DD268844A7

DD268844A7 - Farbstoffzusammensetzungen fuer histologische untersuchungen

Info

Publication number: DD268844A7
Application number: DD82245131A
Authority: DD
Inventors: Gyoergy Balogh; Gyoergy Csaba; Peter Kovaacs
Original assignee: ��@��k��
Priority date: 1981-11-20
Filing date: 1982-11-22
Publication date: 1989-06-14
Also published as: EP0094398A4; FI832357L; DK333283D0; FI74036B; NO832557L; SU1356971A3; EP0094398A1; HU184903B; US4595582A; DE3273990D1; EP0094398B1; FI74036C; JPS58501968A; AU9126882A; CU21441A3; ATE23180T1; RO88189A2; CS830782A2; RO88189B1; FI832357A0

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Farbstoffzusammensetzung fuer histologische Untersuchungen. Erfindungsgemaess besteht die Zusammensetzung aus1) einem Produkt, welches durch die Wechselwirkung von einem molaren Anteil eines oder mehrerer unter Thionin, Toluidinblau und Dimethylthionin ausgewaehlten Thionin-Farbstoffe mit mindestens 0,2 molaren Anteilen Resorzin bei erhoehter Temperatur gebildet wird,2)0,5 (MT/MA) bis 2 (MT/MA) Mol eines Farbstoffes "A", berechnet fuer ein Mol des mir Resorzin in Wechselwirkung getretenen Thionin-Farbstoffes, sowie3)0,5 (MT/MB) bis 2 (MT/MB) Mol eines Farbstoffes "B", berechnet fuer ein Mol des mit Resorzin in Wechselwirkung getretenen Thionin-Farbstoffes,wobei Farbstoff "A" und Farbstoff "B" hinsichtlich Farbe und p H-Wert voneinander verschiedene alkalische Farbstoffe sind und wobei es sich sowohl bei Farbstoff "A" als auch bei Farbstoff "B" um einander in Farbe und p H-Wert aehnliche Gemische von alkalischen Farbstoffen handeln kann,MT Molekuelmasse Thionin,MA Molekuelmasse Farbstoff A undMB Molekuelmasse Farbstoff B ist,oder, wenn entweder der Thioninfarbstoff, der Farbstoff A und/oder der Farbstoff B ein Substanzgemisch darstellt, sind MT, MA und/oder MB die Durchschnittsmasse der Molekularmasse der Einzelkomponenten des Gemisches.

Description

berechnet für ein Mol des Thioninfarbstoffes, der auf Resorzin eingewirkt hatte, wobei Farbstoff A und Farbstoff B farblich und vom pH-Wert voneinander unterschiedliche, alkalische Farbstoffe sind und sowohl Farbstoff A als auch Farbstoff B Gemische alkalischer Farbstoffe sein können, die in Farbe und pH einander ähnlich sind, MT die Molekularmasse des Thioninfarbstoffes, MA die Molekularmasse des Farbstoffes A und MB die Molekularmasse des Farbstoffes B sind, oder, wenn entweder der Thioninfarbstoff, der Farbstoff A und/oder der Farbstoff Bein Substanzgemisch darstellen, sind MT, MA und/oder MB die Durchschnittsmasse der Molekularmasse der Einzelkomponenten des Gemisches.

2. Farbstoffzusammensetzung nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß sie als Komponente (1) ein Produkt enthält, das durch Einwirken eines Mols eines Thioninfarbstoffes, vorzugsweise Thionin, mit 1 bis 5 Molen Resorzin bei einerTemperatur von 50 bis 120⁰C, vorzugsweise bei 70 bis 120°C, entsteht.

3. Farbstoffzusammensetzung nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß sie als Komponente (1) ein Produkt enthält, das durch Einwirken eines Mols eines Thioninfarbstoffes, vorzugsweise Thionin, mit 3 bis 4 Molen Resorzin bei einer Temperatur von 50 bis 120⁰C, vorzugsweise bei 70 bis 120⁰C, entsteht.

4. Farbstoffzusammensetzung nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß sie als Farbstoff A Alcyanblau 8 GX und als Farbstoff B Safranin enthält.

5. Farbstoffzusammensetzung nach Punkt 1 oder 4, gekennzeichnet dadurch, daß sie als Farbstoff A

und B in einem molaren Verhältnis von 1: [0,5 I -^- j bis 2 I -^- J ] enthält, wobei MA und MB die in Punkt 1 genannte Bedeutung aufweisen.

6. Farbstoffzusammensetzung nach einem der vorangehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß sie 0,3 Mole Safranin und 0,3 Mole Alcyanblau 8 GX enthält, berechnet für ein Produkt, das aus dem Einwirken eines Mols Thionin mit 4 Molen Resorzin entsteht.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Farbstoffzusammensetzung für histologische Untersuchungen. Histologische Untersuchungen spielen bei der Erforschung pharmazeutisch aktiver Substanzen, in biologischwissenschaftlichen Untersuchungen wie auch in der Therapie eine bedeutsame Rolle. Eine zuverlässige histologische Diagnose stellt eine unverzichtbare Voraussetzung für die erfolgreiche Behandlung bestimmter Erkrankungen und Störungen dar, wobei die Früherkennung von Krebsgeweben von vorrangiger Bedeutung ist.

Histologische Prüfverfahren sollten leicht zu bewertende, zuverlässige Ergebnisse erbringen. Darüber hinaus sollten die Prüfverfahren schnell, einfach und leicht vorzunehmen sein, ohne dazu spezifische Anlagen und Ausbildungsgänge zu erfordern.

Die bislang bekannten histologischen Färbeverfahren erfüllen diese Anforderungen nicht in jeder Hinsicht. Die Mehrzahl der bekannten Färbemethoden ist schwierig durchzuführen, zeitaufwendig, sie erfordert einen spezifischen Bedienaufwand, und die erbrachten Informationen sind häufig nicht eindeutig. Beispielsweise erfordert der Hämatoxylin-Eosin-Test, die am meisten verbreitete Routinemethode der Gewebefärbung, etwa 90 bis 120min für das Einfrieren und Fixieren des Schnittstückes, wobei das resultierende histologische Bild lediglich im Falle einer drastischen zoologischen Störung eindeutig bewertet werden kann. Zum anderen kann eine die Gefahr schwerwiegender Fehler in sich tragende annähernde Diagnose nur nach einer über mehrere Jahre hinweg erworbenen beruflichen Übung gestellt werden, wobei man sich nichtsdestoweniger mehrfach auf Standard-Bezugspräparate beziehen sollte.

Es hat sich unerwarteterweise gezeigt, daß neue Farbstoffzusammensetzungen es erlauben, ein breites Spektrum histologischer Untersuchungen sehr viel rascher, einfacher und sicherer als zuvor durchzuführen, wobei das resultierende histologische Bild den Bearbeiter in die Lage versetzt, selbst ohne jedwede spezifische professionelle Routine oder Übung eine 86hr viel zuverlässigere Diagnose als bisher zu stellen. Unter Einsatz der neuen erfindungsgemäßen Färbemittelzusammensetzungen

können nunmehr histologische Veränderungen leicht und sicher nachgewiesen werden, die bislang überhaupt nicht bzw. nicht unter Anwendung direkter Färbetechniken nachzuweisen waren.

Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Farbstoffzusammensetzung für histologische Untersuchungen, bestehend aus

(1) einem Produkt, welches durch die Wechselwirkung von einem molaren Anteil eines oder mehrerer unter Thionin (Farbzahl 52000), Toluidinblau (Farbzahl 52040) und Dimethylthionin (Azur A) (Der Index der einzelnen Farbstoffe ist durch das Commission on Standardisation of Biological Stains, chef: H.J. Conus, bestimmt; R. B. Lillte: .Biological Stains". Verlag Williams and Wilkins Company, USA [197]) ausgewählten Thionin-Farbstoffe mit mindestens 0,2molaren Anteilen Resorzin bei einer Temperatur von 50 bis 12O⁰C, vorzugsweise bei 70 bis 120°C,gebildet wird,

(2) 0,5 (Mt/Μα) bis 2 (M_T/M_A) Mol eines Farbstoffes „A", berechnet für ein Mol des mit Resorzin in Wechselwirkung getretenen Thionin-Farbstoffes, sowie

(3) 0,5 M_T/M_B) bis 2 (M_T/M_B) Mol eines Farbstoffes .B", berechnet für ein Mol des mit Resorzin in Wechselwirkung getretenen Thionin-Farbstoffes, wobei

Farbstoff „A" und Farbstoff „B" hinsichtlich Farbe und pH-Wert voneinander verschiedene alkalische Farbstoffe sind und wobei

es sich sowohl bei Faibstoff „ A" als auch bei Farbstoff „B" um einander in Farbe und pH-Wert ähnliche Gemische von Farbstoffen handeln kann.

Mt entspricht der Molekülmasse des Thionin-Farbstoffes, M_A entspricht der Molekülmasse des Farbstoffes „A", und M₃ entspricht der Molekülmasse des Farbstoffes ,B" oder —wenn es sich bei dem Thionin-Farbstoff, Farbstoff „A" und/oder Farbstoff „B" um ein Gemisch aus mehreren Substanzen handelt, dann stellen Mt, Ma und Mb jeweils den gewonnenen Durchschnitt der Molekülmassen der Komponenten des Gemisches dar.

Die Farbstoffe „A" und .B" unterscheiden sich vorzugsweise auch in ihrer Dispersität. Handelt es sich bei Farbstoff „A" oder Farbstoff „B" um eine Farbstoffmischung, dann wird bevorzugt, ι jr Bildung der Mischung Farbstoffe mit ähnlichen Dispersitäten zu verwenden.

Die Grundkomponente der erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen ist das durch die Wechselwirkung eines Thionin-Farbstoffes mit Resorzin bei erhöhter Temperatur gebildete Produkt. Es hat sich gezeigt, daß sich beim Zusammenbringen von 1 Mol eines Thionin-Farbstoffes mit mindestens 0,2 Mol Resorzin für eine kurze Zeitspanne bei erhöhter Temperatur (vorzugsweise 70 bis 120°C) eine neue Substanz ergibt, die sich hinsichtlich ihrer Färbeeigenschaften vom Ausgangs-Thioninfarbstoff unterscheidet. Des weiteren ist beobachtet worden, daß ein Vermischen von Thioninfarbstoff und Resorzin ohne Erwärmen (z.B. bei Zimmertemperatur) keine Veränderung der Färbeeigenschaften des Thionin-Farbstoffes bewirkt. Auf dieser Basis wird davon ausgegangen, daß eine chemische Wechselwirkung zwischen dem Thionin-Farbstoff und Resorzin stattfindet; die Natur des Produktes (einheitliche Moleküle, mehrere unterschiedliche Reaktionsprodukte, Addukt, Komplex usw.) ist jedoch noch unbekannt. Vorzugsweise werden 1 bis 5 Mol Resorzin pro 1 Mol Thionin-Farbstoff verwendet. Auf der Grundlage unserer Voruntersuchungen wird davon ausgegangen, daß 3 bis 4 Mol Resorzin benötigt werden, um eine vollständige Wechselwirkung mit einem Mol des Thionin-Farbstoffes zu erzielen. Die besten Resultate werden erzielt, wenn 3 bis 4 Mol Resorzin für ein Mol des Thionin-Farbstoffes verwendet werden; nichtsdestoweniger gestattet es die erfindungsgemäße Farbstoffzusammensetzung, schnelle und zuverlässige Prüfungen auch dann vorzunehmen, wenn der Thionin-Farbstoff in einem früher angegebenen Überschuß vorliegt. Ein Resorzin-Überschuß an sich beeinträchtigt das Färben nicht, es ist vielmehr unwirtschaftlich, Resorzin im Überschuß einzusetzen.

Wie bereits weiter oben erwähnt, wird der Thionin-Farbstoff mit dem Resorzin bei erhöhten Temperaturen in Berührung gebracht. Die Wechselwirkung vollzieht sich bereits bei etwa 50°C, wenngleich es jedoch bevorzugt wird, diese Ausgangsstoffe bei höheren Temperaturen, so etwa bei 70 bis 120⁰C miteinander in Berührung zu bringen. Die Wechselwirkung verläuft nahezu augenblicklich; werden beispielsweise die Ausgangsstoffe in einer wäßrigen Lösung miteinander in Berührung gebracht, so reicht es aus, die Lösung einige Sekunden lang sieden zu lassen. Als Reaktionsmedium kann irgendeine reaktionslose Flüssigkeit verwendet werden, welche die Ausgangsstoffe auszulösen vermag. Der Begriff „reaktionslos" meint in diesem Zusammenhang, daß diese Flüssigkeit nicht mit einem der Ausgangsstoffe reagiert. Das am meisten bevorzugte Reaktionsmedium ist Wasser. Die Farbstoffe „A" und „B" sind Farbstoffe mit alkalischem Hintergrund, welche die Beobachtung der Farbwirkung des oben definierten Wechselwirkungsproduktes erleichtern. Wie bereits erwähnt, kann es sich bei dem Farbstoff „A" um einen einzelnen alkalischen Farbstoff oder auch um ein Gemisch einander hinsichtlich Farbe, pH-Wert und vorzugsweise auch Dispersität ähnlicher Farbstoffe handeln; das gleiche gilt für Farbstoff „B". Nichtsdestoweniger ist es eine grundlegende Voraussetzung, daß der Farbstoff „A" (oder das Farbstoffgemisch „A") hinsichtlich Farbe, pH-Wert und vorzugsweise auch hinsichtlich Dispersität vom Farbstoff „B" (oder dem Farbstoffgemisch „B") verschieden ist. Als ähnlich gelten Farbstoffe, bei denen

— der Unterschied der Lichtabsorptions-Maxima Δλ = 5pm nicht überschreitet und

— der pH-Wert-Unterschied 1,0 nicht übersteigt, wohingegen Farbstoffe, bei denen

— der Unterschied der Lichtabsorptions-Maxima mindestens Δλ = IOpmund

— der pH-Unterschied mindestens 2,0 beträgt, als verschieden, d. h. different, gelten.

Unter dem Aspekt der Ähnlichkeit oder Unterschiedlichkeit alkalischer Farbstoffe stellt die Farbe den entscheidendsten Faktor

dar. Wenn also beispielsweise ein Farbstoff von warmer Färbung (rot, orange, gelb) oder ein Gemisch derartiger Farbstoffe als

Farbstoff „A" verwendet wird, dann kann nur ein Farbstoff von kalter Farbe (grün, blau) oder ein Gemisch derartiger Farbstoffe

als Farbstoff „B" Verwendung finden.

Vorzugsweise wird beispielsweise Safranin (Farbzahl 50240) und/oder Paronin I (Farbzahl 45005) als Farbstoff „A" in Verbindung mit beispielsweise Alcyan-Blau 8GX (Farbzahl 74240) und/oder Licht Grün (Farbzahl 42095) als Farbstoff „B"

eingesetzt.

Vorzugsweise werden die beiden Typen von Untergrundfarbstoffen in einem molaren Verhältnis von 1 :[0,5 (M_A/M_B) b*s 2

(M_A/M_B))angewendet, wobei M_A und M_B den obigen Definitionen entsprechen. Im allgemeinen werden die besten Ergebnisse mit Farbstoffzusammensetzungen erzielt, die etwa M_T/M_A des Farbstoffes „A" und M_T/M_B Mol des Farbstoffes „B" pro ein Mol des mit Resorzin in Wechselwirkung getretenen Thionin-Farbstoffes enthalten.

Eine speziell bevorzugte Farbstoffzusammensetzung enthält 0,3 Mol Safranin und 0,3 Mol Alcyan Blau für das Wechselwirkungsprodukt von einem Mol Thionin mit 4 Mol Resorzin.

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Die erfindungsgemäßen Farbstoff zusammensetzungen können nach den aus sich selbst heraus bekannten Methoden hergestellt werden, so etwa dadurch, daß

a) das Wechselwirkungsprodukt von Thionin-Farbstoff und Resorcin, in fester Form abgeschieden, geeigneten Mengen der Farbstoffe „A" und .B" beigemischt wird, oder daß'

b) geeignete Mengen der Farbstoffe .A" und .B" in dem nach der Wechselwirkung von Thionin-Farbstoff und Resorcin gewonnenen Reaktionsgemisch (im allgemeinen einer wäßrigen Lösung) aufgelöst werden und — sofern gewünscht — das Lösungsmittel vermittels bekannter Techniken wie etwa vermittels Vakuum-Destillation, Gefriertrocknung usw. abgeführt wird.

Gemäß unserer Erfahrungen sind die in Form eines festen Gemisches formulierten Farbstoffkompositionen stabiler als die

Lösungen.

Die erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen können in histologischen Untersuchungen z. B. zu folgenden Zwecken

angewendet werden:

— „normales" Färben von Nukleus und Zytoplasma (hierzu ist die bereits weiter oben diskutierte Hämatoxylin-Kosin-Färbung am häufigsten angewendet worden),

— zum Unterscheiden von Elementen der verbindenden und glatten Muskulatur (bislang ist hierzu die Mallory- oder Azan-Methode angewendet worden),

— Färben von Mitochondrion (dies ist bislang beispielsweise mit Eisen-Hämatoxylin vorgenommen worden),

— Unterscheiden von serösen und muzinösen Drüsen (bislang ist hierzu keine direkte Färbemethode bekannt; die indirekte Methode besteht im Färben mit Muzikarmin und einer gleichzeitigen Hintergrundfärbung. Gemäß unserer Erfahrungen sind die in Form eines festen Gemisches formulierten Farbstoffkompositionen stabiler als die Lösungen). Die oben erwähnten bekannten Färbemethoden sind im Detail in dem folgenden Werk beschrieben: Hans Christian Burck: „Histologische Technik" (Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1969; 2. Ausgabe).

— Nachweis von neurosekretorischen Körnern (dies ist bislang z. B. vermittels der Gömöri-Methode vorgenommen worden), was durch die folgende Literaturstelle beschrieben ist: A. G. E. Pearse: „Histochemistry, Theoretical and Applied (Little Brown and Co., Boston, 1968).

— Unterscheiden von in ihrer Reife unterschiedichen kartilaginösen Geweben (hierzu war bislang keine geeignete Methode bekannt) und

— Bestimmung des Verhältnisses von aktiven und passiven Nucklei (beginnende Teilung, gerade stattfindende Teilung, bereits vollzogene Teilung) unter dem Aspekt der Proteinsynthese (passive Nuklei treten in großen Mengen in Tumoren auf, welche bislang durch keinerlei Methode nachgewiesen werden konnten).

Aus dem oben dargelegten wird klar, daß die erfindungsgemäßen Farbstoffzusammensetzungen einen sehr breiten Anwendungsbereich besitzen und daß sie sich insbesondere für die histopathologische Diagnostik und Untersuchung von Krebs

eignen.

Die Erfindung wird im Detail mit Hilfe des folgenden, nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels beleuchtet. Ausführungsbeispiel

3,0g Thionin und 1,30g Resorcin werden in 1000ml Wasser bei Zimmertemperatur (etwa 25°C) aufgelöst, und die Lösung wird bis zum Sieden erhitzt. Nach einem 3 bis 5 s dauernden Sieden wird die Lösung zum Abkühlen auf etwa 25⁰C stehengelassen, sodann werden weitere 3,80g Resorzin zugesetzt, und die Lösung wird erneut über 3 bis 5 s hinweg gekocht. Nach dem erneuten

Abkühlenlassen der Lösung auf Zimmertemperatur werden unter Verrühren 2,15g Alcyan Blau 8GX zugesetzt. Die Lösung wird

gefiltert, das Volumen des Filtrats wird mit destilliertem Wasser auf 1000ml eingestellt, sodann werden 2,5g Safranin in der

Mischung aufgelöst. Die resultierende Lösung wird erneut gefiltert, das Volumen des Filtrats wird erneut mit destilliertem Wasser auf 1000 ml eingestellt. Diese wäßrige Lösung enthält 0,003MoI Alcyan Blau 8GX, 0,003 Mol Safranin sowie ein aus

0,01 Mol Thionin und 0,04 Mol Resorzin gebildetes Wechselwirkungsprodukt. Die Lösung kann direkt zu Gewebefärbung verwendet werden.

SoM die Farbstoffzusammensetzung über eine längere Zeitspanne hinweg gelagert werden, so wird sie zwecks Beseitigung des Lösungsmittels einer Vakuumdestillation oder Gefriertrocknung unterzogen. Aus der obigen Lösung können 12,6g einer

pulverförmigen Farbstoffzusammensetzung gewonnen werden.

Die Farbstoffzusammensetzung kann folgendermaßen in histopathologischen Untersuchungen eingesetzt werden: Das frische Schnittmaterial, beispielsweise im Rahmen eines chirurgischen Eingriffes gewonnen, wird eingefroren und dann

10min lang mit der obigen Lösung gefärbt. Das Schnittstück wird mit Leitungswasser abgespült — dies höchstens eine Minute lang — sodann werden die Umgebung des Objektträgers und das Schnittstück mit Fließpapier abgetupft. Nunmehr wird das

Schnittstück höchstens zweimal zwecks Dehydration über jeweils 20s hinweg mit tert.-Butanol behandelt. Sodann wird das Schnittstück zweimal für jeweils eine Minute mit Xylen gereinigt und dann mit Kanadabalsam bedeckt. Damit ist das Schnittstück

für eine histologische Untersuchung innerhalb von etwa 25 bis 30min bereit.

Für zytologische Routineuntersuchungen können die Präparate in ähnlicher Weise angefertigt werden, dies allerdings mit dem Unterschied, daß hierbei fixierte Schnittstücke als Ausgangsstoffe verwendet werden. Die verschiedenen Gewebebestandteile erscheinen in den folgenden Farben:

aktive Nuklei: bläulich-grün

passive Nuklei, Nuklei vor oder nach der Teilung (deren Anzahl ist bei Tumorgeweben bedeutsam): rot

Nukleoli: rot Nuklei der Zellen bei beginnender Teilung: purpurrot Bindegewebe: blau

glatter Muskel: rosa

muzinöse Drüse: blau

seröse Düse: rot

Mitochondrion: violette Körner Knorpel: violett, purpurfarben, rosa, blau oder blaugrün, je nach seiner Reife

neurosekretorische Körner: rot.

Claims

(1) einem Produkt, das durch Einwirken eines Molanteils einer oder mehrerer Thioninfarbstoffe aus der aus Thionin, Toluidinblau und oder Dimethylthionin bestehenden Gruppe mit zumindest 0,2 Molanteilen Resorzin bei einerTemperaturvon 50 bis 120⁰C, vorzugsweise bei 70 bis 120⁰C, entsteht,

1. Farbstoffzusammensetzung für histologische Untersuchungen, gekennzeichnet dadurch, daß sie besteht aus
(2) 0,5 (-JJf^-J bis 2 ( jj±- J Molen eines Farbstoffes A,

berechnet für ein Mol des Thioninfarbstoffes, der auf Resorzin eingewirkt hatte, und
(3) °'⁵ ί nmr 1 bis 2 (-jJ^Tj-) Molen eines Farbstoffes B,

V MB / \ MB /