JPS5810077B2 - 固定化酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で工業的にも行
なわれているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解させ
て、溶液中で反応を行なわせている。

しかし、このような方法によれば、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また反応後に酵素
を回収したりすることが困難であり、一方、反応生成物
の分離精製も容易ではない。

このような問題を解決するために、既に、酵素を担体に
固定化した固定化酵素を用いて、基質と反応させること
が提案されており、担体結合法、物理的吸着法、包括法
等の酵素固定化法が知られている。

しかし、担体結合法は特殊な担体な必要とするうえに、
酵素をこの担体に固定化するために複雑な操作を要し、
一般に高活性の固定化酵素が得られない。

また、物理的吸着法は担体と酵素との結合が十分でない
ので、使用中に酵素が担体から脱離しやすく、酵素反応
を安定に行ない得ない。

これらの方法に比べて、包括法は、水溶性重合体に酵素
を添加した後、架橋剤や放射線処理によって上記重合体
をゲル化させ、酵素をゲルの格子内に固定させるもので
あり、一般に簡単且つ低床に製造できるため、特に工業
的には有用な方法であり、既に一部実用化もされている
が、水溶性重合体を架橋、ゲル化させる際に、酵素活性
の低下を免れないという欠点がある。

架橋密度を抑えれば、ある程度は酵素活性の低下を防ぐ
ことができるが、一方酵素の固定化格子の間隔が太き（
なるので、酵素の溶出が顕著となる。

これは、酵素反応を工業的に連続して安定に行なう際に
致命的である。

本発明は上記した種々の問題を解決するためになされた
ものであって、本来、水不溶性の重合体を用いて担体を
容易に製造できると共に、酵素が共有結合によって担体
に強固に結合され、しかも高い酵素活性を持続する固定
化酵素の製造方式を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素の製造方法は、酢酸ビニル単位
２０〜９７重量％よりなるエチレン−酢酸ビニル系共重
合体の酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化されて
いる重合体に、−分子中に少なくとも２個のアルデヒド
基を有するポリアルデヒドを反応させて担体とした後に
、この担体が有する遊離アルデヒド基に酵素を共有結合
させることを特徴とする特 本発明において用いる重合体はエチレン−酢酸ビニル系
共重合体ケン化物（以下、ＥＶＡ系共重合体という。

）は、エチレン単位３〜８０重量％好ましくは５〜６０
重量％と、酢酸ビニル単位２０〜９７重量％、好ましく
は４０〜９５重量％よりなるエチレン−酢酸ビニル系共
重合体の酢酸ビニル単位の８０モル％以上がケン化され
ているものである。

尚、本発明においては、エチレン単位の二部がアクリル
酸、無水マレイン酸等のエチレン性不飽和酸等で置換さ
れた三元共重合体も用いることができ、ＥＶＡ系共重合
体なる用語はかかる三元共重合体を含むものである。

このようなＥＶＡ系共重合体において、エチレン単位が
３重量％より少ないときは、共重合体の水に対する安定
性が悪くなり、例えば、共重合体を膜状に成形後に水又
は水性有機溶剤中にてポリアルデヒドと反応させた際に
、成形物の形状が破壊されるおそれがあり、一方、８０
重量％より多いとき、及び又はエチレン−酢酸ビニル系
共重合体のケン化度が８０モル％以下のときは、ＥＶＡ
系共重合体中の水酸基数が十分に多くなく、従って、ポ
リアルデヒドと反応させた後の遊離アルデヒド基数が１
分に多くなく、担体の単位重量又は単位面積当りの酵素
油面が十分に高い固定化酵素を得難くなる更に、ＥＶＡ
系共重合体の親水性が十分でなく、従って、一般に水性
雰囲気で行なわれて酵素反応に適してなるためである。

本発明においては、ＥＶＡ系共重合体を適宜の溶剤、例
えばジメチルスルホキシドや水−ｎ−ソロパノール混合
溶剤等に溶解し、酸触媒の存在丁にポリアルデヒドと反
応させてゲル化し、これをホモジナイザー等の適宜手段
にて微粒子状の指付とした後に、この担体に酵素を共有
結合させてもよく、また、ＥＶＡ系共重合体のみを従来
知られている任意の方法にて適宜形状に成形した後、こ
の成形物の形状を破壊しない溶剤、例えば水、メタノー
ル等に浸漬し、この溶剤中にて酸触媒の４在下にポリア
ルデヒドと反応させ、更にこの後に酵素を共有結合させ
てもよい。

成形物の形状は毛に制限されず、例えば、粒状、ペレッ
ト状、シート状、構維状、中空系状、多孔体、発泡体等
であってもよい。

尚、いずれの方法においても、ＥＶＡ系共重合体とポリ
アルデヒドとの反応には塩酸、硫酸、Ｐ−）ルエンスル
ホン酸等の酸触媒が好寸しく用いられる。

本発明において、ポリアルデヒドとは、一分子中に少な
くとも２個の遊離のアルデヒド基を有する化合物（高分
子化合物を含む。

）を意味し、具体的にはグリオキサール、マロンジアル
デヒド、マレインジアルデヒド、コハク酸ジアルデヒド
、アジピンジアルデヒド、グルタルジアルデヒド、ピメ
リンジアルデヒド、スペリンジアルデヒド、テレフタル
ジアルデヒド等のジアルデヒド化合物や、ジアルデヒド
デンプン、ポリアクロレイン等の高分子ポリアルデヒド
を用いることができる。

本発明においては、ＥＶＡ系共重合体にポリアルデヒド
を反応させて担体とする際に、この担体に遊離アルデヒ
ドを残存させる必要がある。

従って、ジアルデヒド化合物を用いた場合には、一部が
、一方のアルデヒド基は共重合体をアセタール化してい
るが、他方のアルデヒド基は未反応のままで残っていな
ければならない。

また、一分子中に３個以上のアルデヒド基を有するポリ
アルデヒドを用いた場合には、その一部が、少なくとも
一つのアルデヒド基により共重合体に結合しており、一
方、共重合体を架橋していても、していな（ともよいが
、少なくとも一つのアルデヒド基は未反応のままに残っ
ていなければならない。

ポリアルデヒドの所要量は、ポリアルデヒドとＥＶＡ系
共重合体との反応方法に応じて、実験的に容易に求める
ことができる。

一般に、一定量のＥＶＡ系共重合体にポリアルデヒドを
反応させるとき、ポリアルデヒドがある量以上になると
、架橋共重合体中の遊離アルデヒド量はほぼ一定となる
。

本発明においては、このように架橋共重合体中のアルデ
ヒド基がほぼ一定となる最少量近傍のポリアルデヒドを
共重合体に反応させ、こうして得た架橋共重合体を好適
に用いることができるが、勿論、固定化酵素において酵
素活性が得られる限りは、架橋共重合体中に残存させる
未反応の遊離アルデヒド基の量に特に制限はない。

このようにして得たアセタール化ＥＶＡ系共重合体から
なる担体へ酵素を共有結合させるには、好ましくは緩衝
液に比較的低い温度で酵素を溶解又は分散させ、この中
に上記担体を浸漬して、静置又は攪拌する。

しかし、酵素活性が失なわれない限りにおいて、担体と
酵素との反応条件は特に制限されない。

従って、反応温度は６℃以上、酵素の不活性化温度まで
の温度、ｐＨは１〜１１の範囲にわたって適宜に選ぶが
、通常は、０〜４０℃の温度、６５〜８のｐＨの範囲で
行なう。

反応時間は数分から数十時間にわたってよく、適宜に選
ぶ。

本発明において用い得る酵素は、担体の遊離アルデヒド
基と共有結合し得る反応基を備えた酵素であり、代表的
には遊離アミン基を有する酵素である。

このような酵素の具体例としてグルコースオキシターゼ
、カタラーゼ等の酸化還元酵素、アスパラギン酸塩アミ
ントランスファラーゼ、ヒスタミントランスファラーゼ
等の転移酵素、リパーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ、ウレアーゼ、α−キモトリプシン等の加水分解酵
素、グルコースイソメラーゼ、アラニンラセマーゼ等の
異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グルタミンシン
ターゼ等のりガーゼ等を挙げることができる。

以上のようにして担体に共有結合によって酵素を固定化
した固定化酵素は、緩衝液のような反応媒体から涙過、
遠心分離等の手段によって簡単に分離することができ、
これを洗滌、凍結乾燥等し、又は緩衝液中に低温で保存
して製品とする。

本発明の方法は、以上のようにＪＥＶＡ系共重合体をポ
リアルデヒドによりアセタール化して安定な担体を形成
すると共に、この担体に含まれる未反応の遊離アルデヒ
ド基に酵素を共有結合により固定化するものであるから
、酵素の担体からの溶出や離脱がなく、酵素が活性を失
なうことなく、担体上に結合され、更に、酵素活性が高
く維持される。

また、ＥＶＡ系共重合体は成形が容易であり、これにポ
リアルデヒドを反応させれば担体を得ることができるか
ら、担体の製造も簡単である。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に何ら限定されるものではない。

実施例 １ エチレン−酢酸ビニル共重合体（エチレン単位含量１３
重量％、日本合成化学工業■ソアレツクスＦＨ）の９８
モル％ケン化物２０グを水１０ｍ１−アセトン２０ｍ１
−ジメチルスルホキシド７０ｍ１混合溶剤に溶解し、ガ
ラス板上に厚さ３００μに塗布した後、５０℃の水中に
１時間浸漬して凝固、膜化させ、ガラス板から剥離して
十分に水洗した３次に、３０℃においてＩＮ塩酸１００
ｍ１にテレフタルアルデヒド１グを分散させ、この分散
液中に上記膜を２４時間浸漬した後、水、メタノールの
順で十分に洗滌し、膜状担体を得た。

ウレアーゼ１００ｍ９を含むリン酸緩衝液（０，０２Ｍ
、ｐＨ７°５）１．００ｍ１中に上記膜状担体を４℃の
温度で１２時間浸漬した後、ウレアーゼを含まない上記
と同様の緩衝液で十分に洗滌して、固定化酵素を得た。

こうして得た固定化酵素を２０℃の温度で３重量％尿素
水溶液（トリス（オキシメチル）アミノメタン−塩酸緩
衝液、０．１Ｍ、ｐＨ６，７）に浸漬したところ、７．
９Ｕ／ｃｍ２の酵素活性を示した。

尚、上記尿素水溶液との反応において発生するアンモニ
アを０．ＩＮ塩酸で滴定して、５分間に１ｍｇのアンモ
ニアを発生させる酵素活性を１単位（Ｕ）とした。

参考例 実施例１で得た膜状成形物を種々の濃度のグルタルジア
ルデヒドとボウ硝１０％とを含むＩＮ塩酸水溶液に４０
℃の温度で３時間浸漬し、アセタール化した後、炭酸ナ
トリウム水溶液、蒸留水、メタノールの順で十分に洗滌
し、乾燥した。

この担体を亜硫酸水素塩による方法、即ち、１Ｍの亜硫
酸水素ナトリウム水溶液２５０ｍ１にＩＮ硫酸５０ｍ１
を徐々に加えて調製した水溶液に、上記担体を浸漬して
反応させ、ＩＮ力性ソーダにて滴定する方法を用いて担
体中の遊離アルデヒド基量を測定した。

結果を図面に示す。実施例 ２ 実施例１と同じＥＶＡ系共重合体２０グをジメチルスル
ホキシド１００グに溶解し、５０重量％グルタルジアル
デヒド水溶液３０グを加え、次にｐ−）ルエンスルホン
酸５グを加えて十分に攪拌した。

この水溶液をガラス板上に厚さ１００μに塗布し、４０
℃の温度で一晩放置して膜状物を得、水洗し、更にリン
酸塩緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ７，５）で十分に洗滌し
て、担体を得た。

リゾチーム（シクマ社製、４０８００Ｕ／ｍ９）０．１
２をリン酸塩緩衝液（０，０５Ｍ１ ｐＨ７，５）に溶
解し、７０℃の温度で上記膜状担体１０ｃｎｆ、を一晩
浸漬した後、リン酸塩緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，０）
で十分に洗滌して、固定化酵素を得た。

光路長１ｃｍのセルに６６０ｎｍにおける吸光度が０．
７となるように調整したＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｉｙ
ｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ懸濁リン酸塩緩衝液（０，０５
Ｍ。

ｐＨ７，０）５ｍｌに上記固定化酵素１４ｃｍ２を１０
分間浸漬し、６６０ｎｍにおける吸光度を１分間当り０
．００１減少させるときの酵素活性をＩＵとするとき、
２２．ＩＵ／ｃｍの活性を示した。

この固定化酵素を新たに調整した上記と同じ緩衝液に１
０分間浸漬し、酵素活性を測定した。

このようにして同じ反応を５回繰返して、酵素活性の変
化を調べた。

結果を下表に示す。

【図面の簡単な説明】

図面はＥＶＡ系共重合体に反応させたグルタルジアルデ
ヒドの濃度とアセタール化共重合体中の遊離アルデヒド
基量との関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酢酸ビニル単位２０〜９７重量％よりなるエチレン
   −酢酸ビニル系共重合体の酢酸ビニル単位の８０モル％
   以上がケン化されている重合体に、−分子中に少な（と
   も２個のアルデヒド基を有するポリアルデヒドを反応さ
   せて担体とし、この相体が有する遊離アルデヒド基に酵
   素を共有結合させることを特徴とする固定化酵素の製造
   方法。