JPS5854797B2

JPS5854797B2 - γ−Ｌ−グルタミル−４−ヒドロキシアニリドの製造法

Info

Publication number: JPS5854797B2
Application number: JP17283080A
Authority: JP
Inventors: 英彦熊谷; 辰六郎栃倉
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1980-12-08
Filing date: 1980-12-08
Publication date: 1983-12-06
Also published as: JPS5799197A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、式（１）で示されるγ−Ｌ−グルタミルー
４−ヒドロキシアニリドの製造法に関する。

γ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドは免疫抑
制活性を有することが知られていて医薬への用途が期待
されている（特開昭５３−１１３０３２）。

γ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドの製造法
としては、Ｎ−フタリルグルタミン酸無水物と４−ヒド
ロキシアニリンを極性有機溶媒中、アミンの存在下で反
応させる方法等が知られている。

これに対し本発明者らは、γ−グルタミルシスティンシ
ンセターゼ（６，３，２，２Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ
：Ｌ −ｃｙｓｔｅｉｎｅｌ−１ｉｇａｓｅ（ＡＤＰ
））が、Ｌ−グルタミン酸と４−ヒドロキシアニリンよ
りγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドを生成
する反応を触媒することを見い出し、この知見に基づい
て本発明を完成した。

即ちこの発明は、Ｌ−グルタミン酸、４−ヒドロキシア
ニリンおよびγ−グルタミルシスティンシンセターゼを
含有する水性溶液を、ｐＨ４から１０の範囲の州に保持
し、水性溶液中に生成されたγ−Ｌ−グルタミルー４−
ヒドロキシアニリドを採取することを特徴とするγ−Ｌ
−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドの製造法である
。

γ−グルタミルシスティンシンセターゼとしては、精製
酵素標品のみならず、これらの酵素以外の成分をも含有
した粗標品をも使用出来る。

また、γ−グルタミルシスティンシンセターゼはいずれ
の起源の酵素でも可能である。

すなわち、この酵素活性を有することが知られているも
の、例えば、ハト肝臓、ブタ肝臓などの動物起源のもの
、マメ胚芽、コムギ胚芽などの植物起源のもの、サツカ
ロマイセス・セレビシェＡＴＣＣ７７５２，サツカロマ
イセス・カールスペルゲンシスＡＴＣＣ９０８０などの
サツカロマイセス属、キャンデイダ・ニーティリスＡＴ
ＣＣ１５２３９などのキャンデイダ属、シゾサツカロマ
イセス・ポンベＩＡＭ４７７９などのシゾサツカロマイ
セス属、トルロプシス・パーサティリスＮＲＲＬＹ
−６６５２などのトルロプシス属、その他、ピキア属、
プレタノマイセス属、マイコトルラ属、ハンゼヌラ属、
エンドマイセス属などの酵母起源のもの、シュードモナ
ス・エルギノサＡＴＣＣ１０１４５などのシュードモナ
ス属、コリネバクテリウム・エクイＡＴＣＣ６９３９な
どのコリネバクテリウム属、スタフィロコッカス・アウ
レウスＡＴＣＣ４０１２などのスタフィロコッカス属、
エシェリヒア・コリＡＴＣＣ１１２４６などのエシェリ
ヒア属、エンテロバクタ−・エロゲネスＡＴＣＣ１３０
４８などのエンテロバクタ−属、プロテウス・ブルガリ
スＦＥＲＭ−Ｐ４７９５、プロテウス・ミラビリスＩＦ
０３８４９などのプロテウス属、アルカリゲネス・フェ
カリスＡＴＣＣ８７５０などのアルカリ土類金属、バチ
ルス・サブチリスＡＴＣＣ１３９５２、バチルス・プレ
ビスＡＴＣＣ８１８５などのバチルス属、ブレビバクテ
リウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７１などのブレ
ビバクテリウム属、アグロバクテリウム・ラデイオバク
ターＡＴＣＣ４７１８などのアグロバクテリウム属、ア
ルスロバクタ−・シンプレックスＡＴＣＣ６９４６など
のアルスロバクタ−属、ミクロコツカス・リゾディクチ
カスＡＴＣＣ４６９８などのミクロコツカス属、エルビ
ニア・ヘルビコラＡＴＣＣ２１４３４などのエルビニア
属などのバクテリア起源のもの、ムコア・ジャバニカス
ＡＴＣＣ１５２４２などのムコア属、リゾープス・デル
マーｌＰＯ４７７５などのりゾープス属、アスペルギル
ス・オリーゼＡＴＣＣ１５２４０などのアスペルギルス
属、ペニシリウム・ルテウムＡＴＣＣ９６４４などのペ
ニシリウム属、ノイロスポラ・クラツセＡＴＣＣ９２７
７などのカビを起源としたもの、ストレプトマイセス・
フラディアＡＴＣＣ１０７４５などのストレプトマイセ
ス属などの放線菌起源のものなど、いずれも使用可能で
ある。

動植物起源のγ−グルタミルシスティンシンセターゼを
使用する場合には組織を破砕してそのまま使用できるが
、または適宜硫安分画、セルロースカラムクロマトグラ
フィーやバイオゲルカラムクロマトグラフィーなどを行
って酵素蛋白を精製するなどして使用する。

微生物起源のものを使用する場合には以下の方法で調製
すればよい。

微生物の培養物または菌体を得る方法は特定の方法を用
いることを必要とせず、通常の培地を用いて通常の方法
で培養すればよい。

γ−グルタミルシスティンシンセターゼとして、培養物
をそのまま用いても良いし、菌体、洗浄菌体、菌体処理
物（凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン、界面
活性剤等と接触せしめた菌体、リゾチームで処理した菌
体、超音波にさらした菌体、機械的に破砕した菌体など
）これら菌体、または菌体処理物から通常の酵素分画法
によって得られたγ−グルタミルシスティンシンセター
ゼ活性を有する酵素蛋白区分、さらにはこれらの菌体の
固定化物、菌体処理物の不溶化物等いずれも使用できる
。

Ｌ−グルタミン酸、４−ヒドロオキアニリンからγ−Ｌ
−グルタミルー４−ヒドロオキシアニリドを生成せしめ
るには、水性溶媒中にＬ−グルタミン酸、４−ヒドロキ
シアニリンおよびｒ−グルタミルシスティンシンセター
ゼを溶解し、溶液を１０から７０℃の範囲の適当な温度
、およびｐＨ４から１０の範囲の適当なｐＨに暫時保て
ばよい。

水性溶液中に抗酸化剤、界面活性剤などを添加すれば好
ましい結果が得られる場合が多い。

また、反応中、必要ならば反応液に原料であるＬ−グル
タミン酸、４−ヒドロキシアニリンを追補添加してもよ
い。

４−ヒドロキアニリンの溶解性を増すために水性溶媒と
して、エタノール、アセトン等の有機溶剤を含有するも
のを用いてもよい。

反応液は特に強い攪拌をする必要はないが、必要により
適宜攪拌する。

水性溶液中に生成蓄積されたγ−Ｌ−グルタミルー４−
ヒドロキシアニリドを採取する方法は、゛イオン交換樹
脂を用いる等の通常の方法で行うことができる。

実施例１ ■ γ−グルタミルシスティンシンセターゼ生産菌の培
養；１１当り、グルコース１０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２
００，２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ。

ＮａＮＨ＋ＨＰＯ＋１０ｇ、クエン酸１水和物７
．０ｇ１Ｌ−スレオニン２５η、Ｌ−ロイシン５０／Ｉ
ｌグ、Ｌ−プロリン２５η、Ｌ−アルギニン５０η、Ｌ
−ヒスチジン１０η、サイアミン１．０■およびペプト
ン１０ｇを含み、ｐＨ８，０に調節した培地２００ｍ
ｌずつ２１容フラスコ５本に入れて加熱殺菌した。

これにあらかじめ、ブイヨン培地にて前培養したプロテ
ウス・ミラビリスＩＦ０３８４９を接種し、２８℃にて
３６時間振揺倍養した。

一方、１００１容ジャーファーメンタ−に上記と同じ組
成の培地２５１を入れ、殺菌後、上記フラスコ５本の培
養液を入れた。

培養は好気的条件下にて２８℃で２４時間培養を行った
。

このようにして得られた培養液を２００００ｒｌ）ｌに
て連続遠心処理後、湿重量７５０ｇの菌体を得た。

これを−２０℃にて凍結保存した。

■ γ−グルタミルシスティンシンセターゼの調製１）無細胞抽出液：凍結した菌体７５０ｇを融解後０．０１ＭＩＪン酸緩衝
液（ｐＨ７，０、５ｍＭＭｇＣｌ□含有）にて全量４
１とし、「ダイノミル」にて細胞膜を破砕し、遠心分離
後、無細胞抽出液を３．８１得た。

２）硫安分画：無細胞抽出液を硫安４０〜８０係にて分画した後、０．
ＯＩＭＩＪン酸緩衝液にて４℃で透析を行った。

３）プロタミン分画：塩基性蛋白質および核酸類を除くために総蛋白の約ｌｏ
％のプロタミン硫酸を加え、遠心分離により生成した沈
澱物を除去した。

４）ＤＥＡＥ−セルロースカラム処理分画：この上澄液
を０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７、Ｏｓ５ｒｎ
ＮｉＭｇＣｌ２含有）にて平衡にしたＤＥＡＥ−セル
ロースカラムを用いてクロマトグラフィーを行った。

０．０５ＭＮａＣｌ溶出液の活性部位を硫安８０％
にし、約１０日間静置後、遠心分離を行い、沈澱した酵
素蛋白質をＣＩＯＣｌ０Ｉン酸緩衝液に溶かし酵素液を
得た。

５）ヒドロキシアパタイトカラム処理分画：ＤＥＡＥ−
セルロースカラムクロマトグラフィーにて得られた酵素
液を０．００１Ｍ’Ｊン酸緩衝液（２ｍＭＭｇＣＩ
□金含有にて充分透析した後、ヒドロキシアパタイトカ
ラムクロマトグラフィーを行い、５０ｍＭと１００ｍＭ
のリン酸緩衝液溶出液より活性部分を得た。

６）セファクリルＳ−２００カラム処理分画：ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィーで得られた酵素
液を０．０５ＭトＩＪス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に
て透析後、同緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−２０
０カラムにてクロマトグラフィーを行った。

７）セファデックスＧ−１００カラム処理分画：セファ
クリルＳ−２００カラムクロマトグラフイーで得られた
酵素液をセファデックスＧ −１００カラムにてクロマ
トグラフィーを行い、諸性質の検討して精製酵素とした
。

第１表に精製の手順と比活性等をまとめた。

酵素活性二単位は蛋白質１ｍＪ！当り１分間にＬ−グル
タミン酸及びＬ−システィンより生成されるγ−グルタ
ミルシスティンのμｍｏｌｅ数で示した。

■ γ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドの製
造得られた酵素蛋白を１．０ＭトＩＪス緩衝液（ｐＨ９，
１５）に６２．７η／ａになるように溶解して酵素液し
た。

これを用いて、第２表に示す反応液を調製し、これを３
７℃に１２時間保った。

反応液中には４２０／ＩＩ９／ｌのγ−Ｌ−グルタミル
ー４−ヒドロキシアニリドが生成蓄積された。

γ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドの定量分
析は、高速液体クロマトグラフイ−によって行った。

実施例２１１あたり、グルコース１０ｇ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０
０，２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１０ｇ、ＮａＮＨ４・ＨＰＯ
，−４４Ｈ２Ｏ１０、クエン酸１水和物７．０ｇ、Ｌ−
スレオニン２５η、Ｌ−ロイシン５０η、Ｌ−プロリン
２５η、Ｌ−アルギニン５０η、Ｌ−ヒスチジン１０η
、サイアミン１．０／ＩＩｊｉおよびペプトン１０．Ｆ
を含み、ｐＨｓ、ｏに調節した培地を５００ｍ容肩付フ
ラスコに１００ｍ１入れて加熱殺菌した。

これに予め、ブイヨン培地にて前培養したプロテウス・
ミラビリスＩＦ０３８４９を接種し、２８℃で２４時間
、振盪培養を行った。

培養液を遠心処理（８ｏｏｏｒｐ＊・３０分）して菌体
を得、これを冷却したトリス緩衝液（ｐｉ（７，４，０
，０５Ｍ）で２回洗浄した。

次に菌体の湿重量の５倍容量のトリス緩衝液（ｐＨ７，
４０，０５Ｍ）に懸濁し、超音波細胞破砕機にかけて５
分間菌体を破砕し、遠心処理（１００００ｒｐｍ、３０
分間）して沈澱物を除いて酵素液を得た。

このようにして得られた酵素液を用いて実施例１に示す
方法によりγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリ
ド生戒生馬反応った。

その結果、反応液中にγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロ
キシアニリド０．４４ｇ／ｌが生成蓄積していた。

上記の方法で得た反応液２１を「ディオライドＣ−２０
Ｊ（アンモニウム型）カラムに通過させ０．７Ｎアンモ
ニア水で溶出させ、塩酸で中和させ濃縮した。

メタノールに加熱溶解し、再結処理してγ−Ｌ−グルタ
ミルー４−ヒドロオキシアニリドの結晶を１８０■を得
た。

実施例３グルコース１．０ｇ／ｄ１１．ＫＨ２ＰＯ４０，２
ｇ／ｄｌ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１ｇ／ｄｉ１ペプトン１．
０ｇ／ｄＡおよび酵母エキス１．０ｇ／ｄＡ！１（
ｐＨ７，０（ＫＯＨ中和））からなる培地５０１１Ｌｌ
を肩付フラスコ（５００ｄ）に分注し、１１５℃にて１
５分間殺菌し、放冷した。

これにあらかじめブイヨン培地で前培養して得た下記第
３表に示す微生物をそれぞれ接種し、３１℃にて２４時
間振揺培養した。

得られた培養液をそれぞれ遠心分離処理して菌体を集め
、超音波細胞破砕機にてそれぞれ破砕し、更に遠心分離
処理して、それぞれ無細胞抽出液を得た。

これを酵素液として第２表に示した反応液を用いて、３
７°ＣＪごて１２時間反応せしめた。

反応液中に生成したγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキ
シアニリドを高速液体クロマトグラフィーにより定量を
行った。

Claims

【特許請求の範囲】

ＩＬ−グルタミン酸、４−ヒドロキシアニリンおよびγ
−グルタミルシスティンシンセターゼ（６，３，２，２
Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ：Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅｌ−１
ｉｇａｓｅ（ＡＤＰ））を含有する水性溶液を、ｐ
Ｈ４から１０の範囲の田に保持し、水性溶液中に生成さ
れたγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリドを採
取することを特徴とするγ−Ｌ−グルタミルー４−ヒド
ロキシアニリドの製造法。