
えることができないと明記されている。

この弱い結合から考えて、酵素は処理される基質の溶液
の存在下で簡単に脱着されてしまうことが多い。

その上、酵素はその可動性の欠如または支持体と酵素の
活性サイトとの相互作用により部分的にまたは強度に不
活性化されることもありうる。

採用されうる別の方法は、酵素のゲル格子内への封鎖で
あり、これはゲルとなるポリマーのモノマー形態と酵素
とを含有する水溶液または乳濁液を重合させるか、或い
は酵素を各種の方法で予じめ形成したポリマー中に混入
することにより行なわれ、しばしば架橋剤を存在させる
。

この酵素固定化法は、封鎖の実施に利用される反応条件
が通常は温和であるので、酵素の変質または不活性化が
ほとんど起らないことが多いという利点を有するが、得
られた複合体の機械的強度が不十分で、連続流れ方式の
カラム内で使用すると圧縮が起きて、それに伴ないカラ
ムの閉塞を生ずるという点で不利である。

この方式はまた孔径に変動幅がかなり大きいので、酵素
の損失を生ずるほどに大きな孔径がいくらかできる。

また、他のいくらかの孔径は逆に小さすぎて、基質と生
成物の移動に対する大きな拡散障壁となり、反応の遅れ
をもたらす原因となることがある。

これは高分子量の基質を使用する場合に特に顕著である
。

上述した分子間架橋による酵素固定法に存在する欠点は
、酵素が高い活性の発現に必要な自然の配置を取ること
が不可能である（特に活性サイトがその結合過程に関連
している場合に）ために、可動性が欠如し、不活性化を
生ずることである。

共有結合法は広く応用されており、単独の固定化法とし
て、或いは上述の架橋反応を利用する多くの方法の一部
分として利用されている。

この方法を利用して、酵素ならびに支持体を２官能性中
間分子により結合させることがしばしば行なわれこの場
合、たとえばγ−アミノプロピルトリエトキシシランの
ような中間分子の官能基は酵素と有機もしくは無機多孔
性支持体のいずれに存在する官能部位とも反応すること
ができる。

多様な試薬および支持体がこれまでにこの方法で使用さ
れてきたが、この方法の利点としては、複合体生成物全
体を通じて強力な共有結合が形成され、多くの場合に高
い活性が得られることがある。

酵素の担体への共有結合は、酵素の官能基のうちでその
触媒活性に必須ではない官能基、たとえば遊離アミン基
、カルボキシル基、ヒドロキシル基、フェノール基、ス
ルホヒドリル基などにより達成されねばならない。

このような官能基は多様な他の官能基、たとえばアルデ
ヒド、インシアネート、アシル、ジアゾ、アジド、アン
ヒドロ活性化エステルなどと反応して共有結合を形成す
る。

やはりこの方法も、試薬および溶媒が高価である、多孔
性支持体が限定され、高価である、面倒な多段工程で行
なわれるなどの多くの欠点を有することが多くそのため
にこの方法も工業的方法としては経済的とは言えない。

このように、各種の酵素固定化法が従来法として既に多
数提案されているが、これらはいろいろな理由から経済
的な工業的方法としての要件を満たしていない。

しかも、以下により詳細に説明するように、本発明の組
成物は従来の組成物のいずれにも包含されるものではな
い。

本発明の組成物は、天然または合成の多官能性ポリマー
、低分子量ポリマー、ポリマー加水分解物または予備形
成ポリマーから２官能性モノマーとの反応によりその場
で生成させたコポリマーを含有する無機多孔性支持体か
ら構成される。

生成したコポリマーは支持体の細孔の内部に実質的に閉
じこめられ、このコポリマーはこれから突き出た末端に
官能部分を有する側基（ ｐｅｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ
）を含有し、酵素はこの側基の末端反応性部分の活性
部位に共有結合するので、運動の自由があり、酵素はそ
の最犬の活性を発揮することができる。

酵素の一定しない部分がマトリックスに吸着されるが、
これは多孔性の無機支持体を利用するほとんどすべての
固定化法に避けられない結果であって、本発明の難点と
考えるべきものではない。

さらに、支持体の細孔内にその場で形成される無機支持
体と有機コポリマーとの間の結合は、共有結合ではなく
、むしろ本質的に物理化学的かつ機械的な結合であり、
こうして生成した無機一有機マトリックスは高い安定性
と耐破壊性を示す。

従来技術の１例、米国特許３．５’ ５ ６，９ ４
５は、酵素をガラスのような無機担体に直接吸着させた
酵素複合体に関する。

米国特許３，５ １ ９，５ ３ ８は、中間のシラン
カツプリング剤により酵素を無機担体に化学的にカップ
リングさせた酵素複合体に関する。

同様に、米国特許３，７ ８ ３，１ ０ １も結合剤
として有機シラン複合体を利用し、酵素は中間のシラン
カツプリング剤によりガラス担体に共有結合され、カッ
プリングのケイ素部分は担体に結合され、カップリング
剤の有機部分は酵素に結合され、この組成物は担体とカ
ップリング剤のケイ素部分の間に配置された担体表面上
の金属酸化物を含有する。

米国特許３８２１０８３では、無機担体上にポリアクロ
レインのような水不溶性ポリマーを析出させ、酵素をこ
のポリマーのアルデヒド基に共有結合させる。

しかし、この特許に記載の実施例の大部分によると、ポ
リマー上への酵素の付着の前に複合体をまず加水分解す
る必要がある。

さらに、この特許の方法で得た生成物には多数の難点が
ある。

すなわち、まず所望のポリマーを有機媒質中で析出させ
るか、最初に生成させておき、無機担体に付着させた後
、有機媒質を除去するために蒸留を初めとする清浄化操
作を実施することが必要である。

さらに、この特許に記載の別の方法では、アルデヒド基
はポリマーに最初はアセタール構造で存在し、これから
アルデヒド基を遊離させるために別の加水分解反応が必
要である。

このアルデヒド部位はポリマーの主鎖に直接結合してお
り、酵素は反応相手のアルデヒド基の炭素原子１個でポ
リマーの表面から隔離されているだけなので、酵素はポ
リマーの表面のすぐ近くに保持され、したがって酵素は
明らかにポリマーの物理化学的影響を受け、運動がかな
り制限されるので、その最適の配置を取ることが阻害さ
れる。

別の従来技術である米国特許３，７ ０ ５，０ ８
４は、酵素を粗孔性（ ｍａｃｒｏ−ｐｏｒｏｕｓ ）
反応体コアの重合体表面に吸着させた後、所定位置に架
橋した粗孔性酵素反応体を開示している。

酵素を重合体表面上で吸着後に架橋させることにより、
酵素は部分的にさらに運動不能にされ、触媒としてその
本来の状態で作用することができなくなる。

酵素の架橋は実際に酵素とおしを結合するので、酵素の
自由な運動を妨げ、活性を最大にするための必要条件で
ある酵素の可動性を低下させる。

米国特許３，６ ５ ４，０ ８ ３は、有機水溶性支
持体に酵素を架橋させて製造した水溶性酵素複合体を開
示しているが、その用途はクリーニング組成物と薬用軟
コウのみに限定されている。

この組成物も、酵素と支持体の近接および相互結合とい
う欠点があり、さらに有機ポリマー支持体を主剤とする
酵素複合体が一般に示す機械的強度が不十分という難点
も有する。

米国特許３，７ ９ ６，６ ３ ４も、本発明の固定
化酵素複合体とはかなり異なる固定化された生物学的に
活性な酵素を開示している。

この特許の酵素複合体は、粒度が５０〜２０，０００Ａ
のコロイド状粒子の形態の無機支持体とポリエチレンイ
ミンからなり、ポリエチレンイミンはグルタルアルデヒ
ドで架橋させて、生成した架橋ポリマーをコロイド粒子
の表面に単分子層として付着させた後、この単分子層に
酵素を直接吸着させる。

その後、コロイド粒子の表面に単分子層として吸着され
た酵素を追加のグルタルアルデヒドにより他の吸着され
た酵素分子と架橋させて、酵素が使用中に簡単に脱着す
るのを防止する。

本発明では存在するような酵素とポリマーマトリックス
との共有結合についての指摘はまったくない。

酵素分子が支持体の表面上で相互に架橋されているので
、この架橋反応と表面の電子および立体作用との両方の
原因から、得られた複合体は不活性化を受け、酵素の可
動性も制限される。

この特許の生成物は本質的にコロイド状であるので、工
業的操業へのスケールアップに対しては非常に限られた
有用性しか有していない。

すなわち、この生成物を充填塔のような連続流れの系に
使用するのは、これが流れている液体流に同拌されて系
外に流出するために、或いは流出防止膜を使用したとし
ても、粒子がじきにこのバリアーにぶつかって詰め込み
状態になり、不透過層が形成されてしまうために、不可
能である。

また、このようなコロイド状の生成物は流動床装置でも
容易には利用できないので、その主要な用途は撹拌槽形
反応器のような回分式反応器に限られ、１回の使用ごと
に遠心分離により分離しなければならない。

これとは対照的に、本発明の固定化酵素複合体は、多様
な回分式または連続式反応器で使用することができ、そ
の利用方式に関してずつと適応性の幅が広い。

また別の従来技術である米国特許第３，９５９，０８０
は、生物学的に有効な物質を固定化するための担体マト
リックスに関する。

しかし、この特許により製造されるマトリックスは、架
橋可能な酸ヒドラジドまたは酸アジド基を含有する有機
ボリマーとグルタルアルデヒドのような２官能性架橋剤
との反応により得られる生成物からなる。

このマトリックスは、有機酵素支持体に特有の比較的貧
弱な機械的安定性およびその他の欠点のほかに、この重
合体ヒドラジドなどの調製に利用される有機反応がかな
り複雑であるという難点もある。

以下により詳細に示すように、本発明の有機一無機マト
リックスは、酵素を共有結合により固定化して、比較的
長期間の使用中にその活性と安定性を保持し続ける触媒
複合体を形成する支持体となる。

本発明は、酵素固定化用の支持体マトリックスとなる組
成物に関する。

より具体的には、本発明は、無機支持体物質を、この支
持体の細孔の内部に実質的に閉じこめられるその場で調
製された有機コポリマーと組み合わせた有機−無機複合
体からなる支持体マトリックスに関する。

コポリマーの生成は、アミノボリスチレンと適当な反応
性部位を有する２官能性モノマーとの反応により行なわ
れる。

２官能性モノマーの使用量は、末端反応性部分で酵素を
共有結合させることのできる末端官能化された側基を有
するコポリマー生成物を生ずるように過剰にする。

また、本発明はこのようなマトリックスの製法にも関す
る。

前述のように、分析、医学または産業用途における酵素
の利用は、この酵素が固定化状態にある、すなわち、他
の固体材料と組み合わせることにより、酵素自体を水溶
性ではないようにし、それにより酵素の触媒活性を維持
しながら酵素をくり返し使用できるような状態にあると
、大いに高まりうる。

固定化状態にするためには、酵素を何らかの方法で水不
溶性担体にしばりつけ、水不溶性状態で工業的に使用で
きるようにすることが必要である。

よって、本発明の目的は、酵素が固定化状態で共有結合
されうる新規組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、反応性末端部分で官能化された側
基に酵素を共有結合させるのに利用される組み合わされ
た無機−有機支持体マトリックスの製法を提供すること
である。

本発明の１態様は、多孔性で水不溶性の無機固体支持体
に、アミノポリスチレンと２官能性モノマーとの反応か
ら得られたコポリマー物質を組み合わせてなる有機−無
機マトリックスにある。

本発明の別の態様は、固体支持体上にｐＨが７未満の水
溶液からアミノポリスチレンの塩を付着させた後、得ら
れたアミンポリスチレンー固体支持体複合体を２官能性
モノマーと反応させて、目的とする有機−無機マトリッ
クスを生成させることによる有機−無機マトリックスの
製法にある。

本発明の１具体例は、γ−アルミナにアミノポリスチレ
ンと過剰のグルタルアルデヒドとの反応から得られたコ
ポリマーを組み合わせてなる有機−無機マトリックスに
ある。

本発明の別の具体例は、γ−アルミナ上にアミノポリス
チレンの塩酸塩をｐＨが約１〜４の範囲内の水溶液から
付着させ、その後、得られたアミンポリスチレンーγ−
アルミナ複合体を過剰のグルタルアルデヒドと反応させ
、得られた有機−無機マトリックスを回収することから
なる有機−無機マトリックスの製法にある。

本発明のさらに別の具体例は、多孔性で水不溶性の固体
無機支持体をスチレンモノマーで処理し、このスチレン
ー固体支持体複合体を重合条件下で重合させ、得られた
ポリスチレンー固体支持体複合体をニトロ化し、ニトロ
化ポリスチレンー固体支持体複合体を還元し、その後得
られたアミノポリスチレンー固体支持体複合体を２官能
性モノマーと反応させて目的とする有機−無機マトリッ
クスを生成させることからなる有機−無機マトリックス
の製法にある。

その他の目的および態様は、以下の本発明のより詳細な
説明から判明しよう。

上述したように、本発明は酵素の固定化に使用される支
持体マトリックスに関し、このマトリックスは以下に詳
述する種類の無機支持体材料に、有機コポリマー物質を
組み合わせてなる有機−無機複合体からなり、コポリマ
ーは支持体が多孔性の場合には多孔性支持体の細孔内に
実質的に閉じ込められる。

コポリマー複合体は、これから突き出た側基を含有し、
この側基は末端に位置する官能性部位を有し、この官能
性部位により側基の末端反応性部分に酵素を共有結合さ
せることが可能となる。

さらに、本発明は、該組成物の製造操作に比較的安価な
反応材料を使用すると共に、より単純な工程を利用して
、上記の支持体マトリックスを製造する方法にも関する
。

本発明の支持体マトリックスに酵素を共有結合させて得
た酵素複合体の機械的強度と安定性は、従来の固定化酵
素が有するものより大きい。

したがって、本発明の組成物が工業的応用にとって有用
な経済的な利点を有することは自明である。

本発明の支持体マトリックスの１構成要素として利用し
うる無機支持体の例は多様な材料を包含するが、たとえ
ば孔径が１００〜５５，０００Åの範囲内で、見かけカ
サ密度（ＡＢＤ）が０６１〜０．６の範囲内の多孔性支
持体（例、アルミナ）がある。

この種の無機多孔性支持体の表面積もかなり広範囲にわ
たるが、一般に１〜５ ０ ０ｍ”／ｇの範囲内であり
、表面積の好適範囲は５〜４００ｍ／ｇである。

多孔性無機支持体材料の外形も、使用する支持体の種類
に応じて変動する。

たとえば、支持体材料は球形、微粒子から粗大球状物ま
での粒子状形態、多孔性無機酸化物で被覆されてもよい
セラミック・モノリス、膜、セラミック繊維（そのまま
、もしくは布はくに織ったもの）、シリカ、金属酸化物
の混合物、砂粒子、ゼオライトまたはマイ力などでよい
。

粒度も、やはり使用する支持体の種類ならびに基質の種
類および酵素複合体を使用する装置の形式に応じて広範
囲に変動しうる。

たとえば、支持体が球形粒子の場合には、球の粒径は０
．２５〜６．３５ｍｍの範囲内でよく、好適粒径は０．
７９〜３．１７ｍｍの範囲内である。

支持体が粒子状形態の場合も粒度は同程度の範囲内であ
ろう。

１米国規格のメッシュ寸法でいうと、このような粒子は
２．５〜１００メッシュの範囲内でよく、１０〜４０メ
ッシュの粒度が好ましい。

また、支持体がセラミック繊維の形状である場合には、
繊維は直径０．５〜２０μの範囲内でよく、膜状のもの
で．は膜は薄いシート状にキャストされたセラミック材
料からなるものでよい。

上述した支持体の外形と各種支持体の寸法は単に例示に
すぎず、本発明を必然的にこれに限定する意図はないこ
とは理解されよう。

多孔性支持体材料は、前述した種類の各種酸化物で被覆
されてもよいし、或いはその混合物からなるものでもよ
く、またリン酸ホウ素のような各種の他の無機物質（こ
れらは支持体材料に特殊な性質を付与する）を混入させ
てもよい。

特に有用な支持体の形態は、本発明の材料に対してここ
に記載した種類の多孔性を有するセラミック体からなる
ものであり、これは全体に接続マクロサイズ・チャンネ
ルを有するハネカム構造にしたものでもよく、このよう
な材料は一般にはモノリス（ ｍｏ−ｎｏｌｉｔｈ）と
して知られている。

これは各種の多孔性アルミナ、ジルコニアまたは酸化チ
タンで被覆してもよい。

この種の支持体の使用は、工業的な酵素作用反応でよく
見られる非常に粘稠な基質の自由な流れを可能にする点
で特に有利である。

支持体マトリックスの有機部分の１要素アミノポリスチ
レンであり、有機部分の他方の要素は２官能性モノマー
である。

２官能性モノマー反応物質は、末端官能化側基を生ずる
ように必要に応じて十分過剰に存在させる。

この２官能性モノマーは、支持体複合体の反応性部位に
対して２〜５０モルの範囲内で存在させ、好適範囲は４
〜２５モル過剰である。

２官能性モノマーに存在する官能基は、カルボニル、ア
シルまたはイソシアナト部位のように、アミン基と容易
に結合できる周知の反応性部位である。

２官能性化合物の２個の反応基は、４〜１０個の炭素原
子を含有する炭素鎖で離されているのが好ましいが、必
ずしもこれは必要ではない。

２官能性化合物の反応性部位は、したがって支持体マト
リックスのアミノポリスチレン成分と共有結合すること
ができると共に、未反応物質を洗浄除去した後に、その
後の工程で加えられる酵素のアミン基とも共有結合する
ことができ、こうすると酵素は側基の末端部分の反応性
官能基に共有結合されることになる。

この組成物に酵素を添加すると、高度の活性と安定性を
有する相当に安定な酵素複合体が生成する。

未反応の酵素は再使用のために回収してもよい。

中間に介在する、すなわちスペーサーとなる２官能性モ
ノマー分子の使用量が大過剰であるので、マトリックス
はこのスペーサー分子からなる側基を含有し、この分子
はマトリックスから伸びて、その末端部分に利用可能な
反応性部位を有し、この反応性部位は酵素と反応して、
共有結合により酵素を上記のスペーサー分子に結合させ
ることができる。

したがって、十分に大過剰の２官能性分子を使用して、
その後で固定化される酵素と反応することのできる反応
性側基を形成するようにすることを条件として、酵素の
結合に利用できる適当な有機−無機マトリツクスが生成
することは明らかである。

酵素に対する結合サイトとしてこのような官能性側基を
利用することにより、酵素により大きな可動性を持たせ
ることができ、ゲル格子内への封鎖、固体表面上での吸
着または２官能性試薬による隣接した酵素分子間の架橋
などの他の方法で酵素を固定化した場合に比べて、比較
的長期間にわたって酵素の触媒活性を高水準に保持し続
けることができる。

しかし、必ずしもすべての組成物で安定度または活性に
関して同等の結果を生ずるわけではない。

多孔性支持体材料の細孔内に実質的に入り込んだポリマ
ー物質に結合している側基のアルデヒド、イソシアネー
ト、アシルまたはエステル部位と反応することのできる
アミン基を含有し、共有結合反応により固定することの
できる酵素の列には、トリプシン、パパイン、ヘキソキ
ナーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）、フイシ
ン、ブロメライン、ラクテート、デヒドロゲナーゼ、グ
ルコアミラーゼ、キモトリプシン、プロナーゼ（ ｐｒ
−ｏｎａｓｅ ）グルコース・インメラーゼ、アシラー
ゼ、インベルターゼ、アミラーゼ、グルコース・オキシ
ダーゼ、ペプシン、レンニン、プロテアーゼ、キシラナ
ーゼおよびセルラーゼがある。

一般に活性サイトが共有結合の形態に関係のないすべて
の酵素を使用できるが、必ずしも同等の結果を生ずるわ
けではない。

上記の説明は、官能性部位としてアルデヒドまたはイソ
シアネート基を含有する側基に重点を置いたが、側基が
酵素に通常存在しているカルボキシル、スルホヒドリル
その他の部位と反応可能な他の官能性部位を含有するこ
とも本発明の範囲内に包含される。

ただし、このような他の部位を含有する酵素と他の側基
との共有結合の形成を利用した場合には必ずしも同等の
結果が得られず、また中間体の製造コストもかなり高く
なることがある。

上に列挙した多孔性固体支持体モノマー、加水分解物、
ポリマーおよび酵素の例は、使用できる各種材料の例示
にすぎず、本発明は必ずしもこれに限定されないことは
理解されよう。

本発明の組成物の製造はバッチ式操業で行なうのが好ま
しい。

好適な製法においては、無機支持体材料をアミノポリス
チレンの塩の溶液、好ましくは本質的に水容液で処理す
る。

この水溶液は７未満のｐＨ，好適にはｐＨ１〜４の範囲
内に保持される。

使用できるアミノポリスチレンの塩の例には、アミノポ
リスチレンの塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩およびリン酸塩が
ある。

水容液のｐＨは上記のような酸の添加により所望の水準
に保持される。

アミノポリスチレンの酸付加塩の添加は本発明の好適態
様では室温および大気圧下で行なわれ、この添加終了後
、混合物を真空下に０．５ないし４時間またはそれ以上
の時間保持するのが好ましい。

この反応時間がすぎた後、吸着されなかった溶液を除去
し、処理した支持体を風乾させる。

得られた無機一有機複合体をその後、最初のアミノポリ
スチレンのアミン含有量に対してモル比で２〜５０倍と
いう十分に大過剰の２官能性モノマーと接触させて、得
られたコポリマーから伸びている、未反応の末端官能性
部位を含有する側基を形成する。

２官能性モノマーも水溶液状態で添加するのが好ましく
、この水溶液はアミノポリスチレンとの反応後に除去さ
れ、得られたマトリックスを洗浄して、まだ存在してい
る未反応の２官能性モノマーを分離する。

この処理は４〜６０℃の温度範囲で実施できるが、２０
〜２５℃が好ましい。

別の好適な製法においては、水溶液中でスチレンにリン
酸水素ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムのよう
な添加剤を混合してなるエマルジョン系を調製する。

この溶液にペレット、ビーズまたはモノリスのような先
に詳述した形態の固体支持体を投入し、エマルジョン溶
液の吸着を０．５〜２時間の範囲内というような時間に
わたって進行させる。

この吸着は減圧下、通常は真空中で行なうのが好ましい
。

この吸着時間の経過後、この混合物を過硫酸カリウムの
ような重合触媒を存在させて５０〜１００℃の範囲内の
温度に或る時間加熱する。

２〜４時間というような時間にわたってスチレンの重合
を進行させた後、加熱を止め、重合したスチレンを含有
する固体複合支持体を水溶液から回収し、蒸留水ならび
にアセトンもしくはベンゼンのような溶剤で洗浄して未
反応のスチレンを除去する。

別法として、スチレンの重合を乳化重合の方式によらず
に実施することもできる。

この調製法を実施する場合には、支持体を液体スチレン
モノマーのみに投入し、スチレンを好ましくは真空下で
所定時間のあいだ吸着させる。

この吸着時間の経過後、水と過硫酸カリウムのような触
媒を添加し、混合物を上記温度範囲に加熱して、重合を
所定時間のあいだ進行させる。

この重合時間の経過後、ポリスチレンー固体支持体複合
体を上記と同様の方法により回収する。

次にポリスチレンー固体支持体複合体のニトロ化を、硝
酸、好ましくは９０％発煙硝酸のようなニトロ化剤にこ
の複合体を加えることにより行なう。

添加は、水浴または冷却コイルのような外部冷却手段に
よって硝酸を好ましくは０〜１０℃の範囲内の室温下温
度に保持しながら、比較的遅い速度で行なう。

しかし、このような低温度はニトロ化反応の遂行に必須
ではなく、所望ならばより高い温度も使用できる。

ポリスチレンー固体支持体複合体のニトロ化は１〜４時
間伐いはそれ以上の時間にわたって進行させ、その後二
トロ化ポリスチレンー固体支持体複合体を回収し、やは
り水と溶剤で洗浄する。

その後、亜ニチオン酸ナトリウムのような還元剤を含有
する水溶液に、得られたニトヨポリスチレンー固体支持
体複合体を添加し、その後この溶液を５０〜１００℃の
範囲内の温度に加熱し、この温度に０．５〜２時間とい
うような時間にわたって保持する。

この時間の経過後、アミノポリスチレンー支持体マトリ
ックスを回収し、洗浄し、真空乾燥した後、好ましくは
窒素雰囲気に保持する。

酵素を固定することのできる側基を含有する目的の支持
体マトリックスを製造するには、アミノポリスチレンー
固体支持体マトリックスを十分に大過剰の２官能性モノ
マーと接触させる。

このモノマーはこれと反応するアミノポリスチレンのア
ミン基に対して２〜５０倍のモル量で使用され、未反応
の末端官能性部位を含有する得られたコポリマーから突
き出て伸びている側基を形成する。

この２官能性モノマーは好ましくは水溶液状で添加され
、それにより生成したコポリマーは無機支持体の細孔内
に実質的に閉じこめられる。

支持体マトリックスをその後蒸留水で洗浄して、未反応
の２官能性モノマーを除去する。

上述したように、好ましい製法における過剰の２官能性
モノマーの使用は、未反応の末端官能性部位を含有して
いる、マトリックスから突き出た側基を生ずる。

この未反応の官能性部位がその後で酵素への共有結合の
形成に利用される。

酵素もやはり水溶液状でマトリックスに添加されるのが
普通である。

洗浄などの常法により未反応物質を除去した後、官能化
された側基に共有結合された酵素は、その末端部分に結
合したまま保持される。

したがって、この固定化の全処理工程を簡単かつ安価に
、たとえば水性媒質または安価な溶剤媒質を使用して、
無機支持体を充填したカラム内において実施できること
は明らかである。

処理工程は最小限の工程数の利用で行なわれ、また過剰
の反応物質、結合しなかった酵素および最終の組成物を
簡単に回収することができ、過剰の反応物質と未結合の
酵素は再使用のために利用できる。

最終的な組成物の生成を連続式操業で実施するのも本発
明の範囲内に包含される。

採用できる１方法は、通常はカラムである適当な装置内
に、ある量の固体支持体を投入することから始められる
。

バッチ式操業の場合と同様に固体支持体材料は粉末、ペ
レットまたはモノリスのような任意の所望形態のもので
よく、カラムに投入された後、好ましくはアミノポリス
チレンの塩の水溶液も装入され、支持体がこの溶液で飽
和されるまで支持体と接触させる。

水溶液は適当な酸の添加により７未満、好ましくは１〜
４のｐＨに保たれる。

支持体の飽和が達成された後、過剰分を排出させ、反応
性のある２官能性モノマー分子のような中間スペーサー
化合物を好ましくは水溶液状でカラムに装入する。

この２官能性分子はアミノポリスチレンのアミン含有量
に対して２〜５０モルの範囲内で過剰に存在させる。

マトリックスの生成は１〜２２時間の範囲内の時間内に
行なわれるが、通常はこの生成は比較的短時間で達成さ
れる。

所望の滞留時間の経過後、グルタルアルデヒドのような
スペーサー反応物質の過剰分を排液により除去し、その
後十分に水洗して未反応の物質を除去する。

固定化酵素複合体を形成するには、上記に詳述したよう
な種類の酵素の水溶液を、上記のようにして生成させた
支持体マトリックスが入っているカラムに通すことによ
り、マトリックスから突出している官能化側基部位の末
端反応基に酵素を共有結合させる。

これは側基含有分子への酵素の共有結合がそれ以上起ら
なくなるまで行なわれる。

過剰の酵素は排液後に連続的に抜き取られる流出液中に
回収され、再利用のためにカラムに再循環させてもよい
。

カラムを洗浄すれば、このカラムは該酵素の触媒作用が
関与する化学反応に対してすぐに使用することができる
。

以上の処理工程は、バッチ式処理工程において上述した
時間、温度および濃度パラメータの範囲内で行なわれ、
同等の固定化酵素複合体を生じよう。

反応，パラメーターを適宜変更すると、上記の方法は多
様な支持体、２官能性モノマーおよび酵素に適用しうろ
ことは当業者には明らかであり、これらも本発明の範囲
内に包含される。

以下の実施例は本発明の新規組成物とその製法を例示す
るものである。

これらの実施例は単に例示を目的としたものであり、本
発明はこれらに制限されるものではないことは理解され
よう。

実施例 １ 本実施例においては、粒度が２５〜４０メッシュ、見か
けカサ密度（ＡＢＤ）が０．３４、細孔寸法が２００〜
１０，０００Åの範囲内の多孔性アルミナ基材１ｇを、
０．１Ｍ塩酸水溶液に理解したアミノポリスチレンの５
ｗ ／ ｖ ％溶液１０ｍｌと混和した。

アミノポリスチレンの分子量は２２，０００であった。

この２成分を室温で混合した後、１時間放置した。

その後、この溶液を脱泡し、沢過し、分離されたアミノ
ポリスチレンを吸着している固体支持体を乾燥した。

得られた複合体を次にｐＨが１．４のグルタルアルデヒ
ドの１． ５ ％水溶液１０ｍｌと混合し、室温に１時
間保持した。

１時間経過後、過剰のグルタルアルデヒドをデカンテー
ションにより除去し、残った有機一無機マトリックスを
数回よく水洗した。

その後、このマトリックスを商品名” Ａｍｂａｚｙｍ
ｅ ”として市販されているグルコアミラーゼ６４８２
単位で処理して、最終的な固定化酵素複合体を調製した
。

酵素の固定化は、複合体の温度を水浴により４℃に保持
しながら１６時間かけて行なった。

その後、残留する未結合酵素を水と食塩水で洗い落とし
た。

得られた固定化酵素複合体をカラムに充填し、商品名″
Ｍａｌｔｒｉｎ−１ ５ ０”として市販のでんぷんの
３ ０ ｗ ／ ｖ ％溶液を２ ｍｌ／分の流速でビ
ーズ上に流した。

このでんぷん溶液の送給は温度を６０℃に保持しながら
２時間続けた。

２時間経過後、グルコースの生成量を分析した。

この酵素複合体の活性は２ｍｌｌ分の流速で３２４０単
位／グラムであることが判明した。

ここで、活性の単位は、固定化酵素複合体１ｇ当り１分
間で生成するグルコースの量（μｍｏｌ）と定義される
。

実施例 ２ 実施例１の実験をくり返したが、ただし酵素、すなわち
グルコアミラーゼを、当該技術分野で周知のイソプロパ
ノール沈殿去により精製して、酵素純度を１，３倍高め
た。

この精製酵素を実施例１と同様の方法で固定化し、でん
ぷんからグルコースへの転化に利用すると、得られた固
定化酵素複合体は２ ｍｌ／分の流速で４０７０単位／
グラムの活性を有することが判明した。

実施例 ３ 実施例１に記載の方法と同様の方法で、粒度が２５〜３
５メッシュ、ＡＢＤが９．３のアルミナ基材１ｇを、０
．１Ｍ塩酸水溶液に溶解したアミノポリスチレンの５ｖ
ｏｌ％溶液１０ｍｌに加えた。

この混合物を室温に１時間保持した後、脱泡し、炉過し
、得られたアミノポリスチレンーアルミナマトリックス
を乾燥した。

この乾燥ビーズを次にｐＨが１．４の１． ５ ％グル
タルアルデヒド水溶液１０ｍｌに加え、この混合物を室
温に１時間保持した後、過剰のグルタルアルデヒドをデ
カンテーションにより除去した。

残留する有機一無機マトリックスを数回水洗した後、比
活性が８．５Ｕ／ｍｇタンパク質のグルコースイソメラ
ーゼ１３００単位で処理した。

このカップリングは４℃の温度で２２時間行なった。

過剰のグルタルアルデヒドの使用により生じたコポリマ
ー物質の遊離アルデヒド官能基に酵素が共有結合してい
る、得られた固定化グルコースイソメラーゼ複合体を、
水と２Ｍ塩化ナトリウム水溶液で十分に洗浄して、未反
応の酵素を除去した。

この固定化酵素複合体を適当なカラムに充填し、この複
合体カラムに６０℃の温度でフルクトースの４５％溶液
（ｐＨ８，５Ｘ１０ Ｍ塩化マグネシウムを含有）を
２時間流した。

グルコース生成量と流速を測定すると、この固定化酵素
複合体は２ ｍｌ／分の流速で７００Ｕ／ｇの活性を有
する（カップリング効率６０％）ことが判明した。

また、この酵素複合体の半減期は、複合体に２ｍｌ／分
の流速で供給流を流す連続カラム操作において６０℃で
２２日であることが測定された。

実施例 ４ 本実施例では、粒度が６０〜８０メッシュ、ＡＢＤが０
．３のアルミナ基材を、上記と同様の方法によりアミノ
ポリスチレンおよび過剰のグルタルアルデヒドで処理し
て、有機−無機支持体マトリックスを形成した。

この支持体マトリックスを比活例が１５Ｕ／ｍｇのグル
コースイソメラーゼで処理した。

カップリングは、支持体マトリックスに４℃の温度で２
８００単位の酵素を接触させて２２時間続けた。

得られた固定化酵素複合体を十分に洗浄した後、これを
カラムに充填し、実施例３に記載したのと同様なフルク
トース供給流を６０℃の温度で２時間複合体カラムに流
した。

生成物を分析すると、この固定化酵素複合体は１２００
Ｕ／ｇの活性を有する（カップリング効率５４％）こと
が判明した。

実施例 ５ リン酸水素ナトリウム０．５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウ
ム０．５ｇ、スチレン２ｍｌおよび蒸留水２０ｍｌから
調製したエマルジョンに、ＡＢＤが０．３ ４ ４で細
孔寸法が２００〜１０，０００人の１０メッシュ多孔性
アルミナペレット１ｇを加えた。

真空下でペレットへのエマルジョンの吸着を１時間行な
わせた後、過硫酸カリウム０．５ｇからなる重合触媒の
存在下に混合物を１００℃の温度に３時間加熱した。

３時間経過後、ビーズを濾別して液体分を除去し、蒸留
水と１００ｍｌのアセトンで洗浄した，その後このポリ
スチレンーアルミナ支持体１ｇを９０％発煙硝酸５０ｍ
ｌに徐々に添加した。

酸への支持体の添加は、装置を氷浴中に置くことにより
約Ｏ〜１０℃の温度に冷却しながら行なった。

２時間後、ニトロ化した支持体を取り出し、水とアセト
ンで洗浄した。

ニトロ化ポリスチレンーアルミナ支持体の環元を行なう
ために、この複合体１ｇを亜ニチオン酸ナトリウム１ｇ
と共に１００ｍｌの蒸留水に加えた。

この混合物を加熱沸騰させ、この温度に１時間保持した
。

その後、得られたアミノポリスチレンーアルミナ複合体
支持体を蒸留水で洗浄し、真空乾燥し、窒素雰囲気下に
保持した。

上記により調製されたアミノポリスチレンーアルミナ支
持体を、ｐＨが３．５の５０％グルタルアルデヒド水溶
液１０ｍｌと室温で１時間接触させた。

その後、過剰のグルタルアルデヒドをデカンテーション
により除去し、未反応の試薬を実質的に除去するために
得られた有機−無機マトリックスを水で数回よく洗浄し
た。

その後、Ｎｏｖｏ ＰＰＡＧ−１２という商標名で市販
のグルコースアミラーゼ８３００単位でマトリックスを
処理することにより、最終的な固定化酵素複合体を調製
した。

この酵素固定化は、マトリツクスの温度を氷浴で約４℃
に保持しながら１６時間かけて行なった。

その後、残留している未結合の酵素を水と食塩水で洗い
落とした。

得らハた固定化酵素複合体を次にカラムに充填し、この
ビーズに温度を６０℃に保持しながら、でんぷん（市販
品、商品名Ｍａｌｔｒｉｎ −１５０）の３ ０ ｗ
／ ｖ ％溶液を２ｍｌ／Ｚ分の流速で２時間流した。

２時間後、グルコースの生成量を分析した。固定化酵素
複合体１ｇ当り１分間で生成するグルコースの量（μｍ
ｏｌ）として定義された単位で、この酵素複合体の活性
は２ｍｌｌ分の流速では６９５単位／グラムであること
が判明した。

実施例 ６ 実施例５をくり返したが、ただし酵素は当業者には周知
のイソプロパノール沈殿法により精製した。

精製酵素を実施例５と同様に固定化し、でんぷんからグ
ルコースへの転化に利用すると、この固定化酵素複合体
の活性は２ ｍｌ／分の流速で８５２単位／グラムであ
ることが判明した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性多孔性無機固体支持体上にｐＨ７未満のア
   ミノポリスチレンの塩の水溶液からアミノポリスチレン
   の塩を付着させた後、得られたアミンポリスチレンー固
   体支持体複合体を大過剰の２官能性モノマーと反応させ
   て形成される有機一無機マトリックス。 ２ 該−ｐＨが１〜４の範囲内である特許請求の範囲第
   １項記載の有機一無機マトリツクス。 ３ アミノポリスチレンの塩が塩酸塩である特許請求の
   範囲第１項または第２項記載のマトリツクス。 ４ アミノポリスチレンの塩が硫酸塩である特許請求の
   範囲第１項または第２項記載のマトリツクス。 ５ 水不溶性多孔性無機固体支持体をスチレンモノマー
   で処理し、このスチレンー固体支持体複合体を重合条件
   下で重合させ、得られたポリスチレンー固体支持体複合
   体をニトロ化し、ニトロ化ポリスチレンー固体支持体複
   合体を還元した後、得られたアミノポリスチレンー固体
   支持体複合体を大過剰の２官能性モノマーと反応させて
   形成される有機一無機マトリックス。 ６ 該重合条件が５０〜１００゜Ｃの範囲の温度を包含
   する特許請求の範囲第５項記載のマトリックス。 ７ 該重合が重合触媒の存在下に行なわれる特許請求の
   範囲第５項または第６項記載のマトリツクス。 ８ 該重合触媒が過硫酸カリウムである特許請求の範囲
   第７項記載のマトリックス。 ９ 該ニトロ化が、ポリスチレンー固体支持体複合体を
   室温より低温度において硝酸で処理することにより行な
   われる特許請求の範囲第５項ないし第８項のいずれかに
   記載のマトリックス。 １０該温度がＯ〜１０℃の範囲内である特許請求の範囲
   第９項記載のマトリックス。 １１ 該ニトロ化ポリスチレンー固体支持体複合体の
   還元を高温度での亜ニチオン酸ナトリウムによる処理に
   より行なう特許請求の範囲第５項ないし第１０項のいず
   れかに記載のマトリックス。 １２−該高温度が５０〜１００℃の範囲内である特許請
   求の範囲第１１項記載のマトリックス。 １３該固体支持体が金属酸化物である特許請求の範囲第
   １項ないし第１２項のいずれかに記載のマトリックス。 １４該金属酸化物がアルミナである特許請求の範囲第１
   ３項記載のマトリックス。 １５該アルミナがγ−アルミナである特許請求の範囲第
   １４項記載のマトリックス。 １６該固体支持体が多孔性金属酸化物で被覆されたセラ
   ミック・モノリスである特許請求の範囲第１項ないし第
   １２項のいずれかに記載のマトリックス０ １７該固体支持体が多孔性シリカである特許請求の範囲
   第１項ないし第１２項のいずれかに記載のマトリックス
   。 １８ ２官能性モノマーがグルタルアルデヒドである特
   許請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれかに記載の
   マトリックス。