JPH0536026B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、動物細胞または動物細胞由来の細胞
を培養する無血清または低タンパク質濃度の培地
に関するものであり、乳および／または乳の成分
を含有することを特徴とする脂肪培養用培地に関
するものである。 動物細胞および動物細胞由来の細胞には、抗
体、インターフエロン、インシユリン、酵素など
の有効物質を産生するものが知られており、その
細胞を培養することによつてこれらの有効物質を
得ることの実施または試みがなされている。従来
よりこれらの細胞を培養するためには、ほとんど
の場合、培地に血清を添加することが必要であ
る。血清としては、一般に牛胎児血清、子牛血清
などが用いられており、添加量は通常10％程度で
ある。しかし、これらの血清は高価であること、
品質が一定しないこと、供給に制限があることな
どの難点がある。また、血清はタンパク質などの
多種多様な成分を含んでいるため、培養物から有
効物質を分離する場合に分離、精製が容易でな
い。 本発明者らは、これらのことを解決すべく研究
を重ねた結果、低タンパク質濃度さらには無血清
の培地で細胞増殖が可能なことを見いだし、本発
明を完成したものである。 乳は、例えば人乳、畜乳（牛、山羊、羊、馬な
ど）であり初乳、成乳を問わず用いることができ
る。乳を遠心して得られる溶液画分（以下乳の遠
心溶液画分と略す）は、乳を例えば２万×ｇで遠
心して得る。分子量分画は、例えばSephadex Ｇ
−200（Pharmacia Fine Chemicals）または
Cellulofine GC−700（生化学工業株式会社）など
を用いるゲルろ過法により行う。そのとき用いる
平衡化および溶出用溶液は、例えばリン酸緩衝化
生理食塩水、100mM Na−Hepes緩衝液（PH
7.4）、水などである。ラクトフエリンは、例えば
Lo¨nnerdalらの方法（Lo¨nnerdal，B.，Carlsson，
J.，and Porath，J.（1977）FEBS Lett.75，89−
92）で精製する。本発明の細胞培養用培地は、こ
れらのものを通常の動物細胞の培養に用いられる
基礎培地（血清を含まない）に添加して用いる。 また、これらの乳および／または乳の成分と、
ローヤルゼリーおよび／またはローヤルゼリーの
成分、胎盤血の分子量５−８万の画分の中より１
種以上を基礎培地に添加して用いることもでき
る。ローヤルゼリーの成分は、以下のようにして
得る。ローヤルゼリーの分子量20万以上の画分お
よび分子量５−８万の画分は、乳の分子量分画と
同様の方法で得ることができる。ローヤルゼリー
の分子量約58000のタンパク質（以下ローヤルゼ
リータンパク質と略す）は、例えば以下のように
して精製する。ローヤルゼリーをリン酸緩衝化生
理食塩水で２倍に希釈後、それに対し透析する。
透析後、２万×ｇで遠心し、得られる上清を乳の
場合と同様の方法で分子量分画し、５−８万の分
子量画分を得る。この画分を1mM Tris−HCl緩
衝液（PH8.0）に透析後、同様の緩衝液で平衡化
したBlue Sepharose（Pharmacia Fine
Chemicals）にかけ、素通り画分すなわちローヤ
ルゼリータンパク質を得る。また、ヒト胎盤血の
分子量５−８万の画分（以下ヒト胎盤血画分と略
す）については、例えば胎盤から自然にしみ出た
血液を２万×ｇで遠心し、その上清を更に上記の
方法で分子量分画し得ることができる。 本発明培地の基礎培地としては、一般の動物細
胞の培養に用いられるものであればいかなるもの
も用ることができる。例えば、Dulbecco's
Modified Eagle medium（以下D'MEMと略す）、
Ｆ−12、RPMI−1640などの基礎培地、また、こ
れら基礎培地にインシユリン（２−10μｇ／ml）、
セレニウム（10^-11−10^-8Ｍ）、トランスフエリン
（10−35μｇ／ml）、核酸前駆体（例えばチミジ
ン、ヒポキサンチンなど、10^-6Ｍ程度）、血清ア
ルブミン（50−400μｇ／ml）などを添加した培
地も基礎培地として用いることができる。本発明
の培地に添加する乳は、0.1〜５％（タンパク質
の最終濃度は７−350μｇ／ml）、好ましくは0.5〜
２％の範囲にすることが望ましい。乳の遠心溶液
画分については７−350μｇ／ml、分子量20万以
上の画分については１−100μｇ／ml、分子量４
−９万の画分については１−150μｇ／mlおよび
ラクトフエリンについては0.5−50μｇ／mlが望ま
しい。その他のローヤルゼリー、ローヤルゼリー
の成分および胎盤血画分については10−300μ
ｇ／mlであることが望ましい。 本発明培地は、繊維芽細胞、リンパ芽球細胞な
どの動物細胞の培養に用いることもできるが、リ
ンパ球由来細胞などの動物細胞由来の細胞の培養
に最も好適に用いられる。本発明の培地を用いれ
ば血清を大量に添加した従来の培地にほぼ匹敵す
る細胞増殖を得ることができる。そして従来の培
地と比べ、安価であり、特に牛乳および／または
その成分を用いる場合には非常に安く培養が可能
である。また、血清を10％添加した場合の培地中
のタンパク質濃度が３mg／ml以上であるのに比
べ、本発明の培地は0.4mg／ml以下と低タンパク
質濃度であることから、有効物質産生に本発明培
地を用いることにより有効物質の分離、精製が容
易となる。更に、本発明培地は分子量的に分画し
た画分を添加することも可能であることから、有
効物質の分子量により使いわけて用いることもで
きる。例えば抗体（分子量15万以上）を産生する
細胞を培養する場合には、ラクトフエリンおよ
び／または乳の分子量４−９万の画分と、要すれ
ばローヤルゼリーから分離、精製した分子量約
58000のタンパク質、ローヤルゼリーの分子量５
−８万の画分、胎盤血画分を必要に応じ加え、用
いるなどのように行う。更に、ヒトラクトフエリ
ンなどの人乳成分および／または人乳と、要すれ
ばヒトの胎盤血画分を添加した培地でヒトの細胞
を培養する場合には、培地中の成分がすべてヒト
由来であることから、培地中に産生した有効物質
を完全に精製しなくともヒトに投与可能であると
いう利点を有する。 以下に実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 健康人の末梢リンパ球株細胞（Bri7）の10⁵個
細胞を、第１表に示す添加物をD′MEM／Ｆ−12
（１：１）に添加した培地２mmに、植え込む。５
％CO₂，37℃の条件下で３日間培養を行つた。得
られた結果は第１表に示すとおりである。

【表】 なおD′MEM／Ｆ−12に添加物としてヒトラク
トフエリン単独、ヒトラクトフエリンおよびロー
ヤルゼリータンパク質、ヒト血清アルブミンおよ
びラクトフエリン、ヒト血清アルブミンとラクト
フエリンおよびローヤルゼリータンパク質の４種
をそれぞれ加えた培地で30日間以上継代培養して
もそれぞれの増殖速度に変化がみられなかつた。
このことは永続的に継代培養することが可能であ
ることを示している。 実施例 ２ Epstein−Barr Virusでトランスフオームした
ヒト由来のリンパ細胞（NL−matsumoto）につ
いて実施例１と同様にして培養を行う。得られた
結果は第２表に示す通りである。 第２表 添加物の 培 地 最終濃度 細胞数 (μｇ/ml) (個) D′MEM／Ｆ−12 0.9×10⁵ ＋ヒトラクトフエリン 10 7.4×10⁵ ＋ヒト血清アルブミン 200 4.0×10⁵ ＋ヒトラクトフエリン 10 7.8×10⁵ ＋牛胎児血清、20％ 6400 8.2×10⁵

【特許請求の範囲】

１ ローヤルゼリーを水若しくはリン酸緩衝化生
理食塩水で抽出した後透析した画分若しくはロー
ヤルゼリー蛋白質のうち分子量20万以上の画分若
しくは分子量５−９万の画分好ましくは分子量
58000の画分から選択したローヤルゼリーの成分
および／またはローヤルゼリーを含有することを
特徴とす細胞培養用培地。 ２ ローヤルゼリーを水若しくはリン酸緩衝化生
理食塩水で抽出した後透析した画分またはローヤ
ルゼリー蛋白質の分子量20万以上の画分若しくは
分子量５−９万の画分好ましくは分子量58000の
画分から選択したローヤルゼリーの成分および／
またはローヤルゼリーと、乳を遠心分離して得ら
れる溶液画分、乳蛋白質の分子量20万以上の画分
若しくは分子量４−９万の画分またはラクトフエ
リンからなる乳の成分、乳、胎盤血の分子量５−
８万の画分から選択した添加成分とを含有するこ
とを特徴とす細胞培養用培地。