JPH08294389A - 新規なβ−アガラーゼ，その産生微生物，その製造方法及びその用途 - Google Patents
新規なβ−アガラーゼ，その産生微生物，その製造方法及びその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 活性が優れた、特にアガロテトラオースやポ
ルフィランの分解活性を有する新規なβ−アガラーゼを
得る。 【構成】 アガロースを分解し、主にネオアガロテトラ
オース（４糖類）又はネオアガロヘキサオース（６糖
類）にまで低分子化する反応を触媒するβ−アガラーゼ
Ａ。アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース
（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒するβ−アガ
ラーゼＢ。これら２種類のβ−アガラーゼは、ビブリオ
ｓｐ．ＰＯ−３０３から産生される。
ルフィランの分解活性を有する新規なβ−アガラーゼを
得る。 【構成】 アガロースを分解し、主にネオアガロテトラ
オース（４糖類）又はネオアガロヘキサオース（６糖
類）にまで低分子化する反応を触媒するβ−アガラーゼ
Ａ。アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース
（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒するβ−アガ
ラーゼＢ。これら２種類のβ−アガラーゼは、ビブリオ
ｓｐ．ＰＯ−３０３から産生される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は例えばβ−アガラーゼ活
性を有する新規酵素、この酵素を産生する新規微生物、
この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いたオリゴ糖，
プロトプラストの製造方法に関するものである。
性を有する新規酵素、この酵素を産生する新規微生物、
この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いたオリゴ糖，
プロトプラストの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】寒天やポルフィランはある主の紅藻の細
胞壁に含まれる海藻特有の多糖類である。現在、この寒
天やポルフィランのオリゴ糖は研究用試薬としてのみな
らず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性
化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌
作用を有することが知られている。特に、ポルフィラン
のオリゴ糖は硫酸根を有しているため、ナトリウムイオ
ンを吸収し、体外に排出するという点で塩分の取りすぎ
防止に有効である。
胞壁に含まれる海藻特有の多糖類である。現在、この寒
天やポルフィランのオリゴ糖は研究用試薬としてのみな
らず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性
化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌
作用を有することが知られている。特に、ポルフィラン
のオリゴ糖は硫酸根を有しているため、ナトリウムイオ
ンを吸収し、体外に排出するという点で塩分の取りすぎ
防止に有効である。
【０００３】寒天の化学成分は、アガロース(agarose)
とアガロペクチン(agaropectin) との２種類からなって
いる。図１はアガロース構成ユニットの構成を示す説明
図である。図１に示す通り、アガロースは、ゲル化する
性質を有する中性多糖類であり、アガロビオース(agaro
biose)（即ち、4-O-β-D-galactopyranosyl-3,6-anhydr
o-L-galactose ）と、ネオアガロビオース(neoagarobio
se) （即ち、 3-O-(3,6-anhydro-α-L-galactopyranosy
l)-D-galactose）とが交互に直線状に繋って形成されて
いる。
とアガロペクチン(agaropectin) との２種類からなって
いる。図１はアガロース構成ユニットの構成を示す説明
図である。図１に示す通り、アガロースは、ゲル化する
性質を有する中性多糖類であり、アガロビオース(agaro
biose)（即ち、4-O-β-D-galactopyranosyl-3,6-anhydr
o-L-galactose ）と、ネオアガロビオース(neoagarobio
se) （即ち、 3-O-(3,6-anhydro-α-L-galactopyranosy
l)-D-galactose）とが交互に直線状に繋って形成されて
いる。
【０００４】一方、アガロペクチンの化学構造は、複雑
であり、未だ明確に解明されていないが、D-ガラクトー
ス(D-galactose) ，3,6-アンハイドロ−Ｌ−ガラクトー
ス（3,6-anhydro-L-garactose ）とともに、少量の硫酸
塩、グルクロン酸、ピルビン酸などから構成されてい
る。ピルビン酸はアガロビオースユニット中のD-ガラク
トース残基のＣ−４及びＣ−６とケタール結合してい
る。このことはアガロビオースが、アガロペクチンの重
要な構成成分であることを示唆している。
であり、未だ明確に解明されていないが、D-ガラクトー
ス(D-galactose) ，3,6-アンハイドロ−Ｌ−ガラクトー
ス（3,6-anhydro-L-garactose ）とともに、少量の硫酸
塩、グルクロン酸、ピルビン酸などから構成されてい
る。ピルビン酸はアガロビオースユニット中のD-ガラク
トース残基のＣ−４及びＣ−６とケタール結合してい
る。このことはアガロビオースが、アガロペクチンの重
要な構成成分であることを示唆している。
【０００５】一方、ポルフィランは、紅藻アマノリ属の
ものを熱水抽出したときに得られる多糖類で硫酸エステ
ル化した直鎖のガラクタンで、3-β-D-galactosyl 及び
4-α-L-galactosyl ユニットを主構成分としている。我
国や中国で、ゲル化材として僅かに生産されている。
ものを熱水抽出したときに得られる多糖類で硫酸エステ
ル化した直鎖のガラクタンで、3-β-D-galactosyl 及び
4-α-L-galactosyl ユニットを主構成分としている。我
国や中国で、ゲル化材として僅かに生産されている。
【０００６】近年、海洋生物資源としての海藻類の有効
利用の観点から、また、生理活性物質としてのアガロオ
リゴ糖の製造方法の観点から、新規なアガロース分解酵
素やアガロース産生能を有する新規な微生物の探索が行
われている（特開平１−２２８４６５号）。特に、アガ
ロースのネオアガロースオリゴ糖への分解活性について
は、ネオアガロテトラオース（４糖類）の分解能を有す
るものは殆ど知られていないのが現状である。
利用の観点から、また、生理活性物質としてのアガロオ
リゴ糖の製造方法の観点から、新規なアガロース分解酵
素やアガロース産生能を有する新規な微生物の探索が行
われている（特開平１−２２８４６５号）。特に、アガ
ロースのネオアガロースオリゴ糖への分解活性について
は、ネオアガロテトラオース（４糖類）の分解能を有す
るものは殆ど知られていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるアガロースやポルフェラ
ンを効率よく分解し、更に、従来のアガラーゼでは分解
が困難であったネオアガロテトラオースをも効率よく分
解する酵素の生産菌であることを発見し、更に該生産菌
から２種類のβ−アガラーゼを単離精製し、本発明を完
成するに至った。
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるアガロースやポルフェラ
ンを効率よく分解し、更に、従来のアガラーゼでは分解
が困難であったネオアガロテトラオースをも効率よく分
解する酵素の生産菌であることを発見し、更に該生産菌
から２種類のβ−アガラーゼを単離精製し、本発明を完
成するに至った。
【０００８】本発明は、活性が優れた、特にネオアガロ
テトラオースやポルフィランの分解活性を有する新規な
β−アガラーゼを得ることを目的とする。
テトラオースやポルフィランの分解活性を有する新規な
β−アガラーゼを得ることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係るβ−アガラーゼＡは、アガロースを分解し、
主にネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオアガロ
ヘキサオース（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒
する酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述す
る。
発明に係るβ−アガラーゼＡは、アガロースを分解し、
主にネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオアガロ
ヘキサオース（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒
する酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述す
る。
【００１０】また、本請求項２に記載された発明に係る
β−アガラーゼＢは、アガロースを分解し、主としてネ
オアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を
触媒する酵素である。この具体的な理化学的性質に付い
ても後に詳述する。
β−アガラーゼＢは、アガロースを分解し、主としてネ
オアガロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を
触媒する酵素である。この具体的な理化学的性質に付い
ても後に詳述する。
【００１１】更に、本請求項３に記載された発明に係る
微生物は、請求項１に記載のβ−アガラーゼＡ又は請求
項２に記載のβ−アガラーゼＢを産生する新規なビブリ
オｓｐ．ＰＯ−３０３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９０５）で
ある。
微生物は、請求項１に記載のβ−アガラーゼＡ又は請求
項２に記載のβ−アガラーゼＢを産生する新規なビブリ
オｓｐ．ＰＯ−３０３（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９０５）で
ある。
【００１２】また、本請求項４に記載された発明に係る
アガラーゼの製造方法では、請求項１又は２に記載のβ
−アガラーゼを製造する方法であって、βアガラーゼを
産生する能力を有するビブリオ属の微生物を寒天を炭素
源として培養し、その培養上清液から分離して精製する
ものである。
アガラーゼの製造方法では、請求項１又は２に記載のβ
−アガラーゼを製造する方法であって、βアガラーゼを
産生する能力を有するビブリオ属の微生物を寒天を炭素
源として培養し、その培養上清液から分離して精製する
ものである。
【００１３】更に、本請求項５に記載された発明に係る
オリゴ糖の製造方法では、請求項１又は２に記載の酵素
を、アガロースを基質とし、作用させるものである。
オリゴ糖の製造方法では、請求項１又は２に記載の酵素
を、アガロースを基質とし、作用させるものである。
【００１４】また、本請求項６に記載された発明に係る
海藻細胞のプロトプラストの製造方法では、請求項１又
は２記載の酵素を海藻に作用させるものである。
海藻細胞のプロトプラストの製造方法では、請求項１又
は２記載の酵素を海藻に作用させるものである。
【００１５】
【作用】本発明におけるβ−アガラーゼＡは、アガロー
スを分解し、主にネオアガロテトラオース（４糖類）と
ネオアガロヘキサオース（６糖類）とにまで低分子化す
る反応を触媒する特徴を有する酵素であって、下記理化
学的性質を有する。
スを分解し、主にネオアガロテトラオース（４糖類）と
ネオアガロヘキサオース（６糖類）とにまで低分子化す
る反応を触媒する特徴を有する酵素であって、下記理化
学的性質を有する。
【００１６】(a) 分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）による測定の結果は、約９００００である。
尚、既知のアガラーゼに、この分子量に該当する分子量
を有するものは報告されていない。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、約６．６である。既知のアガ
ラーゼにこの値に該当する等電点を有するものは報告さ
れていない。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解し
て、主として４糖類と６糖類に低分子化する反応を触媒
する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分
解しない。 (e) 至適温度 ４５℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ７．５ (g) ｐＨ安定性 ｐＨ５．０〜９．０ (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
ＡＧＥ）による測定の結果は、約９００００である。
尚、既知のアガラーゼに、この分子量に該当する分子量
を有するものは報告されていない。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、約６．６である。既知のアガ
ラーゼにこの値に該当する等電点を有するものは報告さ
れていない。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解し
て、主として４糖類と６糖類に低分子化する反応を触媒
する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分
解しない。 (e) 至適温度 ４５℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ７．５ (g) ｐＨ安定性 ｐＨ５．０〜９．０ (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
【００１７】本発明におけるβ−アガラーゼＢは、アガ
ロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖
類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であって、
下記理化学的性質を有する。
ロースを分解し、主としてネオアガロビオース（２糖
類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であって、
下記理化学的性質を有する。
【００１８】(a) 分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）による測定の結果は、約９８０００である。
尚、既知のβ−アガラーゼに、この分子量に該当する分
子量を有するものは報告されていない。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、約３．４である。既知のβ−
アガラーゼに、この値に該当する等電点を有するものは
報告されていない。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解し
て、主として２糖類に低分子化する反応を触媒する。ま
た、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分解しな
い。 (e) 至適温度 ５５℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ６．５ (g) ｐＨ安定性 ｐＨ４．０〜１０．０ (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
ＡＧＥ）による測定の結果は、約９８０００である。
尚、既知のβ−アガラーゼに、この分子量に該当する分
子量を有するものは報告されていない。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、約３．４である。既知のβ−
アガラーゼに、この値に該当する等電点を有するものは
報告されていない。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 少なくとも寒天、アガロース及びポルフィランを分解し
て、主として２糖類に低分子化する反応を触媒する。ま
た、κ−カラギーナン、λ−カラギーナンは分解しな
い。 (e) 至適温度 ５５℃ (f) 至適ｐＨ ｐＨ６．５ (g) ｐＨ安定性 ｐＨ４．０〜１０．０ (h) 熱安定性 ４０℃まで安定
【００１９】本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラ
ーゼＢは微生物を用いて生産される。各酵素を生産する
微生物を培養して、微生物の内部又は培養上清からβ−
アガラーゼＡまたはＢを分離することができる。この何
れかの酵素の生産菌としては、例えば、本発明では、新
たに海底泥中から分離されたビブリオｓｐ．ＰＯ−３０
３を用いることができる。この微生物ビブリ・ｓｐ．Ｐ
Ｏ−３０３は、上記の２つの酵素を産生することができ
る。尚、本菌株は生工研菌寄第１４９０５号（平成０７
年０４月２１日寄託）として既に寄託されている。
ーゼＢは微生物を用いて生産される。各酵素を生産する
微生物を培養して、微生物の内部又は培養上清からβ−
アガラーゼＡまたはＢを分離することができる。この何
れかの酵素の生産菌としては、例えば、本発明では、新
たに海底泥中から分離されたビブリオｓｐ．ＰＯ−３０
３を用いることができる。この微生物ビブリ・ｓｐ．Ｐ
Ｏ−３０３は、上記の２つの酵素を産生することができ
る。尚、本菌株は生工研菌寄第１４９０５号（平成０７
年０４月２１日寄託）として既に寄託されている。
【００２０】尚、本発明に用いる微生物としては、本菌
株とその変種、変位株に限定されるものではなく、前記
β−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢ生産能を有する
ものであれば良い。
株とその変種、変位株に限定されるものではなく、前記
β−アガラーゼＡ又はβ−アガラーゼＢ生産能を有する
ものであれば良い。
【００２１】具体的なβ−アガラーゼＡ又はβ−アガラ
ーゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又は
β−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源
として培養し、その培養上清液から分離して精製するも
のである。この培地は、炭素源として寒天を含む他に、
窒素源、無機化合物等の栄養素を適当量含有するもので
あれば、天然培地，合成培地の何れも使用することがで
きる。
ーゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又は
β−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源
として培養し、その培養上清液から分離して精製するも
のである。この培地は、炭素源として寒天を含む他に、
窒素源、無機化合物等の栄養素を適当量含有するもので
あれば、天然培地，合成培地の何れも使用することがで
きる。
【００２２】具体的な寒天を含む炭素源としては、市販
の寒天粉末は勿論のこと、アガロース，アガロペクチ
ン，寒天の部分加水分解物等の加工物、及び、加工され
る前のアガロースを含むテングサ，オゴノリ等の紅藻類
を単独又は併用して用いることもできる。また、寒天の
他にも炭素源として、グルコース等の糖類を併用するこ
ともできる。
の寒天粉末は勿論のこと、アガロース，アガロペクチ
ン，寒天の部分加水分解物等の加工物、及び、加工され
る前のアガロースを含むテングサ，オゴノリ等の紅藻類
を単独又は併用して用いることもできる。また、寒天の
他にも炭素源として、グルコース等の糖類を併用するこ
ともできる。
【００２３】また、窒素源としては、通常の培地の組成
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス，ペプト
ン，酵母エキス，乾燥酵母，カザミノ酸，各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩，硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス，ペプト
ン，酵母エキス，乾燥酵母，カザミノ酸，各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩，硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
【００２４】更に、無機化合物としては、培養される微
生物の必須無機塩として、ナトリウム，マグネシウム，
カルシウム，鉄，マンガン等のリン酸塩，塩酸塩，硫酸
塩，炭酸塩，酢酸塩等を１種以上用いることができる。
生物の必須無機塩として、ナトリウム，マグネシウム，
カルシウム，鉄，マンガン等のリン酸塩，塩酸塩，硫酸
塩，炭酸塩，酢酸塩等を１種以上用いることができる。
【００２５】培養は、目的のβ−アガラーゼＡ又はＢを
産生する微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選択
される。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養，通
気攪拌培養等が大量に培養することができ良好である。
産生する微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選択
される。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養，通
気攪拌培養等が大量に培養することができ良好である。
【００２６】微生物の培養によって産生されたβ−アガ
ラーゼＡ又はＢは、通常の方法によって、分離・精製さ
れる。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌体
を通常用いられている手段によって破砕してβ−アガラ
ーゼＡ又はＢを抽出して精製される。また、培養液中に
産生されたβ−アガラーゼＡ又はＢは、微生物を濾過・
遠心分離等の方法で除去して精製される。
ラーゼＡ又はＢは、通常の方法によって、分離・精製さ
れる。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌体
を通常用いられている手段によって破砕してβ−アガラ
ーゼＡ又はＢを抽出して精製される。また、培養液中に
産生されたβ−アガラーゼＡ又はＢは、微生物を濾過・
遠心分離等の方法で除去して精製される。
【００２７】精製方法としては、通常用いられる精製方
法を利用することができる。例えば、塩析，溶媒沈殿に
より、β−アガラーゼＡ又はＢを沈殿させて溶媒中から
分離して、精製することができる。また、沈殿させたも
のを更にイオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグ
ラフィ、等電点電気泳動等により、更に精製することも
できる。
法を利用することができる。例えば、塩析，溶媒沈殿に
より、β−アガラーゼＡ又はＢを沈殿させて溶媒中から
分離して、精製することができる。また、沈殿させたも
のを更にイオン交換クロマトグラフィ、ゲルクロマトグ
ラフィ、等電点電気泳動等により、更に精製することも
できる。
【００２８】得られたβ−アガラーゼＡ又はＢは、アガ
ロースを基質として作用させることにより、オリゴ糖を
製造することができる。このアガロースから得られるオ
リゴ糖は研究用試薬としてのみならず、血圧降下作用、
抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性化などの薬理作用なら
びにある種の微生物に対する静菌作用を有することは、
前述の通りである。
ロースを基質として作用させることにより、オリゴ糖を
製造することができる。このアガロースから得られるオ
リゴ糖は研究用試薬としてのみならず、血圧降下作用、
抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性化などの薬理作用なら
びにある種の微生物に対する静菌作用を有することは、
前述の通りである。
【００２９】また、得られたβ−アガラーゼＡ又はＢ
は、海藻に作用させることにより、容易に海藻細胞のプ
ロトプラストを作成することができる。また、寒天組成
中のアガロースを分解する酵素であるため、例えば、ア
ガロース電気泳動により、目的の部位に保持された遺伝
子を回りの寒天を溶かすことにより、容易に入手するこ
ともできる。
は、海藻に作用させることにより、容易に海藻細胞のプ
ロトプラストを作成することができる。また、寒天組成
中のアガロースを分解する酵素であるため、例えば、ア
ガロース電気泳動により、目的の部位に保持された遺伝
子を回りの寒天を溶かすことにより、容易に入手するこ
ともできる。
【００３０】
１．海洋泥中よりのビブリオ菌の採取 海洋泥中に生息する微生物からβ−アガラーゼ活性の高
い微生物を分離選択した。具体的には、海洋泥に生息す
る海洋性微生物を単離し、個々の微生物を寒天を炭素源
とする培地中で培養し、β−アガラーゼ活性を測定した
ところ、β−アガラーゼ活性の最も高い微生物を得た。
い微生物を分離選択した。具体的には、海洋泥に生息す
る海洋性微生物を単離し、個々の微生物を寒天を炭素源
とする培地中で培養し、β−アガラーゼ活性を測定した
ところ、β−アガラーゼ活性の最も高い微生物を得た。
【００３１】尚、本実施例におけるβ−アガラーゼ活性
の測定は次のように行われた。０．５％の寒天を含む１
００mM ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５の０．５ｍｌに酵素
液０．５ｍｌを加え、３８℃で１０ｍｉｎ反応させ、生
じた還元糖の増加をソモジ・ネルソン(Somogyi-Nelson)
法で測定した。酵素活性の１unitは上記反応条件で、１
分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する還元力
を生ずる酵素量と定義した。
の測定は次のように行われた。０．５％の寒天を含む１
００mM ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５の０．５ｍｌに酵素
液０．５ｍｌを加え、３８℃で１０ｍｉｎ反応させ、生
じた還元糖の増加をソモジ・ネルソン(Somogyi-Nelson)
法で測定した。酵素活性の１unitは上記反応条件で、１
分間に１μｍｏｌのＤ−ガラクトースに相当する還元力
を生ずる酵素量と定義した。
【００３２】２．菌学的性質 このβ−アガラーゼ活性の最も高い微生物は、Bergeys'
Manual Systematic Bacteriology の記載に準拠して同
定を行ったところ、次に示す結果からビブリオ（Vibri
o）に属していることが判明した。この微生物の形態
は、次の表１に示すものである。また、表２に生理学的
試験結果を示す。この表１及び表２の結果より、本微生
物は海洋性細菌ビブリオ（vibrio）sp. であることが確
認された。尚、本細菌をビブリオ（Vibrio）sp.PO-303
と命名した。
Manual Systematic Bacteriology の記載に準拠して同
定を行ったところ、次に示す結果からビブリオ（Vibri
o）に属していることが判明した。この微生物の形態
は、次の表１に示すものである。また、表２に生理学的
試験結果を示す。この表１及び表２の結果より、本微生
物は海洋性細菌ビブリオ（vibrio）sp. であることが確
認された。尚、本細菌をビブリオ（Vibrio）sp.PO-303
と命名した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】ビブリオ（Vibrio）sp.PO-303 の生育温
度，酵素生成，生育ＮａＣｌ濃度，炭素源としての糖や
アミノ酸の利用性等を調べた。結果を次の表３〜表６に
示す。
度，酵素生成，生育ＮａＣｌ濃度，炭素源としての糖や
アミノ酸の利用性等を調べた。結果を次の表３〜表６に
示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】即ち、グラム陰性で単極毛を有し、ＯＦテ
スト発酵性であり、カタラーゼならびにオキシダーゼテ
スト陽性、グルコース培地から酸生成、ガス非産生、ビ
ブリオスタティックエイジェント（０／１２９）に感受
性あり、ＧＣ含量４４％であった。
スト発酵性であり、カタラーゼならびにオキシダーゼテ
スト陽性、グルコース培地から酸生成、ガス非産生、ビ
ブリオスタティックエイジェント（０／１２９）に感受
性あり、ＧＣ含量４４％であった。
【００４１】３．培養 本細菌（ビブリオ（Vibrio）sp.PO-303 ）は、酵素産生
のための誘導物質として、寒天を必要とし、その濃度を
０．３％とし、その他、０．３％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、３％塩化ナトリウム、０．５％塩化マグ
ネシウム、０．２％リン酸水素二カリウム、０．０４％
リン酸二水素カリウムの組成からなる培地を用いて、２
５℃、４日間、振盪培養した場合、１，０００ｍｌの培
地から６６ｕｎｉｔｓのアガラーゼを得ることができ
た。
のための誘導物質として、寒天を必要とし、その濃度を
０．３％とし、その他、０．３％ポリペプトン、０．１
％酵母エキス、３％塩化ナトリウム、０．５％塩化マグ
ネシウム、０．２％リン酸水素二カリウム、０．０４％
リン酸二水素カリウムの組成からなる培地を用いて、２
５℃、４日間、振盪培養した場合、１，０００ｍｌの培
地から６６ｕｎｉｔｓのアガラーゼを得ることができ
た。
【００４２】４．β−アガラーゼの精製 産生されたβ−アガラーゼを精製した。即ち、本細菌を
上記の条件で大量培養し、遠心分離して得られた培養上
清液に７５％飽和になるように固形硫酸アンモニウムを
加えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、生じた沈殿を
少量の５０mMＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝
液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用いた。
上記の条件で大量培養し、遠心分離して得られた培養上
清液に７５％飽和になるように固形硫酸アンモニウムを
加えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、生じた沈殿を
少量の５０mMＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝
液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用いた。
【００４３】塩析酵素液を陰イオン交換クロマトグラフ
ィー（DEAE-Toyopearl 65M）、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー（Toyopearl 55）、疎水クロマトグラフィー（Ethe
r-Toyopearl 650S）、陰イオン交換クロマトグラフィー
（Mono Q HR 5/5 ）で分画したところ、その分子量と等
電点の相違により、２種類のβ−アガラーゼが得られ
た。
ィー（DEAE-Toyopearl 65M）、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー（Toyopearl 55）、疎水クロマトグラフィー（Ethe
r-Toyopearl 650S）、陰イオン交換クロマトグラフィー
（Mono Q HR 5/5 ）で分画したところ、その分子量と等
電点の相違により、２種類のβ−アガラーゼが得られ
た。
【００４４】５．アガラーゼの酵素特性 得られた２種類のβ−アガラーゼの分子量，等電点，溶
解性，至適ｐＨ，ｐＨ安定性，至適温度を測定した。結
果を次の表７に示す。尚、２種類のβ−アガラーゼのう
ち、分子量９０，０００のものをβ−アガラーゼＡ，９
８，０００のものをβ−アガラーゼＢと命名した。
解性，至適ｐＨ，ｐＨ安定性，至適温度を測定した。結
果を次の表７に示す。尚、２種類のβ−アガラーゼのう
ち、分子量９０，０００のものをβ−アガラーゼＡ，９
８，０００のものをβ−アガラーゼＢと命名した。
【００４５】
【表７】
【００４６】また、これら２つの酵素画分はディスク電
気泳動的に均一であることから純粋に精製されているこ
とが確認された。精製β−アガラーゼＡ及びＢの寒天，
アガロース，ポルフィラン，ネオアガロビオース，ネオ
アガロテトラオース，ネオアガロヘキサオースに対する
作用様式を調べた。その結果を表８に示す。
気泳動的に均一であることから純粋に精製されているこ
とが確認された。精製β−アガラーゼＡ及びＢの寒天，
アガロース，ポルフィラン，ネオアガロビオース，ネオ
アガロテトラオース，ネオアガロヘキサオースに対する
作用様式を調べた。その結果を表８に示す。
【００４７】
【表８】
【００４８】表７及び表８に示したように、本細菌は寒
天，アガロース，ポルフィランに作用し、主な分解産物
として、ネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオア
ガロヘキサオース（６糖類）を生じる酵素β−アガラー
ゼＡと、主な精製物としてネオアガロビオース（２糖
類）を生じる酵素β−アガラーゼＢとの２種類の作用様
式の異なるアガラーゼを産生することが判明した。
天，アガロース，ポルフィランに作用し、主な分解産物
として、ネオアガロテトラオース（４糖類）又はネオア
ガロヘキサオース（６糖類）を生じる酵素β−アガラー
ゼＡと、主な精製物としてネオアガロビオース（２糖
類）を生じる酵素β−アガラーゼＢとの２種類の作用様
式の異なるアガラーゼを産生することが判明した。
【００４９】６．ネオアガロオリゴ糖の製造 6.1 寒天からのオリゴ糖の調製 従来からの寒天からオリゴ糖を調製する方法として酸に
よる加水分解がある。しかしながら、酸加水分解法は１
００℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、オリ
ゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よくオリ
ゴ糖を調製することが困難である。それに対して、前述
のβ−アガラーゼＡ又はＢを用いる方法では室温で効率
よくオリゴ糖を調製することが可能である。特に、ネオ
アガロテトラオースを分解するネオアガラーゼＢの使用
は従来困難とされているネオアガロビオースの調製に優
れた方法である。
よる加水分解がある。しかしながら、酸加水分解法は１
００℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、オリ
ゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よくオリ
ゴ糖を調製することが困難である。それに対して、前述
のβ−アガラーゼＡ又はＢを用いる方法では室温で効率
よくオリゴ糖を調製することが可能である。特に、ネオ
アガロテトラオースを分解するネオアガラーゼＢの使用
は従来困難とされているネオアガロビオースの調製に優
れた方法である。
【００５０】具体的には、前記の方法で製造したβ−ア
ガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したアガロー
ス（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２０
時間反応させた。その後、反応生成物をセファデックス
（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用い
て分離した。その結果、ネオアガロビオース（約２８
％）が得られた。
ガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したアガロー
ス（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２０
時間反応させた。その後、反応生成物をセファデックス
（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用い
て分離した。その結果、ネオアガロビオース（約２８
％）が得られた。
【００５１】6.2 ポルフィランからのオリゴ糖の調製 ところで、ポルフィランは寒天と類似した骨格に硫酸根
を含有する多糖であるが、酸で加水分解する方法は上記
の問題に加えて、硫酸根を分解するので硫酸根含有オリ
ゴ糖を調製することは困難である。しかしながら、前述
のβ−アガラーゼＡ又はＢはポルフィランも加水分解
し、種々の硫酸根含有オリゴ糖を容易に産出することが
できる。
を含有する多糖であるが、酸で加水分解する方法は上記
の問題に加えて、硫酸根を分解するので硫酸根含有オリ
ゴ糖を調製することは困難である。しかしながら、前述
のβ−アガラーゼＡ又はＢはポルフィランも加水分解
し、種々の硫酸根含有オリゴ糖を容易に産出することが
できる。
【００５２】具体的には、前記の方法で製造したβ−ア
ガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したポルフィ
ラン（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２
０時間反応させた。その後、反応生成物をセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用
いて分離した。その結果、ネオアガロビオース（約１６
％）が得られた。
ガラーゼＢ（２ユニット）と、１％に調整したポルフィ
ラン（２０ｍｌ）とを試験管内で混合して、３８℃で２
０時間反応させた。その後、反応生成物をセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−１５カラム（１０×９０ｃｍ）を用
いて分離した。その結果、ネオアガロビオース（約１６
％）が得られた。
【００５３】７．プロトプラストの製造 7.1 紅藻からのプロトプラストの調製 海藻の優良産業品種の開発を行う上で、細胞融合や遺伝
子操作によるバイオテクノロジーは優れた手法である。
バイオテクノロジーを行うためには酵素で細胞壁を溶解
し、プロトプラストを作出する方法の開発が必要とされ
ている。前記β−アガラーゼＡ又はＢを用いることによ
り、寒天ならびにポルフィランを含む紅藻から多量のプ
ロトプラストを作出することが可能である。
子操作によるバイオテクノロジーは優れた手法である。
バイオテクノロジーを行うためには酵素で細胞壁を溶解
し、プロトプラストを作出する方法の開発が必要とされ
ている。前記β−アガラーゼＡ又はＢを用いることによ
り、寒天ならびにポルフィランを含む紅藻から多量のプ
ロトプラストを作出することが可能である。
【００５４】具体的には、供試海藻（紅藻）１ｇを５％
パパインと、０．７Ｍマンニトール含有２０mMＭＥＳ緩
衝液ｐＨ７．５，３０ｍｌを入れた１００ｍｌ容ビーカ
に加え、２２℃，３０分間振盪した。０．７Ｍマンニト
ール含有ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、４０μｍ
のナイロンメッシュで濾過洗浄し、洗浄した葉体をナイ
フで数ミリ片に裁断した。
パパインと、０．７Ｍマンニトール含有２０mMＭＥＳ緩
衝液ｐＨ７．５，３０ｍｌを入れた１００ｍｌ容ビーカ
に加え、２２℃，３０分間振盪した。０．７Ｍマンニト
ール含有ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、４０μｍ
のナイロンメッシュで濾過洗浄し、洗浄した葉体をナイ
フで数ミリ片に裁断した。
【００５５】裁断片の２００ｍｇを２ｕｎｉｔアガラー
ゼと市販のセルラーゼオノズカＲＳ（４％）ならびにマ
セロチームＲ−１０（１％）、それに０．７Ｍマンニト
ール含有２０mMＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０を入れた３０
ｍｌ容三角フラスコに投入し、２２℃で５時間振盪し
た。その結果、紅藻ツルツル(Grateloupia turuturu)の
１ｇから１０5 〜１０6 、また、紅藻オゴノリ(Gracila
ria verrucosa)からは１０4 〜１０5 のプロトプラスト
が得られた。
ゼと市販のセルラーゼオノズカＲＳ（４％）ならびにマ
セロチームＲ−１０（１％）、それに０．７Ｍマンニト
ール含有２０mMＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０を入れた３０
ｍｌ容三角フラスコに投入し、２２℃で５時間振盪し
た。その結果、紅藻ツルツル(Grateloupia turuturu)の
１ｇから１０5 〜１０6 、また、紅藻オゴノリ(Gracila
ria verrucosa)からは１０4 〜１０5 のプロトプラスト
が得られた。
【００５６】８．アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽
出 本β−アガラーゼＡは高純度に精製してもアガロースを
液化することが可能であるので、アガロースゲル電気泳
動で分画されたＤＮＡ断片の回収に利用できる。即ち、
泳動後のアガロースゲルを精製アガラーゼＡを加えて、
溶解し、目的のＤＮＡ断片を抽出することができる。
出 本β−アガラーゼＡは高純度に精製してもアガロースを
液化することが可能であるので、アガロースゲル電気泳
動で分画されたＤＮＡ断片の回収に利用できる。即ち、
泳動後のアガロースゲルを精製アガラーゼＡを加えて、
溶解し、目的のＤＮＡ断片を抽出することができる。
【００５７】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、β−アガ
ラーゼＡは、アガロースを分解し、主にネオアガロテト
ラオース（４糖類）とネオアガロヘキサオース（６糖
類）とにまで低分子化する反応を触媒する特徴を有する
酵素である。
ラーゼＡは、アガロースを分解し、主にネオアガロテト
ラオース（４糖類）とネオアガロヘキサオース（６糖
類）とにまで低分子化する反応を触媒する特徴を有する
酵素である。
【００５８】また、本発明におけるβ−アガラーゼＢ
は、アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース
（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であ
る。
は、アガロースを分解し、主としてネオアガロビオース
（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であ
る。
【００５９】更に、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−
アガラーゼＢは微生物を用いて生産される。この何れか
の酵素の生産菌としては、各酵素を生産する微生物を培
養して、微生物の内部又は培養上清から生成することが
できる。
アガラーゼＢは微生物を用いて生産される。この何れか
の酵素の生産菌としては、各酵素を生産する微生物を培
養して、微生物の内部又は培養上清から生成することが
できる。
【００６０】また、β−アガラーゼＡ又はβ−アガラー
ゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又はβ
−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源と
して培養し、その培養上清液から分離して精製するもの
である。
ゼＢの製造方法としては、このβ−アガラーゼＡ又はβ
−アガラーゼＢ生産能を有する微生物を寒天を炭素源と
して培養し、その培養上清液から分離して精製するもの
である。
【００６１】更に、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−
アガラーゼＢは、アガロースを基質として作用させるこ
とにより、オリゴ糖を製造することができる。このアガ
ロースから得られるオリゴ糖は研究用試薬としてのみな
らず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性
化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌
作用を有する。
アガラーゼＢは、アガロースを基質として作用させるこ
とにより、オリゴ糖を製造することができる。このアガ
ロースから得られるオリゴ糖は研究用試薬としてのみな
らず、血圧降下作用、抗腫瘍作用や腸ぜん動運動の活性
化などの薬理作用ならびにある種の微生物に対する静菌
作用を有する。
【００６２】また、本発明のβ−アガラーゼＡ又はβ−
アガラーゼＢは、海藻に作用させることにより、容易に
海藻細胞のプロトプラストを作成することができるとい
う効果がある。
アガラーゼＢは、海藻に作用させることにより、容易に
海藻細胞のプロトプラストを作成することができるとい
う効果がある。
【図１】アガロース構成ユニットの構成を示す説明図で
ある。
ある。
Claims (6)
- 【請求項１】 アガロースを分解し、主にネオアガロテ
トラオース（４糖類）又はネオアガロヘキサオース（６
糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素であっ
て、下記理化学的性質を有する新規なβ−アガラーゼ
Ａ。 (a) 分子量；約９００００ (b) 等電点；約６．６ (c) 溶解性；水溶性 (d) 作用；少なくともアガロース及びポルフィランを分
解して、主として４糖類と６糖類に低分子化する反応を
触媒する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナン
は分解しない。 (e) 至適温度；４５℃ (f) 至適ｐＨ；ｐＨ７．５ (g) ｐＨ安定性；ｐＨ５．０〜９．０ - 【請求項２】 アガロースを分解し、主としてネオアガ
ロビオース（２糖類）にまで低分子化する反応を触媒す
る酵素であって、下記理化学的性質を有する新規なβ−
アガラーゼＢ。 (a) 分子量；約９８０００ (b) 等電点；約３．４ (c) 溶解性；水溶性 (d) 作用； 少なくとも寒天、アガロース及びポルフィ
ランを分解して、主として２糖類に低分子化する反応を
触媒する。また、κ−カラギーナン、λ−カラギーナン
は分解しない。 (e) 至適温度；５５℃ (f) 至適ｐＨ；ｐＨ６．５ (g) ｐＨ安定性；ｐＨ４．０〜１０．０ - 【請求項３】 新規なビブリオｓｐ．ＰＯ−３０３（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４９０５）。 - 【請求項４】 β−アガラーゼを産生する能力を有する
ビブリオ属の微生物を寒天を炭素源として培養し、その
培養上清液から分離して精製することを特徴とする請求
項１又は２に記載のアガラーゼの製造方法。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載の酵素を、アガロ
ースを基質とし、作用させることを特徴とするオリゴ糖
の製造方法。 - 【請求項６】 請求項１又は２記載の酵素を海藻に作用
させることを特徴とする海藻細胞のプロトプラストの製
造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12561095A JP3865801B2 (ja) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | 新規なβ−アガラーゼ，その製造方法及びその用途 |
| KR1019960010885A KR960037827A (ko) | 1995-04-27 | 1996-04-10 | 새로운 β-아가라제 및 이를 생산하는 미생물 |
| CA002174906A CA2174906A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-04-24 | .beta.-agarase and microorganism generating the same |
| AU50875/96A AU5087596A (en) | 1995-04-27 | 1996-04-24 | Novel beta-agarase and microorganism generating the same |
| EP96400902A EP0743363A3 (en) | 1995-04-27 | 1996-04-26 | Novel beta-agarase and microorganism generating the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12561095A JP3865801B2 (ja) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | 新規なβ−アガラーゼ，その製造方法及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08294389A true JPH08294389A (ja) | 1996-11-12 |
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ID=14914366
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12561095A Expired - Fee Related JP3865801B2 (ja) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | 新規なβ−アガラーゼ，その製造方法及びその用途 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0743363A3 (ja) |
| JP (1) | JP3865801B2 (ja) |
| KR (1) | KR960037827A (ja) |
| AU (1) | AU5087596A (ja) |
| CA (1) | CA2174906A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021509285A (ja) * | 2018-08-08 | 2021-03-25 | ダインバイオ・インコーポレイテッドＤｙｎｅｂｉｏ Ｉｎｃ． | ストレプトマイセスセリカラー突然変異菌株、これを用いたベータ−アガラーゼ生産方法及びこれを用いたネオアガロオリゴ糖の製造方法 |
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