JPS5857152B2 - グルコ−スイソメラ−ゼの固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースをフラクトースに異性化するのに有
用なグルコースイソメラーゼの固定化方法に関するもの
である。

フラクトースはグルコースの異性体であって、甘味性は
グルコースの約２倍であり、グルコースの約半分量の摂
取でグルコースと同程度の甘味を呈する。

したがってカロリー摂取をできるだけ最小におさえなが
ら甘味をとれるという利点を有している。

またグルコースから異性化されたフラクトースを含む糖
液ば、砂糖よりも約１．２〜１．４倍の甘味性を呈し、
近年、清涼飲料、缶詰、冷菓などの分野に急速に使用さ
れつ＼ある。

従来、グルコースからグルコースイソメラーゼを用いて
異性化して液糖を製造するには、一般に約４５〜５０重
量係の濃厚グルコース溶液に凍結されたグルコースイソ
メラーゼ生産菌体を投入し、約７０℃の温度で長時間、
異性化反応を生じさせた後、濾過、脱色および脱イオン
などの諸工程を経ることにより異性化された液糖を得て
いる。

ところが、上記方法では異性化反応終了時、酸素活性が
反応前に比べて約半分に低下し、新しく異性化反応を行
なうときは損失酵素量を補なわねばならないという大き
な欠点がある。

このため酵素を固定化することによって酵素の長期使用
、および酵素反応の連続化を可能にすることが強く望ま
れている。

グルコースイソメラーゼの固定化については遊離酵素と
菌体内酵素を問わず種々の方法が従来から知られている
。

遊離酵素についてはたとえば多孔性ガラスの芳香族アミ
ノ誘導体を担体として用いる共有結合による担体結合法
、ＤＥＡＥ−セルロースあるいはデュオライ）Ａ７など
のイオン交換体を担体として用いるイオン結合による担
体結合法、ボリアクリルア□ドゲル、コラーゲンあるい
はセルローストリアセテートなどを素材とする包括法な
どがある。

これらの方法では酵素が固定されても物理的強度がなく
、大規模なスケールでは使用に耐えなかったりあるいは
連続反応の途中で固定化酵素が膨潤して目詰りしたりあ
るいは物理的強度に耐えても酵素活性が低く、生産性が
非常に悪いといった点があり、工業的に使われる固定化
酵素としては、いまだ充分なものが得られていない。

また菌体を５５℃以上、９０℃以下の温度に加熱してグ
ルコースイソメラーゼを菌体に固定化させる方法も知ら
れている（特公昭４７−１９０３０号）。

この方法では、無処理菌体に比べて酵素活性の低下を大
幅に改良させたとはいえ、残存活性値は初期の４０〜５
０％であり、まだ充分とはいえなかった。

本発明者等は上記事情に鑑み、グルコースイソメラーゼ
の菌体内酵素の固定化について種々鋭意検討した結果、
菌体を無機酸または有機酸もしくはその塩で処理した後
、キトサンまよは部分アシル化キトサンを比較的高濃度
になるように加えて混合し、無機酸または有機酸もしく
はその塩で処理した菌体表面にキトサンまたは部分アシ
ル化キトサン膜を形成させることにより、グルコースの
異性化反応における異性化液の着色がきわめて少なく、
固定化酵素の乾物当りの活性の著しく高い固定化酵素が
得られることを見出し本発明に到達した。

すなわち本発明はグルコースイソメラーゼ生産菌を無機
酸または有機酸もしくはその塩で処理した後、上記該菌
体の乾燥物に対して８重量幅以上のキトサンまたは部分
アシル化キトサンとを混合し反応させることを特徴とす
るグルコースイソメラーゼの固定化方法である。

本発明におけるグルコースイソメラーゼ生産菌体として
は、たとえばストレプトマイシン・フエオクロモゲネス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｙｏｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓ、
ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマイセス・ロゼオクロモ
ゲナス（Ｓ、ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ス
トレプトマイセス・オリバセウス（Ｓ、ｏｌｉｖａｃｅ
ｕｓ）、ストレプトマイセス・カリフォル＝カス（Ｓ、
ｃａｌ ｉｆ ｏｒｎｉ ｃａｓ ）、ストレプトマイ
セス・ベヌセウス（Ｓ、ｖｅｎｕｃｅｕｓ）、ストレフ
トマイセス・バアジニア（Ｓ、ｖｉｒｇｉｎｉａｓ）、
などの放線菌、シュードモナス・ハイドロヒイラ（Ｆｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉ ｌａ）などのシ
ュードモナス属菌、バチルス・メガテリム（Ｂａｃｉ
１ｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｗｎ）などのバチルス属菌
、ブレビバクテリア属菌、ラクトバチルス属菌、アエロ
バクテリウム属菌のようなバクテリアなど広範囲の微生
物菌体が挙げられる。

これらの菌体は窒素源としてコーンステープリカー単独
または脱脂大豆を併用し、炭素源として澱粉、キジロー
ズなどの炭水化物類、無機塩としては燐酸カリウム、塩
化コバルトおよび塩酸マグネシウムなどを含んだ培地に
培養して取得するものである。

本発明において用いる菌体ば、特に上記菌体を培養後、
培養液から分離した菌体そのままがあるいは加熱処理さ
れたものが好ましい。

また、この菌体ばｐＨ５〜９、特に５〜７．０の緩衝溶
液に分散もしくは懸濁されていてもよい。

緩衝溶液に分散もしくは懸濁された菌体の濃度は通常０
．１〜５０重量係重量性しくは０．５〜１０ 重量幅で
ある。

本発明に用いる無機酸または有機酸もしくはその塩とし
ては、グルコースイソメラーゼを失活させない範囲のＰ
Ｈを有するもの、特に、ＰＨ４，５〜７．０であって緩
衝作用を有するものが好ましい。

このような無機酸としては燐酸、塩酸、硫酸、重合リン
酸などがあり、有機酸としてはコハク酸、酒石酸、クエ
ン酸、酢酸、乳酸、フマール酸、マレイン酸、リンゴ酸
などがあり、これらの酸の塩としてはアンモニウム塩、
ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などがある
。

上記無機酸または有機酸もしくはその塩の濃度はその種
類によって異なるが、一般には０．１〜１０重量係溶液
であることが好ましい。

キトサンとはキチンを脱アセチル化して得られる白色無
定形粉末であって、グリコサミンからなる塩基性多糖類
である。

また部分アシル化キトサンとは上記キトサンを適当なア
シル化剤、たとえば有機酸無水物あるいは有機酸塩化物
により部分的にアシル化したもの、あるいはキチンを脱
アセチル化したものである。

本発明におけるキトサンまたは部分アシル化キトサンは
上記キトサンまたは部分アシル化キトサンあるいはその
溶液、たとえば酢酸、蟻酸、燐酸、塩酸等の酸およびこ
れらの酸およびこれらの酸の酸性溶液に溶解して得られ
る溶液である。

この溶液の濃度は０．０５〜２．０重量幅、好ましくは
０．１〜１．０重量幅である。

本発明方法はまずグルコースイソメラーゼ生産菌を無機
酸または有機酸もしくはその塩で処理する。

酸またはその塩による処理の条件としては、菌体を処理
する酸またはその塩の濃度が０．３％以上において効果
が認められるが、一般に２〜８係の濃度が好ましい。

酸またはその塩の水溶液のＰＨはグルコースイソメラー
ゼを失活させない範囲のＰＥ（、特にＰＨ５〜７で処理
することによって効果が認められる。

上記処理における菌体の濃度は０．０１〜５係、特に０
．５〜１係であることが好ましい。

上記処理された菌体は水洗して、酸またはその塩を取除
く必要がある。

水洗された菌体を乾燥する必要はない。

本発明方法は次いで無機酸または有機酸もしくばその塩
で処理されたグルコースイソメラーゼ生産菌とキトサン
または部分アシル化キトサンとを混合し反応させる。

このキトサンまたは部分アシル化キトサンもしくはその
溶液と菌体との混合量は菌体の乾燥物に対してキトサン
または部分アシル化キトサンが８重量幅以上、好ましく
は１０．０〜５０．０重量幅になるような量である。

キトサンまたは部分アシル化キトサンの混加量が菌体の
乾燥物に対して８重量幅未満であると、キトサンまたは
部分アシル化キトサン膜が微弱過ぎて固定化酵素の安定
性が悪くたるという欠点がある。

すなわち菌体からの酵素の脱離が生じやすく、また機械
的衝撃による破壊などが生じやすい。

上記菌体とキトサンまたは部分アシル化キトサンとを混
合する方法には具体的には菌体を含む液体にキトサンま
たは部分アシル化キトサンもしくはその溶液を添加し混
合する方法、キトサンまたは部分アシル化キトサン溶液
に菌体を添加して混合する方法などがある。

固定化酵素製造の操業性から見て、キトサンまたは部分
アシル化キトサン溶液に菌体を添加してよく攪拌するか
、あるいは混練りして菌体を上記キトサンまたは部分ア
シル化キトサン溶液に分散させることが好ましい。

上記方法により得られる混合物から必要により濾過、遠
心分離などの操作により菌体を分離する。

本発明方法では酸またはその塩で処理した後、キトサン
または部分アシル化キトサンと混合し反応させた菌体を
必要により成型し、次いで乾燥することによって固定化
酵素製品とする。

成形した菌体をＰＨ８〜１０のアルカリで処理するとキ
トサンまたは部分アシル化キトサン膜が一層硬化して、
なお耐久性が向上するので好ましい。

乾燥条件は酵素が失格しない温度範囲で行なうことが好
ましい。

乾燥方法としては真空乾燥、天日乾燥など種々の方法が
採用される。

本発明方法により得られる固定化酵素は物理的強度が優
れているうえに、固定化酵素の乾物当りの活性が高く、
且つグルコース液に浸漬しても膨潤度は低く、浸漬酵素
容積当りの活性が高い、このことばカラム充填した場合
に目詰りがなく、かつ異性化反応速度が高くグルコース
液を速い速度（初期５Ｖ＝１以上）で流せることができ
、異性化糖の生産性が極めて高（工業的規模において満
足出来るものである。

またグルコースの異性化液の着色も極めて少ない特徴も
保持している。

特にキトサンまたは部分アシル化キトサンを菌体に対し
て比較的多量に用いることにより、菌体表面に形成され
るキトサンまたは部分アシル化キトサン膜は菌体相互の
接着剤的役割を果し、菌体の成型性を向上させるもので
ある。

以下実施例を用いて本発明を説明する。

なお、グルコースイソメラーゼ活性は国際グルコースイ
ソメラーゼ単位を用い、グルコース溶液（グルコース濃
度２ Ｍ、 ０．０２ Ｍ 硫酸マグネシウム、０．
００１ 随塩化コバルト、ＰＨ６，８５）で反応温度６
０℃、■分間でグルコース１μモルを異性化する酵素活
性を１単位とする。

膨潤度は固定化酵素１１を水に懸濁した時、水中で占め
る体積で表わす。

また、強度は粒度２０〜３０メツシユの固定化酵素を水
で膨潤□せた後、固定化酵素１粒に分銅を載せた時に漬
れはじめる時の重さをもって示す。

異性化反応はグルコース溶液（グルコース５０（ｗ／
ｖ ） ％、０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．００５Ｍ硫
酸マグネシウム、０．ＯＯＩＭ 塩化コバルト）５０−
に固定化酵素８０ＩＧＩＵを加え、Ｐ Ｈ６，８〜７．
２に維持しながら、６０Ｃで２０時間行なった。

反応終了後、固定化酵素を濾別して回収し、再び同じ組
成のグルコース溶液を加えて漬性化反応を繰返した。

破損塵は異性化反応を５回繰返した後での固定化酵素の
破損状態を示す。

実施例 １ ストレフトマイセス・フエオクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｈａｅｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）
（微工研菌寄第２２１号）を培養して得たグルコースイ
ソメラーゼ生産菌体〔（水分７０係、４２０．３ Ｉ
Ｇ Ｉ Ｕ／ｆ（乾物）１．５に９〕を水７．５ｔによ
く懸濁した。

この懸濁液に５係苛性ソーダ溶液でＰＨ６，０に調整し
た５係クエン酸溶液７，５ｔを添加して混合し、室温で
１時間放置したのち菌体を濾過した。

次いで菌体を水でよく洗滌し、再び水に懸濁して６０ｔ
の菌体懸濁液（ＰＨ７，０）を得た。

この懸濁液を１（ｌずつに６等分し、予め調製しておい
た０、２％キトサン−酢酸溶液（ＰＨ６，０）を菌体（
乾物）に対してキトサンの量が５係、８係、１５係、２
０％および３０％の割合になるように攪拌しながら加え
て菌体と反応せしめた。

このようにして得たキトサン膜を有する菌体を遠心脱水
機で脱水し、孔径１ｒｒａのノズルを有する＊＊押出機
にて押出成形した後、３０℃で一夜通風乾燥し、適当に
粉砕した後、篩でふるって微細部を除去し、２０〜３０
メツシユの固定化酵素を得た。

得られた固定化酵素の性質を第１表に示す。

上記方法により得られた固定化酵素を用いてグルコース
の異性化反応を繰返し行い、異性化率を＊＊測定した。

その結果を第２表に示す。第１表および第２表から明ら
かなように菌体（乾物）に対するキトサンの量が８重量
係以上であると膨潤度が少なく、物理的強度の大きい堅
牢な固定化酵素が得られ、この固定化酵素を用いると活
性低下が小さく破損がないのでグルコースの長期異性化
反応が可能となる。

実施例 ２ ストレプトマイセス・フエオクロモゲネス（ＳｔｒｅＰ
ｔｍｙｃｅｓ Ｐｈａｅｃｈｒｏｍｇｅｎｅｓ） （微
工研菌寄第２２１号）を培養して得たグルコースイソメ
ラーゼ生産菌体〔固形分る。

０係、５９２Ｉ ＧＩＵ／ＰＣ（乾物）〕１３２０ｆを
５係苛性ソーダ溶液でＰＨ６，０に調整した５、０％コ
ハク酸溶液１３．２１に懸濁し、室温で２時間放置した
。

その後、菌体を濾過し水テヨく洗滌した。

次いで再び水に懸濁して５２１の菌体懸濁液を得た。

予め調整しておいた０、２係キトサン−酢酸溶液（ＰＨ
６，０）２６ｔに上記菌体懸濁液を菌体（乾物）に対す
るキトサンの量が１５．８％になるように徐々に攪拌し
ながら混合した。

このようにして得たキトサン膜を有する菌体を洗滌し脱
水し、孔径１ｒ＋ｍ＋のノズルを有する押出機にて押出
成形した後、３０℃で一夜通風乾燥した。

次いで適当に粉砕した後、篩でふるって微細部を除去し
、２０〜３０メツシユの固定化酵素Ａ３７０１を得た。

同じグルコースイソメラーゼ生産菌体〔固形分２５．０
禾５９２ＩＧＩＵ／ｆ（乾物）］１３２０Ｓ’を上記方
法と同様にコ・・り酸溶液で処理し、０．０６ ％キト
サンー酢酸溶液（ＰＨ６，０）２６ ｔに菌体（乾物）
に対するキトサンの量が４．７係になるように加えて固
定化酵素Ｂ５３０ｒを得た。

得られた固定化酵素ＡおよびＢの特性を第３表に示す。

上記固定化酵素ＡまたはＢ５１を内径２．２１ｍ×長さ
１００ｃｍの２重円筒に詰めた。

カラムボリウムが固定化酵素Ａの場合は１８０ｍに対し
、固定化酵素Ｂの場合は２７５−となった。

外筒管には６５゛Ｃの温水を循環させ、内部温度を６５
Ｃに維持した。

このカラムに４０％グルコース溶液（ＰＨ８，５、硫酸
マグネシウム４Ｘ１０−４Ｍ）を流し異性化率４２係に
なるように流速に調節しｔも固定化酵素Ａを詰めたカラ
ムは目詰りもなく、１０００時間の連続運転に耐えるの
に対して、固定化酵素Ｂは連続運転１００時間経過の頃
から膨潤が著しく、目詰りが生じ著しく流速が落ちた。

固定化酵素ＡおよびＢの異性化率を４２係に維持した時
の流速の経過を第１図に示す。

この結果より、固定化酵素Ａでは流速５ｖ＝０．２５ま
で使用した場合、固定化酵素ＩＫｇ当りグルコース１５
００Ｋｇを処理することができた。

実施例 ３ キトサン（商標名フローナックＮ、共和油脂製）８０１
を１０係酢酸溶液１６００−に加え、さらにメタノール
Ｓ、Ｏｔを添加した。

次い℃この溶液を充分攪拌した後、無水酢酸をキトサン
のヘキソサ□ン残基に対して０．５モル（酢酸として２
１．７ｆｆ）を加え、よく攪拌し一夜室温で放置した。

次いで反応終了後、メタノール４ｔを加えて一夜放置し
、生じたゲルを分取し、蒸留水を加えて４０／、とした
。

さらに一夜放置した後、生じたゲルを分離し、凍結乾燥
して６４．５Ｓ’の粉末を得た。

このようにして得た部分アセチル化キトサンを酢酸に溶
かした後、５０％苛生ソーダ溶液を添加してＰＨ６，０
とし、０．２ ％部分アセチル化キトンサン溶液を調製
した。

一方、実施例１と同様のグルコースイソメラーゼ生産菌
体を７０Ｃにて３０分間熱処理した菌体〔固形分３４．
５係、６３１．４ ＩＧＩＵ／ｆ（乾物）〕１．２に７
を水６．Ｏｔで懸濁し、これに５係苛性ソーダ溶液でＰ
Ｈ６，０に調整した５係メタリン酸ソーダ溶液６．０
４を加え、室温で１時間処理した。

次いでこれを吸引濾過し、メタリン酸ソーダ溶液を分離
し水で菌体を洗滌した。

さらに、この菌体を水に懸濁して１３．４４／、とし、
２．２４ Ｉ！、ずつ６等分した。

この菌体懸濁液２．２Ａｔに上記０．２ ｑｌ）部分ア
セチル化キトンサンを菌体（乾物）に対する部分アセチ
ル化キトサン（乾物）の量が第４表に示される量になる
ように攪拌しながら加えた。

このようにして得た部分アセチル化キトサン膜を有する
菌体を脱水し、孔径１ｒｒｒｒｎのノズルを有する押出
機にて押出成形した後、乾燥した。

次いでこれを適宜粉砕し、篩で２０〜３０メツシユの固
定化酵素を得た。

これらの固定化酵素の性質を第４表に示す。

上記固定化酵素を使用し、 グルコースの異性化 反応を繰返し行なった。

その結果を第５表に示す。第４表および第５表から明ら
かなように菌体（乾物）に対する部分アセチル化キトサ
ンの量が８重量係以上であると膨潤度が少なく、物理的
強度において優れた性質を保持し、かつグルコースイソ
メラーゼ活性の高い固定化酵素が得られる。

実施例 ４ 実施例３と同様に熱処理したグルコースイソメラーゼ生
産菌体〔固形分２６．３ ％、４５０ ＩＧＩＵ／ｙ（
乾物）：１４８６グを水２．４ｔに懸濁し、■、２ｔに
２等分し、次の２通りの方法で固定化酵素を製造した。

第１の方法としては、菌体懸濁液１．２／−に５係苛性
ソーダ溶液でＰ Ｈ６，０調整した１０係クエン酸溶液
を添加し攪拌混合した後、２時間放置し菌体を分別濾過
した。

これを水で懸濁し９ 、ＯＬとした。予め調製しておい
た０、２ ％キトサンー酢酸溶液（ＰＨ６，０）６．３
ｔを菌体懸濁液９．ＯＡに激しく攪拌しながら添＊＊加
して反応させた。

このようにして得たキトサン膜を有する菌体を濾別に脱
水後、孔径１ｒｒａｎのノズルを有する押出機にて押出
成形し乾燥した。

この乾燥物を適当に破砕し、２０〜４０メツシユの固定
化酵素Ｃを得た。

第２の方法としては、菌体懸濁液１．２ｔに水を加えて
９．ＯＬとした。

この菌体懸濁液９．ＯＬを予め調整しておいた０、２％
キトサン−酢酸溶液（ＰＨ６，０） ６．３７に第１の
方法と同様にに激しく攪拌しながら添加して反応させた
。

このようにして得たキトサン膜を有する菌体を濾別し脱
水後、５係クエン酸溶液（ＰＨ６，０） ２．４ ｔに
室温で２時間浸漬した後、脱水、洗滌、押出成形した。

成形物を乾燥後、適宜破砕し、２０〜４０メツシユの固
定化酵素りを得た。

得られた固定化酵素ＣおよびＤの性質を第６表に示す。

上記固定化酵素ＣまたばＤを用い、グルコースの異性化
反応を繰返し行い異性化率を測定した。

その結果を第７表に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は固定化酵素ＡおよびＢの異性化率を４２係に維
持した時の流速の経過を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコースイソメラーゼ生産菌を無機酸または有機
   酸もしくはその塩で処理した後、上記菌体の乾燥物に対
   して８重量幅以上のキトサンまたは部分アシル化キトサ
   ンと混合し反応させることを特徴とするクルコースイソ
   メラーゼの固定方法。