JPS58501968A - 組織学的検査用染料組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織学的検査用染料組成物 本発明は組織学的検査用の新規な染料組成物に関する。

組織学的検査は薬理学的活性物質の研究、生物科学的研究および治療上で基本的 役割を演じる。信頼できる組織学的診断は成る種の病気および障害の処置を成功 させるために無視できない必須条件であり、癌組織の早期確認は特に重要である 。

組織学的検査法は評価が容易な信頼できる結果を与えなければならない。さらに また、検査法は特別の設備および訓練を必要とすることなく、その実施が迅速で 、単純でそして容易でなけれはならない。

従来既知の組織学的染色方法は全ての観点てこれらの要件を満していない。既知 の染色方法の大部分は実施が困難であり、時間がかかり、そして特別の注意が必 要であり、提供される情報はしはしはあいまいである。たとえは、組織染色用に 最も広く慣用されている方法であるヘマトキシリン−エオシン試１験は切片標本 の凍結および固定にわたって約９０〜１２０分を必要とし、生じる組織学的画像 は顯著な細胞学的障害の場合にたけ、適切に評価できるものである。その他の方 法では重大な誤認の危険を含むおおよその診断でさえも、数年の専門的訓練後に 得られるてすきす、また多くの場合に、−準比較標本に頼らねばならない。

ここに、予想外に、本発明による新しい染料組成物が広範な組織学的検査を従来 に比較してさら（（迅速に、単純にそして安全に実施可能にし、生じる組織学的 画像はいずれか染料の専門的研究または訓練を必要としなくても、従来に比較し てさらｊ（信頼できる診断を提示できることが見い出された。本発明による新し い染料組成物を使用すると、従来、直接染色法では検出できなかったか、または 如何にしても検出できなかった組織学的変化を容易だそして安全すて認識できる 。

本発明は組織学的検査用の新しい染料組成物に関し、（１，１チオニン（カラー インデックス５２．ｌ］　００　）、トルイジンフ）レー（カラーインデックス ５２．０４０）およびジメチルチオニン〔アズール（−”−ｚ：ｉｒ’）　−４ −）から選ばれる１種まだはそれ以上のチオニ／染料１モル割合とレゾル／ノド なくとも０．２モル割合とを高めた温度で相互作用させることにより生成される 生成物、 （２）　レゾルシンと相互作用させるチオニン染料の１モル当りで計算して、０ ．５（町７１ｖｉ、、、　）〜２（へ吋／１鎖）モルの染料ｒ　Ａ　Ｊ、 （３）　レゾルシンと相互作用させるチオニン染料の１モル当りで計算して、０ ．５　（ｌ匂／ＭＢ）〜２　（１Ｖｉｒ／１ＡＢ）モルの染料「Ｂ」、よりなり 、ここで染料ＩＡＪおよび染料「Ｂ」は色およびｐＨで異なるアルカリ性染料で あり、そして染料「Ａ」および染料「Ｂ」は両方共に、色およびｐＥ（で類似の アルカリ性染料の混合物であることができ、ＭＴはチオニン染料の分子量であり 、 ＭＡは染料ｒＡＪの分子量であり、そしてＭＢは染料ｒＢＪの分子量であるか、 まだはチオニン染料、染料ｒＡＪおよび染料ｒＢＪのいずれかが２種以上の物質 の混合物である場合に、ＭＴ、ＭＡおよびＭＢはチオニン染料、染料ｒＡＪおよ び染料ｒＢＪの成分の分子量の重量平均値をそれぞれ表わす、ものである。

染料「Ａ　ｊおよび「Ｂ」はその上、分散度か異なっていると好ましい。染料「 Ａｊまたは染１４　ｒ　ｐ　Ｊが染料の混合物である場合に、類似の分散度を有 する染料を使用して混合物を形成すると好ましい。

本発明による染料組成物の基本的成分はチオニン染料とレゾルシンとの高めた温 度ておける相互反応により生成される生成物である。チオニン染料１モルをレゾ ルモノ少なくとも０．２モルと高めた温度（好１しくは７０〜１２０℃）で短時 間接触させた場合に、原料チオニン染料とは染色特性か異なる新しい物質が得ら れることか見い出された。チオニン染料をレゾルノンと加熱することなく（たと えば、室温で）混合した場合に、チオニン染料の染色特性か変化しないことかま た見い出された。これだ基づいて、化学的相互作用はチオニン染料とレゾルシン との間に高めた・黒度で生起するものと見做される。しかしながら、生成物の本 質（均一分子、異なる反応生成物の混合物、付加物、複合物等）は未知である。

チオニン染料１モルて対しレゾルシン１〜５モルを使用すると好ましい。我々の 予備的実験に基づき、レゾル７７３〜４モルがチオニン染’Ｍ１モルとの完全相 互作用の達Ｆｙ、テ要求されるものと見做される。最上の結果はチオニン染料１ モルに対しレゾルシン３〜４モルを使用した場合］て得られる。

しかしながら、本発明による染料組成物は、チオニン染料全しソゞルノン１モル に対してチオニン染料の５モルより多くない過剰量で存在さぞｔ場合尾、迅速で １頼でさる検査の実施を可能にするうレソゞルンンの過剰（ま染色を全く妨害し ないか、し・グルノンを過剰：て使用することは経済的でない。

前記したように、チオニン染料はレゾル／ノド高めた温度で接触させろ。相互作 用は５０°Ｃでさえも進行するか、これらの原料物質を７０〜１２０℃のような さらだ高い温度で接触させると好ましい。相互作用（１はとんど即時（（進行す る。すなわち、だ゛とえは原料物質を相互に水浴液中で接触させる場合にｊＬ′ ｉ、浴液を数秒間部とうさせると十分である。反応媒質としては、原料物質を溶 解できるいずれの不活注液体も１更用できる。「不活性」なる用語はこの液体が 原料物質のいずれとも反応しないことを意味する。最も好適な反応媒質は水であ る。

染料「Ａ」およびｒＢＪは前記定義の相互反応生成物のカラー効果の測定を容易 にするアルカリ性バックグラウンド染料である。前記したように、染料「Ａ」は 単一のアルカリ性染料まだは色、ｐＨおよび好ましくはまた分散度で類似するア ルカリ性染料の混合物でありうる。染料ｒＢＪについても同じことが言える。

しかしながら、染料「Ａ」（まだは染料混合物「Ａ」）が染料「Ｂ」（または染 料混合物「Ｂ」）と色、ｐＨおよび好ましくは１だ分散度の点で異なっていなけ れはならないことか基本的要件である。

これらの染料は、 一光吸収最犬匝の差違がΔλ−５μｍを越ないこと、および −ｐＨにおける差違が１．０を越ないこと、について類似しており、他方これら の染料は、 −光吸収最大匝の差違か少なくともΔλ−１０μｍであること、および −ｐＨにおける差異が少なくとも２．０であること、について異なっている。

このアルカリ性染料の類似点または相違点の観点から、色は最も決定的な因子で ある。すなわち、たとえは暖色（赤、オレンジ、黄）の染料またはこのような染 料の混合物を染料ｒＡＪとして使用する場合には、寒色（緑、青）の染料まだは このような染料の混合物だけを染料ｒＢＪとして使用できる。

染料ｒＡＪとしては、たとえばサフラニン（カラーインデックス５０，２４０） および（または）Ｖ口二ン（Ｐｙｒｏｎｉｎ）　Ｉ　（カラーインデックス４５ ，００．−５　）を、染料ｒＢＪとして、たとえはアルシアン　グルー（Ａｌｃ ｙａｎ　ｂｌｕｅ）　８　ＧＸ　（カラーインデックス７４，２４０　）および （まだは）リヒト　グロン（Ｌｉｃｈｔ　Ｇｒｉｉｎ）　（カラーインデックス ４２，０９５　）とともて使用すると好ましい。

２種のバンクグラウンド染料＋ｉ口、　ｓ　＜　ｕＡ／　ＭＢ　）〜２　（ＭＡ 　／　ＭＢ　）　（ここでＭＡおよび］舶は前記定義のとおりである）のモル比 で使用すると好ましい。一般π、レゾルシンと相互反応させるチオニン染料１モ ル当り、染料「Ａ」約ＭＴ／ｌ鎖モルおよび染料「Ｂ」１匂／ｌ舶モルを含有す る染料組成物を用いると、最上の結果が得られる。

特に好ましい染料組成物はチオエフ１モルとレゾルシン４モルとの相互作用生成 物（（対してサフラン０．３モルおよびアルシアン　ブルー０．６モルを含有す る。

本発明による染料組成物はそれ自体既知の方法により、たとえは ｆａ）　固体形で分離した、チオニン染料とレゾルシンとの相互反応生成物を適 量の染料ｒ　ｋ　ＪおよびｒＢＪと混合するか、まだは （−０）　チオニン染料とレゾルシンとの相互作用後に得られた反応混合物（一 般に水溶液）中（Ｃ１適量の染料ｒＡＪおよびｒＢＪを溶解し、所望により次い で浴剤を蒸留、凍結乾燥等のような既知の技術眞より除去する、 方法により製造できる。

本発明による染料組成物は、たとえは次の目的に対して組織学的検査に使用でき る 一細胞核および細胞質の「正常」染色（この目的１（は前述のへマドキンリン− エオシン染色が最もしはしは使用されていた）、 一結合組織筋と平滑筋要素との区別（従来、マＯリイ（Ｍａｌｌｏｒｙ）または アゾン（Ａｚａｎ）法がこの目的；ｊ：１吏用されていた）、 一ミトコンドリアの染色（これは従来、たとえは鉄−へマドキンリンを用いて行 なわ虹ていた）、−漿液腺と粘液腺との区別（従来、この目的のための直接染色 法は知られていない：間接法には入／カルミンを用いる染色および同時的バンク グラウンド染色がある）、 一神経分泌性細粒体の検出〔これは従来、たとえはゴモリ（０６ｍ６ｒ１）法に より行なわれていた〕、−成人における軟骨性組織差違の区別（この目的のため の適当な方法（ｄこれ丑で知られていない）、および 一タンパク質合成の観点から核化動性（ａｃｔｉｖｅ）と受動性（ｐａｓｓｉｖ ｅ）との比率の測定（まさに分解しようとしている、丁度分解しつつある、すで に分解している）（受動性核は癌だ多量に現われ、これは従来、いずれの方法に よっても検出できなかった）。

前記の既知の染色方法は次の参考書に詳細に説明されている　Ｈａｎｓ　Ｃｈｒ ｌｓｔｘａｎ　Ｂｕｒｃｋ：　ｒＨｌｓｔｏｌｏｇｌｓｃｈｅＴｅｃｈｎｉｋＪ 　（ＧｅｏｒｇＴｈｉｅｍｅ　’Ｖｅｒｌａｇ　、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　、　 １９６９：第２版）　：　Ａ、　０　、　Ｅ　、　Ｐｅａｒｓｅ：　「Ｈｔｓｔ ｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　。

Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａ−ｐｐｌｉｅｄ　（Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｏ ｗｎ　ａｎａ　Ｃｏ、。

Ｂｏｓｔｏｎ　、１９６８　）。

本発明による染料組成物が非常に広範囲の用途を有し、そして特；で癌の組織学 的診断および検査に適することは前記から明白である。

本発明を次の非限定的例により詳細に説明する。

例 チオニン６．Ｏｇおよびレゾルシン１．ろＯｇを水１０１００Ｏ（Ｉｃ室温（約 ２５℃）で浴解し、浴数を加熱沸とうさせる。３〜５秒沸とうさせた後ｉ（、溶 液を約２５℃に冷却させ、次いでレゾルシンをさうＫ　３．８０　ｇ加工、浴液 を再度６〜５秒間沸とうさせる。＠液を室１（て冷却させ、アルシアンブルーＦ ３　Ｃ−Ｘ　２．１６９をかきませながら加える。浴液を濾過し、Ｐ液の容量を 蒸留水で１０Ｑ　Ｑ　；ｎｌ　ＩＣ調整し、サフラニン２．５ｇを混合物中１ｃ 溶解する。生成する溶液を再度、濾過し、次いでＦｔＬの容量を蒸留水で再度１ ０１００Ｑに調整する。この水溶液ハアルシアンゾルー８Ｇｘ　Ｏ，００３モル 、サフラ＝：１０．００３モルおヨヒチオニンｏ、ｏ　ｉモルとレゾルシン０． ０４モルとから生成された相互反応生成物を含有する。この溶液は組織染色に直 接使用できる。

この染料組成物は延長された期間、貯蔵せねばならない場合には、減圧蒸留また は凍結乾燥させて浴剤を除去する。上記溶液から、粉末状染料組成物１２．６　 ｇを得ることができる。

この染料組成物は次のとおりにして、組織学的検査に使用できる。

たとえば外科手段により得られた、新鮮な切片を凍結させ、次いで前記溶液で１ ０分間染色する。切片を長くて１分間、水道水ですすぎ、スライドおよび切片の 周囲をティッシュペーパーで吸い取り、次いで切片を第６−ブタノールで最高２ 回、２０秒間処理して、脱水を行なう。その後、切片をキンレンで２回、各１分 間浄化し、次いでカナダバルム（Ｃａｎａａａ　ｂａｌｍ）でおおう。かくして 、この切片は約２５〜６０分以内に組織学的評価を行なうだめの準備かととなっ ている。

慣用の細胞学的検査用の標本が出発材料として固定した切片を使用する点で異な る以外は同様にして作成できる。

各種組織構成要素は次の色で現われる。

能動性核、帯青−緑 受動性核１分解前または後の核（その数が腫瘍組織で重要である）：赤 核小体：赤 結合組織　青 平滑筋：ピンク 粘液腺、青 漿液腺、赤 ミトコンドリア、すみれ色粉状体 軟骨、その成長度に応じて、すみれ色（ｖｌｏｌａｔ）、紫（ｐｕｒｐｌｅ）、 ピンク、青まだは帯青−緑神経分泌性細粒体、赤

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ｆｌｌ　ｆオニン、トルイジン　ブルーおよびジメチルテオニンから選ばれ る１種またはそれ以上のチオニン染料１モル割合とレゾルシン少なくとも０．２ モル割合とを高めた温度で相互作用させることにより生成される生成物、
2. （２）　レゾルシ／と相互作用させるチオニン染料１モルに対して計算して、０ ．５　（、ＭＴ／　ＭＡ）〜２（ＭＴ／ＭＡ）モルの染料「Ａ」、および
3. （３）　レゾルシ／と相互作用させるチオニン染料１モルに対して計算して０． ５（ＭＴ／ＭＢ）〜２（ＭＴ／ＭＢ　）モルの染料「Ｂ」 を含み、ここで、 染料「Ａ」および染料ＩＢｊは色およびｐ’ｇで異なるアルカリ性染料であり、 そして染料「Ａ」および染料「Ｂ」は両方共に、色およびｐＨで類似するアルカ リ性染料の混合物であることができ、 ＭＴはテオニン染料の分子量であり、 １転は染料「Ａ」の分子量であり、そしてＭＢは染料ｒＢＪの分子量であるが、 またはチオニン染料、染料「Ａ」および染料「Ｂ」のいずれかが２種以上の物質 の混合物である場合には、Ｍ工、ＭＡおよびＭＢはそれぞれ、テオニン染料、染 料１−Ａ」および染料「Ｂ」の成分の分子量の重量平均値を表わす、 組織学的検査用の染料組成物。 ２、成分（１）として、チオ二／染料、好ましくテオニン１モルとレゾルシフ１ 〜５モルとの高められた温度における相互作用により生成される生成物乞含む、 請求の範囲１に記載のとおりの染料組成物。 ６、成分（１）として、テオニン染料、好ましくはチオエフ１モルとレゾルシン ３〜４モルとの高メラれた温度における相互作用により生成される生成物を含む 、請求の範囲１または２に記載のとおりの染料組成物。 ４　染料ｒＡＪとして、アルシアン　ブルー８０χ乞、および染料ｒＢＪとして 、サフラニン７含む、前記請求の範囲のいずれかに記載のとおりの染料組成物。 ５　染料「Ａ　」および「Ｂｊｋｏ、５（き、４Ａ／　１作）〜２（＋転／　Ｍ Ｂ　）のモル比率（ここで２・〜９およびユ・！□は請求の範囲１に定義したと おりである）で含有する、請求の範囲１または４に記載のとおりの染料組成物。 ６　チオエフ１モルとレゾルシン４モルトノ相互作用から生成される生成物につ いて計算して、す７う二ｙ　０．３モルおよびアルシアン　ブルー００６モルを 含む、前記請求の範囲の（・ずれかに記載のとおりの染料組成物。