JPS585200A - 体液中のコレステリン及びコレステリンエステルを検出及び測定するための診断材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コレステリンオキシダーゼを活性化する方法
を実施するための＃新材料に関する０特願昭４８−５５
１５７号から１．コレステリン會水性媒体中でコレステ
リンオキシダーゼと共に恒温に保持し、かつ、酸素消費
量又は生成したＨ８０．又はコレステノンを測定する、
コレステリン定菫法は公知である０ま良、特纏紹５３−
１１１７９１号によりコレステリンオキシダー（及びＨ
，０，絢定用の系統又はコレステノン欄定用の系統から
なるコレステリン鎚量用試柴も公知である。ところで、
コレステリンオキシダーゼは貯蔵に際して安定性が充分
でなく、比較的迅速に不活性化されること、そしてこの
不活性化が＃素製違時に使用した表向活性剤の僅かな量
の混入によることが判明した０鋏製造は例えば、Ｉ＃Ｊ
ＩＩｌｌｌ昭４１１−６ｌｌ＆６　号に起部Ｏ方法によ
れば、コレステリンを分解する値生物の＃胞ａｔ−非イ
オｙ性表−活性剤【含有する緩鞠語液を用いて値履分解
し一嵩【抽出し、抽出物を遠心分離し、沈諏ｖ！Ｊｔ−
除去した後に隘イオン交換体で処理し、非イオン性表面
活性剤を含有する緩衝液を用いて酵素を解離し、単線す
ることによって行なわれる。その際、残りの痕跡の表面
活性剤を除去することにより貯蔵安定性の極めて丸い酵
素が得られること１．シかしながら、痕跡の表面活性剤
を絹製除去した酵素の粘性は看しく低下することが判明
した。例えば、酵素をコレステリン定蓋用に使用するに
は、Ｉｆたに［６したものを使用するか、又は極めて多
量のｒｌＩ＄ｆｉ−使用するか又は測定時間ｔ−看しく
＃、長ぜねばならなかった。

本発明者らは、コレステリンオキシダーゼを活性化する
方法１ｒ開発した０特に、−面では表向粘性の追跡も含
有せず、使ってコレステリンオキシダーゼを十分に好酸
安定ならしめ、他菌では酵素の使用に除し、ｋＪ［シく
調装した漁少鼠の衣囲ｌ占社斉１ｊの味−Ｊｉ：をまだ
竹なっていない酵素の油性に相応する酵素油性動殖得す
ることｋｌＵ能にする方法を開発した０ 即チ、コレステリンオキシダーゼ１２用する直前に１そ
の水浴液の重量に対し少くとも−ｏ、ｏｏｓチ、殊にＱ
、００５〜０．６嘔の好誼性及び親水性特性を有する表
面活性化合物少なくともｌ橡＠ｔ′添加するによってコ
レステリンオキシダーゼの活性化を達成した・ 本発明は、この方法を実施するために通するものであっ
て体液中のコレステリン及びコレステリンエステルの検
出及び足量用＃断材Ｎ［［する０ コレステリン’１ｆｔＦｉ医学的＃断にとって着しくＭ
賛である。

臨床化学において、実賑にしばしばさはど楕確な給米は
侍られないが、足期検食又Ｆｉ集団検食用に迅速かつ割
安な報告を可能にする、体液中の！ｌｌｌ１實の検出用
の迅速テストが最近益々所望されている。迅連区ｊｌｌ
ｌ！に使用される＃１１Ｆ材料はすべて反応に必賛な緘
桑【含有する、ａ双性の担体か又゛は耐水性フィルムで
ある・こＯ＃断材料を賦験体赦と接触させると、！４色
反応が生じるから、これ鷺像準色によるか又は簡単な反
射光度計を用いて測定する０ １双性Ｍｋコレステリンオキシグーゼ、ペルオキシダー
ゼ、酸化指示薬及び緩爾剤で含浸することによってコレ
ステリン迅運試験用の材料を＃造する試みは失敗に帰し
た０得られた試験紙はｆ通の一度のコレステリン含有血
清とは反応しないからであった０ 今上記のように、担体に含浸させるさいに付加的に前記
表向活性剤を添加するとき、コレステリン含有の血清と
投階的に反応する、使用可能な試−戯又は試険フィルム
が得られることが明らかＫなった。

それ故、本発明による体液中のコレステリ／及びコレス
テリンエステルの検出及び定貫用の＃麩４ｔｌ［、コレ
ステリンオキシダーゼ、Ｈ，０゜検出用の糸就、ｋＩＬ
衝剤の外に固体賦柴の２〜３〇−１有利にはｌＯ〜２０
慢の一膨で繭配表向活性化合物【含浸してな・るか、又
はこれらを聴設置４ｉする、担持体又はプラスチックフ
ィルムからなっている。

Ｈ８０，検出用の有利な系統は、ペルオキシダーゼ及び
酸化指示系からなり、場合によっては影化削又は／及び
安定化剤も加えられるＯ肝脂性及び親水性特性を有する
、１！−活性イし合物としては、有利には分子中に少く
とも１個のＯＨ基金含有する非イオン性表面活性剤力本
使用される。愕に有利には、アルキル−１了り−ルー及
びアラルキルアルコールのポリオ命ジエチレン紡導俸を
使用するＯこの積の特に有利な−ａＬｆｌ活性化−＆物
の例は、ポリオキシエチレン−アルキルエーテル、ポリ
オキシエチレ／−アルキルカルボン酸エステル、ポリオ
キシエチレン−ソルビタン−アルキルカルボン酸エステ
ル、ポリオキシエテレンーグリセリンーアルキルカルホ
７　ｇ［エステル、ポリオキシエ？Ｌ／ンーアルキルア
ミン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−塊
状菖合体、ポリオキシエチレン−アルキルチオエーテル
、ポリオキシエチレン−アルキルアリールエーテルであ
るＯ詳細な例は、ヒト四キシポリエト中シトデカン、ア
ル中ルフェノールのエチレンオキシ付加生成物、ソルビ
ットアンヒドリドのポリエトキシエチレン＃導体等であ
る。メルカプタンで変性した゛ポリオキシエチレン＃導
体もはげ同じ様に好適であるＯ これらの化合物のうちで、オキシエチレン基数が相通す
る大抵全てのものは市販されている。

最も使用されるものは、中位の叙のオキシエチレン基（
約５〜２０）によって待砿付けられる水蓄性のものであ
る。低数なオキシエチル化タイプは大砥分畝することが
できるにすぎず、値って、あまり筐用さ昨な−。−〆に
エトキシル化された化合物（２５Ｌり大）Ｖよ夾−に水
＃１性で會まあるか、過ムに議水社で必るので拌用が低
下する。

アニオン性湿＠剤のうちで軸にガレンば、例えば、コー
ル−、タウロコール畝及びデオキシコール−の臘が好適
であり、史にｍ１肋咳の一反び繍肋酸ナルコナイドが好
適でめる０脅Ｋ）ｉ知の如く、多くの指示票（・−トリ
ジン、Ｉ１１木場式アジジ）の有色のラジカル性酸化生
成物を安定化する付加的な特性を有する虞！Ｉ２＃導体
が１景である。これは例えば、次の＃類である：スルホ
コハクぼエステル、アルキルアリールスルホネート、ア
ルキルスルフェート、アルキルポリオキシエチレンスル
フェート。

陽イオン蓬閾卸ｊのうちで例えば、アルキルピリジニウ
ム−又はアルキルトリメチルアンモニクム塩が使用口」
能であるが、複線な構造の化合物、例えば、塊化ペンゼ
）＝りム虻使用することもできる。

両性湿＠蛸中で、例えば、イイダゾリウムベタインが便
用−工能である◇ 詳細なりｌｌｒよ、ナトリウムジー（２−エチルヘキシ
ル）−スルホスクシネート、ナトリウムドデシルスルフ
ェート、オレイン鍍ナトリウム、塩化ベンすルコニウム
及び塩化セチルピリジニウムでめる０ ４！利にはこの樟のイオン性又は両性表向活性剤を前記
し九非イオン性表面活性剤と組合せて使用する。適切な
ＪｌｌＦｉ、非イオン性表面活性剤の量に左右される。

少くとも１個のＯＨ基を有する非イオジ性の表面活性剤
が有利である。それというのも、蚊界ｒｊｊＩ活性剤は
その他の使用可能な表面活性′ｊＩＩＪ買に比して約５
倍ないし１０倍強い活性化を生ぜめ、かつ、反応速度の
上昇又は反応時間の短縮が生じるからである。該表面活
性剤も僅かな童で有効である。

アルキル基とはここでは約２０個までの炭素原子を有す
るようなもの、籍には１２〜１８＠の炭素原子を有する
ようなものである。

痕跡の表面活性剤の存在でのコレステリンオキシダーゼ
の不活性化は、酵素が＊＊アンモニウム齢敵中に存在す
る４＆酋に特に張力に起こる０次表に１モルの低酸アン
モニウム中、３３℃で桓々の皺の表１粘性剤の存在下Ｓ
本の貯蔵安定性を記載する。実験はオクチルフェノール
−エチレンオキシド付加生成Ｗｔ用いて実施した〇コレ
ステリンオキシダー（の活性ｆ（新製した＃業に対する
’Ｉｋ） 表面活性剤 非イオン性表面活性のポリオキシエデレｙ化合叢中で、
籍にポリオキシエチレン−に対する疎水基の半値のとれ
た割合を有し、かつ、水溶性であるようなものが使用さ
れるＯ 疎水基とポリオキシエチレン鎖との割合の大鼓はいわゆ
るＨＬＢ値である〔グリフイン（Ｗ−Ｃ、Ｇｒｉｆｆｉ
ｎ）着１ジャーナル・オブ・ソシエテイーｅオブ・コス
メテツクｅケミスツ′（Ｊ　、Ｓｏｃ、Ｃｏｓｍｅｔｉ
ｅ、Ｃｈ＠ｍＪＪｌｉｇ　１　％、３１１真（１９５０
年〕及び同ｍｓ巻、２４１１）Ｉ（１９５４年）参照〕
。

特に、約ｌＯと１７の間の）ＩＬＢｉ［ｋ有する表向活
性物質を使用することかで麹る０この値は勿陶、作用が
疎水基の特性にも圧右されるために、４ｔＩｌｌ率値と
みなされるにすぎない。

血清中のコレステリン１ｒ慣出するために１吸収性紙に
試薬を含浸させることによって得られる普通の試験紙が
脣に好適である。しかしながら全血液中のコレステリン
を検出する場合には、有利には試ｌｌ１ｌ！航ｔ−西ド
イツ特許公開公報第１５９８０４８号に記載のようにし
て練水化するか、又はセルロースニスデル等からなる半
透８Ａ膜で被憶すべきでめる０しかしながら全血献中で
の検出用に西ドイツ特許籐１５９８１５３号明細書にエ
リ得られるような試験フィルムが＠に有利である。

該フィルムを＃造するために、試薬、ガえばコレステリ
ンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、廁示桑及
び場合によっては膨化剤を本発明に１９使用される表向
活性物質と一緒にフィルム形成性ポリ！−の水性分数液
中に混入する０該分散液を薄Ｖ％フィルムに―布し、か
つ、乾燥させる。コレステリン含有血液を仁の種の試薬
フィルムに通加し、かつ、約１分後に拭き取ると、色ａ
１ｍｍ度がコレステリンＩＩｋＫ相応する呈色が得られ
る。該呈色Ｆ！特に簡単な反射光度１１１−用いて定置
的に評価するために好適である〇本発明による１断材料
は、遊離コレステリンの検出及び足駕に好適である◎こ
れに対して、コレステリンエステルが存在する場合には
、該エステルから先ずコレステリンを遊離させるべきで
ある。このことは、常法で例えば水性アルカリを用いて
鹸化することによって冥論することができる。しかしな
がら、コレステリンエステラーゼ（有利には敏生物から
単一した）【用いるエステル分解が特に有利である。そ
れというのも七の釦丼富に好適な条件下に操作すること
ができるからである。

コレステリンエステラーゼを体ｔＫｍ加し、かつ、−短
時間恒温に保持することができる〇該方法は？Ｉｊえば
、体液を両ドイツ籍許隅２２４０６７２号に対応する％
−昭４９−３９１２８号明細書と同様に内壁にコレステ
リンエステラーゼ及び場合によっては助剤を装入した毛
細管中に吸収して実施することができる。毛細管中で恒
温に保持した後に体液針次龜゛に前記したようにして試
験条片上に施こす。体液中に先ず遊離コレステリン及び
エステル化されたコレステリンが同時に存在する場合に
は、当然これらの合計が検出される。しかしながら、特
に有利にはコレステリンエステラーゼを試験余片中に一
緒に混入し、従って、単一工程で遊離コレステリン及び
エステルｆじされたコレステリンの合計を検出するか又
は画定することができるようにすることもできる。

コレステリンの酸化で生じた過戚化水索會検出するため
Ｖこ好適な系統、Ｍ判にはペルオキシダーゼ、稜ｌｌｌ
１ｉ＋１４、鐵化指示楽及びＷ合によってはｖ他剤等か
例えば、グルコース用迅運試験のに２１１Ｘから公知で
ある。これらのＭオリな系此の使用可能な成分の？１ｌ
Ｆｉ、次のとおりである：ベルオキシダーゼの中で、特
にオランダｊラシ（Ｍ＠ｅｒｒ＠ｔｔｉｃｈ）からのも
のが適蟲であるが、ラクトペルオキシダー（等も使用可
能である・緩衝剤としては慣用のもの、例えば、＊＊基
塩−クエン酸塩−又は備酸塩緩衝剤が挙けられる。診断
材料でＩＪＩ製されるｐＨ値は、４と９の間、有利には
５と８の間であるべきである。

酸化指示桑としては、種々の軒類の化合物、すなわちベ
ンテジ／ｌｓ導体、例えば西ドイツ特許出願公告第１５
９８１３１号による０−）リジン、０−バニリン−導体
又は西ドイツ特許出願公告第１６４８８４０号による複
素環式アジンが、挙げられる。

診断材料、特ＩＣ試験フィルム用のも方になお慣用の膨
化剤、例えば、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロース等Ｖ史に酵素用の安定化剤、例えば、ジテ
オエリスリットｔ＃Ａ加することもできる。

試験フィルム用の基材は、ガえば、ポリプロピオン准ビ
ニル又はポリ酢酸ビニルからなるグツスチツタ・分散液
である０該基材にすべての試薬を、有利には溶かした形
で混入し、混合物を薄いフイタムＶｃＩＩｌｉ布し、か
つ、乾燥させる・試験紙は、試薬を水又は水と有機溶剤
からな為混合物に＃かじ、ろ紙に静沿を含浸し、かつ屹
錬させる０しかしながら、先ず水浴性試薬を前以って含
浸し、かつ次いで例えば、有機＃！液からなる指示薬で
後含浸することもできる。

次に、実施例につき本発明【詳説する０例１ ろ紙〔シェフイヒヤー・ラント・シェル（８ｅｈｌｅｉ
ｃｈ＠ｒ　ｍｕｄ　５ｅｈｕｌｌ）　６９７８　Ｆ　　
Ｉｎｄ、）七下記組成の溶液で浸漬し、かつ、４０℃で
乾燥させる： １モルのタエン績塩緩衝剤 ＰＨ１０，２５２０ｍｕ コレステリンオキシダービ（６０率位ｌＩＩｇ）　　　
　Ｑ、ｌ　　ｇベルオキクダー（（７０単位ＩＱ）　　
　　　　　　　　０．０＆ｇ蒸麺水　　　　　　　　　
　　全貢五ＪＯ１１１７該紙を、その他に次の表向活性
１實１ｇｔ各々含有する、塩化メチレン１００ａｌｊ中
００−）リジン０．２ｇ（Ｄ＠液で含浸するニー）ポリ
オキシエチレントリブチルフェノールエーテル、（ｂ）
ポリオキシエチレンソルビタン毫ノ？ウレート、（耐ポ
リオ中タエチレｙ）ニルフェノールエーテル、（ｄ）ポ
リオ中ジエチレンラウリルエーテル、（・）ポリオ中ジ
エチレン竜チルエーテル、（ｆ）ｌＮ’ｊオキ７エチレ
ンステアレート、（２）ポリオキシエチレンドデシルチ
オエーテル０ ［謙後、コレステリン含有の血清と緑色の色１４ｔ４し
て反応する、試験紙が得られるｏｊｌｌ’ＩＩカ同時に
コレステリンエステルを含・有する場合には、血清に数
分前にコレステリｙエステツーゼ浴液１ｍｔ−加える礪
會に強い緑色色調が得られる。前記次ｍ清性書５［を全
く含有しない試験紙は、上述の血清とは反応しない０ 例２ ０戯（シュライヒヤー・ラント・シェル５９７ＮＦ　　
Ｉｎｄ、３に下記組成ｏ＊ｇで浸漬し、かつ、４０℃で
乾燥させる： １モルのタエン酸塩緩衡剤　ｐＨ７２０１１１４コレス
テリンオキング−ゼ（６０単位７９）　　　　　０−１
ｇコレステリンエステラーゼ（１８卑心し４ν）　　　
　　　０．２５ｇペルオキシダーゼ（７０単位／啼ン　
　　　　　　　　０’、０５ｇ蒸溜水　　　　　　　　
　　　　　１０〇−紋紙をその他になお、次の表面活性
物質０．５ｇを含有する、塩化メチレン１００社中の〇
−トリジン０．２ｚＯ溶液で含浸する：（１）ポリオ中
ジエチレンココニー）、（ｂ）ポリオキシエチレンオレ
ート、（Ｃ）ポリオキシエチレンボリグロビレングリコ
ール、（ｄ）ポリオキシエチレンステアリルア建ン、（
・）ポリオキシエチレングリセリン毫ノラウレート。

乾燥後、コレステリン及び／又はコレステリンエステル
を含有するような血清と反応して、縁色會呈する試験紙
が得られる。次面活性剤なしの試験紙は反応しない■ 等量のＰＨ５，２５又はｐｌＩ６のタエン酸塩緩備剤を
含有する試験紙も実際に同様に作用するＯ 例３ 例ＩＫより前含浸した紙を、下記１１！面活性物質を１
．５ｇの濃度で含有する、チートン１０Ｇ−中の・−ト
リジン０．８ｇ０ｉｌｌｌ液で後含浸する：（ａ）ジオ
クチルナトリウムスルホ漬りシネー）、（ｂ）ドデシル
ペンゾールスルホン酸、ナトリウム塩、（Ｃ）ラウリル
ポリダリーールエーテルスルフエート、ナトリウム塩、
（６）ナトリウムラクリルナルコシネート、（ｅ）ナト
リウムラウレート、（ｆ）コール酸、彼）デソキシコー
ル酸、（転）ナトリウムタクロコレート。

該試験紙は、実際に例１Ｋよる試験紙と同じ特性′に有
するが、反応色ＩＩＩは長時間安定てめる・ｐＨ７の燐
酸塩竣債液を有する相応する試験紙は、同様の特性を有
する。

例４ 例２により前含浸した紙ｔ、ｏ−）リジン０．４Ｋ及び
下記表向活性物責合０．５′ｇ【含１−する溶液で含浸
する：−フクリルビリジ二りムクロリド、（ｂ）塩化ペ
ンセトニラム、（＠）セチルＦリメチルアン毫ニウムク
ロリド、（ｄ）ｌ−ヒト關キシエチルー１−カルボキシ
メチル−２−アｋ　キにイ」タソリニウムーベメイン。

蚊賦験紙の特性も例２の賦験軟の特性に相応する。

例５ ろ紙（シエライヒャー・ラント轡シュル５９７ＮＦ　　
Ｉｎｄ、　　）を下記組成のｌｌ４ｇで含浸し、かつ、
４０℃でＩＩｆ、瞭させる： １　％＃（ＤＩｉｌｌｌｌｆｆｌ毅爾剤　ｐＨ６２５ａ
ｎコレステリンオキシダーゼ（６０亭位７１１９）　　
　　　　Ｏ，１ｇペルオ今シダー（（７０率位／’ｆｌ
）　　　　　　０．０５ｇコール＠　　　　　　　　　
　　　　　　１．ｏ　ｇアセトン　　　　　　　　　　
　　　　ｉｏ　　ａｊｊｌｌ獅水　　　　　　　　　　
　全ｆｉ１００　　ａｊ販紙會アセトン１００−中の酸
化ｉ水薬の耐液で恢含浸する◎ 指示秦の童、化学構造反びコレステリン含有血清との呈
色反応ｔ−纂１９にまとめる〇ｔａ　　ｌ　　表 ？Ｉｊ６ 下記成分からなる混合物ｔｉ＋＊ａする：ボリビニルグ
ロピオネート分歓振　　　　　　　４５ｇアルギン酸ナ
トリウム％Ｏ−！ｓ４ルのｔｓ酸塩ｍ１ｌｊ中１　、８
５％％ｐｋｌｆｈ　、　ｊ　　　　　　　　３８ｇコレ
ステリンオキシター−ＩＩ’（６０単位Ａｎｔｉ／）　
　　　　　０．５１１ぺに、ｔ＊　シダーゼ（７０単位
／Ｎ９３　　　　　０．２５ｇジオクチルナトリウムス
ルホスクシネート　　　　　　ｌ　　　ＩＫアセトン６
−に浴かしたゆ一トリジン　　　０．６　１水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｏ　　　Ｊｆｊ
該混合物【湿潤フィルム厚約３００ｍｍのフィルムに伸
ばすか、又は固体担持体上に塗布し、かつ、３５℃でＩ
ｉｊ、燥させろ。コレステリンを含有する血液會フィル
ム上に滴加し、かつ、血敵ｉ１分後に、拭きとると、コ
レステリン皺直に応じて檀々の！Ｉ直の緑色呈色が得ら
れる。

前記処方物になお、コレステリンエステラーゼｉ、ｏｇ
ｋ添加すると、高められた含量のコレステリンエステル
を画定すること−できるフィルムが得られる〇 以　　上 第１頁の続き 優先権主張　＠　１９７４年８月１６日■西ドイツ（Ｄ
Ｅ）■Ｐ　２４３９３４８．４ ■発　明　者　クラウス・ボーカムプ ドイツ連邦共和国トウーツイン グ／オーベルバイエルン・バー ンホーフシュトラーセ５アー Ｍ　　明　者　エーリツヒ・ベルント ドイツ連邦共和国ミュンヘン９０ グリュンヴアルダー・シュトラ ーセ３４ ０発　明　者　ヴオルフガング・グルーペルドイツ連邦
共和国トウーツイン グ・ウンターツアイス・メリン グ・アム・オーベルアンガー７

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コレステリ／をコレステリンオキシダーゼの存在で酸素
   を用いて酸化してコレステノン及び過酸化水素にし、か
   つ、過酸化水素上酸化指示薬のペルオキシダーゼ−接触
   酸化によって検出することによって、体液中のコレステ
   リン及びコレステリンエステルを検出及び測定する九め
   の＃新材料において、該＃耐材料が、コレステリンオキ
   シダーゼ、Ｈ，０，検出用の系統、駿備剤の外に肝脂性
   及び親水性物性を有する表面活性化合物の少なくともｌ
   種類ｔ−ｚ〜３０］［童嚢のＩＩ＆度で含浸又は埋設し
   九＃ｌＬ収性担持体又はプラスチックフィルムよりなっ
   ていることｔ特徴とする、体液中のコレステリン及びコ
   レステリンエステルを検出及び１１４定するための乾式
   診断材料０