JPS5849319A - マイトジエンおよびその単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非免疫的および免疫的過程により惹起される炎症におけ
る組織の破壊は、種々の細胞外物質（メディエータ−お
よびホルモン）を生成する。これらの物質は炎症の活性
化や組織再生過程の１１％な段階を制御する。メディエ
ータ−は、体液性メディエータ−として、血漿および血
清たんば〈因子の限定され制御されたたんばく質分解、
あるいは細胞性メディエータ−として細胞および組織か
らの能動的分泌および／または細胞溶解により遊離され
るなどのいずれかによって形成される。特にメディエー
タ−やホルモンは、細胞増殖過程（有糸分裂過程）の進
路の中で白血球によって形成され分泌される化学的情報
の特異的担体として重要である。これらは全身および局
部的活性化會とれら自身が制御している生体の防御機構
の一部である。メディエータ−は破損した生体自身の成
分および／または侵入した外部物質の除去や解毒に貢献
している。更に癒傷に際しての細胞増殖や組織の生育の
制御によって、これらは生体の生理的機能の抑制に貢献
している。内分泌腺の古典的なホルモン゛として炎症メ
ディエータ−は組織や血液中の微量成分で、極めて低い
濃度でしか存在しない。

実験的例証によると、このようなメデイエーターたんば
く分子は僅か５，０００個以下がある細胞の環境培地中
での有光分裂期の細胞で、完状平衡状態として保持され
ているに過ぎない。

染色体のセットが二重となる過程を伴ない、細胞分裂を
もたらす反応を「有糸分裂」とよぶ。白血球は、熟成し
完全に分化した循環型の顆粒球（好中性、好酸性、およ
び好塩基性食細胞に分けられる）と種々の亜種（Ｔ、Ｂ
−゛細胞、など）を含む単核白血球（単核細胞的食細胞
およびリンパ球）を包含する。これらの循環性細胞のう
ち、熟成した単核白血球だけが、さらに分裂し分化する
ことができる。顆粒球帯は特に分節顆粒球（白血球形成
）の発達と熟成の過程（造血）のための、これらのタイ
プの熟成した白血球の前駆体に属する。これらの前駆体
は、骨髄球、前骨髄球、骨髄芽球、骨髄幹細胞の順に発
生する熟成したおよび幼若な後骨髄球である。

この細胞分化および熟成の過程を制御する生体自身の細
胞内化学物質はロイコボイエチンと呼ばれる（　Ｈ，Ｅ
、　Ｗｈｉｐｐｌｅ　ａｎｄ　Ｍ、１．５ｐｉｔｚｅｒ
　（ｅｄｓ、）＋「Ｌｅｖｃｏｐｏｉｅｓｉｓ　　ｉｎ
　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｊ　＋　　
Ａｎｎ。

Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、１　１　３　　（１９６
４）、　　ｐ、５１１−１″’０９２．参照）。ロイコ
ボイエチンとは他の物質とともに白血球およびその前駆
体の分裂と分化を誘導する物質（マイトジェン）を含む
。

分裂することができる末梢や組織の単核白血球および骨
髄の白血球前駆体の有糸分裂については多くの発表があ
る（　Ｊ、　Ｌｏｂｖｅ　ａｎｄ　Ｓ、Ａ、　ＧＯｒｄ
Ｏｎ＋「　Ｈｕｍｏｒａｌ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　ｏｆ
　　Ｇｒｏｗｔｈ　　ａｎｄ　　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｊ
ａｔｉｏｎｌ。

Ｖｏｌ、　１．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７３参Ｍ）。ま九、たとえば細
胞培養中で白血球またはその前駆体に有糸分裂的形４１
をおよぼす各種の生物活性について多くの報告がある。

そのような活性は、Ｔ、Ｒ，Ｂｒａｄｌｅｙ　ａｎｄ　
Ｄ、　Ｍｅｔｃａｌｆ、　「Ａｕ５ｔ。

Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｂ１１１．　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、　Ｊ
　４４　（１９６６）、ｐ、２８７や、その他多数の著
者によって記載されている□、たとえば「コロニー刺激
因子」である。

たとえば血清または尿抽出物に見られるすべての活性は
、この名前に含まれる。これらは試験管内培養で顆粒球
や大食細胞の増殖と分化を刺激することができる。

同様な活性は、Ｄ、Ｙ、　Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ　ｅｔ　
ａｌ、　［Ｊ。

ＩｍｒｎｕｎｏＬ　Ｍｏｔｈ、　Ｊ　３９　（１９８０
）、ｐ、１８５−２０１に記載されている「Ｔ−細胞生
育因子」である。この活性は、たとえばＴ−細胞および
大食細胞に発し、試験管内でＴ−細胞分枝系を永続的培
養として保つことができるといわれる。

ＬＡＦ　（１／ンパ球活性化因子）の定義は、記述され
ているもう一つの生物活性に適用される（　Ｉ。

Ｇｅｒｙ　ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、　［Ｈａｎｄｓｃｈｕｈｍ
ａｃｈｅｒ、　Ｚｅｌｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｊ　１１　（１９７４）、ｐ、１６２
参照）。

今日まで数多い有糸分裂刺激活性の何れも特定の物質と
して単離決定することは不可能であった。

その一方、すべての報告は、化学的に未決定の溶液や混
合物の有糸分裂刺激活性の実験的証明を取扱うだけであ
る。したがって、活性物質の化学的性質とその生物特異
性について、如何なる知識も存在していない、 有糸分裂活性は細胞数の「有糸分裂指数」として測定さ
れている。有光分裂期にある細胞数の全数に対する比を
染色体分析法により測定するものである。もう一つの試
験法は放射性チミジンの取込みに基礎を置くものである
（　Ｊ、　Ｐａｕｌ、　ｌ−Ｃｅ１ｌａｎｄ　　Ｔｉ５
ｓｕｅ　　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　　Ｊ　　　　　５；ｂ
　　ｅｄｉｔｉｏｎ＋　　　１　　９　　７　５＋Ｃｈ
ｕｒｃｈｉ１１．　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｌｏｎ
ｄｏｎ参照）。

したがって、本発明の第１の目的は、白血球からの新種
の細胞マイトジェンを提供するものである。

本発明の次の目的は、白血球からの新種の細胞マイトジ
ェンを極めて純粋な形で提供するものである。

本発明の次の目的は、白血球からの新種の細胞マイトジ
ェンを実用にかなう物理酌量をもって提供することであ
る。

本発明の次の目的は、白血球および／またはその前駆体
の細胞分裂および分化を刺激し、生物特異性をもち、活
性を有し、しかも自然に作用するメディエータ−である
白血球からの新種のマイトジェンを提供することである
。

本発明の次の目的は、哺乳動物（たとえば人間）の容管
の防御状態に特異的に影響を与えるに適した白血球から
の新種のマイトジェンを提供することである。

また本発明の次の目的は、白血球からの新種のマイトジ
ェンを、経済的に、生物工学的に有用でしかも比較的簡
単な方法で、製造入手する方法を提供するものである。

本発明の次の目的は、白血球よりの新種のマイトジェン
を高純度で、分子的に均一にしかも実用Ｋかなう物理的
な量で製造入手する方法を提供するものである。

そして本発明の次の目的は、哺乳動物体の防御状態に特
異的に影響する薬剤組成物を提供するものである。

本発明に係るこれらおよびその他の目的および利益は、
以下の本発明に関する記述から明らかであろう。

本発明の主題は下記の性質を％償とする白血球および炎
症組織のマイトジェンでおる。

ａ）生体内および試験管内での生物活性もフ：−骨髄お
よび／または組織白血球の分裂および分化有糸分裂）を
選択的に誘導すること、−それらは本質的には他の生物
的影響とけ無関係なこと、 ｂ）物理化学的性質がニ ーアクリルアミド　デルでｐＨ７，４０における電気泳
動がアノ−ディックなこと、 一少くともｐＨ４，０から１０の範囲で１０％エタノー
ルを含む水性系に可溶なこと。

−それらがアニオンおよびカチオン交換体、リン酸カル
シウム　デル、およびヒドロキシアパタイトに、構造的
にも生物活性的にも可逆的に吸着し、非変性形で容量分
配クロマトグラ、フィーにかけられること。

本発明により、はじめて評価され、かつ極めて純粋な形
で得られた白血球のマイトジェンは、それらが本質的に
他の生物的影響から独立しているという事実によって、
更に特徴づけられるものである。更に厳密には、これら
のマイトジェンは下記の性質を示さない。即ちニ ー成熟した、および幼若な白血球の動員（白血球増多ま
たは左方シフト反応）、 一皮膚試験における毛細管透過性増進活性、−平滑筋の
痙隼誘発効果、 一黄紋筋の痙業誘発効果、 一内毒素の含有および内毒素様あるいに同様の活性、 一試験管内で白血球の化学的誘引効果（麹化性）、−試
験管内で正または負の化学力学的効果、−試験管内で白
血球に対する食作用刺激効果、−哺乳動物生体の自然状
態に対して、明白なショックや急性また持続性の全身的
害作用、−生体内で赤血球の、試験管内で栓球および白
血球の溶解作用、 一局所的炎症。

一血管細胞に対する同化性マイトジェン効果、−試験管
内で血管細胞に対するカローン活性。

本発明のマイトジェンは、典型的なたんばく質の性質と
たんばく質反応（フォリン反応およびビューレット反応
）を有する。融点は約２００℃（空気中および無酸素気
流中で分解）である。

本発明のマイトジェンは、トポ化学的および生物学的に
特異な活性を有する細胞性炎症たんばくメディエータ−
である。その生物学的仕事は、骨髄中のある特別なタイ
プの末梢白血球およびその前駆体要素（芽細胞）の分裂
と分化を刺激することである。これらのロイコボイエチ
ンは正常でなく独立した血液または血清の成分である。

これらハ他の多くのホルモンやメディエータ−と同様に
、試験管内では白血球の培養中に、生体内では炎症箇所
に白血球が蓄積される際に形成される。

他の生物学的作用を久〈ことは、本発明のマイトジェン
が細菌内生毒素の構造的および機能的性質と多くめ化学
的および生物学的性質において異なっていることを示す
。本発明のマイトジェンのその他の分子的性質、とくに
その活性発現のために低い血中濃度しか必要としないこ
とは、この炎症メディエータ−がホルモンに似ているこ
とを示す。活性投与閾値は、約１［］−５０ｐｍｏｌ／
詔である。ＬＤ、ｏ値は、生理的活性投与閾値の１，０
００倍量の投与によっても致死作用が認められ力かった
為、測定することができなかった。

本発明のマイトジェンは２群に分類することができる。

すなわち有糸分裂をすることができる特別なタイプの末
梢白血球の有糸分裂を誘導する物質は、それが作用する
目標の細胞のタイプにしたがって「リンパマイトジェン
」（リンパ球に作用する）またはヒスチオマイトジェン
（組織球＝大食細胞に作用する）と呼ばれる。骨髄白血
球前駆体の有糸分裂を刺激する化合物は「プラストデン
」と呼ばれる。この命名法は、ホルモン命名委員会の提
案に則ったもので、第一に、新物質はこれを生成した細
胞のタイプにより、第二に、これが作用する細胞や組織
す々わち目標とする細胞のタイプにより、そして第三に
作用そのものによるという順序で命名されるのである。

本発明のマイトジェンは単核細胞、顆粒球またはリンパ
球から生じる。この起源の相異は同様に命名に際して考
慮されている。すなわち、単核細胞プラストジエン（Ｍ
ＢＣ）　）は、単核細胞から生じたマイトジェンで、骨
髄の白血球前駆体の有糸分裂を刺激し、同様に、顆粒球
プラストデン（ＧＢ（）　）は、顆粒球から生じるマイ
トジェンで、骨髄の白血球前駆体の有糸分裂を刺激し、
したがって、単核細胞ヒストマイトジェンは、単核細胞
から生じて組織球（＝大食細胞）の有糸分裂を誘導する
マイトジェンである。最後に、リンパ球すンフオマイト
ジエン（ＬＬＭ　）はリンパ球からのマイトジェンで、
リンパ球の有糸分裂を誘導する。

マイトジェンが共通に有する上記の性質とは別におよび
それに加えて、　ＭＢＧは下記のよう々特異な性質をも
っている；すなわち ａ）生物的作用としてニ ー骨髄白血球の分裂および分化の特異的刺激、−試験管
内での有効投与閾値が５　Ｑ　ｐｍｏｌ　／Ｊｔ未満、 ｂ）物理化学的性質としてニ ー非変性たんばく（−次構造）の分子量が約２５．００
０ドルトン、 一９０％飽和（３，６ｍｏｌ／に３）の硫酸アンモニウ
ム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視および近赤外部での）は
第１図に示す通り、 一吸光係数は下記第１表の通り 第　　１　　表 ２４８（極小）　　　　　　　　０．２３２６０　　　
　０．３６ ２７６（極大）０．５６ ２８０　　　　０．５５ ２９０　　　　０．３８ ４００−１０００　　　０ Ｅ２８０／Ｅ２６０　　　１．５３” ■Ｇは単核細胞によって分泌される。その分泌は、たと
えば、−例をあげると（ナタマメ）Ｃａｎａｖａｌｉａ
　ｅｎｓｉｐｏｒｍｉｓ　（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
　Ａ、　ＣＯＮ　）から得られる多価レクチン　マイト
ジェンや体内毒素または細胞免疫反応など他のマイトジ
ェンの作用によって刺激される。

マイトジェンに共通な上記の性質のほかに、またはそれ
に加えて、　ＧＢＧは下記の特異的性質を有する。すな
わち： ａ）生体内における生物活性としてニ ー骨髄白血球の分裂と分化の特異的刺激、−試験管内で
の有効投与閾値が５　ｎｍｏｌ　／、１３未満、ｂ）物
理化学的性質としてニ ー非変性たんば〈（−次構造）の分子量が約８５．００
０ドルトン、 一９０％飽和（５，６ｍｏｌ　／４３　）の硫酸アンモ
ニウム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視および近赤外部での）が
第２図に示す通り、 一吸光係数が下記第舊表の通り 第　　１　　表 ２５１（極小）　　　　　　　　０．２２２６０　　　
　　０．３０ ２８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５５
２８１（Ｉ大”）　　　　　　　　０．５６２９０　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．４１４００−１０
００　　　　　　　　　　　　０Ｅ２８０　／　Ｅ２６
０　　　　　　　　　　　１．８３ＧＢＧは顆粒球から
分泌される。その生成は、当該細胞の生理的環境（血液
循環）からの除去、たとえば組織への白血球遊走などに
よってすでに刺激されている。したがってこの場合はマ
イトジェンの添加は不要である。

マイトジェン共通な上記の性質のほかに、またはこれに
加えて、ＭＨ１ｔ４は下記の特異的性質を有する、すな
わち： ａ）生物学的活性としてニ ー腹膜大食細胞の有糸分裂の特異的刺激、−試験管内で
の有効投与閾値がｉ　ｎｍｏｌ／β未満、ｂ）物理化学
的性質として：゛□ 一非変性九んばく（−次構造）の分子量が約１３．００
０ドルトン、 一９０％飽和（”＞−６ｍｏｘ／Ｊ＋　）硫酸アンモニ
ウム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視および近赤外部での）が
第３図に示す通り、 一吸光係数が下記の第璽表に示す通り 第　　置　　表 ２５２（極小）　　　　　　　　０．２０２６０　　　
　　０．２７ ２７９（極大）　　’　　　　　　　ｏ、５６２８０　
　　　　０．５６ ２９０　　　　　０．４６ ４００−１０００　　　０ Ｅ２８ｏ／Ｅ２，０　　　２．０７ ＭＢＧと同様に、ｌｖｌＭは単核細胞により分泌される
。ＭＢＧの場合と同様、　ＭＨＭの形成は、単核細胞の
有糸分裂促進的作用たとえば多価レクチン、体内毒素あ
るいは細胞免疫反応などにより刺激され得る。

マイトジェンが共通に有する上記の性質のほかに、また
はそれに加えてＬＬＭは下記のような特異的性質を有す
る、すなわち： ａ）生物学的活性としてニ ー末梢リンパ球の有糸分裂の特異的刺激、−試験管内で
の有効投与閾値が０．５ｎｍ○１／！未満、 ｂ）物理化学的性質としてニ ー非変性たんばく（−次構造）の分子量が約１７．００
０ドルトン、 一９０％飽和（３，６ｍｏ１／Ｊ！　）硫酸アンモニウ
ム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視および近赤外部での）が
第４図に示す通抄、 一吸光係数が下記の第■表の通シ、 第　　■　　表 ２６０　　　　　０．４１ ２８０　　　　　０．７８ ２８２（極大）　　　　　　　　０．７９２９０．０．
６１ ４００−１．０００　　　０ Ｅ２８０／Ｅ２６０１・９０ ＬＬＭはリンパ球によって分泌される。本発明に係る単
核細胞に由来するマイトジェンの場合と同様に、その生
成はリンパ球に対する有糸分裂促進的作用、たとえば多
価レクチン、内毒素又は細胞免疫反応などによって刺激
され得るものである。

１０μｍａｌ／−６の非生理的濃度まで１本発明に係る
マイトジェンはヒト、ウサギ、ブタ、イヌ、モルモット
、またはラットの好中性好酸性および単核白血球に対し
、化学走性、化学運動性、食作用、有糸分裂刺激性およ
びカローン活性などのいずれ本有していない。更に、こ
れらは１モルモット回腸の平滑筋に障轍誘発活性を示さ
ず、エパンズデルーを血管内標識色素として用いたモル
モットの皮膚試験において毛細管透過促進活性を示さな
い。最後にこれらはモルモットまたはウサギに対し一挙
に生物学的活性（血管スゾラウト誘導）鈎値の１，００
０倍量までを血管内に投与しても明白なショックもその
他の一時的または持続的な全身性の有害作用を有してい
ない、更にマイトジェンは、モルモットまたはウサギに
対してｊ　ｎｒｎｏｌ／１１という高濃度で血管内に一
挙に投与して本、その他の明らかな全身性生物活性を示
さない。さらにこれらは、欧洲薬局方ｖｏ１．　ｌ　（
１９７５）１）５６−５９に基づき直腸温度測定によっ
て標準化した方法によって示されるようにウサギに対し
て発熱源性を有していない。

第１−４図はマイトジェンＭＢＧ、　ＧＢＧ、　ＭＨＭ
およびＬＬＭ水溶液２０℃、吸光スケール（０−１００
）Ｅ＝０−２．セル厚みｄ＝１ｃｍにおける吸収スペク
トルを示す。

第５図は、欧洲薬局方ｖｏ１．２　（１９７５）による
標準発熱源検定を図式的に示したもので、平均体重３１
ｒＰのウサｊＩ？３頭の直腸温度を、３０μｙ　ｗｖ（
１，３ｎｍｃ＞ｔ　ｗｕ／ｂ動物体重に相当）の１　ｄ
　０．９（ｗ／ｖ　）％生理的食塩水溶液の血管内投与
に際して、投与前（Ｖ、Ａ　）、投与中（井）、および
投与後３０−１８０分に測定したものである。

欧洲薬局方１９７５年版、英国（１９７３）および米国
（Ｕ、Ｓ、Ｐ、）　（１９７５）標準は、６頭の実験用
ウサギの直腸温度変動値の総計が２．６℃を超えず、特
に１．１５℃以下の場合、その製剤に「発熱源を含まず
」と表示することを許可している。第８図に示す実験結
果は、この基準を満足するものである。この定義に従え
ば、ＭＨＭＩＪＩ剤は発熱源を含まず、熱性活性をもっ
ていない。このことは残シの極めて高度に精製されたマ
イトジェン製剤にも適用し得るものである。この極めて
厳格なたんばく質の細菌内毒素やその他の通常の発熱源
による汚染に対する基準は１本発明の細胞マイトジェン
の精製法が極めて効果的なことを示す吃のである。これ
はマイ２トジエンの生物特異性の明らかなパラメーター
である。

本発明により調製入手されたマイトジェンは貴重な細胞
内物質である。これらは生体の防御状態、たとえば免疫
状態に特異的作用をもつ本のとして用いられる。これら
は特に白血球およびその前駆体の有糸分裂および分化に
影響を及ぼすに適し、それ故山血球機能、たとえば真菌
症、や心梗塞に特に影響を及ぼすのに適する。更にマイ
トジェンは、その抗体を作るために用いることができる
。

本発明のマイトジェンは、５０　ｐｍｏｌ／Ｊ１以上の
濃度で一日の投与１５０　ｆｍｏＡ以上により、哨乳動
物たと、ｔＩ／ｉヒ）Ｋ対し、単独または混合物として
、非経口的に、望ましくは血管内もしくは局部的に使用
するものである。

本抛明０＊０主題は、マイ　トジエンを白血球および炎
症龜繊郁位から生物工学的に製造および単一する方法で
ある。こｏ７ｊ法は、白血球もしくは炎＃１ｍ１Ｉｋｖ
ｔホモジナイズするかまたは白血球を培養し、生成また
社遊離したマイ　トジエンをホ４ｙネート壜九線培養上
を液から単一することをＩｆ＃徴とす為ものである。

ｊＩ［ｌｌ的には、細胞培養を行わないで白血球から直
接メジエータ−ｔａｔ造することが呼鈴である。

しかし亀から、このような操作は経済的ではない。

その過鴨で白血球は破壊され、また単−前に合成中分泌
を刺激していないので、メゾエータ−の収率紘低く、ま
たメジエータ−は白血球の細胞内構成成分を夾雑し中す
い、し九がって、本発明の方法においては、マイ　トゾ
エンを白血球培ｌＩＯ上置諌かも単離することが好まし
い、白血球社、原型的に社、白血球が適合性を有する任
意のメヂイクム中で培養で亀る。

壱穏０＠ｇＫ）培養に関連して、九とえと骨髄細胞、心
筋ＩＩＡ＾壜九は白血球の培養にはそれぞれ別儒Ｏ培−
基が知られている。これらの培養基は通常、多くの化合
物を含有する水溶液である。これらＯ培養基の主成分は
、塩、糖および代謝物、゛アミノ酸および誘導体、ヌク
レオシド、ビタミン、１ｔＩミノイド、袖−嵩、ステロ
イＹ％抗生物質、ならびに他の添加物たとえば、テンナ
イＶ１重金属塩、指示色素等である。公知の培養基Ｏ特
殊例としては、良とえはＬＨＡＭ７・、　　１−Ｍｇｏ
ｘｕｕ　１９９　］。

Ｌｎｃ゛ｒｃ’ｌ　（ｋｌ、ｘ、　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯ６：　（１９７０）８９〜１０８参照〕
を挙けることができる。

白血球の場合のように、細胞の培養が１時間以上にもわ
九ると亀は、通常、血清（たとえばウシ胎仔皇清を九は
クマ血清）ｔ−培養基に添加する。

血清成分は細胞機能Ｏ１ｓ持に好ましいといわれる。

しかしながら、血清含有培養溶液が培養細胞によって生
成される蛋白（メジエータ−）の単−過ｌｉＫ付される
場合は、培養液に添加された血清の複雑な混合−を形成
する化合物の多様性のために、痕跡の一白生成物の製造
が困難になる。しかも、とのような場合、細胞培−基に
血清を添加すると、食（不可能ではないにしても、メゾ
エータ−の起源Ｏ＊ｍが―しい、得られたメゾエータ−
が体液性（ＩＬ清）ｔた社細胞性（白血球）起源ものか
、ま、たはこのメジエータ−がいずれの動瞼楕に幽鬼す
るものかという間ｍｍ生じてしまう。すなわち、メゾエ
ータ−が、細胞を培養し九動物種のもｏｔｈｏか、また
は血清を添加した（通常は異Ｓ）動物種から誘導された
のかという問題である。

血清貴賓培養基の＃１かに、血清を含まない合成培地も
知られている〔上述のＭＯｒｔＯｎ　　の論文、■。

１１ａｙｍａｈｉ　＆　Ｇ、Ｉｉ、　ａ＆ｔｏ　：　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２５９　：　（１９７６）１５２〜１５４
　、　Ｎ、Ｎ、　Ｉａｃｏｖ＠ｈ　Ｆ、　Ｍ＠ｌｃｈ＠
ｒｓ　：Ｊ、　Ｗｘｐ、　Ｍａｌ、　１４７　：　（１
９７８）９２３〜９５５参照〕。

しかしながら、これらの公知の培地も同様に、細胞培養
および培養上澄液から生成したメゾエータ−の製造の同
者に対し欠点がある。含まれるテンナイＹ１重金属塩お
よび／壕九は色素り、痰ＩＩＦＯＩＮ自メゾニークーを
傷害し、を九不可逆的に汚染することがある。

一方、公知の血清を含まない培地は、白血球の構造的お
よび機能的生存能力を維持するのに必畳な必須成分を欠
いている。すなわち、白血球の培養とマイ　トジエン　
のような細胞痕跡成分の生物工学的製造に適し九培養基
はこれまで知られていなかった。

白血球の培養には、新しい、全合成の、化学的に明確な
培養基を使用するのが好鵞しい。それ杜！１ｌｌｌｌｊ
ｌ）＊に好Ｉ　Ｌｈ条件を与、ＬＡと同時Ｋ、ｍ１ｌｌ
上澄液からの細胞性マイトジエンたんばく質の製造およ
び単一を容易にする。

本籟＠に用いるのに好ましい、全合成の、化学的定義で
龜るｓｔｍ培養基は通常用いられるｍｍ。

化合物、たとえば塩、糖、ｆリオール、ウロン酸および
その誘導体、アきノ絨およびその誘導体、ヌクレオシド
およびヌクレオシド塩基、Ｃり電ン、Ｃり櫂ノイド、フ
ィチル誘導体、Ｍａｌ嵩およびステロイドを含有する水
＊＊である。さらに、これ盲で細膳培−基への使用が考
慮され九ことのない数種Ｏ化舎物Ｏひとつｔ九は混合物
を添加すゐに特徴が参る。これらの化合物は白血球の増
殖によりて示される生命能力に対してと（に有用であｐ
。

型光メゾエーター童生能を促進する・これらの物質には
不麹和脂肪酸、フラバノイド、工Ｃキノｙ、−タずンＵ
、メパロラクトンおよびＬ−カルノシンが但書される。

長時間の白血球の培養に際しては、細胞培養基に血清を
添加しないことが好ましい、そ０代わｐに少なくとも１
１ｍの明確な蛋白を添加する。

本員明のさ、らに好ましい態様においては、本尭明に使
用される合成の、血清を含壕ない細胞培養基にはさらに
付加的な化合物、九とえば４リヒドロキＶ化合物および
糖、ア建）畝、ヌクレオシド、陰イオｙｌｋ化合物およ
び／ま九はビタ（ン等で、公知の培養基にＦ１通常含ま
れていない化合物が添加される。これらの化合物は白血
球の培養に有用である。本発１１に用いられる培養基の
成分は、そＯ比が天Ｉ／ＩＡＯ禽漿０ＩＩＩ度範囲にほ
ば相幽する濃度に＆るように調整される（　Ｃ１ｂａ−
０６１ｇ７　ＡＧ　＠　：（１９６９）Ｄｏａｕｍｅｎ
ｔａ　　Ｇｅｉｇｙ、Ｗｉｌｌｓｎａｃｈａｆｔｌｉａ
ｈ＠Ｔｌｋｌ）＠１１＠！１７版、　Ｇｅｉｇｙ　８．
に、　、　Ｂａｓ＠ｌ　）　４１細胞埼養基には、細胞
を横書し、所望の細胞生成物の単一に＆影響を与える可
能性があるテンナイド、重金属塩および指示色素線加え
ないのが好ましい。

新規な細胞培豐基の正確な成分および性質は、西独特許
出１１ｊｌｌｌｐ５１１０５５９．９号に基づいて同日
に出願した特許出願Ｏ明細書に記載されている。

以下の第７表に示し九組成の細胞培養基は白嵐球の培養
のための本発明の方法にとくに好ましい例である。

培養基はＡ８ＴＭ−１Ｏ品實の水で調製する（　Ａ８Ｔ
ＭＤ　−１１９５−７０試柴用水棒準規格１９７０　；
　Ａｎｎｕａｌ　Ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａ８ＴＭ　−８ｔａ
ｎｃｌａｒｄｌＩｇａａｔｏｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、
　Ａ８ＴＭ　　１９７０参ｊｌｔ）、さらにｅ、ｈｋｓ
排除限界１０，０００〆ルトンのテンサイドｔｔ塘ない
膜で限外−過して、夾雑している可能性があるエンドト
キシンを除去する。得られた培地は、孔径０．２μｍ　
のテンすイドを含ｔない躾で一過して滅■する。

所望Ｏ生成物のＳ類によって、多積白血球の混合物また
は１種の均一な白血球を培養する。白崩球０１ｌｌ製お
よび培養は滅鉋条件下に行わねはならない、培養は満足
できるメゾエータ−線度を達成するのに十分な時間実施
する。適幽な時間は１０〜５０時間である。培養時間が
これより短いとメジエータ−の収率が低く、経済的でな
い。

一方、培地を培養時間５０時間を越えて使用すると、細
胞が死滅しはじめる。したがって、この場合は収率の増
加が望めない。細胞の二次培養に際しては、培地ｔｉｌ
ｉＬいものに交換する必要がある。

白血球は約３０〜４２℃の温度、好ましくは約６７℃で
培養する。温度が低いと培ＩＩ通根は満足で龜る４ｈｏ
ではなく、温度が高すぎると白血球が傷害される。

培養は白血球＃［約１０’〜５　Ｘ　１０”　１ｌｌｉ
ｌ／ｍ　。

好ましくは１０１〜１０＆１個／ｄで行われる。細胞１
１１１［がこれよ襲低いとＪ＠養液率位す童あたりのメ
ゾエータ−の収量が低すぎる。培！ｌｔ液の握飯が大き
くなると不経済である。細胞＃１１度が５８１０”個／
ｄ以上になると、培養液中の細胞栄養が急速に不十分に
なってしまう。

培養は大気中で行うことができる。培養中、炭ｍｙス分
圧ｔｉｗｉ＜ｔ、ておくことが好ましい１、この圧力は
約１０　ｖｏ１％までにすることがで龜ゐが２ｖｏ１％
が好ましい。培養液中へ０ｔ１１本の供帖は龜わめて型
費である。酸素は、培養藺関中たとえば空気を通じるこ
とによって供給できる。培養液の汚染を避けるため、空
気は滅菌し、加熱浄化し、すなわちエンドトキシン中細
の有機夾雑物を除去する。細胞懸濁液は培養中、攪拌ま
良は混合する。

本発明のある種のマイ　トゾエン　は、白血球混合−鵞
たはある種の白血球を通常の方法で培養するだけで、満
足できる収率で得られる。たとえば、ＧＢＧは混合白血
球または均一な拳粒球を上述の条件で培養すると、＾収
率で得られる。

しかしながら、本発明の他種の−イ　トノ１ン祉、白血
球混合物またはある槍の白血球を通常Ｏ方法で培養した
のみでは少量しか生成しない。

九とえ［、ＭＭＲ−？ＭＬＲのような単核細胞Ｏマイト
ジェンの場合がそうである。これら全曲収率で得るには
、培養中の細胞の有糸分裂ｔＪＩｌｌＩ激してやる必要
がある。多価−・イトンエノ、エントド中シンーマイト
ジェンおよび免疫反応が、感受性ｌ１ｍ１Ｉ＆の細胞ｌ
ｌｌ函に与えられると、有糸分裂が酵発される可能性が
ある。適幽なマイトジェンの例としてはレクチン、とく
にＣａｎａｖａｌｉａ　ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｍ　　のレ
クチン（Ｃｏｎ−ｃａｎａｖａｌｉｎ　ｋ　ｚ　ＣＯＮ
　）　＋ｌ＋−挙けることがで龜る。このマイトシェフ
０発因子、Ｃ０Ｎｔ培養液に添加する。

培養を停止させゐには、白面ｍｅ遍心分離して培養液の
上澄から＃き、この上澄液を処理して生成したマイ　ト
、’）　エン　を集める。細胞の障害、その結果として
の細胞粒子による培養液の汚染を避ける丸め、培養ｔＷ
Ｏ遠心分離は比較的低速度の、約３００〜４００）ｌで
行う、上ｆｆｉ液から大部分の細胞を除去し九のち、上
澄ｉ［ｔ−為速度で＾び逮心分離するのが有利である。

この方法で残っていた浮遊粒子は除去される６分離され
た白血球は再び二次培養に付してもよいし、凍結保存し
てもよいし、を九他の生物工学的目的に使用してもよい
。

細胞を除去し九培養上澄液は、培養白血球の分泌生成物
を含んでいる。これには、本発明のマイトジェンのほか
に、数多くの他の蛋白および物質があぺ１．？−れらの
物質の培養液中の一度はほぼノナモルの範囲である。し
喪がって、明確なメゾエータ−約１〜１０１ｖを得るに
は、？１１製後の収率を１０％として約１，０００　ｊ
ｏｊ＠養液が必要なことになる。使用する細胞の数につ
いては、細胞の分子効率から考えて、約１００　ｎｍｏ
ｌの蛋白を得るのに約１０１４個の白血球が必要という
計算になる。ｅの蛋白量は、分子量１０，０００〆ルト
ンのメゾエータ−として約ＩＭｇに相幽する。これは、
生環量のメゾエータ−の単一には、約５ｏｈｏ白血球の
培養が必要でるることを意味する。利用性の点で、白血
球としては、ヒト、クシ、クマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、
ネコ、ウサイ、ラット、マウスまたは毫ルモットの白血
球が好ましい。

大量の白血球の調製には、ドイツ未審査特許公開１１１
ＤＩＩ−０８３００９１２６号に記載の方法がとくに適
轟である（　Ｊ、！ｉ、　Ｗｉｓｓｌｅｒ　＠ｔ　ａｌ
　：　Ｚ、ｆ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅ、　５６１　：　（１９８０）
　５５１−５５２参ＪＩｌ）。

白血球の培養とは別に、本発明の　７１　ト　シュ、ン
は炎症組織部位からも祷られる。！１繊のＳ豐によって
起ζる炎症過楊では白血球の蓄積が起こり、ここにマイ
　トゾエンが生成される。炎症組織は常法によｐ得られ
、マイ　トジエン　の製造に使用で自る。炎症組織を緩
衝潜液中でホモジナイズし、可溶性成分ま九は浸出液を
不溶成分から達心分−によって分離する。

左冠状前脈の前方下行枝を大腿カテーテル法によって２
４時間結集して生成させ喪炎症、梗塞心筋組織を用いる
のが好ましい、白血球含有炎症心筋部位ｔＯ〜４℃で、
他の非梗塞組織から分ルする。

前述のように、本発明のマイ　トゾエン　の製造および
単離には着しく大容量の培養Ｓａｔ必賛必要る・し九が
って、精製操作の開始にあたっては、処理浴液の容量を
有効に減少させねばならない・生成し九少量の蛋白に加
えて、培ＩＩｆ＃液はメディウム成分混合物を含んでい
る。精製の第一工程で、生成した蛋白をメディウム成分
から分離すると同時に、大容量の水溶液を減量すること
が好ましい、これは培養上澄液から蛋白を、たとえば硫
酸塩またはリン酸塩の添加によｐ選択的塩析沈殿するこ
とで達成できる。以下に、培養溶液へのｉｌ＃アンモ品
りム添加による蛋白の塩析沈皺例を示す。

培養上、澄液を硫酸アンモニウムで飽和させると、生成
し友蛋白の大部分は、メディウム成分とじて含まれてい
る血清アルブミンとともにａ歇する。

沈殿し九蛋白はたとえば遠心分離によって回収する。つ
いで以下に述べるようにして、この混合物を個々の成分
に分離する。この方法で、ある樵のマイ　ト　ジエンが
得られる。他方、−１ｔｔのマイト　ゾ　エンは塩にｔ
ｉ′ｉ浴で、塩析沈殿工程における上澄液中に残る。こ
の上澄液にはメディウムのすべての可溶性成分も含んで
いる。この場合は上澄液を鎖線し、祷られ、＊＊Ｅ３を
以下に述べるように処通する。

蛋白含有培養上置液を４ＩＩＬｆＩｌアン毫二りムで飽
和すると、蛋白の大部分は沈殿する。この方法で、多く
の各種蛋白を含む蛋白混合物が得られる。これを個々の
蛋白成分に分離するのは大スな作業になる。し九がって
、本発明の好ましい態様においては、培養上置液中の蛋
白混合物はすてに塩析沈殿工程でいくつかの分画に分離
する。＠ｋｃＤ＊白が異なる硫酸アンモニア濃度で沈殿
するので、いくつかの粗蛋白分画に分離することが可能
である。したがって、本発明の方法では、硫酸アンモニ
ウムをある特定の飽和度まで段階的に培＊＊に加えてい
くのが好ましい。各分−にはそのＪＪｌ飽和範囲に和尚
する潜解度をもつ蛋白群か含まれる。

すなわち、本発明の方法によれば絽一工程で適当な飽和
限界を選択することによって、いくつかＯ蛋白群への粗
分離が達成できる。

たとえは、培養上澄液をまず４ｍ＃アンモニウムで５５
％飽和とする。祷られた蛋白沈声を分離する。次に３５
％飽和上澄液にさらに憾敵アンモニクムを加えて４５％
飽和にする。生成した飯白沈―ｔ−再び分離する。次に
４５％飽和上澄液を９０％懺練アンモニウム飽和にし、
生成した蛋白沈殿會さらに分離する。この沈殿の上澄液
をたとえば脱水透析または限外Ｆ遍によってＳ輪する・
この過程は第８図に図示する。

蛋白の塩析沈殿工程は、約０〜１０’Ｃ，刊に０〜４℃
で行うのが好ましい、以下の精製工程は同一条件下に実
施される、ｎ枳に用いる溶液の−は５〜９、とくに６〜
８である。この浴液のＰＨを一定に保′：）丸め、強力
な緩衝液、たとえば０．１　ｌ１１０１．ｉのリン酸塩
緩衝液を塩析沈殿操作の前に加えておくことが好ましい
、＊白の還元酸化電位を維持するために、この過程の全
溶液に０．００１　ｍｏｌ　／　１ｍ度のシスティンを
添加するのが好ましい・蛋白の楕ｌ１ｔｉ滅１条件で行
う必要はない。

塩析沈澱によって得られた蛋白は、蛋白適合性メディウ
ムに溶解して、［接、以下に述べるような精製、分１１
１１４＃作に付する。電絡沈澱工程の９０う塩飽和上澄
液は凝縮する。たとえば脱水透析筐九は限外濾過を行う
と、分子量約３００〜５００ダルトン以上のすべての化
合物が残留分−として得られる。これらもさらに処逸し
て、塩溶解性ママイ　トゾエンの精製を行う。

上述の工程で得られた蛋白分画は、本発明のマイトシエ
　　ンを、多くの異＊＊白良とえは他の分泌蛋白、一部
は血清アルディン、一部ＦｉｃＯＮとめ混合物として含
有する。これらの異種蛋白がと０ｆＩｌ１合唆の主４Ｉ
！部をなす、マイ　トゾエン　は以後の一連の精製工程
によってさらにｆｆ１ｌｌｔ、なければならない。異Ｓ
＋＊白は、！イトツエンの分子生物学的４ＩＩＪＩ４性
七−書しないようにして、―去しなければならない。さ
らに　マイ　トゾエン自身も細評の蛋白化合物として生
成しているＯで、情々の、特異的作用ｔもつ構造ごとに
分−しなけれはならない。

一般に、蛋白および他の天然物質の精製過桿は、一連の
分離技術の＃ｊｉ付せである。分子の大きさ、電侑、形
状、構造安定性および分子衆面譬の、所望の天然物質と
付随する不活性異物質の間の値妙な差を用いて分離、Ｏ
Ｉ製する。したがって、蛋白の精製には、製造技術の６
ａＩ＆質の多くの組合せが考案されている。用いられる
各製造ニーの性質および条件が、操作上Ｏａ質、工業的
実務、自動化の可能性および＃ＩＩ製過揚の経埼江から
、問題の天然生成物の収率中分子的品質に着しくｍ安で
ある６分瞭工根の至適形態や、問題の吻買の構造骨格お
よび機能的安定性ならびに他の分子パブメーターの範囲
内で精製餉序の功妙な組合せに江意しなければならない
。ということは、同一または類似の分離原理（モレキュ
ラーシープｖｉ遍、透析、イオン交換吸看婢）を用いて
も、その組合せが異なれば、棺纒過機の実際や経済的遂
行にも、また得られる生成物の収率、品質にもｂ″特か
つ者明な違いを生じることを意味する。槓製職序のある
点でまたは部分的順序の中で、半一の方法（たとえばヒ
ドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゾーン沈澱ク
ロマトグラフィー尋）を便用するかまたは省略するかは
、所望の天然物の収率中品質、さらには棺製過楊の実務
や経済的遂行に決定的な意味をもつ場合がある。天然物
のＮｌ１ｉｌ過機に固有なこれらの一般的関係や基本的
原理は、これまでによく知られた事実に明らかな例を求
めることができる。天然物の精製を経済的にまた実際上
技術的に操作可能な方法で行うには、はじめに透析、限
外−過塘九は凍結乾燥工程を置くことはすすめられない
、他の方法で、その前に、粗出発抽出液の容量を蛾初の
５００かり１ｕｏｏ分の１に秋電すべさである〇 各蛋白分−を精製するには、生化学領域で公知の複数個
の精製工程を使用することができる。この檀の鞘胸工機
の例には、分１Ｆ川および分析用モレキュラーシープク
ロマトグラフィー、囁イオンおよび吻イオン交換りロｉ
トゲラフイーおよびパッチ＠５Ｉｌ法、ヒドロキシアパ
タイト上クロマトグラフィー、ゾーン１澱クロマトメラ
フイーおよび循撫またはカスケード毫しキ子う−シーデ
濾過がある。

これらのｎ剃刀法のたにひとつを何うことによって、付
随する異檜蛋白のかなりのｍｔマ・「　１ゾ　コーンか
ら＃ｌｌｌ去することは川−しでめる。しかしながら、
各分１ｉｕＫ言まれた蛋白はきわわて強固に付着し合う
傾向がある。したがって、たとえは、蛋白の分子量が相
違していても、モレキュラーシープＶ過で完全な（理想
的な）ｋ日多電解買の分離が正確な分子量にしたがって
山ちにできるわけではない１．上述の分離過程の少なく
とも２徨ｔ−順次行うことが会費である。本発明のとく
に好ましい一様においては、飯自分幽からの　１１　ト
　ツエン活性のｎ脚に上述の分離過程の６檜が一次夾施
される。

上述Ｏ分喝工幌のすべての機合せが本発明の目的を構成
す４Ｇ分喝工捏ｔ）ｉ４ｍａ朧序で０夷施が他の騙合せ
はと何利でないという場合があることはもちろんであや
、たとえば分析用モレキュラーシーデー過０４ｌｌ　Ｋ
分取用モレキエラ−シーデー過を行うことは必然である
。この逆の順序で行うことは、操作、経済性％収率に間
＠【生じることは明白である。

モレキュラーシーデー過は、蛋白ｔその分子量によって
分離しようとするものでめｂ　Ｊｌｌ檜針白の大−分は
マイ　トゾエン　と分子量が興なるので、この方法で分
離できる。＊ａｔ−分子皺によって分離するには、マト
リックスとして、−水性。

水ｍｓａモレヤニクーシープが出いられる・−当な七し
キュラーＶ−デマトｉツタスｖｖ４としては。

エビタａルヒｆｌｙ−−デキストラｙ　（ｄｅｐｈａｄ
−ｔ）。

１タリル７　ｔ　ｙ東＊ｙｔｒロース（υｉｔｒｏｇ＠
Ｌａ）および三次元秦−１タ啼ル１ｔド（Ｂｉｏにｅｌ
ｍ）がｈる。

用いるマトリツタスｏ＠ｍ−界は分−一界より鈍−１・ いくつかの分離工＆を使用する場合は、七し−キュラー
シーデＶ過は、最初の分離工程りひとつとして実施すゐ
のが好ましい、使用Ｔるカラムの長名対礒の比およびｒ
ルマトリツ？スの粒子径ＶＣよって、モレキュラーシー
デー過は、＝１取＃１または分析用と呼はれる。クロマ
トグラブイ−ｋｍ名対掻の比が１０：１ｔでのカラムで
行い、マトリックスの總分離容量の意味でのカラムの晩
力１／）１／３までカラムが充填されている場合、七し
キュラーν−デＰａはＩｌ造用である０分析用モレキュ
ラーシーデー過は、ｋ嘔対優の比が１０：１より大。

好ましくはｆＪプｕ：１であり、カラムリ峡人充填が１
力の！１％までの場合でめゐ。

公取用モレキーラーＶ−デクａマドグラフィーでは−１
−な皺大Ｏ眩子僅のｒルマト呼ツタスを用い％粘稠な嚢
白―敵ｔ４Ｍｏ憾出で蚊大−過進度ＫｍいてＩＩ＆臘す
る。寸析出七しキュフーν−デＶ−では、ｒルマト啼ツ
タス０粒す峰Ｉａｄはでさ心だけ小６いもＯが１択され
％雇−釣プレートが数人に、またＩｌｌ喝と安全−から
−りれる出力とともに移動横１）＠遮が２〜４−／ｈに
なるようにする。

これらのパラメーターはｒルマトッッタスのｉｌｌ造に
依存し、ｒｋＫよって直−する御 一同かＯ分取用そレキュラーＶ−デー過をｊＩＩ次夷細
する場合は累進的な分離限界虻虐択する。使用するｒル
の排除限界はすべて約１０．０００　／ルトｖ以上とし
、−疋デルマトリッタス権と移働畿伺水嬉鍛相Ｏｒｗ）
マイ　トシエンＯ容置分配を可能にす為。

排除爾界は溶解した粒子の流体力学パラメーターであり
、ｒルマト啼ツタスＯ孔掻に相当する。

流体力学パラメーター以上の粒子はダルマトリックスを
通過できない（ｄ量分配係数置υ漏０）。

併除暖界とは嬉解拉子を他と分離するために１扇はれ、
容鰍分配係腋ｆ：Ｄ−ｕとＫＤ■１の間の値とした酸体
力学パラメーターで６４１゜ 七レキエラーシープ濾過の場合、蓋白は伽臼扇合性醒体
に＃ｗｌたのち、七しキュラーν−デに―崩すゐ・虐蟲
な爾蝿のひとつの−には、０．６１１ｏｌ　／　ｌ　＊
＠および００口０１　ａｉｏｌ　／　ｌシスティンを含
み、Ｈ７，４ｃｏｏ、υ（］　５　ＥＱＯ１／　ｌリン
ａｔナトリ９ムカリ９＾嬉績がめゐ・Ｐａ倣、７１・　
１　ジエン倉有分−【以ドに６ベるような７７法で＃−
シ。

所−により次の＠斃工程に付す。

１当な鴫イオン交換樹−の−には、エビクａルヒｙｑｙ
鋼嬌デキストランマトリックスまたは陰イオン交換能が
ある官能＆をもったヤルロースマトリックスが包含され
る。これらの父！Ｉｌｌ樹１ｌｋ１は＾生して反Ｉ［使
用することができる。己−型の−い鴫イオン交侠−起−
１たとえば、めりかじめ―Ｎ鏝中で膨情、半偶化した０
８Ａ１＆　−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　−ｂ　Ｏｆ用いる
のが好ましい。彰調および半匈化は−８〜１０でけうの
が好ましい。この場合り蝋−献としては、たとえばＬＪ
、Ｌｌ　４０１０１　／　４食礒および０．０υｌ　ｍ
ｏｌ　／ｊ　ｖステイｙｔｔみ、−δ、Ｕの口、Ｌ）　
Ｉ　ＥＣｌ０Ｉ　／　ｌ　ｔｒｔａ　−ｋｌｃｌ　ｇ−
故が使用で（ｉ隙イオン交ｌ１ｌｌ樹ｌ１ｌＩ−１，マ
イ　トゾエ　ンと他りａＳＳ材付飯日に死金に牧婁する
のに十分な皺、点８分−に山える　ａｍ鍬臼瘍欣１ｄ置
ｂｖこ肘してＩｌ−喝イｘｙＲ侠樹−２谷臘邸か遍１−
ｔ−分でめる。に応はタロマドグラフ法で行っても、ま
た−債、進達なパッチ吸１１績で打ってもよい、倣１の
場合、非吸着性の飯白會含有する上Ｉ＃１ｓｔ−，ａ暮
性のマイ　トゾエンまたは他の蛋白を＠璽した喝イオン
交換樹−と、りａマトダラフカラムによる一過、傾錦ま
たは遍心分離等の方法で分離する。

吸着隘イオン交換樹−は水または０−０４　ｍｏｌ　／
　１食塩に槽重する最大イオン強度４１：１１ｆシー８
〜１００塩溶液で洗浄して、付着した非＊ａ性化合物を
除去する。

好ましいｍ度の１績は約１５℃でろる。洗浄工程に適当
な塩溶液の例としては、た七えは上述ｅ）４Ｂ、Ｏｏ　
ｚｒｔａ　−ｓｂが６る。

マイ　トゾエン　および他０嶽白が蚊纏し、非吸着性の
化合−は−去された錫イオン愛！ＩＩＩ樹−【、４Ｊ、
０４　ｍｏｌ　／　Ｊ　＊＠ＡｋＪ、上のイオン曽Ｓｔ
ｔ自し、−４、υ〜１０．００ＩＩｉ白噛合！ｌ珈水廖
象を崩いて溶出する。−５，０〜７．００＾イオン＊ａ
楓−敵Ｏ蚊用が好ましい、こＯ−のｍｏｌｌＩｇとして
は、たとえばＵ、４）１ｍｏ１／Ｊｅ）ｆベラジ／Ｊｌ
ｌｌ１ｍ！蟲で−６，５に１檎化し、Ｄ、０口１　ｍｏ
ｌ　／　ｊのシスティンに加えた２、０　ｍｏｌ　／　
１食塩溶液を挙げることができる。

陰イオン交換反応管クロマトグラフ法で行う場合には、
ンイトシエンと他の吸着性蛋白の溶出を食塩の直線濃度
勾配によって実施することもできる。

蛋白分−ｏｔｍ彊に適当な陽イオン交換マ）　１７ツク
スの例には、エピクロルヒドリン架橋デキストラン（ｄ
ｅｐｈａｄａｘ）　　または陽イオン交換を有する官能
Ｊ＆ｔもったセルロースマトリックスがある。これらは
使用後簡単に再生でき、反復使用が可能である。弱酸性
陽イオン交換樹ｔｔｍ、たとえば可動性対イオンとして
Ｎａ＋を有するＣＭ−ｄｅｐｈａｄａｘ　Ｃ−５０を用
い、交換反応はｒｊ１４〜６で行うのが好ましい、ｓｅ
＊過捏を各編にし、より理想的な平置条件に近づけるた
め、−イオン変換−Ｉ１１１１で地端する自」に、蛋白
分画は０．０４　ｍｏｌ　／　４食塩に→しい最大イオ
ン強度をもつ飯白迩合性−浴敵で希釈しなければならな
い、この塩浴液は同時に−Ｉの劇髄にも使用できる。こ
の目的で使用できる塩浴液り例としでは、たとえば０．
０４　ｍ、ｐｌ　／　７食塩とυ・υ０１　！ＪＩＯＩ
　／　ｌシスティンを含み％−４〜６のりシ酸−酢鍍カ
リクム緩彎ＩｅＬｆｒ：挙げることができる。この陽イ
オン交換反応はクロマトグラフ法で行ってもよく、また
技術的Ｋｍ＄なパップ法で行ってもよい。

膨調腸イオン交換樹脂を蓋自分１ｉｌｉＫ、その＠看に
十分な量添加する。一般にこの目的には、Ｉｉ自白溶液
容量部に対して膨潤イオン交換樹８＠２容置都で十分で
ある。次に１ｉ白ｔ−吸着したーイオン交換樹脂を、傾
瀉または遠心分離して上Ｉｇｌｌｌ＆と分ける。吸着陽
イオン交換ｗＢ−は、水または０．０４ｍｏｌ　／　７
食塩に相当する蚊大イオン強度を有する塩盾液で洗浄し
て、付着した非吸着性化合物を除去する。−約４〜６、
敏１１１ｉ温度約１５−ｏの使用が好ましい。

洗醗に造した塩溶液の例としては、たとえば削述り−５
，０のリン鹸−酢絃カリタムー鞠液を挙げることができ
る。

洗紗した責白吸璽崗イオシ交換樹ａｍを次に飯白過合性
塩水溶液で溶出する。この目的ｅ（は、−１約４〜１０
の＾イオン強度塩浴液【用いるのが好ましい、この櫨の
塩溶液の例としては、たとえば−１６，５〜７．５の０
．５　ｍｏｌ　／　ｌリン酸カリクム水溶液または同じ
−の２〜５　ｒｎｏｌ、　／　ｌ★塩水溶液をφげるこ
とがで會る。

ヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィーを行う
Ｋあたっては、塩、たとえば前工程で疹加された蝋酸ア
ンモニウムやリン酸塩？ｒ前もって。

排出限界５１３Ｏｔルトンの膜で透析または幽界−過す
ることが好ましい、しかしなから、付随する＃ＡＫよっ
て粘度が上昇することは別にして、粛白溶液中のリン酸
＃度だけがヒドロキシアパタイトによるクロマトメラフ
イーで間＠になる。マイトソエ／は好ましくは直線性の
リン酸カリウム１１ｍ［勾配ｔｔＣよって溶出させる。

マイ　トジェン含有分幽會集め、以下の方法で濃縮する
。

ヒドロキシアパタイトの使用は、純粋な　−′イトジエ
ンを構造を維持したまま単離するＫｈｚされめて慮聾で
ある。しかしながら、一般に、大容量の蛋白溶液をヒド
ロキレアパタイトカラムによるクロマトグラフィーに付
すにはＭ内的にも経済的にもかなりの困ａｔ伴う。ひと
つには、蛋白鰍が大量になるとヒドロキシアパタイト會
っまらせる傾向が強く、タロマドグラフィーの固定マト
リックスとしては使用できない・他方、ヒドロキシアパ
タイトはきわめて高価である。大規模な使用は経済的で
ない、このような通出から、本発明の方法においては、
マイ　トジェン含育蛋自分−からの適当な生物工学精製
工程による大部分の付随異種蛋白の分喝では、ヒドロキ
シアパタイト上でのクロマトグラフィーの前に蛋白１容
液の′ｇ蝋をかなり低下させておくことが好ましい。

ゾーン沈ｈクロマトグラフィー（Ｊ、Ｐｏｒａｔｈ　：
１Ｊｔｔ　ｓｕｒ　＠、１９６（１９６２）４７〜４８
参鍼〕では、マイ　トゾエン中に残った飯白爽軸＠を塩
濃屓勾配ＶｃＪｌｌいた蛋白の分別塩析によって分離す
る。ｆ−ｖ沈皺クロマトグラフィーにおける飯自分−の
基本ｍｍは蛋白の構ｍＫ由来する一■逆的溶解特懺Ｏ羞
を利用するものである。この方法はもっと感度の−い分
子分離＆準に属し、蛋白の分子的均一性を明らかにする
場合に繁用される。この方法には、タロマドグラムの展
開に２檀の変法が知られている。分幽沈ｍｆ−ンクロマ
トグラフイーと分−溶出デーンクロマトダラフイーであ
る。

蛋白分離法における分−沈澱と分−溶出法の場合と同様
、両方法には場合に応じた利点がある・温度と−、カラ
ム特性はいずれも比較的広範囲に変えることができる。

ゾーン沈澱クロマトグラフィーの温度条件は０〜４０℃
である。温度軸回は約Ｕ〜１０℃、とくに約４〜６℃と
することが好ましい。−条件は４〜１０であり、６〜８
が好ましく、とくに約７で行うのが好ましい。カラムの
員さ対僅比は約１０＝１以上としなければならない、６
０〜１００：１゜と（に約５０：１が好ましい、鈑臼に
対し塩析性貴賓するすべての蛋白−合性塩が使用できる
。この罐の塩の例としては、リン酸ナトリツムーカリ９
ム、硫峻１ｙモニウム、硫鹸ナトリウムがめり、と（に
硫鐙アンモニウムが好ましい。

塩一度勾配は、蛋白の塩析基準が蛋白分離を達成できる
限り任意Ｆｔｒ望の形態とすることができる。

直線濃度勾配、とくに硫酸１ンモニクム鉋相２５〜１０
０％の上昇直線濃度勾配が好ましい。最大カラム充填は
総力ラム容量に対して約５％、好ましくは約１％である
。

循環またはカスゲートモレキュラーレーデ−過は分析用
モレキュラーシーデー過について上述した条件で実施で
きる。同じモレキュラーν−デと同じカラム条件が使用
できる。固定相マトリックス８θｐｈａｄ＠ｘ　　（）
　５０は長さ対礒比が少なくとも約５０：１のカラムに
漱大充填がカラム容量の約５うになるように充填使用す
るのが好ましい。分析用そレキュラーシーデー過に用い
た磐媒が、この方法における溶出溶媒としても好ましい
。

循環モレキュラーシー−一過では、分配平衡がたえず破
壊纏れ、溶出液は１Ｉ８Ｌ１惠された分離限界で同一カ
ラム上をｌ１ｌｌする。この方法では、移動蓋臼分妃バ
ンドの分−員は羞動的に拡大すゐ、また、力スケードモ
レキエクーＶ−デー過では、分配平衡は、同一または類
似の定められたパラメーターをもつ新しい第二のカラム
への園芝された分−限界での磐出液Ｏ遍−的輸送により
破壊される。

上述の各精製工程の間で、必要があれば任意の段階で目
的に応じて、蛋白溶液から望ましくない塩を分離し、ま
た同時に濃縮することができる。

濃縮（、Ｉｆ白水溶液の大部分の分Ｉｍ）は襦々の方法
で達成できる。この種の方法にはたとえ−ば、蒼白適合
液体、好ましくはリン酸ナトリウムカリウム緩衝液に対
する脱水透析または限外−過がある。

脱水透析はポリエチレングリコール（分子櫨２０、Ｕ　
００　ＩＦルトン）Ｋ対してたとえば排出限界５υ０ダ
ルトνのａｔ用いて行うのが好ましい。

限外濾過は排出限界約５ｏｕｒルトンの＃Ｉ４ｒ用いて
行うのが好ましい。生成した少量の飯白沈誠は中間遠心
分離によって除去すると、纜明な嶽Ｈ溶液が優られる。

この目的には、過温な分離および排除限＋１＃會もった
マトリックス、たとえはａｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−１０
＃　Ｇ　１５１またはＧ２０ｔ−用いた脱塩モレキュラ
ーシーデー過も便用できる。さらに常法により適当な移
動相を遍んだ通常のモレキエラーシーデｌ過工極會この
目的に併用することもできる。

スルフヒｒ９ル晶の鹸化を防止するために、全工程を通
じて蛋白溶液には約０６口（］　１　ｍｏｌ　／　Ｊの
システィンｔＳ加することが好ましい。

モレキエラーシーｆ濾過精製工程では、蛋白ｍ１ｌＩＩ
Ｋ約０．４膳ｏ１　／　ｊの硫酸アンモニウムｔＳ加す
ることが好ましい、鳥虐度の場合と逆に、この程度の一
度の硫酸アンモニクムは蛋白に対して強い塩析社止効ａ
ｔ示す、したがって、蛋白はモレキュラーシーｆＰｉａ
ｏ閣、溶液中に麺好に維持されることになる。しかも硫
酸１ンモニクムは微生物の生育ｔ−防止し、あるーの一
巣を１書する・したがって、これはマイ　トシエ／構慮
の安定化に嵜与し、りａマドグラフィーを＾い感度ｔｚ
ｕ’。

以上）で、また滅−しない条件Ｆに行う場合嵐賛で６４
ａ 硫酸１ンそニクＡ【約５−２　ｂ　〜５−７　ｍｏｌ　
／　Ｊ（８０〜９０★鉋相）まで績加すると、塩析　６
Ｊ　１ｊｉ５なマイトジェンが好ましくは単践１こまた
は付随する蛋白とともに完全に沈澱する。この目的では
。

６３０　Ｍ／Ｉの硫酸アンモニタム（ｒＪ９０％飽和）
を加える。−値は４〜９に維持するのが好ましく。

温度は４０℃まで、０〜８℃とすることが好ましい。マ
イトジェン含有蛋白沈澱は、蛋白を含まない上澄液と一
過、傾瀉または遠心分離により分離する。とくに限定の
ない限り、遠心分離は少なくとも１０．０００）ｌで最
低４５分間行い、一工程につき１時間行うのが好ましい
。あるいは２段階に、最初は低速で行って、沈殿蛋白の
大部分ｔｍ去し、ついで總１段階のｌ！細な蛋白粒子を
残した上澄液を一通、たとえば２０．０００からｓｏ、
ｕｏｏｘｙで貫流遍心分離する方法ｔとることもできる
。

精製工機中の龜竿およびｐＨＫは　特に制−はない、鈑
白の天然の」ンホーメーシコンτ維持する必要かめる場
合には、全４温度は＃Ｊ　Ｌｌ〜８℃の軸回であり、約
Ｕ〜４℃が好ましい。しかも、分離およ＜ｆｉｇ製工楓
は生還的−および塩条件で′ＡｊＩＩすることが必須に
なる０本発明の方法の主たる利点は、これらの藁件がは
じめて逓守しゃすくなった点である。

得られたマイ　トジェンは緩衛食塩水、たとえばＱ、　
１５　ｍｏｌ　／　Ｉ　（０−９’／Ｗ　　％　）食塩
、０．００１ｍｏｌ／ｊνスティνを含有し、ｐＨ７，
４の０．００１５　ｍｏｌ　／ノリン酸ナトリウムーカ
リウム溶液中に保存することができる。通常の滅■−過
（孔径０．２ａｍ）後、この蛋白プレバレージョンは天
然のままで、富諷で少なくとも２００時間、−２５℃に
凍結すると少なくとも５年間、生物学的活性ｔ−維持す
る。鑞白のこの安芝性は、とくに、分子の均一性の１革
のひとつである。マイ　トジエン溶液は、２．Ｌｌ〜５
．６　ｍｏｌ　／　ｊの硫−アンモニウム（５０〜９０
％飽和）の存在下、−２０〜＋５０℃の＠度で安全に保
存できる。この高浸透圧により、マイ　トジエン　　溶
成は微生物の感染や分解、また細−の生育に対して保−
される。

これを生理学的に、治療的に、またその他の目的で使用
する場合には、上述のような過当な食塩水に対して透析
または限外Ｐ遍して、　ｊａｃｋ除去すればよい。

マイトジェンを製造、単離するための上述の過ｌ１ｌＫ
おける好ましい方法をまとめると次のとおりである。

白血球もしくは炎症組織をホモジナイズするかまたは白
血球を培養し、４られた　マ　イ　ト　ジ１７をホそゾ
ネートまたは培養上澄液から単離する。

培養は各種白血球の混合物ｔｃついても、また特足の種
類の白血球についても実線できる。

白血球は、蛋白としては血清アルブミンだけｔ會む、完
全合成層Ｉｌ基中で培養することが好ましい。培養中に
は、必要に応じて白血球の有糸分裂を促進させる。こ〇
−的には多価マイトジェンもしくはエンドトキシンマイ
トジェンｔｍ加ｔ、、１Ｉ）ｂいは白血球の有糸分裂を
銹鈍するため、細胞表向に免疫反応を起こさせる。白血
球の有糸分裂は、レタデνと（Ｋ　Ｃａｎａｖａｌｉａ
　ｅｎａｉｆｏｒｍｌｓ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｌｎ　
Ａ　！　ＣＯＮ　　）　ｔＰｉｈ加して―発するのが好
ましい。

もっとも好ましいａ様においては、白血球は第表に示し
た組成を有する埼彎基中、４０時間、３７℃、一度約１
０’〜１０８細胞／培養液、ｃｏ寓分圧約１％の条件下
に、培養液に酸素を供給しながら培養する。

白血球を分離して培養を終結させたのち、培養液中に含
まれる蛋白部分を、それが塩の添加で不溶性になる場合
は溶液から塩析し、それが塩飽和溶液に可溶な場合はこ
の溶液を濃縮して得る。蛋白の塩析には硫酸アンモニウ
ムを用いるのが好ましい、培養液の硫酸アンモニウム濃
度は段階的に上昇させ、硫酸アンモニウムの添加毎に沈
殿した蛋白を分離し、ＪＩ４なる硫酸アンモニウム濃度
で段階的溶解性を示すい（つかの粗麺自分−が得られ為
。場ＩＩ＆欧中の硫酸アンモニウム濃度は段階的に６５
％、４５％、ゾ０％細相に＆１１慢することが好ましい
。

塩析沈飄Ｖ上１１ｉ液は、ｋ８沈澱物【限外−過または
透析で分離したのちに一翻する。段階的塩析で単離され
た各粗麺自分−および上澄液のＩＩＡ輔で得られた粗麺
自分−は別個に処理して　マイ　ト〉二　／を得る。粗
責自分幽の処理およびマイ　トゾエンノ４１離ハ、ガ枢
用および分析用モＬ’　キ２ラーシーデｐ過、脇イオン
および陽イオン交換クロマトグラフィーならびにパック
吸着処理のそれぞれ、ヒドロキシアパタイトを用いるク
ロマトグラフィー、デーＶ沈崎りロマトグウフイーおよ
び／または循環もしくはカスケードそレキュラーシーデ
ー過によって行われる。上記精製工程の少なくとも２稙
、神に少なくとも６梼を一次夾施ブることか好ましい。

白血球の培養液の代わりに、白血球または炎紅組−のボ
七ゾネートの一工溶性部分を使用して、マイトシ：ｒ−
ンｔ−＊造、皐龍することもできる。

次に、本＠明の方法を、ブタ白血球全出発原料トＬ”（
マイ　トゾエン飯白プレバレージョンを率−する例につ
いて詳細に例ボする。しかしながら、この態様は本軸明
を限定するものではない。

他の哺乳動物の白血球および火鉦組減が１−徐に便用で
きる。

例Ａ 白血球混合物の培養ｆ中でのマイトジェンの製造、なら
びに上澄液の他成分からの単球プラストデン（ＭＢＧ）
、顆粒球・デラストデン（ＧＢＧ）、単球ヒスチオマイ
トジェン（ＭＨＭ　）およびリンパ球−リンパマイトジ
ェン（ＬＬＭ）の単離について述べる。全工程は、特に
指示のない限シ、０．００１　ｍｏｌ　ｌｌのシスティ
ンの存在下、０〜８℃で実施される。遠心分離は前述の
ように、一工程操作または二工程操作（貫流遠心分離）
によって行う。

Ａ、１．生育能ある白血球の混合群の調製と培養Ｉ　Ｏ
，０００１のブタ血液から生理学的組成の白血球混合群
細胞として、白血球５０ｋｇ（約１０１′個）１単離し
、滅菌条件下に２．５ｋｇ（細胞５×１０１２個）の２
０バツチとして培養する。培養溶液としては、第５表に
示したメディウムを用いる。

培養はグラス容器（Ｄｕｒａｎ　５０またｎ　Ｐｙｒｅ
ｘｇｌａｓθ）中で行う。初めの細胞密度は約１０８細
胞／Ｉｌｌである。培養液を１Ｖ／ｖチｃｏ２雰囲気中
、４０時間以上、６７℃に保持する。この間、細胞懸濁
液をゆつ〈シ攪拌し、また滅菌し、水洗し、加熱清浄化
した空気の泡（＜　１　＋＋ｎ　）を送る。空気の加熱
清浄化は、約５００℃でシリカ管を貫流させて行う。酸
素分圧のほかに、−値（７，１）およびＤ−グルコース
濃度を測定して、一定に維持する。培養中に、細胞は、
培養基中の多価マイトジェン成分（ＯＯＮ）によって有
糸分裂が銹発される。細胞の数、分類および形態的生存
能（色素排除試験）を血液学および細胞培養技術の常法
によってたえず測定する。細胞の機能的生存能は化学運
動性および走化性に応答する運動能によって測定する。

有糸分裂は染色体数によって測定する。

生物工学的培養後の細胞の形態学的生存能は９５−であ
る。培養時のＭｌｔｌ胞の全景失（主として顆粒球）は
通常、−次細胞培養の場合、最高２０％である。

細胞ｉ４００Ｘ、９，１０℃で１０分間遠心分離して上
澄液から分離し、培養を終結させる。細胞ｔ　％　０．
１５　ｍｏ１／　１食塩、０．００１５　ｍｏ１／　ｌ
リン酸ナトリウムカリウムを含有し、ｐ）（７，１の塩
溶液で２回洗浄する。細胞は他の目的にも使用すること
ができる。

培養上澄液を再び４℃において、１０，０ＯＯＸ、！ｉ
＋で１時間分離して、懸濁粒子を除去する。得られた澄
明な培養上澄液は総容量１０００１で、蛋白約１４００
．９ならびに他分子および塩を含む。この溶液を直接、
硫酸アンモニウムにょる塩析分画に付す（Ａ２）。とく
に指示のない限９、以下の全工程は０〜４℃で実施する
。

分画の製造 培養上澄液（Ａ１）ＪＣＰ８６．７の［１，５１！＋０
１　／　ｌＩリン酸ナナトリウムカリウム緩衝液、最終
濃度が０．１　ｍｏ１／　ｌになるまで加える。さらに
Ｌ−システィンを濃度０．００１　ｍｏ１／　ｌｌにな
るまで加える。

次にこの緩衝培養上澄液に、硫酸アンモニウム１９９１
１／／溶液を添加して、５５チ硫酸アンモニウム飽和に
調整する。添加中、蛋白溶液の−１は２Ｎアンモニアを
加えて６．７にたえず調整し、維持させる。蛋白の一部
は溶液から沈殿する。生成した蛋白沈殿を塩可溶性蛋白
を含む上澄液から、ｉｏ、ｏｏｏｘｙで１時間塩心分離
して分離する。

沈澱した粗蛋白分画Ｉが硫酸アンモニウム含有沈積物と
して得られ、この中には蛋白約１００ｇが含まれている
。この粗蛋白濃縮分画Ｉは、以下に記載する粗蛋白濃縮
分画■の場合と同様に操作して、別個にその成分のため
に処理することができる。

次に６５％塩飽和培養上澄液に、硫酸アンモニウム６０
　ｇ／ｌ溶液を加えて、４５％硫酸アンモニウム飽和に
調整する。蛋白溶液のＰＨは２Ｎアンモニアを加えてた
えず６．７に調整、維持さｎる。

溶液から嘔らに蛋白が沈殿す、る。蛋白沈殿を１０．０
００ｘＮで１時間遠心分離し、塩可溶性蛋白含有上澄液
から分離する。沈澱した粗蛋白濃縮分画■が硫酸アンモ
ニウム含有蛋白沈積物として得らｎｌこの中には蛋白約
６０ｇが會ま九る。この粗蛋白濃縮分画■は、粗蛋白分
画■について以下に記載すＺ操作にしたがって、別個に
その成分のために処理することができる。

次に、４５チ塩飽和培養上澄液に硫酸アンモニウム５２
５９／ｌ溶液を加えて、硫酸アンモニウム９０％飽和に
調整する。この場合も、２Ｎ硫酸アンモニウムを加えて
、−が６．７に維持されるようにコントロールする。さ
らに蛋白が溶液から沈澱する。１０，０００　ｘ　ｇで
１時間遠心分離して、塩溶解性蛋白を含む上澄液から蛋
白沈澱を分離する。沈澱粗蛋白濃縮分画■が硫酸アンモ
ニウム含有沈積物として得られ、これは蛋白的１，０８
０　ｇ全含有する。この分画は培養基の成分である血清
アルブミンの大部分を含んでいる。この粗蛋白濃縮分画
■は以下記載する方法によって含有マイトジェンＭＢＧ
、ＧＢＧ、ＭＨＭおよびＬＬＭのために処理する。粗分
−■の９０％塩飽和上Ｍ液分画ｌ■には横可溶性蛋白１
６０ｇ′と他の分子（）５００ダルトンンが含まれてい
る。またその成分のために処理する仁とができる。

Ａ、６．　　粗製たんばく濃縮液分画ｔｎ中のマイト上
記（Ａ２）によって得られた粗製たんばく濃縮液分画■
は、最少量の緩衝液Ｂ　（０，０４ｍｏｘ／１Ｎａｉｌ
　、　０．００１　ｍｏｌ／ｌシステインヲ含む０．０
１ｍｏｌ　／　ｌ　）リス−Ｈ（Ｊ溶液でｐ［−１８，
０）に溶解する。

生成した僅かに濁・つた溶液（２０１）は遠心分離によ
って清澄にし、ついで排除限界５００げルトンの膜を用
いて硫酸イオンが検出できなくなるまで緩衝液Ｂに対し
て透析脱塩する。得られた澄明な溶液は、膨潤させ再生
したアニオン交換体（可動な交換できるイオンｆｉ（Ｊ
−）のカラムにかける。

これはエピクロルヒドリンと架橋構造をもつデキストラ
ン（ＤＫＩＣ−セファデックスＡ３０）で、上記の緩衝
液Ｂ中で平衡に達している。

カラムの体積はたんば〈浴液の４倍で、その長さと直径
の比は１０：１である。ゲルのカラムは、更に上記の吸
着緩衝准Ｂで、ν液の２８０　ｎｍにおける吸光が≦１
．０になるまノで洗浄する。

マイトジェンと吸着したたんば〈質の溶出はＮａＣｊ濃
度勾配により吸着しているイオン交換ゲルを２日間溶出
する。濃度勾配は０．０４から２．０ｍｏ１／　ｌ　Ｎ
ａ（Ｊまで直線的に上昇するが、−、トリス／ＨＣＪ、
およびシスティン濃度は一定に保たれる。同じ形の濃度
勾配は、その化合物を更に溶出するためにｐＨ１８から
６．５に下げるのに用いる。

これは、２．Ｏｍｏｌ　／　ｌ　Ｎａ（Ｊ、０．００１
　ｍｏｌ／ｌシスティンを含み、ｐ）（６，５の０．０
１　ｍｏ：ｌ　／　ｌ　ヒヘラシンーＨＣＪ、−緩衝液
によって作られる。

マイトジェンを含む分画は別々に分取される（　ＭＢＧ
　、　ＧＢ（）　、　ＭＨＭおよびＬＬＭはこの段階で
分別される）。したがってこれらは以下に記する精製段
階（Ａ、３．２−　Ａ、３．６　）において別々に処理
される。

ａ、　５．２．　　分取分子ｌｌ濾過 分画（Ａ、３．１．　）中のたんばく質を硫酸アンモニ
ウム沈澱によシ塩析沈澱した後、ＭＢＪ　、　ＧＢＧ　
。

ＭＨＭ　、またはＬＬＭ　ｉ含むたんばく質の沈澱は、
最少量の緩衝液０　（０，５ｍｏｌ　／　ｌ　ＮａＣｊ
、０．００１ｍｏｌ　／　ｌ　システィンｆ含み、ｐ）
４７．４の０．００３ｍｏｌ　／　ｌリン酸ナトリウム
・カリウム）に浴がｔ遠心分１１１ｆＫＪニジ少量の不
溶性物質を除い′ｆＣ後、この溶液を分取分子篩・濾過
のためにアクリルアマイＰと架橋構造をもつアがロース
（ウルトロデルＡＣＡ　３４、粒径６０６０−１６０ｐ
の分子篩カラムにかける。カラムの体積は、たんば〈質
溶液の１０倍で、長さと直径の比Ｉ／ｉ２０：１である
。カラムは前述の緩衝液Ｃを用いて逆流法により（３ｃ
ｍ／ｈ）溶出する。ＭＢは分離限度２０．００および３
０，０００げルトン、ＧＢＧは分離限度７０，０００オ
ヨびｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、ＭＨＭｔｌｊ：１０，０
００オ！び１６．０００、ＬＬＭは１４，０００および
２０，０００Ｐルトンの分画によりそれぞれ分取する。

たんば〈質のａｍは、こｎらの分画を凍結乾情、排除限
界５００ドルトンの膜による限外濾過、または硫酸アン
モニウム濃度を３．７　ｍｏｘ　／　ｌに調整すること
によって行なう。この場合、たんはく質の沈澱は遠心分
能によって上澄と分離し、以下（Ａ、３．３）のように
処理する。

Ａ、３．３．　　カーＦ−オン交換クロマトグラフィー
生成したＭＢＧ　、　ＧＢＧ　、　ＭＨＭまたはＩ、Ｌ
Ｍを含むたんばく質の沈澱＜　Ａ、３．２　）は、１．
５倍量の緩衝液Ｄ　（０，０１ｍｏｌ　／　ｌリン酸ナ
トリウム・カリウム、０．０４　ｍｏｌ／　ｌ　ＮａＣ
ｊ、、０．００１　ｍｏｌ　／　ｌシスティン、ｐ）１
６．０）に溶解する。これらの溶液は、１０．０ＯＯＸ
、９で１時間遠心分離して少量の不溶性物質を除く。

澄明となった溶液は、排除限界５００「ルトンの膜を用
い、硫酸イオンが検出されなくなるまで緩衝液りに対し
て透析する。得られた澄明な液は、膨潤、再生させたエ
ピクロルヒドリンと架橋構造をもつデキストランを基材
とするカチオン交換体（ＯＭ−セファデックスＣ３０）
のカラムにかける。この交換体は上記の緩衝液Ｄ（可動
な交換さ扛るイ°オンｉＮａ”）に対して平衡に達して
いる。

このカラムの体積に当該たん白質液の４倍で、長さと直
径の比は１０：１である。このゲルのカラムは、引きつ
づきｐ液の２８０　ｎｍにおける吸光が１．０以下にな
るまで上記の吸着用緩衝液りで洗浄する。この段階で、
ＭＢＧ　、　ＭＨＭ　、およびＬＬＭが溶出される。

ＧＢＧとその他の吸着したたんばく質の溶出は、これら
を吸着しているイオン交換ゲルを、食塩濃度勾配で２日
間溶出する。この勾配は、０．０４から２．０　ｍｏｌ
　／　ｌ　ＮａＣ２の範囲で直線的に上昇し、−、リン
酸塩濃度およびシスティン濃度は一定である。その後の
溶出にはリン酸塩濃度に０．０１から０．５　ｍｏ１／
　ｌに増加する用じ形の勾配を用いるが、−１食塩（２
ｍｏｂ／／　）およびシスティン一度は一定に保たれる
。

ＭＢＧ　、　ＧＢＧ　、　ＭＨＭまたはＬＬＭを含む分
画が常法により捕集され濃縮されて、下記のようＶこ（
Ａ、、５゜４）処理される。

Ａ、６．４．　　ヒＰロキシ　アパタイトによるクロマ
トグラフィー マイトジェンを含むたんばく質の沈澱は、［Ｊ、００１
　ｍｏｌ／Ａ’のシスティア’ｆｆ含み、ＰＨ７，２０
の０．０００１　ｍｏｂ／／のリン酸ナトリウム・カリ
ウム緩衝液Ｅの最少量りことかす。この溶液に、この緩
衝液を用い、分子篩涙過、限外沖過、または透析（排除
限界＝５００ドルトン）によって透析緩衝液中に硫酸イ
オンを検出しなくなるまで脱塩する。その後、少量の不
溶物ｔｗ１０，０ＯＯｘ４１時間の遠心分離により除去
する。

得られた澄明なＭＢＧ　、　ＧＢＧ　、　ＭＨＭま良は
ＬＬＭを含むたんばく質溶液は、ヒげロキシアパタイト
のカラムにかける。カラムの長さと直径の比は１０；１
で、体積はこれにかけるたんばく質溶液の４倍である。

このカラムは、カラム体積の５倍量の前記緩衝液Ｅに対
して平衡に達せしめである。

（流速は３ｃｍ／ｈ）。

吸着しないたんばく質は、カラムを平衡させた緩衝液Ｅ
で洗浄流出し、ＭＢＧ　、　ＧＢＧ　、　ＭＨＭまたは
ＬＬＭｔ含む分画の浴出は、リン酸塩濃度勾配によって
４日間行なう。この勾配は、リン酸ナトリウム、カリウ
ム濃度０．０００１　ｍｏ１／　ｌ　−０，５ｍｏ１／
ｌの範囲で直線的に上昇し、Ｐ）′１７．４およびシス
ティン濃度は一定でおる。ＭＢＣは平均リン酸塩濃度０
．００３　ｍｏｌ／ｌで、ＧＢＧは約０．１ｍ０１／ｌ
で、ＭＨＭは約０．００６　ｍｏ１／ｌで、そしてＬＬ
Ｍは約０．０１　ｍｏｌ／　ｌで溶出される。この溶出
濃度勾６ｅは電導度によって測定、制御される。マイト
ジェンを含む分画は常法によって濃縮し、更に下ｉ己（
Ａ、３．５．）のように処理する。

Ａ・６・５・　ゾーン沈澱クロマトグラフィーマイトジ
ェンを含む分画け、０．１　ｍｏｌ／　ｌの食塩、０．
００１　ｍｏｌ／ｌのシスティンおよび１ｍ０１／ｌの
硫酸アンモニウムを含み、ＰＨ７，４の０．１ｍ０１／
ｌリン酸ナトリウム・カリウム浴液Ｆにと力）す。この
溶液ヲエビクロルヒげリンと架橋構造をもつデキストラ
ン金基材とする膨潤させた分子篩（セファデックスｅ−
２５）のカラムで４℃で処理する。

このカラムの中では、硫酸アンモニウムａ度１．［ｌ−
４，０ｍｏｌ／ｌ（２５−１００％飽和）の可動緩衝液
相によって、硫酸アンモニウムの直線的上昇濃度勾配が
形成されている。こぐ）勾配に、カラム高さ１ｃｒｎ当
り硫酸アンモニウム飽和度＋２％（０，０８ｍｏｌ　／
　１（ＮＨ４）２ｓｏ、　／（ｚ　）である。この勾配
をもつ範囲は、カラム。長さの約牛分に１ｊｌＡ、でい
る。

カラムの長さと直径の比は５０：１で、カラムの体積は
、これにかけるたんば〈質溶液の体積の１００倍以上で
ある。流速ｔｄ　２　ｃｍ　／　ｈである。

溶出には１　ｍｏ１／Ｊ　（ｙ）硫酸、アンモニウムを
含む上記のリン酸ナトリウム・カリウム液７１に用いる
。

硫酸アンモニウム飽和度それぞれ７２　％　（ＭＢＧλ
５２％（ＧＢＧ　）、６５　ｑＩｂ（ＭＨＭ　）および
６１％（ＬＬＭ　）で溶出されるマイトジェンを含む分
画を捕集する。

各たんばく質は常法で濃縮し、下記（Ａ、３．６．）の
ように更に処理する。

Ａ　、　３　：６　、　　分　的外循環分子篩濾過マイ
トジェンを含む分画は緩衝液Ｃ（０，５ｍｏｌ／１Ｎａ
ＣＪ、　　と°０．００１　ｍｏｌ／　ｌシスティンを
含む−７，４の０．００３　ｍｏｌ／ｌ　　リン酸ナト
リウム・カリウム）にとかす。少量の不溶物は４８，０
ＯＯＸ、９で６０分間遠心分離して除去する。

生成した澄明な浴液は、更に分析的再循環分子篩クロマ
トグラフィーにかける。この目的のために溶液は粒径６
０−１４０μｍのウルトロデルＡｃＡ　４４のカラムに
４°Ｃでかける。カラムの体積は、たんば〈實溶液の５
０倍、長さと直径の比は５０：１である。溶出は前記緩
衝液Ｃで行なう０浴出液は分離限界３０，０００げルト
ン（ＭＢＧ　）、１００．０００）Ｆル）ｙ（（）Ｅｌ
（）　）、２０，０００　ｈルトン（ＭＨＭ　）または
２４，０００ドルトン（ＬＩ、Ｍ　）のいずれかで６回
循環させる。通常のたんばく濃縮の後、約６〜のＭＢＧ
　、約８９のＧＢＧ　、約６〜のＭＨＭ　、および約５
９のＬＬＭが得ら扛るこれらのマイトジェンは通常の方
法によれば９５％以上の分子的均一性がある。

つぎのフローシートに、本発明のマイトジェン調製の上
記方法′ｌｔ図式的に示す。

白血球由来のマイトジェンの生物工学的精製法のフロー
シート 単核　プラストジエン 顆粒球　プラストジエン 単極ヒスチオマイトジェン リンパ球すンフオマイトジエン 例Ｂ　生育し得る単核細胞培養の上澄液からのマブタノ
血液から得られ＊　３．５　ｋ＆（約７　ｘ’　１０１
２）の単核細胞を例Ａに記載した条件下に培養する。

培養中に培養液中の多価マイトジェンが細胞の有糸分裂
を誘導する。

培養液中に分節されたＭＢＧおよびＭＨＭは、例Ａに記
載されている方法で分離される。こうしてこれらは極め
て純粋な状態で得られる。収量は例Ａにおけるものとほ
ぼ等しい。

例Ｃ炎症組織部位からのマイトジェンの調製炎症組織か
らのマイトジェンの調製および単離に関して記載する。

５００ｇの梗塞し炎症奮起したイヌの心筋組織を用いる
。心筋組織ｔｏ−４°Ｃで摩細する。０．００１　ｍｏ
ｌ／Ｊのシスティンを含みｐｉ（６，８の０．０５　ｍ
ｏｌ／ｌのり７ｆＲナトリウム・カリウム緩衝＃を当該
組織の６倍蓄加え、生じた懸濁液は、ホモジナイず−（
ウルトラツラツクス）で均質化する。それから、この炎
症組繊の可溶部分を含む上澄ｔ、１０，０００ｘ、９．
４℃で遠心分離して不溶部分から分離する。この上澄部
は更に１００，０００　Ｘ　、！ｉ’で６時間遠心分離
する。得られた澄明な上澄液は、浮遊している脂質層か
ら吸引法により分離する。

このマイトジェンを含む澄明な上澄たんばく溶液は、例
Ａの方法で硫酸アンモニウムの分画塩析沈澱に付する。

得られたたんばく分画■は例Ａに記載の方法で処理する
。マイトジェンは、５ｏ。

、ｐｏ組織カラＭＢＧ　ｄ−約ｏ、ｏ　２　ｔｎｇ、Ｇ
ＢＧ　ｄＥ　約Ｑ、［］　４ダ、ＭＨＭ　カ約０．０２
　ＩＱ、ＬＬＭ　７ｂｘ約０．０３　ａｖノ収量で得ら
れる。

調製 白血球は血液から例Ａの方法で調製される。

５００ｇの白血球のホモデネートは、筋肉組織に関する
例Ｃのようにして調製する。白血球に含まれるマイトジ
ェン単離は例Ａの方法で行なう。無刺激培養で得た白血
球でに、比較的少量（約１％）の単核およびリンパ球マ
イトジェンを含む。収量は、ＧＢＧ約５μ、９．ＬＬＭ
約１μ、９．ＭＧＢ約１μｙ１

【図面の簡単な説明】

第１図はモノサイト　プラストジエン水溶液の吸収スペ
クトル〔２０℃、吸光スケール：　（０−１００）、Ｅ
＝０−２、セル厚み：ｄ−１ｃｍ〕であり、 第２図は顆粒球プラストジエン水浴液の吸収スペクトル
〔２０℃、吸光スケール：（０−１００）、Ｆｉ＝０−
２、セル厚み：　ｄ＝　１　ｃｍ　）であり、第６図は
単核細胞ヒスチオマイトジェン水溶液の吸収スペクトル
〔２０℃、吸光スケール：（〇−１００）、Ｅ＝０−２
、セル厚み：　ａ　＝　１　ｃｍ　）であり、 第４図はリンパ球すンフォマイトジエン水溶液の吸収ス
ペクトル〔２０℃、吸光・スケール：（〇−１００）、
Ｅ＝０−２、セル厚み：　ａ　＝　１　ｃｍ　〕であシ
、 第５ａ図は欧州薬局方１９７５年第■巻Ｖこよる標準発
熱源検定〔ウサギの直腸温度単核細胞ヒストマイトジエ
ｙ（ＭＨＭ　）３０μ、９　（１，３ｍｍｏ１ＭＨＭ　
／　ｋｇ動物体重相当）の血管的投与Ｖ、　Ａ　：投与
前、＊：投与中、Ｐ：投与後〕でおり、第５ｂ図は欧州
薬局方１９７５年第■巻による標準発熱源検定しウサギ
の直腸融度単核細胞ヒストマイトジェン（ＭＨＭ　）ろ
Ｏｌ’ｆ／　（１，３ｎ　ｍｂＩＭＨＭ　／　ｋｇ動物
体重相当）の血管的投与Ｖ　、Ａ：投与前、＊：投与中
、Ｐ：投与後〕であり、第５Ｃ図は欧州薬局方１９７５
年第■巻による標準発熱源検定（ウサギの直腸温度単核
細胞ヒストマイトシェフ（ＭＨＭ　）３０μ、９　（１
，３ｍｍｏ１ＭＨＭ　／　ｋｇ動物体ｌ相当）の血管的
投与Ｖ、　Ａ　：投与前、＊：投与中、Ｐ：投与後〕で
ある。 代理人　洩　　村　　　皓 外４名 細胞一　０ｍ ＦＩＧ、　　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ 細胞會面 ＦＩＧ、　４ ＶＶＶＶＡＡ等Ｐ　沁憩曹た訓話台自 −一　−一　！−Ｎ　Ｃ１ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和Ｖ年持許願第幻／２ケ　号 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補１Ｆ命令の日付 昭和ｊ／年７ｇ月２２日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の（−１３（内容−二友更なし） ＆補正の内容　　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 口）下記の性質を特徴とする白血球および炎症組織のマ
   イトジェンであって、 ａ）生体内および試験管内での生物的活性としてはニ ー骨髄および／ｌたは組織の白血球の分裂および分化（
   有糸分裂）を選択的に誘導すること、 −これらは本質的に、他の生物的効果をもたないこと、 ｂ）物理化学的性質としてはニ ーｐ８７．４０でアクリルアミドデルによる電気泳動が
   、アノード方向であり、 一少なくともｐＨ４，０から１０で、１０％エタノール
   を含む水性−系に可溶であり、 −構造的にも生物活性的にも可逆的に、アニオンおよび
   カチオン交換樹脂、燐酸カルシウム　デル、およびヒド
   ロキシアパタイトにｒｔｌｌＬ、かつ容量分配クロマト
   グラフィーにかけることができることを特徴とする、上
   記マイトジェン。 （２）　　単核白血球より得られ、以下に示す附加的性
   質： ａ）生物学的効果としてはニ ー骨髄白血球の分裂および分化を選択的に刺激し、 一試験管内における有効投与閾値が、５゜ｐｍｏｌ／Ａ
   未満であり、 ｂ）物理化学的性質としてはニ ー非変性たんばくの分子量（−次構造）が約２５．００
   ０ドルトンであり、 −９０％飽和（５，６ｍｏｌ　／看）の研酸アンモニウ
   ム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視、および近赤外部での）
   が、図１に示す通りであり、−吸光係数が表１の通りで
   あり、 表　　１ ２４８（極小）　　　　　　　　０．２３２６０　　　
   　　　　　　　　　　　　　　０・３６２７６（極大）
   　　　　　　　　０．５６２８０　　　　　　　　　　
   　　　　　　　０．５５２９０　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　０．３８４００−１０００　　　　　　
   　　　　　　０Ｅ２ｅｏ／Ｅ＋６ｏ　　　　　　　　　
   　　　１．５３を有することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載のマイトジェン（モノサイト−プラストジ
   エン）。 （３）顆粒性白血球（ゲラニューロサイト）から得られ
   、下記の附加的性質： ａ）生体内における生物活性がニ ー骨髄白血球の分裂および分化を特異的に刺激し、 一試験管内での有効投与閾値が５ｎｍＯ１／Ｊ３未満で
   あり、 ｂ）物理化学的性質がニ ー非変性たんばく（−次構造）の分子量が約８５．００
   ０ドルトンであり、 −９０％飽和（３，６ｍｏｌ　／Ａ　）の硫酸アンモニ
   ウム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視、近赤外部での）が図２
   に示す通りであり、 一吸光係数が表２の通りであり、 表　　２ ２５１（極小）　　　　　　　　０．２２２６０　　　
   　　０．３０ ２８’ｔｌ　　　　　　Ｏ，５５ ２８１（極大）　　　　　　　０・５６２９０　　　　
   　０．４１ ４００−１００００ Ｅ、ｓｏ／Ｅ＋２６ｏ　　　　　　　　　　　　１．８
   ３を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   のマイトジェン（ゲラニューロサイト−プラストジエン
   ）。 （４）単核白血球より得られ、下！己の附加的な性質：
   ａ）生物的活性としてはニ ー腹膜マクロファージの有糸分裂を特異的に刺激し、 一試験管内での有効投与閾値がｌ　ｎｍｏ１／１３未満
   であり、 ｂ）物理化学的性質としてニ ー非変性たんばく質（−次構造）の分子量が約１３，０
   ００ドルトンであり、 −９０％飽和（３，６ｍｏｌ／Ｊａ　）の硫酸アンモニ
   ウム溶液に不溶であり、 一吸収スベクトル（紫外、可視、近赤外部での）が図６
   に示す通りであり、 一吸光係数が表３の通りであり。 表　　３ ２５２（極小）　　　　　　　　０．２０２６０　　　
   　　０．２７ ２７９（極大）　　　　　　　　０．５６２８０　　　
   　　０．５６ ２９０　　　　　０．４６ ４００−１０００　　　０ Ｅ２８０／Ｅ２６０　　　２・０７ を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   マイトジェン（モノサイト−ヒスチオマイトジェン）。 （５）　リンパ球から得られ、下記のような附加的な性
   質： ａ）生物活性としてニ ー末梢リンパ球の有糸分裂を特異的に刺激し、−試験管
   内での有効投与閾値が０．５　ｎｍｏｌ／Ｊ１３未満で
   あり、 ｂ）物理化学的性質としては： −非変性たんばく質（−次構造）の分子量が約１７，０
   ００げルトン、 一９０％飽和（３，６ｍｏｌ、／、＃　）の硫酸アンモ
   ニウム溶液に不溶、 一吸収スベクトル（紫外、可視、近赤外部での）が図４
   に示す通りであり、 一吸光係数が表４の通りであり、 表　　４ ２５２（極小）　　　　　　　　　　　０．３２２６０
   　　　　　０．４１ ２８０　　　　　０．７８ ２８２（極大）　　　　　　　　　　　０．７９２９０
   　　　　　０．６１ ４０［］−１００００ Ｅ２８０／’Ｆ’２６０　　　１・９０を有することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載のマイトジェン（
   リンフオサイド　リンクオマイトジエン）。 （６）　　白血球または炎症組織をホモジナイズする乃
   ・または白血球を培養し、そしてホモジネートまたは上
   澄培養液からマイトジェンを単離することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項記載の
   マイトジェンを製造および分離する方法。 （７）特許請求の範囲第２項から第５項に係るマイトジ
   ェンを得るにあたり、混合白血球集団または、それぞれ
   の集団の一部を培養し、培養の過程において細胞の有糸
   分裂をＣＯＨにより任意に誘導し。 培養終了後、硫酸アンモニウムを９０％飽和に達するま
   で培養液に加え、沈澱したたんば〈質を硫酸アンモニウ
   ムを含む上澄から分離し、再び溶解してアニオン交換ク
   ロマトグラフィー、分取分子篩濾過、カチオン交換クロ
   マトグラフィー、ヒドロキシアパタイトによるクロマト
   グラフィー、・ｌ−ン沈澱クロマトグラフィおよび、カ
   スケード分子篩濾過によって精製することを特徴とし、
   かつ随伴するたんばく質を分離した後に、カスケード分
   子ｍ＃過の溶出液中にマイトジェンをきわめて純度の高
   い状態で単離するこ−とを特徴とする特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 （８）特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項
   に記載のマイトジェンを少なくとも１箇含み、まｆｃは
   少なくとも１箇の抗−マイトジェン　イムノグロブリン
   と、通常の担体、補薬および添加物を含むことを特徴と
   する、哺乳動物体の防御状態、白血球形成、および炎症
   過程に特異的影響を与える薬剤組成物。 （９）特許請求の範囲第１項から第５項に係るマイトジ
   ェンを誘導する少なくとも一つの白血球の分裂および分
   化の使用法、および唾乳動物体の防御状態、白血球形成
   、および炎症過程に、選択的に影響を与えるすくなくと
   も一つのアンティマイトジェン　イムノグロブリンの使
   用法。