JPS5856678A - 新規リゾチ−ム感受性微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規リゾチーム感受性黴生物ならびに咳黴生愉
を用いるプ四トプ２ストの調製法および黴生物の形質転
換法κ関する。

以下本発明を詳ｍＦｃ説明する。

本発Ｉｊｉｉｔ新規リゾチーム感受性徴生物ならびＫ皺
徴生物を用いるプロトプラストの調製法および微生物の
形質転換法を提供する。

本発明の新規リゾテーム感受性徴生一κは、コリネバタ
テリウ▲属またはプレビバクテリウ五属に属し、コＩＪ
７７，／ｌ未満の濃度のりゾチー▲ｋ感受性を示す微生
物があけられる．本尭明徴生物は，培養中に抗生物質な
どの薬剤前処思を施さずに、単にリゾチー▲処理でその
細胞壁ｔ゛柵解除去され，高儀条件下でグロトグラスト
化される． 試験管内でデオ中シリボｌｋｌｌ（ＤＭＡ）ｔベクター
１ツス建ドＤＩＡＫ組込ませ、それを愼生物＃１１内ｋ
導入するｍ伝子工学釣技法は，最近非常κ注−されてい
る． 遺伝子工学的技法によって得られる形質転秦細胞は、ベ
タタ一の自律的Ｉｌ製に＠伴して得られる 異種 ＤＩＪ▲の製造手段としても．ｔた真種ＤＩ▲を細胞内
Ｋ存在させることによって細胞に価値ある特性を付与す
る中段としても冨蚤である．この分野での＠死の多くは
大腸曹を宿主とする系で行われているが、大腸曹以外の
工業的に有用な値生物、例えはアミラーゼなどＯ生童曹
である枯軍曹、抗生物質などの生＊＊である放細曹およ
び一造用アルコールの生童曹である酵母などでも「組換
えＤＭＡ技法」を確立しようとの試みがな嘔れている。

遺伝子工学技法では、ベクタープラス冫ドを単一したク
、異＠ＤＩ▲を組込んだハイブリッドプラスミドを解析
するのＫ，培養ｓａｌからのプラスミドＯ分雁操作が必
懺であるが，それには、まず＃総をＭａｌしなければな
らない．その破栖はＤＩ▲のせん新を肪止するために１
１和な矯件で行う必賛があるので、超音波やフレンチプ
レス等のＩａＩｓ的値譲法祉遍用できず、通常、細胞＆
１１Ｍ−累を用いる方法で行われている。

創記の組換え１）Ｎ▲研究のなされている曹楕にはいず
れ一目的にかなう１１１ｉ＃本があり、それらが使用さ
れている。

大＃１ｈｌｋ中枯草曹など多くの＃ｉｍでは、細曹紬ｂ
ｅ妙解酵索リゾチームによ夛ｂ易に細胞費を溶解除去で
畷るが、リゾチームで皺解され顛い細曹もある。このよ
うな細胞＊ｂ齢解性０＠檜では培養中に高鏝度のダリシ
ンなどのアミノ酸中ペニシリンのような抗生物質に接触
させて細胞をリゾテーム感受性化させ％し，かる倣にリ
ゾチームＪＧ場する方法がとられている．グルタミン酸
、リジン等多くの１ｔノ絨の工業生童κ用いられるコリ
ネバクテリウム属およびプレビパクテリウム属に属す／
８一棟は、過冨、一胞黴がリゾテームに一癖解性である
ので、便米、これらのｍａｔでは培養中に・・ニシリン
のような抗生物質を作用させた場Ｉ１細胞にリゾテー▲
処塩する前記のどと龜＃ｌＩ＃ＩｌＩｌ！絵云法が使わ
れて＃ｉた．しかしながら，この方法は煽雑であるはか
りでなく、Ｊ＆彊粂件でリゾナーム処塩することによっ
て生成するｍｍ一除六一胞（プロトプラスト）の正常細
胞への復帰能（４％生能）が低いなどの欠点がある。

本＠明者らｌまコリネバクテリクム属およびプレピバク
テリウム属ｌ＃ｉ徳などの有用細曹において組換えＤＭ
Ａａ法を確立せんがために、これらｉｉｉｓの細胞壁の
除去法κついて検索してき九。

その一法として、本出願人が特１！ｉｌｌ８ｊ参一ｌコ
Ｊ７デ参号公報に開示したコリネパクテリウム属および
グレビバクテリウム属菌種のりゾチー▲感受性菌株を用
いてリゾチー▲による細胞壁の除去法を検討してき九が
，これらの菌株はいずれもリゾテーム非ｓｇｔ性株と同
橡Ｋペニシリン等の前処理なしに唸りゾチームでその細
胞一がｓｍ除去されなかった。そこでさらに検討した結
果、咳公細公＠記載のリゾチー▲悪受性一味よヤさらに
為度のりゾテーム感受性度ｔ有するリゾチーム超感受性
一休はその細胞壁がペニシリン等で前処埴することなく
リゾチー▲で１＃聯されることを見出した。さらに本発
明者らは、ζＯような璽抹を用いれは、細胞内からのプ
ツスミドの抽出がＷＪ＆に行なえ、またリンナーム旭壊
で生成するプロトプラストの鼻生馳か優れているためプ
ロトプラストを用いるＤｌｍＡ［よる形實転挾を効率的
Ｋ行わしめるζとかできることをＸ出し、本発明を完成
するＫ至った。

本発明のリゾチーム感受性株はコリネパクテリウム属ｔ
九はプレビバクテリウム属のりゾチーム非感受性株（例
えに野生株）まえはリンチー▲低感受性株を親株とし、
ζれｆ変Ｊｉ４鋳導処通して取得される。変異ｍ導の力
癒としては、索外ＩＩＩｗＫ射、放射線照射、質＾紡起
剤処塊勢の通常の方法が用いられる。変Ｉ４篩導され次
ｔ典株から本発明倣生物のごときリゾテームに勉感受性
を有する一株（以下本軸明のリゾチーム感受性味をリゾ
チーム一感受性株ということがめる）ｔ−遍択するには
、嵐株が、７ｃ全に生賀する偽めて低鎖直のりゾテーム
（ＩＩ−１１μＩ／一禾−）を含有する培地で生育でき
なく【、リゾチーム勲龜加培地で生育できるものを遍べ
はよい。

本発明の倣生物の具体的例としては、コリ不パクテリウ
ム・クルタミクム−２１−１０４株（倣工＠寄託受塊★
号！タダ！）を親株として酵導されたＬ−／！ｒ株（ｍ
ｌ工輯嵜託ｌＪ！厘賛号！？−４７、コリネバクテリク
ム・ハーキエリス▲’ｘｃｏｉｉｒｔｔを嶌株として一
導されたＬ−／０３株（像工斬寄託受ｍｓ号ｊナ参７）
、プレビバクテリウム・デイパリカッム▲ＴＣＯ／ダ０
２０を一株として鱒導されたＬ−一〇−株（ａ工研奇託
受珈番号ｊｆ＃Ｉ）およびプレビバクテリウム・ラクト
７アーメンタム▲テＯＣＩＪｔｊＪｔ−歳休として紳導
され九Ｌ−Ｊ／コ休（窮工ｉ＃脊託受塩喬号ｊタ−デ）
があげられる。これらのりゾテーム超感受性株は黴生物
工業技術−死次に脅此され上記のような黴工研脊Ｉｉｔ
受城着号がつけられている。さらに米一のアメリカン・
タイプ・カルテャー−コレクシ欝冫にも▲Ｔｏｏ▲Ｊ／
ｒＪＪ、３１１１参、Ｊ／１４４、Ｊ／Ｉｔ７およびＪ
ｌＩＩＩとしてそれそれ寄託されている。

なお、コリネバクデリウム・グルタミクムと命名した２
２１−／０４株は土壌から分一し九一抹で、その菌字的
性状は次の一如である。一字的＠賀の検討は”Ｍａｎｕ
ａｌｏｆＭｉＣ＋’ＱｂｉＱ１ＱｇｉＣａｌＭｅｔｈｏ
ｃａ’ｂｙｔｈｅＢｏｃｉｔｙｏｆ７ｕｏｅｒｉｃａｎ
Ｂａｃｔｅ−ｒｉＯＩＯｇｉｉｌｔＱＯｍｉｔｔ＠＠ｏ
ｒ１＄ａＣｔ４ｒｉＯｌ％ｉ（：ＩｓｌＴ＠Ｃｂｌｌｌ
ｑｕｂ（ｌデｊ７）に記載された方法で１１つた。

■・細胞形鯵 過常ａ７〜／．ＯＸ／．５〜ｉ０ミクロンの楕円あるい
は殻桿状であるが、培簀粂件により複数の細胞が厘鎖状
あるいは■字皺に連−し九ような多形性を示す。グフム
ー性、井連動性で胞子をつくらない。

ト富栄養培地での生育特性 寒天培地上でＯ率集語は円状で、六一は九沢をおび，色
は淡黄色である。スラント上での生育は同じくＩｋ＊色
で不ｉａ１である。球大培地上の一剰培養で紘敵上部で
艮〈生育し、深部ではわずかに生育する。献Ｓ４−培嘗
ではｔノずかに生育し看千一状に沈降する。

量・止珈的性賀 ／）ｍ＆二至４１１［ｔ’！Ｊｊ〜ｊ７゜Ｃだが、４４
．２℃でかすかに生育する、 Ｊ）Ｉ）Ｊ｛二主通ｐＨ７〜ｔだが、ｐｉｔｉ〜タでも
生１Ｉｔ町馳である， ３）＃ｍｌ熱性、 ４Ｉ）好気性、 ｊ）ゼラチンを液化しない， ｔ）カセインを分解代謝しない、 ７）インドール非産性、 ｌ）カタ２−七陽性、 ？）−初非四化性， ｉｏ）ｆルコース、フラクトース、１ノノース、マルト
ースから酸を生成するが、キシロース，ガシクトース，
ラクトースおよびグリセロールからＦｉｌ１を生成しな
い、ｉｉ）ビオチン資水性、 ／λ）ビオチ／量制＠培地では多量のグルタミン酸を腫
生ずる、 ｌ３）尚一度ビオテン含有培地では乳酸およびα−ケト
グルタール酸を急生する。

以上の結果は、Ｊ．Ｇｅｎ．▲ｐｐＬＩＪｉｃｒｏｂｉ
ＯＬ，７Ｊ，２７Ｆ−１０−／（／１４７）に記載され
た鯛曹詳と比軟す◆と、コリネバクテリウム・グルタミ
クムに極めてよく一致している。それゆえ、ココｊ−１
０４株はコリネバクテリシム・グルタミク▲と同定され
た菌株である。

リゾチーム非感受性のコリイバクテリウム属およびプレ
ビバクテリウム輌菌株から本発明のりゾチーム趙感受性
変異株を堆得する方法について具体的一例を以下に貌明
する。嵐株を栄養培地に植曹しＪＯ〜Ｊｊ’Ｃで振盪培
養する。対畝増殖期中ばで培誉を中止して集劇し，生１
的食塩水で洗浄級、過当なｐｌｉＪｌｌ餉液（ｐＭｊＪ
〜ｔｏ）、たとえはＭ／コＯトリスーマレート駿ＩＩＩ
液（νｄ五〇）に約／Ｘ／０’〜／Ｘ／０’細胞／―と
ｒｌるように鰺淘する。この一濁液に象Ｍｉｌｌ良λ０
０〜２００μ１１／ＱＣなるようにニトロングアニジン
を加え、一〇−Ｊｊ’ＣでＪｏ分〜１時間放置する。

遠心分一により集−し、同一緩負液で曹体を洗浄恢、生
埴的食塩水に懸淘し，庄理的食塩水で逸１ｔ希釈して一
定量を栄養寒天培地九とえはＮＢ寒天培地（ＭＢに／．
１一寒天を含む培地）上に塗りつける。コｊ−Ｊｊ℃で
ｌ〜参日間ｊ＆養し、生じたコロニーを栄養庫大培地と
、コｊ−２ｊｔｔｌ／ｄのリゾチー▲を含有する栄養寒
天培地とＫレプリカ塗布する。

レプリカ平板をコｊ〜Ｊｊ℃でｌ〜参日間培ＩＩ後、栄
養球天培地で生育しりゾチーム含有寒天培地で 生育しない一忙リゾチーム超感受性変異株としてｋＩＲ
得する。

上記のｉｌ専抹はいずれもこうして侍られた値ソテーム
超ＩＩＩｋ受性涙＾株である。

リンテーム起感受性ｔ異休のリゾテーム感受性反は対数
増地期の約ｉｏ”細胞柘幽を倍々糸タリの線度のりゾテ
ームを含むＮＢ寒天培地上に―下嫉伽し、３０℃でλ日
関培ｌＩ後、曹の缶育状ｊＩＩＡを観察することによっ
てーｊ定できる。一〇生肯が全くーめられｌ，い歳小の
リゾテーム一度ｔ―のりゾチームム１父性麺（献小生育
阻止龜度）として各覗株と比軟し九鮎米を纂ｌ衆に示す
。

本尭明のリゾテー▲超Ｊｌｌｌ蛍社浚典株は紬紀の如く
リゾテームコｊ〜よｊμ１７／Ｍ含有するｂｂ寒天培地
上で住育できない餉抹として：Ｉ４択Ｊることによって
得られるが、→一紹！参一ｌコＪ７タが号公報に記載さ
１したコリネハクテリウ▲属およびプレビバクアリウム
ｍｒｓｍノリゾチー▲感受性褒ＪＩｊ株番ゴリンチーム
−００〜夢００μＩ／ｄ含有するＢＩＢ球大培地上て生
青できない麺株を選択して得られたものてあ９、崗ａｔ
よ本實的に画つ九社★ｔ肩丁る−ｊ総性がある。檎に、
それらの賀銭ｗＩ尋の一休ケこ細いたリゾデーム′＃＃
ｉＩＩｋ受憔−休は上記のリゾテー五悪質性度絢定紘に
より鰍小生宵凪止砿良参ＱＱ〜ｔＯ０μｉ／ｌとはソ１
ロｊ−であるに４かかわらす、本尭−の倣使勧のリノチ
ーム感受性＠／４〜３コμｉ／ｗね肴一陥ｊ−−ｌ２λ
７タ参号公権記載のリゾチーム感受性一休のリノナーム
感受性ｍコｊ〜ｔｉｒｏｏμｌ／１とは明らかκ異って
いる。さらに藺看ではべさシリンの薊処坦な〈して容易
に＃ｉ胞−が緩ｍ除去されることに基づいて以下に＋１
！―する有用性を有すのに対し、ｕｋ省にはそれらの特
性がないことから、リゾチー▲超感受性菌株はりゾナ〜
ム感受性菌株とは異質の菌株であることが明らかである
。

リゾチームで８Ｊ＆に細胞歓か冶解除去される本発明の
倣生物の有用性は、ｉ）細胞一か除去されたプロトプラ
ストの再生詫が優れていることに１づき、そのプロト１
ラストを川いることκよってＤＩ▲による効単的な形質
転換を町能ならしめ、コ）細胞中からのプシスミドのよ
うなＤＩ▲の抽出分一を容Ｊ６Ｋする、などの点にある
。以下詳細に説明する。

ｌ）本発明黴生物からのプロトプラストの１製および骸
プロトグラストを川いるＤｌｌ▲による形質転換 プロトプ２ス｝Ｏｉｌｉｌｉ製は単に櫓書増畑させ九細
胞を亀縁りゾチーム処塩゛ｔることによって行われる。

培地は一が壇へできるものであれはよく、例えは栄養石
地１４Ｂｔ−用いる。培地に−１ｋ績檀し、コＪ〜３７
℃で振盪培養して対畝期の中期あるいは健期１で培養し
Ｍｍｋ集曹する。次いで過当な＾張培地に触軸徴度ａコ
〜ｌ０〜／ｄのリゾテームを含む液にａｉ淘丁る。−張
坩地とじては、例えばｆ３８Ｍ培地〔グルコースコｏｐ
、（ＮＨ，），ＢＯ，／Ｏｊｌ％縁嵩３１％酵母エキス
／ｍｌ，ｌＵｉ，｝Ｏ，／ｊ．ｕＲ，−４１．０４４１
．ｌ●８０ｊ・７ＨＪＯ／０１４７、Ｍｎ８０＋−参〜
４Ｍ２００．ＪＩｌ＠、Ｚｎ８０，−７１，ＯＱター）
、ｃｕｓｏ，−ｔｎ．ｏｏ．ｐｑ、Ｎａ，Ｂ，Ｏ，−ｉ
ｏｍ，ｏｏ．ｏデ噌、（Ｎ｝Ｉ，），ＭＯ７（Ｊ，，−
４Ｃ１４００．０＃Ｑ、ビオテン３０μＩ１サイアミン
塩酸塩／ｌＩｆを純水／Ｉに含み、ｐＨＺＪＫ調整し九
培地〕の一倍希釈液中にσ弘Ｍシヨ軸、０．０７ＭＭＩ
ＯＩ．・！ＨＪＯを含み、ｐ！１７．０〜ｔ．ｊＫ調整
した培地ＰＦＭ’ｉｉ使用することができる。ＪＯ〜３
７℃で反応するζとＫよって正常細胞は次絽にノートグ
２スト化され、その横度は九字’ＩＩＩ４ｖ続で嵌察で
龜る。ほとんどの細胞かノＣトノラスト化されるに費す
る時関は一休によって異なるが、前記条件でＯ．ｊ〜１
時関である。リゾチーム作用後，ζの掴一陶液中の低張
条件で破裂死せずに生残する正常細胞はリゾチーム処理
に供試し九初発の正常細胞の／０−ｗ以下１（すること
ができる。

仁のようにしてｖ４Ｍされるノロトプラストは遍幽な高
彊寒天培地上−ごコロニー彩戚絽（再生能）を有する。

＾一味大坩地としてれ、例えはＲＣＧＦ培地Ｌグルコー
スｊＩ，カゼインハイドロライセートＪｉｌ％酵母エキ
スよ！ｌ％ＫコＨＰＯ４１Ｊ．！Ｉ，ＫＨＪＰＱ＠／．
ｊＩ，ＭＩＣｌ２−ｔＢ２００．夢／Ｉ，Ｆｅ８０，−
７Ｍ，ＩＣ／０１４７、ＭｒｌＢ−Ｄ．Ｉ１４’〜Ｉ馬
ＯコＡｉ，ｚｎｌ＊ｓ７ｋｘ，υＯ．２吋、（ＮＨ４１
）ＡＭＯ７０Ｊ４１−参Ｈ，Ｌ＋０．０参〜、ビオチン
ｉｏｓｌｓサイアミン塙【堪コ吋、コノ・ク酸二ナトリ
ウム／３！ｌ、ポリビニルビロリドン（分子重／０，０
００）ＪＯ１１ｋ細水／ｌに含み，ｐｍ７．２ｆｃ銅灸
し九培地〕を用いることができる。ｋｔＣＬ｝ＰｊＱ地
でのプロトグラストの丹生は、田体、リソテーム処ｍｓ
度およひ処塩跨閾ｙｃよって血十典なるが、リゾチーム
処ｂ供緘初開止富鯛胞ゐたり２０〜７０優の効奉でめ４
ａｔた丹生コロニーの出稠が認められるに賛する培養日
数Ｆｉ繭株で差があるが．ｈ＊できる筐での大きさにな
るのは！〜７日である。

以上のような特性をもつ該倣生一から僧られるプロトプ
ラストのＤ掘▲による形質転挾は、ポリエチレングリコ
ール（ＰＩ（｝）ま九はポリビニルアルコール（ＰＶ▲
）と二一金１ｓｌｌ＃イオンとを共存する高張条件下で
原プロト７ラストとＤＩ▲とを混合処理することによっ
て行われる。形質転換株は、前配のプロトプラストのｈ
生と岡様にＲＯＧＰ層地のこと＠鵡彊寒大培地上でプロ
トプラストを舛生さぜ、正常細胞として権得される。ル
貢転快休Ｃ工供与ＤＮ▲に由米する遺伝子かーに＋１与
する％似的杉質に基いて應也することかできる。この辿
択は高ｇＩ＆球大檜地上でＳ止と同時に行ってもよく，
あるいは一旦＃！辿値的Ｋ？４生させてから衿生細胞′
ｔ″毫め曾瀘の低彊寒天培地上で行ってもよい。

このような方法を一崩して通常の１シスミドＤＭ▲で形
買転換した一合，杉質転快株は再生一ゐたクｌ０〜ｌθ
の鎖度で侍られる。

影質転換については後記夷ｈ例に具体例を述べる。

コ）形質転換株からのプラスミドＤ）Ｊ▲の単一 菌が増殖できる培地、例えばＮＢＪ＠地で培曽し、集ｌ
Ｉｌ後，リゾチーＪ−ｔ作用さゼて細ａｍを沿解させる
。浴−一からは％例えばＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙａ
．▲ｅｔａ，ＪＩＪ参１７−参４３（／デ７ｊ）に記執
されたような通常用いられる方痢によシグフスミト’ｔ
−谷易に−輪分廟できる。

使用するりゾテームの１１よ、，対象の一休によ夕＾な
るが一＠Ｑ／−／０師／一の一度で行う。

グルタミン鈑、リジン今多くのア・ミノ叡の工業的尭岬
生意に用いら／Ｌるコリネノ｛クテリウム属およひブレ
ビバクテリウ▲鵬■慣への岨供えＤｌｌＩＡａ法の通用
は、それらの＊橿あるいはその他の倣ｇＥ４ＩＩ＋から
アｉノ讃などの有用一貞の生合Ｉｌ！ｃあるいはその一
節に関与する遺伝子をクローン化し、その遺伝情−の増
巾に基づく生合成系の強化により有川資質の缶歳量を増
大させ九ク、さらには動植物の遺伝子をクローン化し、
その遺伝情報の発機により有用なベプタイドをこれらの
ｔ！ｌＩｌ伽を用いて生ｍｇせ祷るａ７能性力・りり、
＆東上゛他めて有用である．本発明のリノテーム超感受
性做生物は、組換えＤＮＡ技昧尋人の前蝿蛾件となる細
胞中からの７ラスイド勢のＤＭ▲の悄出分廟、ＤＮ▲に
よる細紀の杉負転換などを効皐的にイＩわしめること′
ｋ町馳ＫＬ，七れゆえコリ洋バタテリクムＩＩ４ｓ？よ
びブレビパクテリウム属にνｂｙるＭ供えＤ）１▲技昧
の適用を谷勘ならしめるものである。

本発明考らは、本発明微生物がｄらＫ組換えＤＭＡｔｍ
法における安全な宿主歓生−として有用であるζとを見
出し丸。

組み換えＤＭ▲手法において安全なホスト（ＩＩ主）一
ベクター系の確立がまず鯖一Ｋ賛求される。安全なホス
トの条件としては病原性が會わめて弱いこと、人体ｋ寄
生しないこと、自然壌墳に放出され九場合連やかに死滅
することなどが挙げられる。最初に組み換えＤＩ▲技法
に用いられた大膳曹は本来人体脊生性であり、その安全
性については議論のあるところであク九が、少なくとも
最年夷験菫で継代培養されて龜友Ｋ−１２株Ｋついては
、その寄生性、＠原性は着しく低下しているζとが判り
’Ｂ１ホストとして一定された。この五一１２株を人淳
に投与し九揚合航日にわ九シｍＯ＃出がみられｈ一収率
は約ｌ一前後と報告されている（サイエンｘｚｏｅ巻８
１１１〜３９４真ｈｌｏ牛）。

組み換えＤＩ▲技法をアミ１ノ敵・袂績・抗生物質など
の生産曹に拡大していく場合，これら値生物の多くは土
砿より分鵬されたもので、人体への寄生性は低いと考え
られるが，なかには人体消化管内の条件に耐え増殖しな
い★でも、そのまま生きて圓収される揚合一考えられる
。

ころした１株の安全性をさらに増すためκは，消化管内
の条件で死滅するような性質を人為的に附与することが
考えられる．Ｂ２ホストで紘自然穣墳下に放置しても死
滅するような脆弱な性質を附与することが行なわれてい
る。

本発明のリゾチーム感受性徴生物Ｋついて動物の消化管
内での生存テストを行なつ九ところ１動物の消化管内で
着しく死絨しやすいことを見出した。すなわち、ａａｙ
系の膳マクス（体重１９ｉｔ士１）一評２匹ｇｔ匹＊！
ｚ約ａ〜ｓｘｔｏ’の下記黴生資を一口投与して、腸内
に残存する■数と禽便中Ｋ排一される曹ａを、それぞれ
の１０優ホモジエネートを適幽希釈ＭＢｓＦ板培地にま
いて渕定した。第２１ＲＫ示す如く、本発明のリゾチー
ム感受性＃１株は、覗株κ比べ著しく死滅して排一され
麺内での生存曹数も著しく滅さらに本発明のリゾチーム
感受性薗株の掴々薬剤に対すみ性質を−べたところ、櫨
々の抗生１質Ｋ感受性になっていることｔ−ｊＬｔｉｊ
Ｌ九。

すなわち、対数増殖期の約１０細胞相轟を倍々皐判の−
度の薬剤を含むＭＢ晦天培地上Ｋ―下接檀し、３０℃で
２日閏培髪後、菌の生育状繍を嵌蒙することにより本発
明蒙生物の感受性をｍべた結朱、第３ｐに示すごとく、
べ二シリ７Ｇ，リファンビシリンなどに極めて感受性で
あることがわかった。このことは、種々の薬剤で鷺株よ
り殺菌、靜薗しやすいことを示唆しており、組換えＤＮ
Ａのベクターとして礪剤耐性グラスξドを用いる場合の
薬剤抵抗性の増大を緩和する効用もあることを示してい
る。

以上のごとく、本発明のりゾテーム感受性徴生物が、動
物の消化管内で着しく死威しゃすく、さらに禰々の秦剤
に対して感受性になっていることは、該値生智が組換え
ＤＮ▲用宿主黴生物として好ましい性質を有することを
示している。

夾ｊｌｌｉｆＦｌｊ／．リゾチーム超感受性質＾休の振
造コリネパクテリウム・グルタ，ミクムＪＪｊ−／０４
、コリネバクテリクム・ハーキュリス▲ＴＯＯ／ＪＩ４
ｔ，プレビバクｒリウ▲・デイパリカツム▲ＴＯＯ／４
１０コＯνよびブレビバクテリウム・２クト７アーメン
タム▲ＴＯＣ／Ｊ４ＪＪｆ’ｋｉＢ培地（粉末プイｄ冫
λｏｔｉ，一母エキスＪｌを純水／ＩＫ含み、ｐＨｚ一
に調整し九培地）に桶菌し、３０℃で振ｍ培養する。対
数増殖期半はで培養を中止して＊Ｉｌ、生理的食塩水で
仇浄後，Ｍ／Ｊθトリス・マレート＆働ａ（ｐａ＆０）
に約ＪＸ／Ｏ’ＨＪ胞／１となるようにＩｍｆｌ／ｊす
る。

この騰淘蹴に１＃軒績茨≠００μｉ／ｌｍになるようｖ
Ｃニトロソグブニジンを加え、λ３１，ＴＪＯ分関放随
する．鳩心分一により幾−Ｌ．ｌｋ！ｊ一轍餉敵で一体
を仇浄依、生埋的食塩水に一濁し、任塩的食塩水で壜亘
希釈して一短量τｉｎ岸大Ｋ１地とｌλＩμｊ／／ｌの
リゾナー▲言４４球大層雄とＫｍクつける。

ＪＯ℃でλ日ｔ＃ｌＪ増書し、生じたコロニーを宋警瞭
大ｊ＠地と／１１μＩＩ／′一のり／チームを含有する
１４ｌｌｔ球大檜地に冫７リヵ麿今する。レノリヵ平＆
１ｒＪＯ℃で一日関培書彼，ＭＢ庫大培地で生肯姑セ，
リノナーム含有寒天培地で生育しない墓をリノナーム岨
感受性五異株として＊得する。

央施例よ 本尭９１倣庄切ｆ）リゾチームによる細胞搬浴解岐云と
生戚プロトフラストの丹生 コリネパクテリク▲・グルタミク▲ココｊ−／０４，５
リネバクテリウム・ハーキュリス▲’ＸＯＯ／Ｊｔ４１
，プレビバクテリウム・デイバリカッ▲▲ＴＯＯ／＄０
λＯ，プレビバクテリウム●ラクト７アーメ／タム▲Ｔ
ＱＯ／Ｊ４ｊｊおよび、それらからＩ４され夾施例ｌで
傅られたリゾテー▲超感受性変異株の稙冶養を、ＮＢ培
地にＩＩＩＩＩＬ，ｊＯ℃で振盪場齋する。束氷允竃比
色計で≦ｔＯｎｍにおける＠元度（ＯＤ）を絢定し、Ｏ
Ｄ改ｔになった時点で，住塊的負塩水で適当に希釈して
一定麓をＭＢ球大培地に政布し、初発の正常細胞数をー
』建するとＩＩＩｊ時Ｋ、一 ＄１１液から細胞を集菌し、販細劇をＲＣＧｋ’増Ｗｉ
＃／ｗｔｖリゾテームをｔｔｒａ（ｐｎｚｉ）に約ｉｏ
細胞／―となる伽に麺為し、Ｌ皺緘−實に撥して３０℃
でゆるやかに一慮反応する。

ｊ時間故一胞ｔよＪＯＯＸ＆で７０分関纏・１２分階し
てｆｇｌ枢し、前記ＰＦＭ七地に一一し一〇一回遠心洸
浄恢、尋谷董の｝Ｆ一楢地に丹患幽してプロ｝７ｒ）ス
ト＃ｉ液をｌｌＩｌ１線した。この一部ｒとり、一つは
ｉ１ｃＧＦ培地で過幽に廊釈して一定量ｋＲＯＧＰ縁大
培地へ塗壱接種し，もう一つは生珈的負塊水で適当Ｋ希
釈して剥１嘩大培地へｔＭ布振伽し３０℃で培養して、
各々ｉＩＩＩ張条件、ｕｋ瞭栄件テｏ：ｙｏ＝−彫ｇＩ
ＳＪｗＡ菌数（ｃｒｙ’）を求めた。低張条件での生成
コロニー数は、培！ｌ２日目にーＩ足した（さらに培養
しても数は増加しない）。＾彊峰件での生成コ四二一数
は、それ以上培誉ｌ一て４杏生コロニーが増加しない７
日目に鋤定した。これらの結果を熟Ｊ真に示す。

いずれの蛎休も，リゾチームｔ作用６せてもｍ倣鋺で蝮
樟状の止富細胞しか与られず、詠仏のグロトップストの
生成社飯察されない。また低張東件でのコロニー彫成数
もリゾチーム処塩前とはとんと変わらなかった。一万、
リゾテーム雌感受性菌株は、リゾチームの＃ｉｌ！ｔ一
齢解作用Ｋよりプロトプ２スト化され，プ四トグラスト
のＭＮ裂丸する低張条件で生＊口」馳な残存一畝（＆透
圧ショック抵抗性の非クロトプラスト細胞と考えられる
）鉱，リゾチーム処ｍ供賦劇叙あ九りｌ０−″〜／Ｏ−
６であった。これらのノ一ト１ラストは，＾彊粂件では
コロニール成舵を有し、その丹生効率はリゾチーム処崩
供Ｋ一畝に対してコＯ〜７０％でめった。一ｍ−１’ｓ
壬し１こコロ＝−１１１Ｊｎ球大増地上で生宵゛ぐさる
止常細脳でめった。

央ｋｅｌｌＪＬ 本発明値生一から僧られるンレトプラストのプラスミド
ｐＯＧ４ｔＤム▲による形賀転洪／）１ラスミドｐｃｏ
参の分販 本＊ｍ鉤にνいて杉質転換に１ｉ２相するプツスミトｐ
ＣＧ４Ｉ−は、ｌ）ＯＧ４１の保有曹であるコリネパク
デリウム・グルタミクムＪＪｊ−ＪｊＯ（骸１研音肚受
塩誉号纂ＩタＪタ号）の１＠９１曹体から次のようＫ抽
出分一し丸。コリネバクテリウム・グルタミクムλコ！
一一！０をＮＢ坩地でｊ＠ＩｔＬ九種培養！一を、参〇
０一半合成培地８８ＭｔｌＣ接種して１０℃で振盪Ｊ＠
養する。氷水光竃比色針で４４ｅｌｎｍｌｃ：おける吸
光度（ＯＤ）をｍｊｊ！ｔ，．ＯＤＯ．ＪＫなクた啼嶌
で、培養猷中０．７率位／ｄの濃度κなるようにペニシ
リンＧを−加する。さらに３０℃で増＊１鮎枕し，ＯＤ
約σぷになるまで生賞させる。

坩＊＊から蒙捧ｔ来諭し，Ｔ息ｂ綾狗液ＬＯ．（７７Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメメン（トリス）、
０．００１Ｍエテレンジアミ／四訃鹸二ナトリウム（］
ｌｉＤＴ▲）０．０２Ａｔｋｉａｃｚ：ｐｋｉｉＯ）で
洗浄後、リゾチーム獣（λｊｆｂ’／ＥｉｅａｓＯ．ｌ
ＭＭ＆Ｏｌ，０．ｔ）ｊＭトリス、０．ｌｌｑｉ／−リ
ゾテームｐｐｌｉｔｏ）で／ＯｍＫ懸淘し、Ｊ７℃で４
Ｉ−時間反応させる。反応液は，ｊＭＮａＯｊＪｌａｊ
，０．１ＭＥＤＴ▲（Ｘｌｌｉ＃．ｊ）Ｑ４ｓｊ、Ｖ−
ラワリル硫Ｗナトリ９ムと０．７ＭＩＡ＆ＣＩからなる
ｆ＃！ｍ４Ａダｊｌｊｆ：麺次ム加し、緩やかに虎和し
てから氷水中に７！時間置く。溶１１＃全董を遠心賀に
移し、ｒｅでｔｏ分間、Ａ＊ＩＩ００ｘｊｉの１ 遠心分一にかけ上泄液をとる。これに重量日分率ＩＯ％
相当のＰＥＣｋ＆０００ｔ−加え，討かに混和して齢解
後氷水中に亀〈。ｌ１時間後，／，１００ｘ１でｌ０分
間遠心分制してベレットを１収する。Ｔ五８緩恢柩よ−
を加えて、ペレットを靜かに８１Ｆ！！解し−（ρ−＆
：）／．ｊ＆ＦＭエナジクムブロマイドコーをｍ／ＡＩ
Ｌ／ｓこれＩｃ埴化セシウム【加えて静かに険解し、會
良【／，ｊ１０に合わゼる。この＠ｙ７ＩＯＪＯυＯＸ
ＪＩ、ｔｒ’ｃで−１時閾通心９１１ｋ−ｆる。この＠
度匈配遠心により、共薯鮎曾て閉じられ１ｃ壊状ＤＭＡ
は、餡外−フング１ｒ黒射することケこよって鳩心チュ
ーブ中下方のｖ！ｆ度の高いバンドとして兇出逼れる。

このバンドを注射器で造心ナユーノのー自から掘龜とる
ことケこよつ１、ゾシスミ｝ｐＯＧ４１１が分離される
。次いで分＠＊＊静容量のイングロビルアルコール液〔
容量日分皐タ０Ｉｓイングロビルアルコール％ＩＯ’ｌ
ｋＴｔ８緩ｇＩｋ液（この混箪中Ｋ飽和浴解量の塩化セ
シウムを含む）〕で１回処理してエチジウムプロマイド
を抽出除去し、しかる饋に，Ｔｌ８緩働液に対して透析
すムこのようにして／ｊμｇのプラスミドｐｏａａが得
らｎる。

ノ７スミドｐＯＧ≠は約ｌタメガダルトンの分子竃倉南
゛シ、ストレ７′トマイシンおよび１たはスベクテノマ
イシンに耐性を示す瀘伝Ｂａ＋ｌＩＨＩ． 子を有し、Ｑ−Ｑ分子中にＢｅａＲｌ，ＡＨｉｎｄＬＰ
ｕｔ．ｌおよひムａｊ５による切Ｗｒ部位をそれそｎダ
，ａ、Ｐｍ６およひ４一有している新魁グ７スミドであ
る。

Ｊ）プラスミドｐｃｏ＊ｏ杉ｊｉ［＆．快形質転供は、
夾箆例コとーｊ一に詞製した１ノゾチーム処ｍ細胞を川
いて打った。プロトグラストｗＩ液ｏｒ一を小試験管ケ
ことり、シ２００ｘｙでＩ分間遠心分一し、Ｔｂ．ＭＯ
ｋ＠叡（／０１ｆ，Ｍ塩化ｉグネシウム．ＪＯｕＪＭ塩
化カルシウム、ｊＯＬＭ｝ＩＪス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（トリス）、４ＡＯＯム．Ｍシヨ糖、ｐＨ
７．ｊ）７ａｊＫ外Ｓ濁して遠心況浄する。沈４したプ
ロトプラストにｏ．ｌ編ｖＴ８ＭＯ緩冑猷を加え．ゆる
やかに振って丹麺陶する。これに上記のＪ倍７ｋＷＩＩ
１度のＴ８ハＣ−冑叡とｌ対／Ｋ混合したｐＯＧ＄Ｄ＃
Ａ猷σｉｍ（ｏ．λμ＃ｌ）ＭＡ言有）を加えて混和し
、，久いでＴｌｊＪｄＱ轍負叡中に一〇％Ｐ八（ｈＪｈ
Ｏυ０會含む准ｏｌ編を＆加してゆるｆかに楓曾・ｊ゛
る。３分恢、ＲＯＧｍ’４地λ―ｔ−ｍｍし、−ｃｊ０
０Ｘｌ−（ｊ分ＦＩ４）鳩／Ｖ分騙にかけて上ｔｘ−ｙ
鰭を啄六し，ａ′．降したグロトフ“ラストｙ７．ｔＱ
ｈａａｐ増地にｍ濁してからｈａａｐ培遥で叙楓増ｔＣ
■’ｌｌｔ（Ｌ、−５ｔ量をスペクチノマイシン参ＱＯ
μＶ１１ｔを含むＲＯＧ｝庫天培地Ｋ麿泳する。

ｌＢｊ時にコロニー杉成ａｌ鉋曹゜数を知る丸めに、Ｒ
ＣＧＦ課大培地にも高希釈度の液を一定量ｒｉＩｉ泳す
る。ＪＯ℃でｔ日間培養して出構したコロニー数を＃ｊ
定ナる● スペクチノマイシン含有ＲＯＧＦ培地で生じたコロニー
をとり，／ＪＬＪＩＡＩ／ｄのストレプトマイシンを含
むＭＢ蜂天培地に塗りつけ、３０℃でＪ８ｊｎ養してス
トレプトマイシン耐性形實のＩ＋２ノ時謙侍を調べた。

交差耐性を示した休′４ｔ一作為に遇び、夾ｈ例参にボ
す力法で７ラスｉドｔｒｉｍｌ丸． 仁れらのｋｉ鰍ｋ外参次に筐とめで示した。

リゾチーム非感受性の一株をリゾチーム処理」７た細胤
で山楓したスペクチノマイシン耐性休は、ストレフトマ
イシン交龜耐性を示さず、さらに−配の一一Ｉ一一ｊ０
株とＩｗｌ様κグラスミドｔｊＰ階したが，ＰＯＧ参〇
存在は藺められなかった。一方、リゾチー▲超感受性菌
株をリゾチーム処通した細飽で出現したスペクテノマイ
シン耐性株はストレプトｉイシン交差耐性ｔ−有し、そ
れらの株から分離されるブシスミドは、ＩＩＩｉ＠酵素
ＨｉｎｃＬ量で消化後１カロース１ＩＬ気泳動にかけて
わかる生成Ｌ）ｋ４Ａ＃片がｐＣａ−と同一で６つ九。

上記のようにして得られたｐｏａａの杉買歓快休の憾工
彎脅肚受塩膏号を弟Ｉ衆に示九ｖ４論例倶 グラスミドを保有する微生物からのプラスミドの単一 実施例ＪでＪ＆得しＡＩ）ＣＧ−の杉買転換株であるコ
リネバクテリウム・グルタミクムＬ／ｊ／ｐｏｏｐ．コ
リネバクテリウム・ハーキュリスＬ／０１／ｐＯＧ４１
Ｌ．プレビパクテリウム・テイバリカツムＬ１０４’／
ｐｏｅ≠およびプレビパクテリウム・ラクト７アーメン
タムＬｊ／コ／ＰＣＧ参をＭＢ培地で培簀した憤培養ｊ
―を参ｏｏｗ１１ｌＢ培地に植藝し，ＪＯ℃でｌコ時間
振盪ｊＩＩ養すゐ。

培ｇＩ液から菌体を集曹し、Ｔ≦８緩伽液で仇融後，リ
ゾチー▲敵（λｊ−シｄ纏，０．ｌＭｋｉｈＣｌ，ＧＯ
ｊＭトリス，ＱＩＮ／−リンチーＡ：ｐＭｔ）ｉｏ編に
Ｉｖ１滴し、３７℃テｌＩ＃間反応ａゼる。反応液Ｋハ
ｔｍａａｚユ弘−、ｃｊ．ｊｔ門ＩＤ１゛▲（ｐ１１１
１）０．４ｍ，ｕ％９ウリル愼酸ナトリワムとＱ７Ｍｌ
１１ＬＯｊからなる齢取伍参−を一次絵加し，緩中かに
混和してから氷水中κ／Ｊ時間置く。潜１物全量を遠心
管に移し，参℃で４０分間，４露参００ｘｌＯ遠心分一
κかけ上置液をとる。これに重量百分率ｌ０一相轟０−
ＰＩＧｔｏｏｏｔ加え、静かＫ温和して溶解後氷水中ニ
置く。ｌ一時間後，／，１００ＸＩ”Ｃ／０分間遠心し
てベレットを回収する。！１ａｍｗｉｉ液！一を加えて
ペレットを一再溶解してから／．ｊＱ／ｄエチジウムブ
四マイドコ一を添加する．これに塩化セシウムを加えて
溶解し、密度を７．７ｔＯに合わせる。この溶液を夷施
ｆｉＪＫ記戦したのと同一条件で密度勾配達心κかけ，
プ１ｑドを分画採取する。分画液を夷施例Ｊと同機にイ
ングロビルアルコールＷＩＩＩ＆通によシエテジウ▲プ
ロマイドを抽出除去した後，Ｔｌ８１１価液に対して透
析する。

このようにしてＰＯＧ＄を保有するいすれのりゾチーム
勉感受性株からも／Ｊ−１０声ＩのｐＯＧＩ！ＤＩ▲が
得られえ。

−４０３− −４０４＝

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム属またはプレビパクテリウム
   属κ属し、コ！μ１１／一未満の濃度のりゾチー▲に感
   受性を示す新規リゾチー▲感受性徴生物．
2. （２）腋徽生物がコリネバクテリウム・グルタミクム、
   コリネバクテリウム・ノ・−キエリス、プレビパクテリ
   ウム・デイパリカツ▲およびプレビパクテリウム・ラク
   トフアーメンタムから違はれる黴生物でゐるζとを伸愼
   とする峙許請求の範Ｓ第ｌ項記載０＠生一．
3. （３）該黴生物がコリネバクテリウム・グルタミクムＬ
   −／！，コリネバクデリウム・ノー−キエリスＬ−／Ｏ
   Ｊ．プレビパクデリウム・デイバリカツ▲Ｌ−２０＃お
   よびブレビＩ｛クテリウ▲・ラクトフアーメンタムＬ−
   Ｊ／Ｊから選ばれる微生物であるζとを響黴とする特許
   請求の範囲第ｌ項記載の黴生物。
4. （４）コリネバクテリウ▲属ま九はプレビバクテリウム
   属に属し、ＪＩμ７７／Ｉ未満の鎮変のリゾチームκ感
   受性を示すリゾチーム感受性黴生一ＫＩＪゾチームを作
   用させ、鋏黴生物のプロトプラストを生成せしめること
   を譬黴とするコリネバクテリウ▲属マ九扛プレビパクテ
   リウム属微生物のグ四トプツストの調製法．（５）コリ
   ネバクテリウ▲菖１九はプレビバクテリウ▲属Ｋ１ｌ４
   シ、Ｊｊｓｌ／一未満の饋変のりゾチームＫ感受性を示
   すリゾチーム感受性黴住物にリゾチームを作用名せ、得
   られるプロトプラストにデオキシリボ核酸を）ＩＪ）込
   ませ、ついて絨プロトグラストを再生させることを特徴
   とするコリネバクテリウ▲属塘九はプ゛レピ′バクテリ
   ウム属黴生一の形質転換法。